High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Cara Kerja :

1. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut . Fase

gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-

partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab

adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor

sehingga akan mengacaukan analisis.

2. Fase gerak kemudian dipompa dengan pompa bertekanan sekitar 241 bar untuk menuju

ke kolom. Pompa harus inert terhadap fase gerak. Tujuan penggunaan pompa atau sistem

penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak

berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.

3. Sebelum menuju ke kolom, fase gerak diinjeksikan dengan sampel menggunakan

injektor.

4. Pada kolom terjadi pemisahan antara fase gerak dan fase diam, sehingga dapat diteruskan

menuju detektor dan menghasilkan sinyal-sinyal dalam bentuk spektrum.

5. Dengan spektrum yang dihasilkan, kita dapat menganalisis dan mengidentifikasi sampel

yang digunakan.

Penggunaan HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

1. Digunakan untuk menganalisis obat/bahan obat

Pada Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 sudah digunakan KCKT dalam

analisis kualitatif maupun kuantitatif dan uji kemumian sejumlah 277 (dua ratus tujuh

puluh tujuh) obat/bahan obat. Pemerintah Indonesia telah mengikuti perkembangan dan

kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi canggih dalam bidang analisis obat.

Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal,

namun metoda ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 jenis obat/bahan obat

karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi, waktu analisis cepat.

2. Menganalisis kandungan vitamin yang dapat larut air, misalnya vitamin C, dll.

3. Mengidentifikasi kandungan gula dan pestisida yang terkandung dalam buah

4. Mengidentifikasi kandungan alkohol dan zat diazepam dalam darah.

Diazepam (Valium) merupakan turunan dari benzodiazepine dengan rumus molekul

7-choro-1,3-dihydro-1-methyl-5-phenyl-2H-1,4-benzodiazepin-2-on, rumus kimianya

biasa ditulis dengan C23H27N. Senyawa golongan psikotropika ini berbentuk kristal agak

kekuningan yang tidak larut air. Diazepam termasuk obat  antiansietas, antikonvulsan,

dan sedatif.

Tugas III : Bagaimana anda menentukan:

d. Tinggi piringan (H) dalam meter

e. Panjang kolom bila resoliusi kolom menjadi 1,5

f. Waktu elusi senyawa etanol dalam kolom yang telah diperpanjang

Jawaban :

d. Tinggi piringan (H) dalam meter

Misal :

Panjang kolom (L) yang digunakan adalah sepanjang 75 cm

Maka, tinggi piringan (H):

H = LN

= 75 cm53 , 045

= 1 , 414 cm

e. Panjang kolom bila resolusi kolom menjadi 1,5

Panjang kolom bila resolusi kolom menjadi 1,5 (Rs)2

Dari persamaan:

N = 16 RS

2 ( αα − 1 )

2 ( 1 + k 'B

k 'B)2

diketahui bahwa α dan k’B konstan (tidak berubah) dengan berubahnya N dan L, sehingga

diperoleh persamaan seperti berikut :

Subtitusi (Rs)1 = 1,88 ; (Rs)2 = 1,5 ; dan N1 = 53.045 ke dalam persamaan di atas,

sehingga didapat jumlah piringan (N2) bila resolusi diharapkan menjadi 1.5:

1 ,881,5

= √53 ,045

√ N2

N2 = 53 ,045 (1,51 ,88 )

2

N2 = 33 ,77N2≈ 33

Jumlah piringan dibulatkan menjadi 33 karena tidak bisa dibulatkan ke atas menjadi 34

sehingga dibulatkan ke bawah.

Jadi, panjang kolom bila resolusi kolom diharapkan menjadi 1,5:

L = N xHL = 33 × 1 , 414 cm =46 , 662 cm ≈ 47 cm

f. Waktu elusi senyawa etanol dalam kolom yang telah diperpanjang

Diketahui persamaan waktu (tR)B yang dibutuhkan untuk mengelusi 2 senyawa tersebut

dengan resolusi Rs adalah:

(t R )B =16 R

S2 H

u ( αα − 1 )

2 ( (1 + k 'B )3

(k 'B)2 )dari persamaan di atas, diketahui bahwa tR ~ RS

2, sehingga diperoleh persamaan:

( tRA)1

( tRA)2

=Rs

12

Rs2

2

Jadi, waktu elusi etanol pada kolom yang telah diperpanjang tsb:

2,4( tRA )2

=(1, 88 )2

(1,5 )2

(tRA )2 = 1 ,528 menit =91 , 68 det ik

Kesimpulan :

1. Kandungan etanol dalam darah dapat diketahui konsentrasinya dengan menggunakan

GC/MS melalu perhitungan menggunakan kurva kalibrasi standar.

(RS)1(RS)2

=√ N1

√ N2

2. Parameter yang dianalisis pada GC dan MS yaitu panjang kolom, tinggi piringan,

jumlah piringan yang efektif, waktu retensi, dan resolusi kolom.

Daftar Pustaka :

Lindsay, S., John Wiley & Sons. (1992). High Performance Liquid Chromatography. 2nd (ed).

Chischer. New York, Toronto, Singapura.

Veronika, R. Meyer, John Wiley & Sons. (1999). Practical High Performance Liquid

Chromatography. 3rd (ed). ISBN 0-471-98373-X

Anonymous. (2010). Definition of High-performance liquid chromatography (HPLC).

[Online], dari :

http://www.chemicool.com/definition/high_performance_liquid_chromatography_hpl

c.html

[diakses pada 22 November 2014]