Disciplina de Métodos Purif. e Anál. de Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

Síntese Proteica e Modificação

Pós-Traducionais

Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br

www.fcav.unesp.br/mtoliveira

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Disciplina de Métodos Purif. e Anál. de Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

Agradecimento à doutoranda

Flávia Campos Freitas Vieira

Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br

www.fcav.unesp.br/mtoliveira

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Dogma Central da Biologia

Molecular

A importância da síntese de proteínas

• As proteínas são os produtos finais da maioria das

vias de informação.

• Componentes e mecanismos utilizados pela

maquinaria de síntese proteica são bem conservados

em todas as formas de vida, de bactérias a

eucariotos.

• É o mais complexo processo de biossíntese que

envolve ao todo quase 300 macromoléculas

diferentes, quase todas dentro do ribossomo.

• Chega a consumir 90% do total de energia utilizada

por uma célula para reações biossintéticas.

• Apesar da complexidade podem produzir proteínas de

forma rápida.

• Ex: um polipeptídeo de 100 resíduos é sintetizado em 5 seg

em uma célula de E. coli (a 37ºC).

• Os processos de endereçamento e degradação devem

estar sincronizados com o de síntese.

O código genético

Propriedades do código genético

Os aminoácidos são formados a partir de códons

A, G, U, C

4¹ = 4 4² = 16 4³ = 64

Os códons são lidos de maneira

sucessiva e sem sobreposição

• Os códons não compartilham nucleotídeos.

Um primeiro códon específico na

sequência estabelece a fase de leitura

• Todo mRNA tem três fases de leitura possíveis.

• Os códons e, consequentemente, os aminoácidos

codificados, são diferentes em cada fase de leitura.

• Apenas uma fase codifica uma dada proteína.

O código genético é degenerado e

universal • Um aminoácido pode ser

codificado por mais de um códon.

• A degeneração não é uniforme.

• Os códons dos aminoácidos são idênticos em quase todas as espécies estudadas.

Tradução do código genético

A decifração do código genético é tida como uma das mais

importantes descobertas científicas do século XX.

• Códon de iniciação:

AUG Met

• Códons de parada:

UAA

UAG

UGA

Existem códons com funções

especiais

Não codificam

nenhum

aminoácido

Fase de leitura aberta (ORF)

• É uma fase de leitura sem um códon de parada entre

50 ou mais códons.

• Longas ORFs geralmente correspondem a genes que

codificam a proteínas.

• Ex: proteína de 60 kDa 500 códons ou mais

Fase de leitura aberta (ORF)

A terceira base de um códon é

oscilante

As duas primeiras letras de um códon são

determinantes primários da especificidade.

A terceira letra é oscilante. Pareia de forma frouxa e

permite rápida dissociação entre o tRNA e seu códon.

• O tRNA possui três bases

(anticódon) que pareiam com

o códon no mRNA.

Degeneração do código genético

• O código é extremamente resistente aos efeitos deletérios

dos tipos mais comuns de mutações.

• Mutações sem sentido (missense):

– Mutações silenciosas;

– Mutações de transição.

• G≡C A=T;

• GUU (Val) CUU (Leu) AUU (Ile).

Síntese Proteica

Estágios da Síntese Proteica

4

Componentes-chave na biossíntese

de proteínas

tRNA

ribossomos

Ribossomos

• Bacterianos 65% rRNA + 35%

proteína

• Constituídos por no mínimo uma

grande subunidade de rRNA +

proteínas ribossomais.

• As proteínas são elementos

secundários.

Ribossomo bacteriano

RNA transportador

• São compostos por uma única fita de RNA dobrada

em uma estrutura tridimensional precisa.

• Existe pelo menos um tRNA para cada aminoácido.

RNA transportador

aminoácido + tRNA + ATP aminoacil-tRNA + AMP + PPi Mg2+

Síntese Proteica: Estágio 2

• A síntese é feita na direção:

Aminoterminal (5’) carboxiterminal (3’)

Estágio 2

• Dois tRNAs para o códon AUG.

• Em bactérias, cloroplastos e mitocôndrias:

– Um para iniciar a síntese: N-formilmetionina (tRNAfMet);

– Outro para a tradução da met em posições internas

(tRNAMet).

• Em eucariotos:

– Existem dois tRNAMet .

Estágio 2 – A iniciação em Procariotos

Estágio 2 – A iniciação em Procariotos

Sequência Shine-Dalgarno

Sinal de iniciação que pareia com

a extremidade 3’ do rRNA 16S.

Estágio 2 – A iniciação em Eucariotos

-80S

elF3

Subunidade ribossomal 60S

Estágio 2 – A iniciação em Eucariotos

-80S

elF3

Subunidade ribossomal 60S

Estágio 3

Etapa 1 – Ligação de um aminoacil-tRNA

Estágio 3

Etapa 2 – Formação da primeira ligação peptídica

Estágio 3

Etapa 3 - Translocação

Estágio 4 – A terminação

• Os fatores de terminação

contribuem:

– Hidrólise da ligação peptidil-tRNA

terminal;

– Liberação do polipeptídeo e do

último tRNA;

– Dissociação do ribossomo e

reciclagem.

• RF-1 UAG e UAA

• RF-2 UGA e UAA

Estágio 4

Polissomos

• É um conjunto de

ribossomos adjacentes em

uma molécula de mRNA que

está sendo traduzida

simultaneamente.

• Eucariotos e procariotos.

Inibição da síntese por antibióticos e toxinas

• A síntese proteica é o alvo de muitos antibióticos e

toxinas naturais.

• Diferenciação entre os processos de procariotos e

eucariotos.

Puromicina

Streptomyces alboniger. Se liga ao sítio

A do ribossomo.

Tetraciclinas

Bloqueiam o sítio A do ribossomo

Cloranfenicol

Bloqueia a atividade peptidil-transferase

em bactérias, mitocôndrias e cloroplastos

Cicloeximida

Bloqueia a peptidil-transferase em eucariotos

Estreptomicina

Leitura errada do código genético.

Inibe a iniciação

Ricina

Inativa a subunidade 60S dos ribossomos

eucarióticos

Estágio 5 – Enovelamento e Processamento

• Algumas proteínas recém-sintetizadas não adquirem

sua conformação final biologicamente ativa até que

sofram modificações pós-traducionais.

Modificações Aminoterminais e Carboxiterminais

Resíduos como N-formilmetionina (bactérias) e

metionina (eucariotos) podem ser removidos para a

formação da proteína funcional.

Perda das sequências sinalizadoras

Sequências sinalizadoras

são removidas no final por

peptidases específicas.

Modificações de aminoácidos individuais

Aminoácidos fosforilados

Aminoácidos carboxilados

Aminoácidos metilados

Ex: caseína do leite

Ex: prototrombina Ex: proteínas musculares

Modificações em Histonas

Histonas podem ter modificações N-terminais feitas

por uma variedade de pequenas moléculas (grupos

acetil, metil ou fosfato).

• Acetilação associados com regiões

no cromossomo de transcrição ativa.

• Desacetilação associados com

regiões na cromatina de transcrição

reprimida.

• Metilação associado com ativação

ou repressão da cromatina,

dependendo do aminoácido

modificado.

• Fosforilação associada com as

cromatinas altamente condensadas de

cromossomos mitóticos.

Ligação de cadeias laterais de carboidratos

Cadeias laterais de carboidratos de glicoproteínas são

ligadas covalentemente durante ou após a síntese. Como

proteínas extracelulares, proteoglicanos.

Formação de pontes dissulfeto

Algumas proteínas formam

pontes dissulfeto entre

resíduos de Cys (cisteína).

Comuns em proteínas

secretadas.

Ajudam a proteger a

conformação nativa no meio

extracelular.

Adição de grupos prostéticos

Muitas proteínas exigem a ligação de grupos prostéticos,

para sua atividade.

Cloroplastos

Endereçamento proteico

• Sequência sinal ou peptídeo sinal sequência curta

de aminoácidos que direciona a proteína para o seu

local apropriado na célula.

• Nas proteínas que vão para o RE, mitocôndrias ou

cloroplastos, a sequência sinal está localizada na

porção aminoterminal.

Endereçamento de proteínas em eucariotos

Endereçamento de proteínas em eucariotos

• No lúmem do RE, as proteínas recém-sintetizadas

sofrem modificações (enovelamento, pontes dissulfeto,

glicosilação, etc).

• As proteínas são transportadas

para o aparelho de Golgi, para

depois serem selecionadas e

enviadas para seu destino final.

Degradação de proteínas

• Evita o acúmulo de

proteínas anormais ou não

desejáveis;

• Permite a reciclagem dos

aminoácidos.

• Eucariotos: ubiquitina –

ligada a proteínas que vão

ser degradadas por meio de

uma via de ATP no

complexo proteossomo.

Tradução

https://www.youtube.com/watch?v=DcCnmPeutP

4

Modificação Proteica

https://www.youtube.com/watch?v=Cy5gCjctps4

Disciplina de Métodos Purif. e Anál. de Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

Próxima aula: Prática Pymol