SORANA TEODORA MATEI REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT ... · martor de 15 vaci sănătoase, de vârste şi rase diferite. Parametri biochimici efectuaţi şi metodele de analiză sunt

______________________________________________________________

Cluj-Napoca

2011

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE

ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ

CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ

Facultatea de Medicină Veterinară

SORANA TEODORA MATEI

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

DIAGNOSTICUL MAMITELOR

SUBCLINICE LA VACĂ PRIN METODE

DE LABORATOR

Conducător ştiinţific,

Prof. Univ. Dr. IOAN GROZA

„Diagnosticul mamitelor subclinice la vacă prin metode de laborator”

TEZĂ DE DOCTORAT

I

INTRODUCERE

Mamitele subclinice continuă să reprezinte cele mai importante afecţiuni ale

glandei mamare la vacă, cu implicaţii zooeconomice datorită pierderilor mari în producţia

de lapte şi riscul care îl reprezintă laptele infectat pentru sănătatea publică (Tylernw J. şi

Cullor S.J., 2002). Deşi s-au înregistrat progrese importante în controlul şi terapia

mamitelor subclinice, totuşi s-a constatat că rezultatele acestor afecţiuni sunt

suboptimale, frecvenţa acestor afecţiuni fiind în unele efective de animale la nivele

superioare, ceea ce are o influenţă negativă asupra parametrilor de producţie şi implicit

asupra indicilor economici în fermele de vaci cu lapte (dos Santos Nacimento şi col.,

2005).

În acest context, abordarea problemelor ce privesc mamitele subclinice la vaci este

oportună, deoarece cota de participare a României în cadrul pieţei comunitare se va

menţine doar prin creşterea calităţii laptelui care este o necesitate pentru crescătorii de

taurine, producătorii de lapte şi economia românească în general, iar în acest fel se va

putea obţine un lapte conform standardelor Uniunii Europene, care se va putea vinde la

un preţ avantajos. În consecinţă cea mai importantă cale de a produce un lapte de bună

calitate, constă în menţinerea situaţiei mamitelor subclinice sub un control foarte strict

(Krzysztof Urbanek, 2008).

CERCETĂRI PROPRII

SCOPUL CERCETĂRILOR

Dată fiind importanţa acestor afecţiuni, prezenta teză de doctorat îsi propune un

studiu al mamitelor subclinice la vaci privind diagnosticul, epidemiologia şi

repercusiunile stresului oxidative indus de aceste afecţiuni asupra calitaţii laptelui,

obiectivele abordate fiind următoarele:

diagnosticul mamitelor subclinice la vaci, studiul epidemiologic precum şi

implementarea unui program computerizat de supraveghere a sănătăţii glandei mamare;

metode de laborator utilizate în monitorizarea parametrilor stresului oxidativ cu

aplicabilitate în diagnosticul mamitelor subclinice la vaci; studiul modificărilor induse de mamitele subclinice la nivelui compuşilor lipofili ai

laptelui şi impactul asupra calitaţii acestuia.

DIAGNOSTICUL ŞI STUDIUL EPIDEMIOLOGIC AL

MAMITELOR SUBCLINICE LA VACI

SCOPUL CERCETĂRII

Având în vedere incidenţa tot mai crescută a mamitelor subclinice la vaci datorită

tehnologiei de muls, încă precare în fermele din Romania, considerăm ca fiind necesare

cercetări suplimentare în ceea ce priveşte aceste afecţiuni. În consens cu acestea,

obiectivele capitolului se referă la precizarea diagnosticului mamitelor subclinice la vaci

şi studiul epidemiologic care priveşte rolul factorilor extrinseci şi intrinseci ce pot

interveni în producerea mamitelor subclinice ca elemente de risc.


TEZĂ DE DOCTORAT

II

Cercetările noastre au în vedere actualitatea conform căreia cantitatea şi calitatea

laptelui este de o importanţă deosebită pentru crescătorii, producătorii şi consumatorii de

lapte. Rolul şi importanţa acestui subiect se reflectă asupra implementării unor metode de

control şi dirijare a funcţionării glandei mamare la vaci dar şi asupra unor activităţi legate

de producţie şi reproducţie.

MATERIAL ŞI METODĂ

Cercetările au fost efectuate în perioada 2008–2009 în cadrul a 2 ferme din judeţul

Cluj (Ferma A Şi Ferma B), pe un număr total de 1224 de vaci în lactaţie de rase şi vârste

diferite.

S-au colectat date referitoare la şeptelul de bovine, date privind factorii intrinseci

şi extrinseci care pot interveni ca factori de risc în producerea mamitelor subclinice.

Diagnosticul s-a pus pe baza examenelor efectuat cu indicatorul de mamite Waikato,

metoda R-mastitest, hârtia indicatoare Bovi-vet şi programul AfiFarm.

Dintre factorii extrinseci s-au analizat datele referitoare la condiţiile de întreţinere

din adăposturi şi padocuri, condiţiile de furajare, tehnologia de muls, regimul de

dezinfecţie, acţiuni sanitare veterinare efectuate. În cazul factorilor intrinseci s-a făcut o

analiză detaliată a incidenţei mamitelor în relaţie cu rasele de vaci, sezon, vârsta

animalelor, stadiul lactaţiei, producţia de lapte şi numărul sferturilor afectate în relaţie cu

poziţia anatomică a acestora, respectiv drept anterior, drept posterior, stâng anterior şi

stâng posterior.

REZULTATE ŞI DISCUŢII

În urma diagnosticului de mamite subclinice, efectuat prin metoda Waikato la

Ferma A, au fost depistate în anul 2008 un număr de 56 de vaci, media incidenţei lunară

fiind de 3,45%, iar în anul 2009, media incidenţei luneare a acestor afecţiuni a fost mai

scăzută de 3,27% (51 de vaci), iar la nivelul Fermei B, în urma supravegherii activităţii

glandei mamare prin programul computerizat AfiFarm, au fost diagnosticate în anul 2008

un număr de 25 de vaci din totalul de 485 de vaci aflate în lactaţie, media incidenţei

lunare fiind de 0,42% şi 19 vaci din totalul de 470 de vaci cu o medie lunară de 0,33% în

anul 2009. Cele mai mari valori înregistrate în urma studiului epidemiologic efectuat în

funcţie de factorii intrinseci analizaţi ce pot interveni ca factori de risc în producerea

mamitelor subclinice sunt prezentate în tabelul 1:

Tabel 1

Valorile maxime obţinute în urma studiului epidemiologic

Factori

intrinseci

ANUL 2008 ANUL 2009

Ferma A Ferma B Ferma A Ferma B

Sezon Iunie – August

(4,37% - 5,83%)

Iunie – August

(0,82%-1,23%)

Iunie – August

(4,54% - 6,06%)

Iunie – August

(0,53% - 0,85%)

Rasă M2 (55,35%) - M2 (50,98%) -

Vârstă 4-6 ani (62,50%) 4-6 ani (56,00%) 4-6 ani (56,86%) 4-6 ani(73,68%)

Nr. lactaţii lactaţia 4 (46,42%) lactaţia 4 (48,00%) lactaţia 4 (49,01%) lactaţia 4 (42,10%)

Producţie

lapte >15 l/zi (69,63%) >15 l/zi (72,00%) >15 l/zi (58,82%) >15 l/zi (78,94%)

Sferturi Sferturi posterioare

(69,63%)

Sferturi posterioare

(76,00%)


(58,82%)


(84,21%)


TEZĂ DE DOCTORAT

III

METODE DE LABORATOR FOLOSITE ÎN MONITORIZAREA

PARAMETRILOR STERSULUI OXIDATIV CU APLICABILITATE ÎN

DIAGNOSTICUL MAMITELOR SUBCLINICE LA VACI

SCOPUL CERCETĂRII

Numeroase studii, mai ales pe laptele de vacă, au arătat faptul că modificarea

numărului de celule somatice este în legătură cu modificările care apar în compoziţia

laptelui, această legătură având cel puţin două explicaţii: lezionarea celulelor mamare

care reduce sinteza constituenţilor laptelui în glanda mamară şi modificarea

permeabilităţii membranelor şi spaţiilor interstiţiale care amplifică pasajul unor

componenţi din sânge în lapte.

Scopul acestui capitol îl constituie evidenţierea unor indicatori biochimici ai

stresului oxidativ în lapte provenit de la vaci diagnosticate cu mamite subclinice.

principalele obiective ale acestui capitol fiind:

efectuarea profilului metabolic;

determinarea numarului de celule somatice şi a parametrilor fizico-chimici;

examenul microbiologic;

dozarea proteinelor totale, proteinelor solubile şi cazeinelor din lapte;

determinarea profilului de proteine prin electroforeză monodimensională şi

bidimensională;

determinarea aminoacizilor liberi din lapte;

determinarea statusului antioxidant total din sânge şi lapte;

determinarea nivelului de oxidare al lipidelor şi proteinelor din lapte;

determinarea activităţii antioxidante enzimatice în sânge şi lapte.


Cercetările au fost efectuate pe parcursul a 3 ani, în perioada 2009 - 2011, în

cadrul Fermei A şi Fermei B. Analizele biochimice au fost efectuate în cadrul Clinicii de

Reproducţie, Obstetrică şi Ginecologie Veterinară în colaborare cu Disciplina de

Biochimie şi Microbiologie a Facultăţii de Medicină Veterinară din Cluj-Napoca,

Facultatea de Fizică Cluj-Napoca precum şi cu Institutului National de Cercetări

Agronomice INRA Jouy en Josas – Paris, Franţa. În vederea realizării obiectivelor acestui

capitol, vacile luate în studiu au fost împărţite în 3 loturi experimentale. Astfel studiul s-

a efectuat pe un număr de 55 de vaci diagnosticate cu mamite subclinice şi pe un lot

martor de 15 vaci sănătoase, de vârste şi rase diferite. Parametri biochimici efectuaţi şi

metodele de analiză sunt prezentate în tabelul 2:


TEZĂ DE DOCTORAT

IV

Tabel 2

Parametri biochimici efectuaţi şi metodele de analiză

Nr.crt. Parametri determinaţi Metode de analiză

1. Profil metabolic Aparat automat Vet Scan

2. Numărul de celule somatice şi parametri fizico-chimici Aparat MT-04, EkoMilk ULTRA

3. Conţinut proteine totale, proteine solubile şi cazeine Metodă fotometrică, reactive Bradford

4. Profil proteic prin electroforeză mono şi bidimenională Dispozitiv BioRad Model-MiniProtean 3 Cell

Dispozitiv Amersham Biosciences Ehan Dalt Six

5. Aminoacizi liberi Tehnica gazcromatografica cu spectrometrie de masă

6. Statusul antioxidant Kituri de analiză de tip Randox TAS

7. Activităţii antioxidante enzimatice

Catalaza - metodă fotometric; kitul CAYMAN

SOD - metodă fotometrică; kit RANSOD

GPx - metodă fotometric; kit de tip RANSEL

LpX - metodă cinetică, spectrofotometrică

8. Nivelul de oxidare al lipidelor şi proteinelor Metodă spectrofotometrică-acid tiobarbituric

Metodă spectrofotometrică-reacţia cu DNPH


În cazul profilului metabolic efectuat, menţionăm faptul că în afară de media

proteinelor totale şi a globulinelor, valorile obtinute s-au încadrat în limitele fizologice

prezentatea în datele de literatură. Datorită acumulării globulinelor din sângele vacilor cu

mamite subclinice, apare o creştere a ptoteinelor totale din sânge, media fiind cuprinsa

între 10,23 g/dl şi 9,14 g/dl in cazul vacilor cu mamite subclinice şi între 7,20 g/dl

respectiv 7,50 g/dl în cazul vacilor sănătoase. Aceste creşteri indică activarea răspunsului

imun datorită infecţiei de la nivelul glandei mamare, proteinele fiind implicate direct în

mecanismul de apărare al acesteia.

Rezultatele determinărilor numărului de celule somatice şi a

parametrilor fizico-chimici

Diagnosticul mamitelor subclinice a fost confirmat şi de numărul mare de celule

somatice din laptele mamitic respectiv modificarea ph-ului şi a punctului de îngheţ faţă

de limitele fiziologice.Rezultatele ne-au indicat o creşterea numărului de celule somatice

la vacile cu mamite subclinice peste norma admisă (<400.000. cel/ml.) media fiind între

740.120 NCS/ml şi 1.077.273 NCS/ml (grafic 1). În ceea ce priveşte pH-ul, acesta a fost

alcalin cu o maximă de 7,55, iar punctul de îngheţ cu o medie între -0,590 şi – 0,630

(grafic 2, 3).

Grafic 1 - Media numărului de celule somatice din lapte


TEZĂ DE DOCTORAT

V

Grafic 2 - Media punctului de îngheţ din lapte Grafic 3 - Media pH-ului din lapte

Rezultatele examenului microbiologic

În urma prelucrării microbiologice a probelor de lapte s-au putut izola

microorganisme din toate probele obţinându-se 9 specii diferite, din care 7 specii

bacteriene şi 2 tipuri de ciuperci. Speciile bacteriene predominante au fost

Staphylococcus intermedius (45,45%), Streptococcus agalactiae (31,81%) şi Bacillus

cereus (27,27%).

Rezultatele determinării statusului antioxidant din lapte şi

a nivelului de oxidare lipidică

În cazul analizelor bochimice efectuate s-a observat faptul că activitatea

antioxidantă totală a laptelui scade în probele de lapte mamitice comparativ cu cele

normale. Astfel în probele de lapte normal valorile s-au încadrat între 10,30 µmoli/ml şi

11,92 µmoli/ml în timp ce în probele de lapte mamitice media s-a încadrat între 7,75

µmoli/ml şi 8,43 µmoli/ml (grafic 4). Aceste scăderi sunt direct proporţionale degradare

oxidativă a lipidelor. Aşa cum se observă şi din graficul 5, în mamite nivelul de

peroxidare creşte semnificativ. În laptele recoltate de la vaci sănătoase, concentraţia

malonil-dialdehidei (MDA), indice al peroxidării lipidice, a prezentat valori medii

cuprinse între 14,54 nmoli/ml şi 16,84 nmoli/ml, în timp ce în laptele mamitic media

MDA a fost între 38,53 nmoli/ml şi 49,97 nmoli/ml. Mai mult nivelul de peroxidare

lipidică este corelat cu creşterea numărului de celule somatice (grafic 6).

Grafic 4 - Activitatea antioxidanta totală din lapte

Grafic 5 - Variaţia concentraţiei MDA în lapte


TEZĂ DE DOCTORAT

VI

Grafic 6 - Variaţia concentraţiei MDA şi NCS în lapte

Rezultatele determinării nivelului de oxidare a proteinelor din lapte

În cazul probelor de lapte mamitic, în toate experimentele efectuate, media

concentraţiei proteinelor oxidative a fost mult mai crescută comparativ cu media

înregistrată în cazul vacilor sănătoase, valorile având o medie de aproximativ 12

µmoli/mg la vacile sănătoase şi 19 µmoli/mg în cazul vacilor cu mamite subclinice. Mai

mult există o strânsă legătură între peroxidarea lipidelor şi a proteinelor. Aşa cum se

observă din graficul 7, intensificarea proceselor de peroxidare lipidică duce la o creştere a

proceselor de degradare oxidativă a proteinelor.

Grafic 7 - Intensificarea proceselor de peroxidare lipidică concomitent cu

creşterea concentraţiei proteinelor oxidative

Rezultatele determinării activităţii antioxidante enzimatice din lapte

În ceea ce priveşte determinarea activităţii antioxidante enzimatice, o primă

enzimă determină în lapte a fost lactoperoxidaza (LPx). Această a prezentat creşteri

semnificative în laptele mamitic de la valori medii de 3 U/ml în laptele normal, la cu 5

U/ml în laptele mamitic (grafic 8). Mai mult un număr ridicat de celule somatice în

laptele mamitic este corelat cu o activitate ridicată a lactoperoxidazei (grafic 9).


TEZĂ DE DOCTORAT

VII

Grafic 8 - Variaţia LPx în lapte

Grafic 9 - Corelaţia dintre LPx şi NCS

Rezultatele determinării activităţii antioxidante enzimatice din lapte şi sânge

Pentru toate perioadele luate în studiu, superoxid-dismutaza (SOD), nu şi-a

modificat semnificativ activitatea nici la nivel sanguin nici în lapte (grafic 10).

Activitatea catalazei spre deosebire de SOD, a prezentat creşteri uşoare în ambele medii

studiate, media activităţii catalazice fiind de aproximativ 1,45 U atât în lapte cât şi în

sângele vacilor sănătoase şi o medie de 2 U în probele prelevate de la vaci cu mamite

subclinice (grafic 11).

Grafic 10 - Media SOD din lapte şi sânge

Grafic 11- Media catalazei din lapte şi sânge

Spre deosebire de enzimele prezentate anterior, glutation-peroxidaza (GPx) creşte

semnificativ în laptele mamitic, atingând valori medii de 60 U, comparativ cu media

obţinută în laptele normal de 23 U (grafic 12).

Grafic 12 - Activitatea GPx din lapte


TEZĂ DE DOCTORAT

VIII

Am emis astfel 3 ipoteze care ar putea explica această variaţie a activităţii

glutation-peroxidazei:

1-creşterea activităţii acestei enzime în lapte se datorează unei creşterii a

concentraţiei/activităţii la nivel sanguin;

2-în lapte enzima este esociată cu cazeinele, iar procese intensive ale hidrolizării

cazeinelor ar duce la eliberarea acesteia şi deci la creşterea activităţii;

3-enzima poate fi produsă de agenţii patogeni.

Prima ipoteză nu a fost confirmată prin datele de laborator obţinute. Aşa cum se

observă şi din graficul 13, ezima nu îşi modifică activitatea la nivel sanguine valorile

fiind apropiate, având o medie atât în sângele vacilor cu mamite cât şi în sângele vacilor

sănătoase de aproximativ 104 U/g Hb.

Cea de a doua ipoteză, pleacă de la modul în care există această enzimă în lapte,

într-o combinaţie legată de cazeine. Rezulatele obţinute au arătat faptul că în laptele

mamitic nu apar modificări semnificative în conţinutul de protein totale, dar se modifică

raportul dintre cazeine şi proteinele solubile. Din graficul 14 se observă scăderi în

cantitatea de cazeine concomitant cu creşterea conţinutului de proteine din lactoser.

Grafic 13 - Activitatea GPx în lapte şi sânge

Grafic 14 - Variaţia concentraţiei proteinelor

din lactoser şi a cazeinelor

Modificările apărute în profilul proteic al laptelui, au fost evidenţiate şi prin

tehnici de electroforeză. Principalele proteine identificate au fost: lactoferina, BSA-

albumina serică bovină, imunoglobulinele, -cazeina, -cazeina, k-cazeina, -

lactoglobulina şi -lactalbumina. În cazul laptelui normal se observă din figura 1, benzi

intense corespunzătoare cazeinelor, benzi ce scad în intensitate în cazul laptelui mamitic.

Concomitent se observă benzi difuze în regiunea intermediară dintre cazeine şi -

lactoglobulină, zonă ce corespunde produşilor de hidroliză a cazeinelor.

Intensificarea proceselor de hidroliză a cazeinelor, este direct corelată cu numărul

de celule somatice prezente în lapte şi bacteriile patogene. În cazul probelor de lapte

mamitic, intensitatea benzilor din regiunea intermediară este mai mare în cazul celor cu

un număr mai mare de celule somatice („zona b”) comparativ cu cele cu un număr redus

(„zona c”). Intensitatea hidrolizei este dependentă de tipul de agent patogen implicat în

infecţie. Astfel daca se compară zonele b şi d (fig. 2), se observă faptul că numărul de

celule somatice este similar în probe, dar profilul proteic este mult diferit. Astfel proba

corespunzătoare „zonei b” este mai intens hidrolizată la nivelul cazeinelor, în această


TEZĂ DE DOCTORAT

IX

probă fiind identificată specia Staphylococcus intermedius. Proba corespunzătoare „zonei

d”, în care hidroliza cazeinelor este mai redusă conţine germeni patogeni din specia

Streptococcus agalactiae. Pentru a evidenţia modificările apărute la nivelul proteinelor

din lactoser, am efectuat o analiză electroforetică bidimensională. Prin această analiză am

urmărit profilul proteinelor prezente în lapte de origine sanguină şi anume BSA şi Ig.

Astfel în cazul probelor de lapte mamitic se observă apariţia unor zone intense în cazul

albuminei serice bovine (BSA) şi a imunoglobulinelor în special cele cu catenă lungă

(fig. 3).

Fig. 1 - Proteinele majore identificate

în lapte

Fig. 2 - Corelaţie între profilul de

proteine şi NCS

Figura 3 - Gelurile bidimensionale 2D-PAGE obţinute la separarea proteinelor din lactoser

Rezultatele variaţiei conţinutului de aminoacizi în lapte

În ceea ce priveste conţinutul în aminoacizi totali, acesta creşte semnificativ în laptele

mamitic comparativ cu cel normal. Astfel că pentru toate probele analizate, valorile au

fost de peste 20 de ori mai mari, mediile fiind cuprinse între 12.073 mg/ml şi 10.861

mg/ml în laptele mamitic respectiv 553 mg/ml şi 622 mg/ml în laptele normal.Aceste date

confirmă rezultatele obţinute în analiza profilului de proteine din lapte, creşterea

conţinutului de aminoacizi datorându-se proceselor proteolitice ce apar la nivelul

cazeinelor în mamitele subclinice. Aşa cum reiese din graficul 15, apar variaţii între

diversele tipuri de aminoacizi.


TEZĂ DE DOCTORAT

X

Grafic 15 - Variaţia conţinutului procentual de aminoacizi în lapte

Cea de a treia ipoteză emisă, se bazează pe mecanismul de acţiune al bacteriilor

patogene care se pot adapta stresului oxidativ prin activarea enzimei glutation-

peroxidază. Studiul statistic ralizat a arătat că există o corelaţie directă între activitatea

glutation-peroxidazei şi creşterea numărului total de germeni (tabel 4).

Tabel 4

Corelarea între activitate enzimei GPx din lapte, numărul de celule somatice, CFU

şi concentraţie cazeinelor din laptele mamitic

Corelare Pearson “r” IC 95% “p” R2

Activitate

GPx

U.mL-1

SCC/mL-1

0,0191 -0,6534 - 0,6748 0,9610 0,00036

CFU/mL-1

0,1785 -0,5511 - 0,7534 0,6459 0,03187

Caseins/mg.mL-1

-0,2606 -0,7884 – 0,4881 0,4983 0,06790

STUDIUL MODIFICĂRILOR INDUSE DE MAMITELE SUBCLINICE LA

NIVELUL COMPUŞILOR LIPOFILI AI LAPTELUI ŞI IMPACTUL ASUPRA

CALITĂŢII ACESTUIA

SCOPUL CERCETĂRII

Plecând de la importanţa nutriţională a compuşilor lipofili prezenţi în lapte, în

cadrul acestui capitol am urmărit evidenţierea modificările induse de mamitele subclinice

în concentraţia vitaminelor liposolubile prezente în lapte, în profilul de acizi graşi şi în

concentraţia colesterolului. Astfel, au fost urmărite etapele generale:

dozarea provitaminelor A din lapte (β-carotină, Carotenoide totale);

dozarea vitaminelor liposolubile din lapte (A - α-retinol şi E - α-tocoferol);

determinarea profilului de acizi graşi din lapte;

dozarea colesterolului total din lapte;

evidenţierea unor corelaţii dintre acestea şi înfluenţa lor în diagnosticul mamitelor

subclinice şi a calităţii laptelui.


TEZĂ DE DOCTORAT

XI


Cercetările au fost efectuate pe parcursul a trei ani, în perioada 2009 – 2011, pe

probe de lapte mamitic şi sănătos recoltat de la vaci din cadrul Fermei A şi Fermei B.

Analizele biochimice au fost efectuate în cadrul Disciplinei de Reproducţie,

Obstetrică şi Ginecologie Veterinară respectiv Disciplina de Biochimie a Facultăţii de

Medicină Veterinară din Cluj-Napoca. Parametri analizaţi precum şi metodele folosite

sunt prezentate în tabelul 5:

Tabel 5

Parametri biochimici efectuaţi şi metodele de analiză Nr.

crt. Parametri determinaţi Metode de analiză

1. Determinarea vitaminelor

antioxidante din lapte

Cromatografie în fază lichidă de înaltă performanţă - HPLC

►sistem de pompe Shimadzu LC-20 AT

► detector cu fotodiodă SPD-M20A cu softul de prelucrare a datelor

► injector Rheodyne cu buclă de 20 μl

► coloană Hibar 250-4 Lichrosorb RP18 column (5 μm), 25 cm x 4.6 mm

► faza mobilă - acetonitril: metanol (85:15, izocratic)

2. Determinarea acizilor graşi

şi a colesterolului din lapte

Cromatografia în faza gazoasă

Gaz-Cromatograf Shimadzu GC-2010 cu detector FID;


Rezultatele dozării provitaminei A din lapte

În studiile efectuate de noi am observat modificări în concentraţia vitaminelor şi

provitaminelor antioxidante din lapte. În cazul provitaminelor β-caroten şi carotenoide

totale, valorile au fost sub limita de detecţie.

Rezultatele dozării vitaminei A şi E din lapte

În ceea ce priveste rezultatele dozării vitaminelor liposolubile din lapte, se observă

din graficul 16, că în toate cele trei experimente efectuate atât în cazul α-retinolului cât şi

a α-tocoferolului, valorile au fost mai scăzute la vacile cu mamite subclinice faţă de

vacile sănătose, cu o medie de 13 µg/ml în ceea ce priveste α-retinolul în laptele mamitic

şi 17 µg/ml în laptele sănătos respectiv 50 µg/ml în cazul α-tocoferolului din laptele

mamitic şi 63 µg/ml în laptele normal. Scăderea concentraţiei acestor vitamine poate fi

explicată tocmai prin exercitarea funcţiei lor antioxidante.

Grafic 16- Variaţia concentraţiei α-retinolului şi α-tocoferolului din lapte


TEZĂ DE DOCTORAT

XII

Rezultatele determinării profilului de acizi graşi şi colesterol din lapte

Analiza comparativă a datelor obţinute în analiza acizilor graşi, relevă faptul că în

probele de lapte mamitic creşte proporţia de acizii graşi în special acid stearic, cu o medie

de aproximativ 65% comparativ cu 57% în laptele normal, concomitent cu o scădere a

acizilor graşi nesaturaţi (grafic 17). Scăderea concentraţiei acizilor graşi nesaturaţi, se

explică prin faptul că principalul substrat al peroxidării lipidice îl constituie dublele

legături prezente în aceşti acizi.

În ceea ce priveşte dozarea colesterolului, în laptele mamitic, conţinutul

acestuia scade uneori chiar şi sub limita de detecţie. Valorile medii din laptele normal au

fost cuprinse între 10,84 mg/100 ml şi 11,20 mg/100 ml lapte, fiind în concordanţă cu

datele prezentate de literatura de specialitate, iar în laptele mamitic între 6,28 mg/100 ml

şi 7,28 mg/100 ml lapte (grafic 18). Scăderea concentraţiei colesterolului în laptele

mamitic nu este un semn pozitiv, deoarece scăderea semnalului corespunzător

colesterolului, uneori sub limita de detecţie, este însoţită de apariţia unui nou semnal, care

corespunde produşilor de oxidare ai colesterolului. Studii recente au demonstrat faptul că

aceşti produşi de oxidare sunt nocivi pentru organismul animal şi uman.

Grafic 17 - Variaţia claselor de acizi

graşi din lapte

Grafic 18 - Media concentraţiei colesterolului

din probele de lapte


TEZĂ DE DOCTORAT

XIII

CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI PRACTICE

În urma cercetărilor efectuate în stagiul de pregătire al tezei de doctorat, pot fi

formulate următoarele concluzii generale şi recomandări:

1. supravegherea epidemiologică a mamitelor constituie o componentă majoră a

programelor de control şi combatere a acestor afecţiuni. Studiul epidemiologic aplicat

la nivelul celor două ferme luate în studiu ne-a permis să concluzionăm faptul că

tehnologia de exploatare a vacilor, tehnologia de muls precum şi sistemul de prevenire

a afecţiunilor glandei mamare sunt foarte importante:

● diagnosticul mamitelor subclinice la nivelul celor două ferme luate în studiu, ne-a

permis identificare prin metoda Waikato la ferma A, unui număr de 56 de vaci, media

incidenţei lunare fiind de 3,45% în anul 2008, iar în anul 2009 a unui număr de 51 de

vaci, cu o media a incidenţei lunare de 3,27%, iar prin monitorizarea sănătăţii glandei

mamare cu ajutorul programului Afifarm la ferma B, în perioada 2008-2009, incidenţa

lunară a fost de 0,42% (25 vaci) în anul 2008 respectiv 0,33% (19 vaci) în anul 2009;

● datorită programul AfiFarm, cel mai avansat soft pe plan mondial pentru gestiunea

fermelor de vaci de lapte, putem spune că diagnosticul mamitelor subclinice se pune cu

mult mai mare uşurinţă în condiţiile în care se corelează activitatea dinamică a femelei,

cantitatea de lapte, timpul de muls precum şi conductibilitatea electrică a laptelui;

2. studiul epidemiologic efectuat pe durata a 2 ani, în cadru celor două ferme, a

demonstrat faptul că incidenţa mamitelor subclinice este dependentă de diverşi factori

intrinseci cum ar fi: sezon; rasa şi vârsta animalelor; stadiul lactaţiei şi parametri

productivi ai glandei mamare precum şi poziţia anatomică a sferturilor:

● din punct de vedere a evoluţiei temporale putem spune că există o distribuţie

variabilă de la o lună la alta, incidenţa cea mai mare a fost înregistrată la nivelul ambelor

ferme în lunile de vară (iunie – august) cu valori medii cuprinse între 4,37% şi 6,06% la

Ferma A, respectiv 0,63% şi 1,23% la Ferma B, la polul opus fiind situate lunile din

sezonul rece (octombrie – ianuarie), cu valori cuprinse între 1,45% şi 2,91% la Ferma A,

respectiv 0,00% şi 0,41% la Ferma B;

● procentul cel mai mare a mamitelor subclinice a fost evidenţiat în cazul vacilor din

rasa metis Bălţată românească cu Holstein Friză (55,35 - 2008; 50,98 - 2009), iar cea mai

mică incidenţă au prezentat-o vacile din rasa din rasa Bălţată Românească (14,28% - 2008;

21,56% - 2009);

● analizând frecvenţa mamitelor subclinice la vaci în raport cu vârsta, la nivelul

ambelor ferme incidenţa cea mai mare pe perioada cercetărilor a fost întâlnită la vacile

încadrate în categoria 4-6 ani (62,50%; 56,85% - Ferma A; 56,00%; 73,68% - Ferma B),

iar cea mai mică la vacile sub 3 ani (12,50%; 17,64% - Ferma A; 12,00%; 5,26% - Ferma

B);

● studiul epidemiologic al mamitelor subclinice la vaci efectuat în raport cu stadiul

lactaţiei a arătat că apariţia acestor afecţiuni este direct proporţională cu numărul de

lactaţii, astfel că în ambele perioade studiate la cele două ferme, frecvenţa cea mai mare a

fost înregistrată la vacile aflate în a 4-a lactaţie (46,42%; 49,01% - Ferma A; 48,00%;

42,10% - Ferma B) iar cea mai mică incidenţă a fost înregistrată la vacile aflate la prima

lactaţie (8,92%; 11,76% - Ferma A; 12,00%; 10,52% - Ferma B);


TEZĂ DE DOCTORAT

XIV

● au fost evidenţiate corelaţii directe între producţia de lapte şi incidenţa mamitelor

subclinice. Astfel, atât în anul 2008 cât şi în anul 2009 incidenţa cea mai mare a fost

înregistrată la vacile cu producţii mai mari de 15 l/zi (69,63%; 58,82% -Ferma A;

72,00%; 78,94% - Ferma B);

● analiza globală a rezultatelor obţinute pe perioada de monitorizare, referitoare la

sferturile afectate în funcţie de poziţionarea anatomică a acestora, a arătat că frecvenţa

cea mai mare o prezintă vacile cu sferturile posterioare afectate (69,63%; 58,82% -Ferma

A; 76,00%; 84,21% - Ferma B), în timp ce în cazul sferturilor anterioare frecvenţa este

mult mai mică (30,35%; 41,17% - Ferma A; 24,00%; 15,78% - Ferma B);

3. s-a efectuat un studiu biochimic complex prin care s-a urmărit evidenţierea

unor indicatori biochimici ai stresului oxidativ în lapte provenit de la vaci

diagnosticate cu mamite subclinie, indicatori ce pot fi utilizaţi în laborator pentru

diagnosticarea mamitelor încă în faza subclinică:

● rezultatele parametrilor metabolici efectuaţi au relevat valori fiziologice atat în cazul

vacilor sănătoase cât şi în cazul vacilor cu mamite subclinice, cu excepţia proteinelor

totale şi a globulinelor:

- media proteinelor totale (9,14 g/dl-E1; 10,23 g/dl-E2; 9,20 g/dl-E3) şi a globulinelor

(5,76 g/dl-E1; 5,44 g/dl-E2; 5,80 g/dl g/dl-E3) în cazul vacilor cu mamite subclinice a

fost mult mai crescută comparativ cu media proteinelor totale (7,50 g/dl-E1; 7,20 g/dl-E2;

7,60 g/dl-E3) şi a globulinelor (3,95 g/dl-E1; 4,10 g/dl-E2; 3,78 g/dl-E3) din sangele

vacilor sănătoase;

● determinarea numărului de celule somatice din lapte a scos în evidenţă depăşirea

limitelor acestora în probele mamitice şi valori normale la probele prelevate de la vaci

sănătoase, animalele considerate sănătoase au prezentat valori ale SCC cuprinse între

120 şi 300 SCCx10-3

mL- în timp ce limitele numărului de celule somatice în cazul

vacilor cu mamite subclinice au fost cuprinse între 500 şi 1.500 SCCx10-3

mL-;

● determinarea parametrilor fizico-chimici din laptele mamitic cu ajutorul aparatului

Ekomilk Ultra a evidenţiat, la toate cazurile, modificarea în deosebi a valorilor pH-ului şi

a punctului de îngheţ în cazul probelor mamitice. În toate probele de lapte mamitic

analizate media punctului de îngheţ a fost mai scăzută cuprinsă între -0,6300C, iar pH-ul a

prezentat valori cu mult peste limitele normale admise (6,5-6,7 la 20 0C), fiind situat în

domeniul alcalin cu o medie de 7,55;

● examenul microbiologic al probelor de lapte mamitic a arătat existenţa în laptele

mamitic a unui număr de 7 specii bacteriene şi 2 tipuri de ciuperci. Speciile bacteriene

predominante au fost Staphylococcus intermedius (45,45%), Streptococcus agalactiae

(31,81%) şi Bacillus cereus (27,27);

● concentraţia şi profilul proteinelor specifice laptelui se modifică în cazul mamitelor

subclinice:

- în cazul proteinelor totale pentru laptele recoltat de la vacile sănătoase valorile s-au

încadrat în limitele date de literatura de specialitate (30,52 mg/ml-E1; 30,45 mg/ml-E2;

30,43 mg/ml-E3). În cazul laptelui mamitic, concentraţia în proteine totale (29,61 mg/ml-

E1; 29,88 mg/ml-E2; 30,04 mg/ml-E3), nu s-a modificat semnificativ comparativ cu

laptele normal în schimb apar variaţii importante în cazul proteinelor solubile şi a

cazeinelor;


TEZĂ DE DOCTORAT

XV

- în probele de lapte provenit de la vaci diagnosticate cu mamite sublinice apare o

creştere a concentraţiei proteinelor solubile (proteinele din lactoser) (12,03 mg/ml-E1;

12,43 mg/ml-E2; 12,22 mg/ml-E3) faţă de probele de lapte normal (8,08 mg/ml-E1; 8,02

mg/ml-E2; 8,11 mg/ml-E3) concomitent cu scăderea concentraţiei în cazeine în (lapte

mamitic: 16,57 mg/ml-E1; 16,69 mg/ml-E2; 17,12 mg/ml-E3; lapte normal: 22,42

mg/ml-E1; 22,39 mg/ml-E2; 23,11 mg/ml-E3);

-în cazul laptelui mamitic s-au observat scăderi ale concentraţiei cazeinelor

concomitent cu creşterea concentraţiei proteinelor solubile de origine sanguină, în cazul

albuminei serice bovine şi a imunoglobulinelor. Aceste variaţii apărute în profilul proteic

sunt direct corelate cu numărul de celule somatice prezente în lapte şi numărul total de

germeni respectiv tipul de patogen care a determinat infecţia;

- patogenii implicaţi în infecţie eliberează enzime proteolitice cu specificitate diferită

faţă de cazeine (ceea ce explică hidroliza lor diferită) iar organismal reacţionează la

aceste infecţii printr-un răspuns imun similar (fapt ce explică prezenţa în cantităţi similare

a lactoferinei, BSA şi imunoglobulinelor);

- intensificarea proceselor hidrolitice la nivelul cazeinelor laptelui (fapt demonstrat prin

scăderea concentraţiei cazeinelor, substratul preferat al proteazelor eliberate de agenţii

patogeni implicaţi în infecţiile glandei mamare) determină creşterea accentuată a

conţinutului în aminoacizi liberi în laptele mamitic (12.073,06 µg/ml-E1; 11.150,37

µg/ml-E2; 10.861,74 µg/ml-E3) comparativ cu cel normal (619,82 µg/ml-E1; 553,97

µg/ml-E2; 622,45 µg/ml-E3), pentru toate probele analizate, valorile fiind de peste 20 de

ori mai mari ca urmare a proceselor proteolitice ce apar la nivelul cazeinelor;

● activitatea antioxidantă totală a laptelui a prezentat modificări semnificative, în cazul

probelor mamitice comparativ cu cele normale. Laptele provenit de la vaci cu mamite

subclinice prezintă o activitate antioxidantă scăzută (8,43 µmol/mL-E1; 7,75 µmol/mL-

E2; 8,28 µmol/mL-E3) faţă de laptele normal (10,39 µmol/mL-E1; 11,92 µmol/mL-E2;

11,24 µmol/mL-E3) ceea ce duce la acumularea speciilor reactive de oxigen şi instalarea

stresului oxidativ, fiind observată o corelaţie corelaţie directă între nivelul statusului

antioxidant (8,43 µmol/mL-E1; 7,75 µmol/mL-E2; 8,28 µmol/mL-E3) şi severitatea

infecţiei respectiv numărul de celule somatice prezente în lapte (1077,273 SCCx10-3

mL-

- E1; 900,875 SCCx10-3

mL- - E2; 740,120 SCCx10

-3 mL

- - E3);

● stresul oxidativ apărut la nivelul glandei mamare infectate şi a laptelui provenit de la

vaci cu mamite subclinice a fost demonstrat prin creşterea concentraţiei produşilor de

degradare oxidativă a lipidelor şi proteinelor laptelui:

- concentraţia malonildialdehidei, indice al peroxidării lipidice a fost mult crescută în

probele de lapte mamitic (48,97 nmoli/ml-E1; 43,89 nmoli/ml-E2; 38,53 nmoli/ml-E3)

comparativ cu cel normal (16,84 nmoli/ml-E1; 15,60 nmoli/ml-E2; 14,54 nmoli/ml-E3);

- s-a demonstrat faptul că pentru toate probele de lapte prelevat de la vaci cu mamite

subclinice, intensificarea proceselor de peroxidare lipidică duce la o creştere a

concentraţiei proteinelor carbonilate (lapte mamitic-19,16 µmoli/mg-E1;19,06 µmoli/mg-

E2; 18,93 µmoli/mg-E3; lapte normal: 12,17 µmoli/mg-E1; 12,32 µmoli/mg-E2; 12,14

µmoli/mg-E3), deci la o creştere a gradului de degradare oxidativă a proteinelor;

● la vacile cu mamite subclinice apar variaţii diferite în activitatea enzimelor

antioxidante prezente la nivel sanguin şi în lapte:


TEZĂ DE DOCTORAT

XVI

- în cazul catalazei (lapte mamitic: 2,12 U/ml-E1; 2,09 U/ml-E2; 2,07 U/ml-E3; lapte

normal: 1,55 U/ml-E1; 1,56 U/ml-E2; 1,45 U/ml-E3) şi superoxid-dismutazei (lapte

mamitic: 1,065 U/ml-E1; 1,066 U/ml-E2; 1,050 U/ml-E3; lapte normal: 1,044 U/ml-E1;

1,041 U/ml-E2; 1,036 U/ml-E3), s-au observat creşteri uşoare în laptele provenit de la

vaci cu mamite comparativ cu vacile sănătoase, activitatea acestor enzime nefiind

corelată cu creşterea numărului de celule somatice din lapte;

- în cazul mamitelor subclinice nivelul lactoperoxidazei creşte în laptele de vacă

(5,30 U/ml-E1; 5,28 U/ml-E2; 5,21 U/ml-E3) comparativ cu laptele provenit de la

vacile sănătoase (3,23 U/ml-E1; 3,25 U/ml-E2; 3,16 U/ml-E3) fiind astfel stabilită o

corelaţie directă între creşterea lactoperoxidazei şi creşterea numărului de celule

somatice din probele de lapte;

● s-a evidenţiat o creştere semnificativă a activităţii glutation-peroxidazei din laptele

mamitic (60,37 U/ml-E1; 60,32 U/ml-E2; 60,14 U/ml-E3), valorile înregistrate fiind

semnificativ statistic crescute comparativ cu laptele normal (23,09 U/ml-E1; 23,02 U/ml-

E2; 22,94 U/ml-E3), în schimb ce în sânge nu prezintă modificări în ceea ce priveşte

laptele mamitic sau laptele sănătos:

- creşterea activităţii enzimei în laptele mamitic este statistic corelat cu numărul de

celule şi numărul total de germeni; creşterea activităţii enzimatice a fost explicată, în

primul rând prin hidroliza complexului cazeine-enzimă, care conduce la eliberarea acestei

enzime şi, pe de altă parte, mecanismele de apărare antioxidante specifice agenţilor

patogeni;

4. în urma studiul ce a urmărit modificările induse de mamitele subclinice la

vaci la nivelul compuşilor lipofili ai laptelui şi impactul asupra calităţii acestuia putem

concluziona următoarele:

● concentraţia provitaminelor şi vitaminelor liposolubile antioxidante studiate, prezintă

scăderi semnificative în laptele provenit de la vaci diagnosticate cu mamite în fază

subclinică comparativ cu cele sănătoase. Β-carotinele şi carotinoidele totale, au fost sub

limita de detecţie iar concentraţia vitaminelor liposolubile antioxidante studiate (retinol:

13,87 µg/100ml-E1; 12,97 µg/100ml-E2; 13,45 µg/100ml-E3 şi tocoferol: 50,27

µg/100ml-E1; 50,45 µg/100ml-E2; 49,86 µg/100ml-E3) prezintă scăderi semnificative în

laptele provenit de la vaci diagnosticate cu mamite în fază subclinică comparativ cu cele

sănătoase (retinol: 17,26 µg/100ml-E1; 17,63 µg/100ml-E2; 17,32 µg/100ml-E3 şi

tocoferol: 63,60 µg/100ml-E1; 64,11 µg/100ml-E2; 63,70 µg/100ml-E3). Scăderea

vitaminelor este explicată tocmai prin exercitarea funcţiei lor antioxidante;

● studiul comparativ al profilului de acizi graşi în lapte mamitic şi normal a relevat

faptul că laptele mamitic conţine proporţii mai ridicate din acizii graşi saturaţi cu catenă

scurtă C10 – C14, şi de acid stearic (66,85%-E1; 61,00%-E2; 67,85%-E3 ) comparativ cu

laptele normal (60,60%-E1; 56,60%-E2; 59,64%-E3), în schimb am putut remarca o

proporţie mai mică de acizi nesaturaţi;

● mamitele subclinice determină apariţia unor modificări calitative şi cantitative la

nivelul colesterolului total prezent în lapte. În laptele mamitic apare o scădere a

concentraţiei colesterolului total (6,28 mg/100 ml-E1; 6,87 mg/100 ml-E2; 7,28 mg/100

ml-E3), concomitent cu apariţia produşilor de oxidare ai colesterolului.


TEZĂ DE DOCTORAT

XVII

RECOMANDĂRI

Având în vedere faptul că laptele de calitate bună (număr mic de celule somatice

şi număr total de germeni) are un preţ de livrare mai bun, decât cel în care aceste

elemente sunt în cantitate mare, diagnosticul precoce al mamitelor subclinice trebuie

să reprezinte o prioritate pentru fiecare fermier, prevenţia apariţiei mamitelor clinice

ducând la evitarea pierderilor economice cauzate de costurile terapeutice ale acestor

afecţiuni primare. Supravegherea activităţii de reproducţie şi implicit a performanţei

glandei mamare presupune folosirea unui program cât mai eficient, lucru care duce la

creşterea duratei de exploatare a vacilor de lapte, a performanţelor acestora cu preţuri

de cost mai scăzute. Aceste aspecte prezentate în corelaţie cu rezultatele obţinute în

urma cercetărilor epidemiologice efectuate de noi, ne permite să recomandăm

implementarea unui nou program performant de supravegere a sănătăţii glandei

mamare, cum ar fi programul Afifarm, în toate fermele din Romania.

Studiul biochimic a demonstrat faptul că, încă în faza subclinică, infecţiile

mamitice determină apariţia stării de stres oxidativ. Aceasta se manifestă atât la nivelul

sângelui cât şi în laptele secretat de glanda mamară infectată. Până la ora actuală

datele din literatura de specialitate propun trei parametri ai stresului oxidativ ce pot fi

aplicaţi în laboratoare pentru diagnosticarea mamitelor subclinice la vaci:

lactoperoxidaza şi catalaza (din categoria enzimelor antioxidante) respectiv nivelul de

peroxidare al lipidelor. Toţi aceşti indici sunt în legătură directă cu creşterea

numărului de celule somatice din lapte. Rezultatele obţinute în studiul de faţă le

considerăm de interes, deoarece am reuşit stabilirea unor noi corelaţii între activitatea

enzimei glutation-peroxidază şi numărul de celule somatice în laptele recoltat de la

vacile cu mamite subclinice (până în la ora actuală nu au fost identificate date de

literatură care să prezinte aceste corelaţii). Mai mult, prin analizele suplimentare

efectuate (analize microbiologice respectiv determinarea profilului de proteine din

lapte) am demonstrat mecanismele care determină creşterea activităţii acestei enzime

în lapte.

Astfel, în urma cercetărilor efectuate considerăm că, din punct de vedere al

stresului oxidativ, au fost identificaţi doi indici noi care pe viitor ar putea fi utilizaţi în

laboratoare pentru un diagnostic precoce al mamitelor subclinice la vaci – activitatea

glutation-peroxidazei şi concentraţia proteinelor carbonilate.

Analizele efectuate au demonstrat faptul că, din punct de vedere al calităţii,

laptele provenit de la vaci cu infecţii subclinice prezintă modificări drastice, cu impact

asupra valorii nutriţionale a acestuia. Astfel, creşterea numărului de celule somatice

din lapte determină scăderi accentuate ale concentraţiei provitaminelor A şi a

vitaminelor liposolubile A şi E precum şi a nivelului de acizi graşi esenţiali, toate

aceste componente fiind factori nutriţionali esenţiali pentru creştere şi metabolism la

om şi animale.

De asemenea, din punct de vedere toxicologic, consumarea unor alimente ce

conţin produşi de oxidare ai acizilor graşi şi colesterolui (deci şi lapte provenit de la

vaci cu mamite subclinice, ce ajunge frecvent în alimentaţie) trebuie evitat. Astfel de

compuşi pot avea efecte negative, ei fiind consideraţi citotoxici şi chiar mutageni.

Documents

SORANA TEODORA MATEI REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT ... · martor de 15 vaci sănătoase, de vârste şi rase diferite. Parametri biochimici efectuaţi şi metodele de analiză sunt