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M A R T Í N E S P A R I Z - E S P A R I Z @ I B R - C O N I C E T . G O V . A R
B I O T E C N O L O G Í A D E L O S A L I M E N T O S 2 0 1 8
SÍNTESIS QUÍMICA, AMPLIFICACIÓN Y
SECUENCIACIÓN DEL ADN
EL MÉTODO DE LA FOSFORAMIDITA
Diagrama de flujo para la síntesis química
de oligonucleótidos de ADN. Después de
n ciclos de reacciones de acoplamiento,
se produce una molécula de ADN simple
hebra con n + 1 nucleótidos.
Molecular biotechnology : principles
and applications of recombinant DNA
/
Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak,
and Cheryl L. Patten. — 4th ed.
Capítulo 4 (p98-143)
EL MÉTODO DE LA FOSFORAMIDITA
El nucleósido inicial tiene un grupo protector de
DMT unido al grupo 5’ hidroxilo del resto
desoxirribosa y una molécula espaciadora unida
al grupo hidroxilo del carbono 3' de la
desoxirribosa. La unidad espaciadora está unida
a un soporte sólido, que generalmente es un
cordón CPG.
Complejo de inicio para la síntesis
química de una cadena de ADN.
EL MÉTODO DE LA FOSFORAMIDITA
Estructura de una fosforamidita. Existen derivados fosforamiditas para cada
una de las cuatro bases (A, C, G y T).
Un grupo diisopropilamina se une al grupo fosfito 3 'del nucleósido. Un grupo
β-cianoetilo protege el grupo fosfito 3 'y un grupo DMT se une al grupo
hidroxilo 5' del azúcar desoxirribosa.
EL MÉTODO DE LA FOSFORAMIDITA
Destritilación. El grupo 5 'DMT se elimina por tratamiento con TCA. En
este ejemplo, se representa la destritilación del primer nucleósido.
EL MÉTODO DE LA FOSFORAMIDITA
Activación y acoplamiento. La
activación de una fosforamidita
permite que su grupo 3 'fosfito se
una al grupo hidroxilo 5' del
nucleósido destritilado unido.
EL MÉTODO DE LA FOSFORAMIDITA
Capsulando Los grupos hidroxilo 5 'disponibles de nucleósidos
destritilados sin reaccionar se acetilan para evitar que
participen en la reacción de acoplamiento del ciclo siguiente.
EL MÉTODO DE LA FOSFORAMIDITA
Oxidación. El enlace internucleotídico del triéster de fosfito
se oxida al triéster de fosfato pentavalente. Esta reacción
estabiliza el enlace fosfodiéster y lo hace menos susceptible a
la escisión en condiciones ácidas o básicas.
EL MÉTODO DE LA FOSFORAMIDITA
EL MÉTODO DE LA FOSFORAMIDITA
Cold Spring Harb Perspect Biol 2017;9:a02381
EL MÉTODO DE LA FOSFORAMIDITA
Cold Spring Harb Perspect Biol 2017;9:a02381
SÍNTESIS DE OLIGOS: APLICACIONES
Un oligonucleótido palindrómico
(rojo) con un sitio de
reconocimiento BamHI se hibrida
formando homoduplex.
Durante la reacción de ligación, los
linkers se unen al ADN de interes y
entre sí.
Clonación con un linker.
SINTESIS DE OLIGOS: APLICACIONES
Crear un sitio de endonucleasa de
restricción en un vector con un
adaptador.
SINTESIS DE OLIGOS: APLICACIONES
Los oligonucleótidos
individuales (de 20 a 60
mers) se sintetizan
químicamente. Sus
secuencias están diseñadas
para que formen una matriz
bicatenaria después del
recocido. La T4 ADN ligasa
se usa para unir los niks y
producir una versión intacta
del gen.
Ensamblaje de un gen sintético a partir
de oligonucleótidos cortos.
SINTESIS DE OLIGOS: APLICACIONES
Los oligonucleótidos individuales se
sintetizan químicamente. Sus
secuencias están diseñadas para
permitirles formar una molécula
estable, con regiones emparejadas
por bases separadas por regiones
abiertas (gaps). Estas regiones se
completan mediante síntesis
enzimática de ADN in vitro. Los niks se
eliminan con T4 ADN ligasa.
Ensamblaje y síntesis de ADN
enzimático in vitro de un gen.
POLYMERASE CHAIN REACTION
POLYMERASE CHAIN REACTION
POLYMERASE CHAIN REACTION
POLYMERASE CHAIN REACTION
PCR DE RNA MENSAJEROS EUCARIOTAS
Amplificación por PCR de ADNc de longitud completa. La transcriptasa inversa usa un oligonucleótido con oligo (dT) y una secuencia añadida [oligo (dT) -primer] para iniciar la síntesis de cDNA de primera cadena a partir de plantillas
de ARNm de poli (A) (1). La actividad transferasaterminal de la transcriptasa inversa agrega mayormente desoxicitidinas (dCs) al extremo de cada molécula de ADNc de la primera cadena de longitud completa (1). Un oligonucleótido cebador-desoxiguanosina (dG) que se empareja con la cola dC (2) actúa como un molde para la transcriptasa inversa para extender el ADNc de la primera cadena en los extremos 3 '(3).Los cebadores directo e inverso que tienen las mismas secuencias que los oligonucleótidos cebador-dG y oligo (dT) -primer, respectivamente, se añaden a la mezcla de ADNc de la primera cadena (4), y los ADNc de doble hebra de longitud completa se generan por PCR (5).
PCR PARA LA SÍNTESIS DE GENES (GENES SINTÉTICOS)
Los oligonucleótidos solapantes que
codifican un dúplex de ADN se
ensamblan juntos a través del
ensamblaje de extensión de
solapamiento progresivo en una
reacción en pocillo. Después del
ensamblaje, el sintón ensamblado de
longitud completa se amplifica fuera
de la mezcla de ensamblaje mediante
reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) con los cebadores más externos.
Cold Spring Harb Perspect Biol 2017;9:a02381
SÍNTESIS QUÍMICA DE OLIGOS EN MICROARREGLOS DE ADN
Síntesis de oligonucleótidos basada en
microarreglos (microarrays). En este
método, los chips de microarrays que
contienen decenas de miles de
oligonucleótidos de diferente
secuencias. El producto final es un
conjunto de secuencias que contiene
cada oligonucleótido sintetizado en la
matriz.
Se requieren etapas de procesamiento
posteriores para "pescar" las
secuencias de oligonucleótidos
deseadas fuera del conjunto de síntesis
para la posterior síntesis génica
Cold Spring Harb Perspect Biol 2017;9:a02381
SÍNTESIS DE GENES BASADO EN MICROARREGLOS
Amplificación de subpools con código de barras por
PCR (eliminando así la complejidad de fondo),
eliminan las secuencias de código de barras y luego
ensamblan los genes.
Nature Methods 11, p499–507 (2014)
doi:10.1038/nmeth.2918
SÍNTESIS DE GENES BASADO EN MICROARREGLOS
Se usa un sintetizador personalizado para imprimir los oligos necesarios
para cualquier ensamblaje en pocillos separados micropateados.
Aprovechando la separación espacial que permite la síntesis de
microarrays, amplifican y ensamblan estos genes dentro de los
micropocillos.
Nature Methods 11, p499–507 (2014)
doi:10.1038/nmeth.2918
SÍNTESIS DE GENES BASADO EN MICROARREGLOS
Longitudes y costos de diferentes
tecnologías de síntesis de oligos y
genes. La síntesis comercial de
oligos de proveedores tradicionales
(rosa) y las tecnologías basadas en
arreglos (café) se trazan de
acuerdo con las escalas de tallas y
los puntos de precio comúnmente
disponibles. Se muestran los costos
de la síntesis de genes de
proveedores comerciales para
genes clonados, verificados por
secuencia (verde oscuro) y
ensamblajes de ADN no purificado
(verde claro), así como los costos
de síntesis de genes derivados de
informes académicos (azul) .Nature Methods 11, p499–507 (2014)
doi:10.1038/nmeth.2918
REAL-TIME PCR
Molecular biotechnology Capítulo 9
El colorante fluorescente
“SYBR green” no se une al
ADN monocatenario
(A), se une al ADN
bicatenario mientras se
sintetiza (B). Solo el ADN
unido fluoresce (C).
REAL-TIME PCR
Molecular biotechnology Capítulo 9
Un gráfico de ΔRn (fluorescencia normalizada) versus número de ciclo
en un experimento de PCR en tiempo real. Se muestran cuatro fases de PCR. (1) Una fase lineal, donde la emisión de fluorescencia aún no está por encima del nivel de fondo. (2) Una fase exponencial temprana, donde la intensidad de fluorescencia se vuelve significativamente más alta que la linea de base. El ciclo en el que esto ocurre generalmente se conoce como CT. (3) Una fase exponencial, donde la cantidad de producto se duplica en cada ciclo. (4) Una fase de meseta, donde los componentes de la reacción son limitados y la amplificación se ralentiza.
REAL-TIME PCR
Gráfica de CT frente a la
cantidad inicial de una
secuencia de nucleótidos
diana.
La detección de
fluorescencia es lineal en
varios órdenes de
magnitud.
REAL-TIME PCR IN FOOD SCIENCE: PCR DIAGNOSTICS
Curr. Issues Mol. Biol. 15: 39-44.
• Principales problemas y desafíos:
• Tratamiento previo a la PCR de las muestras de alimentos.
• Controles analíticos
• Desarrollo de estrategias para el uso cuantitativo de qPCR.
• Automatización y escala.
• Detección de organismos viables.
La validación internacional a gran escala de los métodos
basados en PCR en comparación con los métodos
convencionales estándar existentes no se ha cumplido, pero
es esencial si se debe alentar a la industria a adoptar estos
nuevos enfoques.
REAL-TIME PCR IN FOOD SCIENCE: PCR DIAGNOSTICS
Curr. Issues Mol. Biol. 15: 39-44.
REAL-TIME PCR IN FOOD SCIENCE: PCR DIAGNOSTICS
Curr. Issues Mol. Biol. 15: 39-44.
• Control del proceso de muestra (SPC): muestra negativa con una cantidad suficiente de sustancia blanco (por ejemplo, patógeno, especie, etc.) y procesada a lo largo de todo el protocolo. Se debe obtener una señal positiva que indique que todo el proceso (desde la extracción de ácidos nucleicos hasta la reacción de amplificación) se realizó correctamente.
• Control de proceso de muestra negativo (NSPC): una muestra negativa con una cantidad suficiente de agua no objetivo o agua, y procesada a lo largo de todo el protocolo. Se debe obtener una señal negativa que indique la falta de contaminación a lo largo de todo el proceso (desde la extracción de ácidos nucleicos hasta la reacción de amplificación).
REAL-TIME PCR IN FOOD SCIENCE: PCR DIAGNOSTICS
Curr. Issues Mol. Biol. 15: 39-44.
• Control positivo de PCR: una muestra de ADN que se sabe que contiene la secuencia diana. Una amplificación positiva indica que la amplificación se realizó correctamente.
• Control de amplificación interno (IAC): ácido nucleico quimérico no diana añadido a la mezcla maestra para ser co-amplificado por el mismo conjunto de cebadores que el ácido nucleico diana pero con un tamaño de amplicón distinguible visualmente o una región de secuencia interna diferente del objetivo amplicón La amplificación de IAC tanto en presencia como en ausencia de blanco indica que las condiciones de amplificación son adecuadas.
REAL-TIME PCR IN FOOD SCIENCE: PCR DIAGNOSTICS
Curr. Issues Mol. Biol. 15: 39-44.
• Control de PCR negativo: incluye todos los reactivos utilizados en la amplificación excepto los ácidos nucleicos modelo. Por lo general, se agrega agua en lugar de la plantilla. Una señal negativa indica la ausencia de contaminación en el ensayo de amplificación.
• Control ambiental: Un tubo que contiene la mezcla maestra o agua se dejó abierto en la sala de configuración de PCR para detectar posibles ácidos nucleicos contaminantes en el medio ambiente.
REAL-TIME PCR IN FOOD SCIENCE: PCR DIAGNOSTICS
• El mercado mundial de pruebas de inocuidad de
los alimentos se puede desglosar por tipo de
contaminante e incluye:
• Patógenos
• Organismos genéticamente modificados (OGM)
• Toxinas
• Residuos
• Otros contaminantes / verificación de ingredientes
REAL-TIME PCR IN FOOD SCIENCE: PCR DIAGNOSTICS
• Las pruebas de patógenos tienen la mayor parte del mercado seguidas por las pruebas de OGM.
• Los motivos para las pruebas de alimentos incluyen:• Problemas recurrentes de salud pública relacionados con los alimentos• Las expectativas del consumidor• Montaje de requisitos reglamentarios de seguridad alimentaria• Ventaja competitiva de la industria• Costo de retiro del producto• Protección del valor de marca• Evitar litigios
• Muchas empresas no se recuperan financieramente de un brote de enfermedad transmitida por los alimentos asociado con su producto.
REAL-TIME PCR IN FOOD SCIENCE: PCR DIAGNOSTICS
• Los motivos para la adopción de PCR en tiempo real en pruebas de alimentos:
• Ahorro de tiempo, tanto en el tiempo total desde el muestreo hasta el resultado y en el tiempo del técnico necesario para configurar y ejecutar el ensayo.
• El alto grado de automatización.
• Alta especificidad generalmente significa que se requieren menos pruebas repetidas.
• Puede ser Multiplex.
• Puede ser cuantitativos
• Beneficios de costos en resultados de pruebas rápidas.
REAL-TIME PCR IN FOOD SCIENCE: PCR DIAGNOSTICS
• Los motivos para pruebas de OGM: • Controversias en torno a la seguridad humana y ambiental• Etiquetado y trazabilidad• Elección del consumidor• Derechos de propiedad intelectual• Seguridad alimentaria
• La detección eficiente de OGM es cada vez más importante para cumplir con más restricciones y una mayor conciencia en la seguridad alimentaria.
• La presencia de cultivos transgénicos en el mercado de alimentos y piensos ha dado lugar a diferentes regulaciones en diferentes países:
• EE. UU .: comida etiquetada como "GM libre" si <5% GM• UE: alimentos etiquetados "GM" si> 1% GM• Japón: alimento etiquetado como "GM" si> 5% GM
