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  • SOLUTIONS DE RECHANGE AUX ANIMAUX MODIFIS PAR GNIE GNTIQUE

    MARS 2014

    TABLES DES MATIRES

    PRFACE ................................................................................................................... 2

    1. Techniques de production danimaux modifis par gnie gntique .......... 2

    1.1 Injection pronuclaire ................................................................................. 2

    1.2 Transgense cible et mutagense dans des cellules souches

    embryonnaires ............................................................................................ 4

    1.2.1 Transgense cible ........................................................................................... 4

    1.2.2 Mutagense cible ............................................................................................. 6

    1.3 Transfert gnique mdiation virale (transgense par lentivirus) .............. 6

    1.4 Chromosomes artificiels bactriens (BAC) ................................................. 6

    1.5 ZFN (nuclases doigts de zinc) et TALEN (acronyme pour Transcription

    Activator-Like Effector Nuclease) ............................................................... 7

    2. Raffinements pour contrler lexpression du transgne ................................ 7

    2.1 Technologies de knock-out conditionnel et de transgense (p. ex. les

    systmes de recombinaison FLP/FRT et Cre-loxP) ................................... 7

    2.2 Isolants ....................................................................................................... 9

    2.3 Slection du promoteur pour la transgense .............................................. 9

    2.4 Vecteurs de pigeage ................................................................................ 9

    3. Raffinements pour le transfert dembryons ................................................... 10

    3.1 Transfert non chirurgical dembryons (NSET) chez la souris .................... 10

    3.2 Transfert gnique par des spermatozodes .............................................. 10

    RFRENCES .......................................................................................................... 11

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    PRFACE1

    La mthode utilise pour la production d'une ligne d'animaux modifis par gnie gntique

    dpendra essentiellement du type de modification gntique ncessaire. Nanmoins, il faut

    galement tenir compte, lors du choix de la mthode, des questions de bien-tre et des

    possibilits de raffinement pour nuire le moins possible au bien-tre des animaux et amliorer

    l'efficacit de la production. La production dun animal modifi par gnie gntique doit tre

    prcde dune confirmation que la ligne nest pas disponible ailleurs, car la rptition inutile

    de toute production est un gaspillage d'animaux.

    La section 1 de ce document propose un panorama des mthodes employes pour produire des

    animaux modifis par gnie gntique. Chaque mthode succinctement dcrite est accompagne

    des proccupations pour le bien-tre animal souleves ainsi que des possibilits de raffinement

    afin de rduire le nombre danimaux requis ou damliorer le bien-tre des animaux utiliss. Les

    solutions proposes sont compltes par une discussion sur dautres mthodes ou des

    amliorations de celles en usage, en dgagent le raffinement du contrle de lexpression gnique

    (section 2) et des techniques de reproduction (section 3). Pour de l'information sur les mthodes

    d'identification, les pratiques exemplaires actuelles pour l'obtention de matriel gntique et les

    possibilits de raffinements pour le gnotypage, consulter Solutions de rechange pour le

    gnotypage des animaux modifis par gnie gntique (en prparation).

    1. Techniques de production danimaux modifis par gnie gntique

    1.1 Injection pronuclaire

    Linjection pronuclaire est utilise pour produire des animaux qui expriment les squences de

    gnes sous le contrle d'un promoteur htrologue. Le promoteur et les squences de gnes

    peuvent provenir dune mme espce ou d'espces diffrentes. Il sagit dune technique courante

    dans les tudes sur les effets dune surexpression ou dune mauvaise expression de certaines

    squences gntiques. Toutefois, les transgnes qui expriment des constructions dites ngatives

    (Levin et coll., 1993, Inoue et coll., 2010) ou les ARN interfrents (petit ARNi, microARN,

    ARNi) (Casola, 2010) peuvent tre utiliss pour produire des knock-out chez les organismes ne

    pouvant faire lobjet dune mutagense cible, comme solution de rechange cette approche

    pour affecter le fonctionnement des complexes multiprotiques ou comme technique de

    mutagense conditionnelle lorsque combin des recombinaisons diriges ou autres

    technologies.

    Proccupations pour le bien-tre animal

    Comme les transgnes sintgrent de faon alatoire dans le chromosome, leur expression peut varier en fonction du site d'insertion (effet de position) ou provoquer une mutagense

    insertionnelle lors dune insertion dans des gnes natifs. Cela peut affecter la survie des

    embryons injects ou avoir des effets imprvus sur le bien-tre des animaux produits

    (Robinson et coll., 2003; Kirkwood et Hubrecht, 2010).

    1 Ce document de meilleures pratiques a t rdig par un comit, dirig par le CCPA, qui a particip llaboration

    des lignes directrices sur les animaux modifis par gnie gntique.

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    De multiples lignes fondatrices sont ncessaires pour un contrle efficace des effets de position et de mutagense insertionnelle, ce qui augmente le nombre d'animaux ncessaires

    (notamment pour la comparaison de plusieurs promoteurs ou de squences exprimes).

    Certains sites d'intgration peuvent entraner l'chec de l'expression ou de la transmission ultrieure du transgne, ce qui signifie que les animaux utiliss ont t gaspills (Robinson et

    coll., 2003).

    Pour produire relativement peu d'animaux possdant les niveaux et les profils d'expression dsirs du transgne, il faut un assez grand nombre dembryons (Robinson et coll., 2003).

    Un grand nombre de donneuses et de receveuses dembryons peut tre ncessaire (Robinson et coll., 2003).

    Considrations exprimentales

    Le taux de succs varie d'un animal l'autre. Cette mthode est actuellement inefficace chez les mdakas, les xnopus et les poulets, o l'ADN tranger ne peut gnralement pas

    s'intgrer dans le gnome de lanimal (Houdebine, 2002).

    L'expression transgnique peut steindre aprs plusieurs gnrations en raison dun silenage pigntique du promoteur du transgne.

    Possibilits de raffinement

    Les mthodes suivantes peuvent aider rsoudre les problmes lis l'intgration alatoire du

    transgne : la transgense cible dans des cellules souches embryonnaires (section 1.2), le

    transfert de gnes par mdiation virale (section 1.3), les chromosomes artificiels bactriens

    (BAC) transgniques (section 1.4) et la transgense cible au moyen de nuclases doigts de

    zinc (ZFN) ou de nuclases effectrices de type activateur de transcription (TALEN) (section 1.5),

    ainsi que des possibilits de raffinement comme les procds dexpression transgnique

    inductible et conditionnelle (sections 2.1 et 2.2), l'utilisation d'isolateurs (section 2.3) et la

    slection rigoureuse des promoteurs (section 2.4).

    Dautres techniques peuvent galement traiter de problmes lis au bien-tre des animaux utiliss

    pour la production danimaux modifis par gnie gntique, comme le transfert non chirurgical

    dembryon (NSET) (section 3.1) et le transfert de gnes par des spermatozodes (section 3.2).

    De plus, il convient de tenir compte de certaines variables pouvant tre lies la conception et

    prparation dune construction ainsi que de l'expression et la transmission du transgne lors du

    recours l'injection pronuclaire. Les variables en question sont dcrites par Robinson et coll.

    (2003).

    Pour rduire le risque de perte de lexpression du transgne aprs plusieurs gnrations, des

    sujets de la premire gnration de transgniques devraient tre cryoconservs. Il est alors

    possible de rcuprer la ligne en cas de perte d'expression du transgne, sans devoir la crer de

    nouveau. Toute ligne fondatrice supplmentaire non slectionne pour une utilisation

    exprimentale devrait galement tre cryoconserve; il est inutile de la reproduire sur plusieurs

    gnrations.

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    1.2 Transgense cible et mutagense dans des cellules souches embryonnaires

    1.2.1 Transgense cible

    Le ciblage dsigne l'insertion ou la dltion de squences d'ADN gnomique un endroit prcis.

    Il se pratique le plus souvent par recombinaison homologue dans les cellules souches

    embryonnaires de souris. Cependant, lingnierie par nuclases diriges a permis le ciblage dans

    des cellules souches embryonnaires de souris (Osiak et coll., 2011) et dans les embryons de

    divers animaux, dont les rats, les lapins et les poissons-zbres (Ben et coll., 2011; De Souza,

    2012; Duranthon et coll., 2012; Jacob et coll., 2010) (section 1.5). Les recombinases (p. ex. Cre

    et FLP) et les intgrases (p. ex. PhiC31) site spcifique sont galement utilises pour le ciblage

    dans les cellules souches embryonnaires et les embryons (Lister, 2011; Monetti et coll., 2011;

    Osterwalder et coll., 2010; Tasic et coll., 2011). Ces mthodes permettant une transgense cible