Antonio Novelli

Societa’ Italiana di Genetica Umana

Busto Arsizio, 11 maggio 2012

La SIGU ha obiettivi prevalentemente scientifici e si propone come struttura di riferimento e di consulenza per problemi di interesse scientifico e sanitario concernenti la Genetica Umana in tutti i suoi aspetti applicativi all'uomo. La SIGU intende collaborare con coloro che in Italia sono interessati alla ricerca e ad ogni tipo di approfondimento relativo alle discipline Genetica Medica e Genetica Umana, in particolare elaborando criteri di qualità per i l aboratori di Genetica Medica operanti nell'ambito delle strut turesanitarie pubbliche e private , contribuendo alla elaborazione di linee guida nell'ambito della ricerca Genetica Umana e promovuendo con ogni mezzo la pubblica consapevolezza sulle funzioni, le potenzialità ed i limiti delle tecniche diagnostiche di Genetica Umana.

Guidelines

7. QF-PCR FOR RAPID PRENATAL

DIAGNOSIS OF ANEUPLOIDY

This technique is a useful

adjunct to prenatal diagnosis

and is a more appropriate

technique than FISH when

dealing with large numbers of

prenatal referrals. Internal

validation is essential before

using this technique. Close

liaison with Molecular Genetics

colleagues is necessary to

establish this technique in a

cytogenetic laboratory.

The limitations of QF-PCR in

identifying chromosome

abnormalities must be clearly

known. It is recommended that

testing for trisomies 13, 18 and

21 is carried out, whilst it is

acceptable to test for sex

chromosome aneuploidy in only

a subset of referrals. QF-PCR

analysis provides information

only about the probe locus in

question. It does not substitute

for a complete chromosome

analysis.

EE(RI)(RI)VOLUZIONE DELLA CITOGENETICA:VOLUZIONE DELLA CITOGENETICA:DAL CROMOSOMA ALLDAL CROMOSOMA ALL’’ARRAYARRAY

10 Mb

VisioneVisionedd’’insiemeinsiemedelldell’’interointerogenoma, ma genoma, ma

bassabassarisoluzionerisoluzione

40-100Kb

AumentaAumenta la la risoluzionerisoluzione, , ma ma ll’’analisianalisi diventadiventa

locuslocus--specificaspecifica

ArrayArray--CGHCGH: AltaAlta risoluzione(10-12Kb) e analisidell’intero genoma in un unico esperimento

Chromosomal revolution400 550 800bande

different

cytogenetical

RESOLUTION

Investigations over the past four years clearly demonstrate that the

human genome harbors thousands of structural genomic variants. The

largest category of currently-known structural genomic variants are

copy number variants (CNVs), where segments of DNA sequences are

either lost or gained within individual genomes.

The existence of CNVs in healthy individuals has made it a

challenge to accurately interpret “pathogenic” CNVs detected

in genetic diagnostic testing

CNVs – Copy Number Variations

An ongoing “revolution”

2,6

milion

SNPs

arrays

Implication of this revolution

Over 100 new genetic syndromes

CNV:

Stevenson et al, Am J Med Genet 123A: 29-32, 2003

Exponential

increase of

genomic

diseases in

human

pathology

Koolen et al. 2008 HumMut

Recurrent reciprocal 16p11.2 deletion

and duplication syndrome

Genomic analysis -

Hard to interpret results

Variable espressivity : from normal to

developmental delay and autism.

It is not possible to predict the phenotype

Which indications?

Real cost/benefit?

Which kind of array?

PD indications

EMA (≥ 35 years)

Previuos pregnancy with

chromosomal anomaly

Parent carrier of a chromosomal

rearrangement

Familiar hystory of chromosomal

anomaly

Abnormal ultratounds

Positive biochemical screenings

Familiar hystory for neural tube

defects

Parent(s) carrier (s) of a

mendelian condition

““anan inevitableinevitable questionquestion …”…” (actually, more than one!)

Targeted array

Whole-genome array (Oligo)

Considerazioni

• il dubbio-domanda-preoccupazione se gli strumenti che la citogenetica tradizionale codifica per la formulazione del cariotipo siano realmente oggettivi rispetto alla realtà tecnologica.

• se la diagnosi cromosomica offerta quotidianamente regge lo scontro coi propri limiti sempre più spesso portati alla verifica di tecniche genomiche precise (array-CGH).

• Se forse non sia ora di attuare un salto verso l'automazione di alcune tecniche che alzino il livello di precisione della citogenetica.

•....gli arrays servono a verificare la qualità del lavoro citogenetico ?

•... si vuole sostituire la citogenetica con gli arrays..e/o tecniche molecolari?.

•Queste nuove piattaforme tecnologiche sono sufficienti ad individuare le anomalie cromosomiche?

•. necessità che il gruppo di citogenetica si esprima t empestivamente su questo argomento nell'attesa di un consenso general e le linee guida

specifiche e condivise

non certo come strumento di concorrenza

Considerazioni……… .

Domande?� Quali patologie analizzare – Come stabilire che una

patologia è grave o meno grave?

� Si deve comunicare il risultato che uno screening genomico

rivela al di fuori della specifica patologia richiesta – informed

consent or generic genetic consent? Elias S, Annas GJ. NEJM 1994

� In assenza di linee guida chiare non si rischia che sia il

mercato a scegliere – chi direbbe no?

� Questa DP è economicamente sostenibile o rischia di

creare una discriminazione tra le coppie?

L'uso del termine cariotipo molecolare per intendere l'analisi array-CGH può indurre (più o meno innocentemente) l'utente a pensare che altro non trattasi che di miglior tecnica in un unico percorso metodologico, come dal Giemsa alle bande, e di conseguenza a pensare che chi lo applica sempre è bravo e gli altri no.

L'innocenza scompare quando ci accorgiamo che gli arraysvengono eseguiti e gli esiti comunicati senza l'analisi cromosomica e ad un prezzo surrogato, ……

è evidente che l'offerta è alternativa

il CARIOTIPO non è tradizionale, e neppure molecolare. …………………...

The Karyotype is the number and the appearence of the chromosomes in the nucleus of an eukaryotic

cell...Karyotypes describe the number of chromosomesand what they look like under a light

microscope..(Wikipedia).

Analisi dello stesso campione in altro centro, non conferma il dato

• dalla necessità di rispondere il prima possibile ad un paper di un gruppo Italiano ed a una copertina di Prenatal Diagnosis che raccomandano l'utilizzo degli aCGH come test di primo livello, cosa che ogni genetista, oggi non puo' accettare.

• e soprattutto quello che sta accadendo: si manda in giro una pubblicazione che asserisce la "morte del cariotipo" e la sua sostituzione con un CGH array a tutto spiano per risolvere tutti i problemi a costi bassissimi,con la conseguenza che con risultati spesso dubbi, la gestante viene presa in carico per la consulenza genetica da centri di riferimento regionali

•OBJECTIVES: At present, a precise guideline establishing chromosomemicroarray analysis (CMA) applications and platforms in the prenatal setting does not exist. The actual controversialquestion is whether CMA technologies can or should shortlyreplace the standard karyotype in prenatal diagnosispractice

• CONCLUSIONS: Presently CMA analysis can be considered a second-tierdiagnostic test to be used after a standard karyotype in selected group of pregnancies, such as those with single (apparently isolated) or multiple US fetal abnormalities, with de novo chromosomal rearrangements, even ifapparently balanced, and those with supernumerarymarker chromosomes.

Karyotype on amniotic fluid:

46,XY,t(4;11)(q25;p15)

chr (4)der (4) chr (11)der (11)

Post-natal genetic counselling →

RIEGER Syndrome - PITX2 (4q25)

AD include several congenital malformations of the eye anterior segment

Array-CGH con risoluzione di 200 Kb → NEGATIVA

Rottura del gene PITX2 (RP11-380D23)

APLOINSUFFICIENZA di PITX2

RP11-380D23

CEP 4

Analisi dei punti di rottura sul cromosoma 4 con sonda

locus-specifica

RP11-380D23 (PITX2)PITX2

der (4)

der (11)

chr (4)

46, XX, t(15;17)(q14;p13.2)

WCP 17

WCP 15

15p11.2 D15Z1

15q11-q13 / 15q22 PML

17p11.2 SMS (RAI1)

17p13.3 MDS (LIS1)

Chr:17

Chr:15

Array-CGH piattaforma Oligo 2x105K

Hg:18

_ Nata a termine_ Misurazioni nella norma_ Buone condizioni generali_ Ecocardiografia, Ecografia renale, Ecografia cerebralenella norma_ Difetto isolato bilaterale arti superiori: Pollice digitalizzato (ad impianto prossimale, trifalangeo)

RP11-1D5 (17p13.1) RP11-78N21 (17p13.1)

Break Point

RP11-483E23 (15q13.1)

HYPOTHESIS:

1) interruption of a gene in one of the translocation breakpoints

2) Positional effect on genes neighbouring the breakpoint or translocated to a different locus.

PATHOLOGICAL REARRANGEMENT NOT ASSOCIATED TO THE PH ENOTYPE

RIS ORIGINE Mb START END

dup 16p13.12-p13.11 pat 1,5 14,687,665 16,218,541

dup 15q13.2-q13.3 mat 1,7 28,801,829 30,494,145

Variable phenotype with incomplete penetrance

21 weeks of pregnancy: 46,XXUltrasound: complex heart defect (troncoconal malformation)Counselling: ? Normal variat or susceptibility locus?

Termination of pregnancy for fetal malformationexcess of information50% recurrence risk in future pregnancies?

Locus associated to susceptibility to autismand to mental retardation

Locus associated to susceptibility to schyzophrenia

PATHOLOGICAL REARRANGEMENT NOT ASSOCIATED TO THE PH ENOTYPE

RIS ORIGINE Mb START END

dup 16p13.12-p13.11 pat 1,5 14,687,665 16,218,541

dup 15q13.2-q13.3 mat 1,7 28,801,829 30,494,145

20 SG: 46,XYUltrasound: increased NT Counselling:? Normal variat or susceptibility locus?

Not requested information about maternal genome: What does it involve? Eventually late onset...

Variable phenotype with incomplete penetrance

The analysis detected two rearrangements:

A 1,2Mb microduplication, in 4p15.31, paternally inherited

A 86,8Kb microdeetion, in 2p16.3, maternally inherited

+

=

?

46,XY,t(1;2)(p22;q13)dn

aCGH: detection of cryptic imbalances not visible by standard cytogenetics techniques

� Amniotic fluid

� Normal parental karyotype

WCP1

WCP2

WCP1

WCP2

WCP1

WCP2

� Empiric risk of develompental anomalies: 6%

� alla nascita: ritardo di crescita, dismorfismi

a

b

c

a) 2 microdeletions on chromosome 1 havebeen detected.

b) partial deletion of region 1p32p31.3(~3 Mb)

c) partial deletion of region 1q23.3(~1,9 Mb)

.

aCGH: detection of cryptic imbalances not visible by standard cytogenetics techniques

Oligo 4x44K del 2q37.1-q37.3 dn 7.6 Mb 235164577.5 242717042.5

RP11-655C18 (16q24.1-q24.2)

Oligo4x180K

del 16q24.1-q24.2 dn 1,9 Mb 85,009,312 86,911,88

9

Gene FOXC2; Yu et al 2010 idronefrosi congenita

19 S.G. Amnio: 46,XYEcografia:igroma cistico,onfalocele,idronefrosi

IUGR

Complex heart defect(Shone’s anomaly)

Minor skeletalanomalies

Radio FC, Bernardini L, Loddo S, Bottillo I, Novelli A , Mingarelli R, Dallapiccola B.“TBX2 gene duplicati on associated with complex heart defect and skeletal malformations mimicking animal models with Tbx2 null phenotype” Am J Med Genet 2010

Elevata risoluzione del microarray � CNVs “monogeniche”

Array-CGH con risoluzione di circa 200 Kb : NEGATIVA

arr dup(17)(q23.2q23.2)

Elevata risoluzione del microarray � CNVs “monogeniche”

Radio FC, Bernardini L, Loddo S, Bottillo I, Novelli A , Mingarelli R, Dallapiccola B.“TBX2 gene duplicati on associated with complex heart defect and skeletal malformations mimicking animal models with Tbx2 null phenotype” Am J Med Genet 2010

Analisi di SNP-array con risoluzione di 75 Kb (Affymetrix 6.0 Chip) � POSITIVA

TBX2: uno dei membri dei fattori di trascrizione della famiglia T-box. Modelli animali hanno dimostrato l’importanza di Tbx2 nello sviluppo del cuore, degli arti e della retina. In particolare, a livello cardiaco, Tbx2 interagisce con altri fattori di trascrizione nella formazione del canale atrioventricolare e nello sviluppo del tratto di efflusso.

III CASO. Elevata risoluzione del microarray � CNVs “monogeniche”

Le concentrazioni relative dei fattori di trascrizione sono cruciali per il corretto controllo della trascrizione durante lo sviluppo

Primo caso di duplicazione nell’uomo.Il topo knockout presenta cardiopatia e una delezione recentemente descritta 17q23.1q23.2 (Ballifet al., 2010) che include i geni TBX2 e TBX4 presenta un fenotipo parzialmente sovrapponibile � IPOTESI ����Delezione e duplicazione dello stesso gene èresponsabile delle stesse malformazioni congenite

Radio FC, Bernardini L, Loddo S, Bottillo I, Novelli A , Mingarelli R, Dallapiccola B.“TBX2 gene duplicati on associated with complex heart defect and skeletal malformations mimicking animal models with Tbx2 null phenotype” Am J Med Genet 2010

→ c'è bisogno di ulteriori studi prospettici con ampie coorti studiate con KHR e CGH (perchè intervallo di confidenza troppo ampio, non abbiamo ancora una stima precisa di quello a cui andiamo incontro,)

→ la risoluzione ottimale ancora non è stata determinata (in futuro useremo targeted array per screening per evitare CNV di significato incerto? )

→ trovare CNV di significato incerto ha una ricaduta immediata sulla consulenza genetica, con un aumento dei costi assoluti della diagnosi prenatale.

Take Home Message

Un analisi genetica

deve essere

INTEGRATA in una

consulenza

genetica

e NON essere un

test di laboratorio

Quality self-assessment in provision of genetic

counselingEurogentest WP3, 2008

Dimensioni e collaborazioni all’interno dell’Unità

massa critica (almeno 2 specialisti); revisione temporalizzata della casistica clinica; supervisione

da parte del responsabile; multidisciplinarità.

Aggiornamento dello staff

aggiornamento continuo interno e esterno; tempo adeguato per l’auto-educazione.

Ambienti e accesso

riservatezza nei locali della consulenza; facile accesso; conoscenza del servizio da parte del

pubblico; disponibilità della consulenze anche con telefono, telemedicina, ecc.; assistenza ai

bambini durante la consulenza.

Tempi di attesa

conoscenza degli utenti dei tempi di attesa; capacità di

gestire le urgenze.

Attività precedenti la consulenza genetica

studio del caso prima della consulenza; acquisizione di

informazioni compresa la storia familiare.

conclusioni• Un test di laboratorio deve essere sottoposto ad

una valutazione clinica prima di venire trasferito nella pratica.

• ogni test medico viene definito in base ad alcune caratteristiche, tra le quali sensibilità, specificità, valore predittivo positivo e negativo.-

• non esiste un test migliore: esiste il test appropriato per la specifica condizione clinica, discussa dal paziente e dal medico nell’ambito di ogni singola e specifica situazione.

• Nel caso dei test genetici la consulenza genetica deve essere inserita nel percorso diagnostico.

Grazie !