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République Algérienne Démocratique et Populaireي ـــــــــمــلــعــث الــحــبــي و الــالــعــم الــیــلــعــتــــوزارة ال
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherches Scientifique
التأھیل الجامعي و البحث العلمينیابة مدیریة الجامعة للتكوین العالي في ما بعد التدرج وVice rectorat de la formation supérieure de post-graduation, de l’habilitation universitaire et
de la recherche scientifique
FACULTE DES SCIENCESDEPARTEMENT DE BIOLOGIELABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE APPLIQUEE
THESEPrésentée par : Mohammed Salih BARKA
Pour obtenir le Diplôme de Doctorat
Spécialité : Microbiologie
Intitulé
Recherche et Caractérisation d’Escherichia coliEntérohémorragique O157:H7 dans les viandes
bovines importées en Algérie
Devant le jury composé de :
Henni Jamal Eddine Professeur Université d’Oran Président
Kihal Mebrouk Professeur Université d’Oran Directeur de thèse
Moussa-Boudjema Boumediene Professeur Université de Tlemcen Examinateur
Abdelwahed Djamel Eddine Professeur Université de Tlemcen Examinateur
Benlahcène Kheira Maitre de Conférences A Université d’Oran Examinateur
Hassaine Hafeda Maitre de Conférences A Université de Tlemcen Examinateur
ANNEE UNIVERSITAIRE : 2011-2012
I
Remerciements
A Monsieur le Professeur KIHAL MEBROUK, mon Directeur de thèse.J’ai eu le privilège de bénéficier de ses conseils précieux, de son écoute permanente et surtoutde sa patience. Nous sommes reconnaissants de la confiance qu’il nous a accordée et desdiscussions enrichissantes que nous avons eues. Nous tenons à lui assurer toute notreadmiration et notre amitié.
A Monsieur le Professeur HENNI Jamal. Nous sommes très sensibles à l’honneur qu’ilnous a fait en acceptant la présidence de notre jury de thèse. Qu’il reçoive ici le témoignagede notre profonde reconnaissance.
A Monsieur le Professeur MOUSSA-BOUDJEMA Boumediene.Nous le remercions, d’avoir accepté de juger ce travail. Nous sommes reconnaissants pourl’intérêt qu’il a porté à ce travail, nous le remerciant aussi pour les corrections qu’il à apportéà ce travail et nous tenons à lui assurer tout notre respect et toute notre amitié.
A Monsieur le Professeur ABDELWAHAD Djamel Eddine. Nous le remercions d’avoiraccepté de juger ce travail. Qu’il trouve ici l’expression de notre respectueuse gratitude.
A Madame Hassaine Hafeda. Nous la remercions, d’avoir accepté de participer à ce jury.Qu’elle reçoive ici le témoignage de notre profonde amitié
A Madame BENLAHCENE Kheira. Nous sommes reconnaissants de l’honneur et du plaisirqu’elle nous a fait en participant au jury de notre thèse. Qu’elle reçoive ici nos sincèresremerciements.
Que chacun d’entre vous soit ici vivement remercié de m’avoir faitl’honneur d’accepter de participer à ce jury et le plaisir d’assister àma soutenance. Recevez ici, l’expression de notre respectueusegratitude pour l’attention et l’intérêt que vous avez portés à cetravail.
II
Je tiens à remercier chaleureusement Boudilmi Benabdallah pour son soutien et pour tous lesmoments privilégiés que l’on a passés.
Un grand merci à Khatib et à toute l’équipe du Laboratoire Vétérinaire Régional deTlemcen, pour leur aide et leur soutien durant la réalisation de ce travail.
Je remercie infiniment le Docteur Curmi Patrick qui à permis la réalisation de la partiebiologie moléculaire, ainsi que Vandana Joshi et toute l’équipe du Laboratoire Structure etactivité des biomolécules normales et pathologiques.
J’adresse mes plus sincères remerciements à mes amis Noureddine, Khalifa et Abdeljelilpour leur soutien permanent, leur bonne humeur et tous les fous rires et les moments fabuleuxque l’on a partagés. Un grand, grand Merci.
Une pensée particulière pour…
Mes Parents, sans qui, je n’en serai pas là aujourd’hui. Merci pour tout leur amour et leursoutien depuis toujours. Ils ont su me donner toutes les chances pour réussir. Qu’ils trouvent,dans la réalisation de ce travail, l’aboutissement de leurs efforts ainsi que l’expression de maplus affectueuse gratitude. Je vous dédie ce mémoire en guise de remerciement et dereconnaissance pour votre soutien constant et votre présence à mes côtés.
Ma femme Naima, celle qui partage ma vie, mes doutes et mes joies.
Ma mes sœurs Zahira et Wafa, pour leur soutien et toute la complicité qui nous unit.
A mon frère Noureddine, et ses deux enfants, à qui je souhaite une réussite sans faille.
A la mémoire de mes grands-parents, qui m’ont inculqué les valeurs de la vie.
A mon oncle Mohammed.
Toute ma famille et tous mes amis qui me sont chers…
III
Table des matièresRésumé VIAbsract VIIملخص VIIIListe des figures IXListe de tableaux X
Introduction 1
Synthèse bibliographique 41- Données générales sur Escherichia coli 5
1-1-Taxonomie et définitions 51-1-1Caractères généraux 51-1-2 L’espèce Escherichia coli 6
1-1-2-1 Habitat 61-1-3 Les différents pathovars d’E. coli 7
1-1-3-1 E. coli entéropathogène (EPEC) 71-1-3-2 E. coli entéro-toxinogènes (ETEC) 71-1-3-3 E. coli entérohémorragiques (EHEC) 71-1-3-4 E. coli entéro-aggrégatifs (EAggEC) 71-1-3-5 E. coli à adhérence diffuse (DAEC) 81-1-3-6 E. coli entéro-invasifs (EIEC) 8
1-2-Les sources d’Escherichia coli O157:H7 91-2-1 Portage et excrétion de E. coli O157:H7 chez les bovins 10
1-2-2-1 viande bovine 101-2-2-2 lait et produits laitiers 111-2-2-3 Végétaux 121-2-2-4 Eau 121-2-2-5 Transmission inter-humaine 12
1-2-2 Dans l’environnement 121-3- Pathologie des infections humaines liées aux EHEC 12
1-3-1 Forme asymptomatique et diarrhée non hémorragique 121-3-2 Colite hémorragique 121-3-3 Syndrome hémolytique et urémique 141-3-4 Purpura thrombotique thrombocytopénique 141-3-5 Autres aspects cliniques 151-3-6 Les pathologies animales à STEC 15
2- Facteurs de virulence, pouvoir pathogène des STEC 152-1- Facteurs de virulence des EHEC 15
2-1-1 Les Shiga-like toxines 152-1-2 Les facteurs d’adhésion 16
2-1-2-1 Lésions d’attachement-effacement 162-1-3 Les entérohémolysines 18
2-2- Les éléments mobiles de pathogénicité 182-2-1- Ilots de pathogénicité 182-2-2- Plasmides 192-2-3- Bactériophages 19
3- Données sur l’élevage en Algérie 203-1 L’importation de la viande congelée en chiffres 20
IV
4- Interactions E. coli O157:H7, bactéries lactiques 224-1 Rappel sur les bactéries lactiques 22
4-2 Classification et mécanismes d’action des bactériocines 22
4-2-1 Classe I 224-2-2 Classe II 224-2-3 Classe III 224-2-4 Classe IV 23
4-3 Applications des bactériocines dans l’industrie alimentaire 235- Antibiorésistance 23
5-1 Définition rapide des additifs alimentaires antibiotiques 235-2 Utilisation des antibiotiques en élevage 235-3 Risques liés aux antibiotiques 24
5-3-1 Risques pour la santé animale et humaine 255-3-1-1 Bactéries résistantes 25
5-4 Principales pathologies microbiennes bovines rencontrées en Algérie 265-5 Principaux antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire en Algérie 26
5-5-1 Antibiotiques utilisés à titre curatif 265-5-2 Antibiotiques utilisés comme facteurs de croissance 27
Matériels et méthodes 281- Recherche de E. coli O157:H7 dans la viande. 29
1-1 Echantillonnage 291-2 Isolement des E. coli 291-3 Méthodes phénotypiques 30
1-3-1 Enrichissement 301-3-2 Isolement sur milieu Mac Conkey sorbitol 301-3-3 Recherche de la β-glucuronidase 30
1-4 Utilisation des propriétés biochimiques d’E. coli O157:H7 311-5 Utilisation Tests immunologiques d’E. coli O157:H7 32
2- Etude des caractéristiques biochimiques des E. coli O157:H7 322-1 Température 322-2 pH 322-3 Activité de l’eau «(AW) 322-4 Recherche du pouvoir hémolytique 33
3- Interactions avec les bactéries lactiques 333-1 Bactéries lactiques utilisées 333-2 Technique utilisée 33
4- Etude de l’antibiorésistance 334-1 Technique utilisée 334-2 Lecture 34
5- Méthodes génétiques de la détection des E. coli O157:H7 345-1 Détection des gènes spécifiques du sérotype E. coli O157:H7 35
5-1-1 stx1 et stx2 365-1-2 eae 365-1-3 ehx 36
5-2 Recherche des plasmides 365-3 Séquençage 38
Résultats 39
V
1- Recherche de E. coli O157:H7 dans la viande. 402- Etude des caractéristiques biochimiques des E. coli O157 :H7 423- Interactions d’E. coli avec les bactéries lactiques 454- Etude de l’antibiorésistance 465- Méthodes génétiques de la détection des E. coli O157:H7 47
Discussion 531-Les protocoles de recherche de E. coli O157:H7 dans la viande. 542-Etude des caractéristiques biochimiques des E. coli O157 :H7 553-Interactions avec les bactéries lactiques 554-Etude de l’antibiorésistance 565-Méthodes génétiques de la détection des E. coli O157:H7 56
Discussion générale 58
Conclusion 61
Perspectives 63
Références bibliographiques 65
Annexes 80
VI
RésuméLes Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) sont responsables de toxi– infections
alimentaires conduisant à des colites hémorragiques pouvant se compliquer d’un syndrome
hémolytique et urémique. Cependant, il n’existe aujourd’hui aucune réglementation officielle
stipulant les procédures à suivre pour l’échantillonnage et la recherche des STEC dans les
denrées alimentaires.
Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à la recherche des E. coli O157:H7
producteurs de Shiga-toxines (STEC) dans la viande surgelée d’importation. Après
enrichissement et utilisation d’agents sélectifs qui ont pour but de freiner la croissance de la
flore annexe, nous avons pu isoler 5 souches à partir de viandes provenant de différents pays.
Ces souches présentées les caractéristiques principales des E. coli O157 :H7, à savoir la non
fermentation du sorbitol et β-Dglucuronidase négative.
La caractérisation génétique à révélée la présence de gènes de toxicité stx1 et stx2
responsables du pouvoir pathogène de ces bactéries par la production de toxines ainsi que les
gènes eae et ehxA spécifiques pour les E. coli O157 :H7.
L’étude de la résistance des souches isolées aux antibiotiques à révélée qu’elles sont sensibles
aux antibiotiques testés.
Enfin l’interaction avec les bactéries lactiques, à montrée que toutes les souches isolées ont
été inhibées par la production de bactériocines.
Mots clés : E. coli O157 :H7, viandes surgelées, stx1, stx2, interactions bactéries lactiques,
résistance aux antibiotiques.
VII
AbstractThe enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are responsible for food poisoning leading to
hemorrhagic colitis may be complicated by hemolytic uremic syndrome. However, there are
currently no government regulations stipulating the procedures for sampling and retrieval of
STEC in food.
In this study, we were interested to find the E. coli O157: H7 Shiga toxin-producing (STEC)
in frozen meat import. After enrichment and use of selective agents that aim to curb the
growth of flora appendix, we have isolated five strains from meat from different countries.
These strains presented the main characteristics of E. coli O157: H7, namely non sorbitol
fermentation and β-Dglucuronidase negative.
Genetic characterization revealed the presence of toxic genes stx1 and stx2 responsible for
pathogenicity of these bacteria through the production of toxins and genes eae and ehxA
specific for E. coli O157: H7.
The study of resistance of isolates to antibiotics revealed that they are sensitive to the
antibioticstested.
Finally the interaction with lactic acid bacteria, shown to all strains were inhibited by the
production of bacteriocins.
Keywords: E. coli O157: H7, frozen meat, stx1, stx2, lactic acid bacteria interactions,
antibiotic resistance.
VIII
ملخص
enterohemorrhagicكوالي إن اشیریشیا (EHEC) المؤدي النزیفيالتھاب القولونالغذائي الذي یؤدي إلىالتسمممسؤولة عن
ألخذ الحكومةإجراءاتتنص علىأي لوائح، ال یوجد حالیا مع ذلك(SHU).الیوریميالى بعض التعقیدات منھا انحالل الدم
.في الغذاءSTECالبحث عن العینات و
O157كوالي اشیریشیا في ھذه الدراسة ،كان إھتمامنا البحث على : H7شیغالسموم الالمنتجة(STEC)المجمدة في اللحوم
سالالتخمسةعزل، قمنا بة بھااطالبكتریة المحنموللحد منالتي تھدفاالنتقائیةاستخدام العوامل وعملیة التكاثر بعد. المستوردة
O157كواليشیریشیا الخصائص الرئیسیة المن.من دول مختلفةةدل اللحوم المستورمن خال : H7 السوربیتول تخمیر، عدم
. β-Dglucuronidaseوعدم إحتوائھا على أنزیم
اجمن خالل إنتو ذالك المسؤولة عنقدرة العدوى لھذه البكتیریاالسامةstx2و stx1وجود جیناتبالجینيالتوصیفكشف
7O157كوالياشیریشیا الخاصة ب ehxAوeaeوكذا الجیناتالسموم : H .
.التي تم اختبارھامضادات الحیویة حساسة للأنھابللمضادات الحیویة كشفتمقاومةالدراسةإن
طة إنتاج البكتریوسین جمیع السالالت المعزولة قد تم توقیف نموھا بواستبین أن اللبنیك بكتیریا حمضالتفاعل معدراسة وأخیرا
)bacteriocins.(
O157كوالي اشیریشیا :الكلمات المفتاحیة : H7 المجمدة ،، اللحومstx1 ،stx2 ،المقاومة ، حمض الالكتیكبكتیریاتفاعالت
.للمضادات الحیویة
IX
Liste des figuresFigure 1 Principales étapes du processus infectieux des EHEC 13
Figure 2 Lésions d’attachement-effacement induites par une souche E. coliO157:H7 sur des cellules rectales de mouton
17
Figure 3 Schéma d’isolement et de caractérisation des souches basé sur laméthode ISO 16654:2001, modifiée.
31
Figure 4 Photo montrant l’aspect des colonies sorbitol négatif sur SMAC 40
Figure 5 Photo des différents chimiotypes E. coli O157 :H7 isolées 41
Figure 6 Graphique représentant l’influence du pH sur la croissance des E. coliO157 :H7
43
Figure 7 Graphique représentant l’influence de l’Aw sur la croissance des E.coli O157 :H7
43
Figure 8 Graphique représentant la croissance en fonction du temps dans lesconditions optimales.
44
Figure 9 Recherche du pouvoir hémolytique par ensemencement des E. coliO157 :H7 en spot sur gélose au sang frais
44
Figure 10 Photo montrant les interactions des bactéries lactiques avec lessouches 26 et 28
45
Figure 11 Electrophorèse sur gel d’agarose montrant le profil plasmidique 47
Figure 12 Recherche du gène stx1 par amplification génique (PCR) 49
Figure 13 Recherche du gène stx2 par amplification génique (PCR) 49
Figure 14 Recherche du gène eae par amplification génique (PCR) 50
Figure 15 Recherche du gène ehxA par amplification génique (PCR) 50
X
Liste de tableauxTableau 1 Affections associées aux pathotypes d’E. coli responsables de
diarrhées chez l’homme9
Tableau 2 Fréquences observées de produits contaminés par des STEC. 11
Tableau 3 Fréquences observées de laits et fromages contaminés par des STEC. 11
Tableau 4 Génotype stx des STEC et leur fréquence relative parmi les isolatscliniques de patients atteints de SHU et de diarrhées
16
Tableau 5 Evolution du cheptel bovin en Algérie entre 2002 – 2009 20
Tableau 6 Production de viandes rouges en Algérie (tonnes). 20
Tableau 7 Importation de la Viande et abats comestibles en kilogramme 21
Tableau 8 Importation viandes bovines en Algérie (tonnes). 21
Tableau 9 Antibiotiques utilisés à but thérapeutique en élevage bovin en Algérie 26
Tableau10 Nombre de prélèvements en fonction de leur pays d’importation. 29
Tableau 11 Diminution de l’activité de l’eau par le NaCl 32
Tableau 12 Oligonucléotides utilisés en PCR pour l’amplification des gènes. 35
Tableau 13 Concentrations des solutions utilisées en pcr pour tous lesoligonucléotides.
36
Tableau 14 Nombre et pourcentage des E.coli O157 :H7 détecté par pays 40
Tableau 15 Caractères phénotypiques, biochimiques et sérologiques des E. coliO157 :H7, ainsi que de la souche 29 E. coli non O157 :H7
41
Tableau 16 Récapitulatif des diamètres des zones d’inhibition 46
Tableau 17 Gènes détectés chez les différentes souches E. coli O157 :H7 48
Tableau 18 Résultats des souches séquencées. 51
Tableau 19 croissance des souches isolées à différentes températures 84
Tableau 20 croissance des souches isolées à différents pH 84
Tableau 21 croissance des souches isolées à différentes concentrations de NaCl 85
Tableau 22 Valeurs critiques des diamètres des zones d’inhibition pour lesEntérobactéries (espèce ruminants)
85
XI
Tableau 23 Température, pH et Aw optimales pour les souches isolées. 86
Tableau 24 Croissance des souches isolées (mesure en mcfarland,0.5macfarland= 108 ufc/ml) à Température, pH et Aw optimales enfonction du temps (heures)
86
1
INTRODUCTION
2
A l’heure actuelle, les espèces d'Escherichia coli productrices de Shiga-toxines (STEC
ou VTEC selon l’ancienne dénomination) sont considérées comme des pathogènes émergents
importants en santé publique, notamment en raison des faibles doses infectieuses observées.
Depuis 1982, après la découverte des premiers cas aux Etats-Unis chez des personnes
ayant consommés des hamburgers insuffisamment cuits, elles ont été à l’origine de nombreux
cas d’infections humaines à travers le monde, essentiellement consécutives à la
consommation d’aliments contaminés (e.g. viande hachée, lait et fromages au lait cru,
légumes, etc.) par des STEC (Caprioli et al, 2005). Il existe très peu de données à ce sujet en
Afrique du Nord et particulièrement en Algérie. De ce fait, les premières recherches des
STEC O157 ont été mises en place au niveau de l’Institut Pasteur d’Alger avec l’étroite
collaboration du laboratoire national de référence en microbiologie des aliments de
l’Université de Liège (Chahed, 2006). L’objectif était d’établir l’existence de ces pathogènes
au niveau de l’abattoir principal produisant des carcasses de bœuf destinées à la
consommation humaine pour la population d’Alger et de ses environs.
Il existe néanmoins d’autres modes de transmission des infections à STEC à l’homme,
comme la transmission inter-humaine, le contact avec des animaux porteurs sains, ou bien
encore le contact avec des éléments du milieu extérieur souillés par des fèces (ex. eaux de
baignade, sols…).
L'infection à STEC peut revêtir plusieurs aspects dont le plus fréquent est la colite
hémorragique. Le tableau clinique peut cependant se compliquer d'un syndrome hémolytique
et urémique (SHU) parfois mortel, particulièrement chez l'enfant et le sujet âgé, ou d'un
purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) chez l’adulte. Les STEC et plus
particulièrement le sérotype O157:H7 représentent donc un danger potentiel pour la santé
publique, avec un impact important pour les industries agro-alimentaires. Or, en dépit des
différents éléments soulignés dans les lignes précédentes, il n’existe à l’heure actuelle aucune
réglementation officielle stipulant les procédures à suivre pour l’échantillonnage et la
recherche des STEC dans les denrées alimentaires. Ainsi, les divers protocoles de recherche
utilisés actuellement dans les industries et les laboratoires de diagnostiques varient
principalement, d’une part, en fonction des procédures d’échantillonnage mises en place dans
ces structures et, d’autre part, en fonction des protocoles d’enrichissement et méthodes de
détection employés (Vimont, 2007).
3
Il se pose alors la question de savoir si les principaux protocoles en vigueur permettent
de détecter de façon fiable le pathogène; ou bien si ceux-ci nécessitent une optimisation afin
de garantir une réelle sécurité des denrées commercialisées vis-à-vis des STEC.
Il paraissait donc important de disposer d’éléments de réponse concrets par rapport à cette
interrogation, de manière à pouvoir proposer ensuite aux industriels des recommandations
pertinentes de maîtrise de ce danger.
Avant d’exposer les résultats de notre étude, objet du mémoire expérimental, il convient de
replacer ce travail dans son contexte scientifique général, développé dans le mémoire
bibliographique.
La synthèse bibliographique est successivement consacrée à des rappels généraux sur
E. coli O157:H7, ainsi que sur les différentes propriétés de la viande surgelée; deux parties
requises pour mieux comprendre la troisième et dernière partie concernant les protocoles de
recherche d’E. coli O157:H7 dans les aliments « viande surgelée ».
Les étapes de notre étude sont les suivantes :
─ Recherche de E. coli O157:H7; au niveau de la viande surgelé d’importation;
─ Etudier les interactions avec les bactéries lactiques ;
─ Connaitre l’état de l’antibiorésistance des E. coli O157:H7 ;
─ Dresser un profil plasmidique;
─ Caractérisation des gènes stx1, stx2, eae et ehxA.
4
Synthèse bibliographique
5
1- Données générales sur Escherichia coli
1-1-Taxonomie et définitions
1-1-1 Caractères généraux
C’est en 1885 que la bactérie Escherichia coli est décrite pour la première fois dans
des selles de nourrissons, par l’Allemand Theodor Escherich. Toutefois, son nom actuel lui
est donné en 1919 par Castellani et Chambers (Grimont, 1987).
Le genre Escherichia appartient à la famille des Enterobacteriaceae, qui doit son nom
à leur isolement fréquent du tube digestif et/ou des fèces des mammifères (Greatorex
etThorne, 1994). Les entérobactéries sont une vaste famille de bactéries qui sont rencontrées
tous les jours en bactériologie médicale.
Le terme Entérobactériaceae vient de deux mots grecs : Enteron « intestin » et baktéron
« petit baton », il signifie bacille intestinaux. (Fauchére et al, 2002).
La famille des Entérobactéries se définit par les caractères suivants (Le Minor et al., 1990).:
- bacille à gram négatif (2 à 4 µ de long sur 0.4 à 0.6µ de large) ;
- immobiles ou mobiles grâce à des flagelles disposés de manière péritriche ;
- poussent sur milieu ordinaire ;
- aérobies-anaérobies facultatifs ;
- réduisent le nitrate en nitrite ;
- ont une réaction d’oxydase négative ;
- utilise le glucose par voie fermentative.
Le genre Escherichia regroupe cinq espèces : E. blattae, E. coli, E. fergusonii, E. hermanii et
E. vulneris. Il s’avère important de souligner que les membres d’une même espèce présentent
habituellement plus de 70% d’homologie génomique alors qu’entre espèces différentes,
l’homologie est inférieure à 60%. Chaque espèce d’Escherichia possède des caractéristiques
biochimiques spécifiques, permettant ainsi de les différencier
6
1-1-2 L’espèce Escherichia coli
Selon le Bergey’s Manual of systematic bacteriology l’espèce Escherichia coli appartient à
l’ordre des Enterobacteriales ; famille des Enterobacteriaceae ; et au genre Escherichia. Elle
est considérée comme un hôte normal de la microflore bactérienne du tractus digestif de
l’homme ainsi que de celle de nombreux animaux à sang chaud. Il représente près de 80% de
la microflore aérobie (Ghebru, 1988). A ce titre Escherichia coli, et plus largement les
coliformes thermotolérants, sont recherchés dans les aliments comme indicateurs de
contamination fécale; leur présence fournit ainsi une indication sur une éventuelle
contamination de l’aliment par des bactéries pathogènes d’origine digestive (e.g. Salmonella
thyphimurium, E. coli O157:H7…).
En outre, bien que la majorité des souches de E. coli soient commensales banales, certaines
d’entre elles sont pathogènes et connues des médecins comme étant à l’origine de pathologies
intestinales (Levine, 1987) ou extra-intestinales (Pohl, 1993).
1-1-2-1 Habitat :
Les entérobactéries sont présentes dans de nombreux écosystèmes, en particulier l'intestin qui
leur a donné son nom mais aussi dans l'environnement (eau, sol…). Elles peuvent être
saprophytes, commensales ou pathogènes. Le cas d'E. coli est typique puisque cette bactérie
est retrouvée dans les eaux souvent en provenance d'une contamination fécale, dans l’intestin
(Greatorex et Thorne, 1994).
Cependant, bien que la majorité des souches d’E. coli soient commensales, certaines d’entre
elles sont associées à des pathologies intestinales (Levine, 1987) ou extra-intestinales (Pohl et
al., 1989) très diverses chez l’homme. Comme la plupart des pathogènes des muqueuses, les
souches d’E. coli pathogènes utilisent une stratégie d'infection dont les points clés sont la
colonisation des muqueuses, éventuellement l’invasion des cellules, la multiplication,
l’évasion des défenses de l’hôte et les dommages à l’hôte. La détermination des combinaisons
de propriétés particulières associées à la virulence d’une souche, les modes d’infection et les
signes cliniques de l’infection, constitue un moyen de typage d’E. coli, que l’on désigne sous
le néologisme de pathotype ou pathovar. (Montet, 2009)
7
1-1-3 Les différents pathovars d’E. coli (Tableau 1) :
1-1-3-1 E. coli entéropathogène (EPEC) :
Ces souches étaient responsables, dans les années 50, de diarrhées infantiles graves ou
toxicoses survenant par épidémies dans des crèches ou des maternités. Ces souches encore
appelées E. coli G.E.I (des gastro-entérites infantiles) sont plus rarement rencontrées
aujourd’hui, elles sont alors isolées de cas sporadiques. (Andrade et al., 1989 ; Jerse et
al.,1990).
1-1-3-2 E. coli entéro-toxinogènes (ETEC) :
Leur pouvoir pathogène est du principalement à la sécrétion de toxines thermostables (ST)
et/ou thermolabiles (LT) (Kaper et al., 2004). Elles sont responsables de diarrhées très
liquides survenant dans les pays en développement. Ces diarrhées s’observent aussi chez les
voyageurs «Turista». Elles sont souvent épidémiques chez les enfants de ces pays (Levine,
1987).
1-1-3-3 E. coli entérohémorragiques (EHEC) :
Ces souches ont été décrites en Amérique du Nord, au Japon et en Europe. Elles sont
responsables d’épidémies de diarrhées aqueuses puis hémorragiques (colite hémorragique).
Elles appartiennent à quelques sérotypes particuliers (O157 :H7, mais aussi O103 :H2,
O26 :H11, O111 :H38). Les EHEC sont capables de produire une ou plusieurs cytotoxines
appelées verotoxines capables de tuer in vitro les cellules Vero (cellules rénales du singe vert
africain) par inhibition de la synthèse protéique. Les toxines sont appelées également Shiga-Like-
Toxin en raison de leurs similitudes avec la toxine de Shigella dysenteriae type 1. Deux types de
verotoxines existent STX1, STX2 avec plusieurs variants de STX2. STX2 serait mille fois plus
cytotoxique sur les cellules endothéliales rénales humaines que STX1. L’homologie entre STX1
et STX 2 varie de 50 à 60% avec des régions de faibles ou de très hautes homologies (Karmali,
1989). Ces souches sont aussi responsables de syndromes hémolytique-urémique (SHU) chez
l’enfant ou à un Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT) chez l’adulte (Riley et al.,
1983)
1-1-3-4 E. coli entéro-aggrégatifs (EAggEC) :
Les EAEC sont une catégorie de souches pathogènes associés, à des diarrhées aqueuses
pouvant évoluer vers des formes persistantes (Huang et al., 2006). Ils élaborent une
entérotoxine thermostable (EASTI) et une entérotoxine thermolabile (Kaper et al., 2004).
8
1-1-3-5 E. coli à adhérence diffuse (DAEC) :
Les DAEC sont une toute nouvelle catégorie de souches associées à des diarrhées aqueuses
aigues ou persistantes survenant surtout chez les enfants (plus particulièrement ceux âgés de 2
à 6 ans) (Garcia et al., 1996).
1-1-3-6 E. coli entero-invasifs ( EIEC) :
Les EIEC sont responsables de diarrhées aqueuses qui, dans de rares cas, vont évoluer vers
une dysenterie suggérant que leur pouvoir pathogène est similaire a celui des Shigella sp.
(Nataro et Kaper 1998).
La classification des STEC la plus utilisée par les microbiologistes est fondée en grande partie
sur les travaux de (Kauffman 1947 ; Fremaux, 2007) et se base sur la détermination :
De l’Antigène O ou somatique:
Cet antigène est localisé au niveau de la paroi bactérienne de nature lipopolysaccharidique, il
est en fait l'endotoxine bactérienne. A cet antigène O correspond une agglutination O. Il existe
environ 180 antigènes O différents. Au moyen d’immun sérum spécifique de ces antigènes O,
il est possible de classer sérologiquement les E. coli (Fauchère et al., 2002).
De l’Antigène K ou capsulaire :
De nature polysaccharidique, ils entourent les antigènes O et se présentent sous deux types de
structure :
- La première, capsulaire lorsqu’ils constituent une capsule visible au microscope.
- La seconde, d’enveloppe quand ils ne sont pas visibles au microscope et masquent les
antigènes somatiques, si bien qu’ils inhibent l’agglutinabilité O des bactéries par les sérums
de diagnostic des Escherichia coli préparés sur lapin.
Environ 80 antigènes K ou antigènes d'enveloppe différents ont été reconnus
De l’Antigène H ou flagellaire:
Il n'existe que chez les bactéries mobiles, donc pourvues de flagelle. A cet antigène H
correspond une agglutination H faite d'agglutinats floconneux, lâches et facilement dissociés
par agitation. Les bactéries sont agglutinées par leurs flagelles. On en connaît 56 types. Les
antigènes O, K, H sont à la base d’un schéma de diagnostic antigénique, notamment pour le
diagnostic différentiel, ils permettent d’établir le sérotype et de détecter les souches
d’Escherichia coli responsables de pathologies (Kauffman, 1947).
9
Tableau 1. Affections associées aux pathotypes d’E. coli responsables de diarrhées chezl’homme (Kaper et al., 2004 et Blanco et al., 2007).
a : [H] indique la présence de souches non mobiles.AAF : fimbriae d’adhérence aggrégative; Afa : adhésine afimbriales ; CFA : antigène facteur de colonisation ;CS : antigène de surface coli ; EAST-1 : E. coli enteroaggragative ST1 ; HPI : ilots de pathogénicité élevé; LEE: locus d’effacement des entérocytes ; LT : enterotoxine thermolabile ; PAI : ilots de pathogénicité ; ST :enterotoxine thermostable ; Stx : shiga-like toxines.
1-2-Les sources d’Escherichia coli O157:H7
Ce n’est qu’a partir de 1982 après que deux épidémies de colites hémorragiques dues à une
infection à E. coli O157:H7 aux Etats Unis dues à la consommation de hamburger qu’on
commencé a s’intéressé aux E. coli O157:H7 (Riley et al., 1983).
Les sources de E. coli O157 H7 sont avant tout les produits d’origine animale avec en premier
lieu les steaks hachés de bœufs insuffisamment cuit (MacDonald et al., 1988 ;Chapman et al.,
10
1993; Willshaw et al., 1993 ; Rodrigue et al., 1995 ; Cowden, 2001; Espié et Vaillant, 2003),
les produits laitiers (les fromages au lait cru) (Casenave et al., 1993; Morgan et al., 1993
Allerberger et al., 2001), les ovo-produits, mais également les produits d’origine végétale
(cidre artisanal de pommes, laitues, pomme de terre, pousse de radis…)( Morgan et al., 1988 ;
Ackers et al., 1998; Hilborn et al., 1999, Michino et al., 1999; Breuer et al., 2001) .
D’autres parts, le milieu extérieur représente une source importante, notamment par
l’intermédiaire de l’eau (baignades en lac ou en pataugeoires contaminées par des matières
fécales d’origine humaine, ou eau de boisson insuffisamment chlorées…). ( Keene et al.,
1994;; Cransberg et al., 1996; Ackman et al., 1997; Jackson et al., 1998 ; Paunio et al., 1999 ;
CDC, 2000).
1-2-1 Portage et excrétion de E. coli O157:H7 chez les bovins
Les bovins sont considérés comme étant les principaux réservoirs de souches STEC, en
particulier de souches STEC O157. La présence de STEC chez les bovins a été démontrée
dans le monde entier : Amérique (Etats-Unis, Brésil), Océanie (Australie), Asie (Japon, Inde),
Afrique (Ouganda) et Europe. Les données disponibles sont nombreuses et varient selon les
études et les sérotypes recherchés. Quant au seul sérogroupe O157, le pourcentage de bovins
porteurs varie entre 0,2% (France) (Pradel et al., 2000) et 16,6% (Italie) (Caprioli, 1999) avec
une moyenne de 4,1%.
1-2-2-1 Viandes bovinesE. coli O157:H7 et les autres STEC sont introduits dans la chaîne alimentaire par
l’intermédiaire de carcasses contaminées provenant elles-mêmes d’animaux porteurs (Tableau
2). La contamination des carcasses peut avoir lieu principalement aux moments du
dépouillement des cuirs (potentiellement souillés par le pathogène) et de l’éviscération (le
pathogène ayant pour réservoir principal le tube digestif des bovins).
11
Tableau 2. Fréquences observées de produits contaminés par des STEC (Vimont, 2007).
STEC
Pays Aliment n*
Fréquence(%) Référence
Thaïlande Boeuf cru 93 8.6 Suthienkul et al.,1990
Canada Boeuf cru 225 36 Read et al., 1990
RoyaumeUni
Boeuf haché cruSaucisse de boeuf crue
Beef burger cru
13452124
131722
Willshaw et al.,1993
Etats-Unis Boeuf cruVeau cru
608
2363
Samadpour et al.,1994
France Boeuf cru 411 11 Pradel et al., 2000
1-2-2-2 Lait et produits laitiers
Le lait et les produits laitiers sont à l’origine de différents foyers épidémiques à STEC dans le
monde depuis plusieurs années (Tableau 3). La voie de contamination du lait actuellement
retenue est celle de la contamination à partir des matières fécales de bovins lors de la traite,
même si certaines études suggèrent l’existence possible d’une voie de contamination du lait
avant la traite (Matthews et al., 1997).
Tableau 3. Fréquences observées de laits et fromages contaminés par des STEC (Vimont,2007).
STEC
Pays Aliment n*Fréquence(%)
Méthodeutilisée
Référence
FranceLait cruFromages au lait cruFromages au laitpasteurisé
205180
45
21,530,5
8,9
PCR-ELISA
Fach et al., 2001
France Fromages au lait cru 1039 13 PCRVernozy-Rozand et al.,2002
Allemagne Lait cru et lait certifié 273 3.9 et 2.1 VT-ELISA Klie et al., 1997
Hollande Lait cru 1011 0 IMS Heuvelink et al.,1998
Angleterre Lait cruFromages au lait cru
500739
00 IMS
Coia et al., 2001
Italie Lait cru 100 0 EHECELISA test
Massa et al.,1999
12
1-2-2-3 Végétaux
Les fruits et légumes crus (salade, radis, épinards, oignons, etc) peuvent être directement
contaminés par l’eau d’irrigation, à partir du sol contaminé suite à l’épandage d’effluents
d’élevages ou via l’activité de la faune du sol.
1-2-2-4 Eau
Les épidémies d’origine hydrique sont généralement associées à la consommation d’eau de
boisson (Holme, 2003; Mannix et al., 2005).ou à l’ingestion accidentelle d’eau lors de
baignades (Ackman et al., 1997; Paunio et al., 1999).
1-2-2-5 Transmission inter-humaine
La majorité des cas résulte d’une contamination indirecte mise en évidence chez les personnes
en contact avec les malades. Ce mode de transmission est aussi responsable de l’extension de
l’infection au sein des familles (Ludwig et al., 1998) et dans les hôpitaux (Karmali et al.,
1999; Bolduc et al., 2004).
1-2-2 Dans l’environnement
La contamination fécale est la principale source de contamination de l’environnement et
l’apport régulier de STEC à travers les fèces des animaux est en partie responsable de la
persistance de ces pathogènes dans l’environnement.
Les ruminants et notamment les bovins sont considérés à l’heure actuelle comme le réservoir
principal de E. coli O157 H7 (Andral et al., 2000).
1-3- Pathologie des infections humaines liées aux EHEC
1-3-1 Forme asymptomatique et diarrhée non hémorragique
Lors d’une épidémie récente survenue en octobre 2005 en Irlande, des souches O157
semblables à celles impliquées dans les cas de SHU ont été isolées chez des personnes ne
présentant aucun symptôme (Mannix et al., 2007). La fréquence des formes asymptomatiques
ou bénignes pourrait ainsi être sous-évaluée puisque ces formes sont difficilement décelables
(les personnes ne présentant pas ou peu de symptômes cliniques ne consultent pas de
médecin) et ce n’est qu’au cours d’enquêtes épidémiologiques dans l’entourage des patients
atteints qu’elles peuvent être identifiées (Figure 1).
1-3-2 Colite hémorragique
Principale manifestation clinique de l’infection à Escherichia coli O157:H7 (Griffin et Tauxe,
1991; Tarr, 1995). La colite hémorragique est caractérisée par des crampes abdominales, une
diarrhée initialement aqueuse puis sanglante chez un patient généralement apyrétique ou
13
subfébrile (Griffin et Tauxe, 1991). La diarrhée sanglante est retrouvée dans 90% des cas
diagnostiqués (Tarr, 1995). Des nausées, des vomissements, des céphalées et des frissons ont
également été rapportés, mais leur fréquence est plus faible.( afssa, 2003).
Le diagnostic de l’infection peut être établi par isolement d’une souche EHEC dans les selles,
mais seulement au début de la phase diarrhéique (du 1er au 6ème jour), ou par dosage
sérologique à tout moment de l’infection (Vernozy-Rozand, et Montet, 2001).
Figure 1. Principales étapes du processus infectieux des EHEC (Grimont et al., 2003, Gyles,
2007). SHU : Syndrome hémolytique et urémique. (Loukiadis, 2007).
14
1-3-3 Syndrome hémolytique et urémique
Décrit pour la première fois en 1955 par Gasser, le SHU typique touche surtout l'enfant de
moins de 3 ans et survient brutalement après une diarrhée prodromique sanglante dans la
majorité des cas.
Ce n’est qu’en 1983 que Karmali et collaborateurs établissent la relation entre une infection
intestinale à EHEC et la survenue d’un SHU. L'apparition du SHU se fait en moyenne une
semaine après le début des symptômes digestifs. Deux à 7 % des patients atteints d’une
infection intestinale à E. coli O157:H7 développeront un SHU. Cette incidence est supérieure
chez l'enfant et les personnes âgées : 10 % chez les enfants de moins de 10 ans et 10 à 20 %
chez les sujets âgés (Griffin et al., 1991).
A l’heure actuelle deux types de SHU ont été décrits.
- Le SHU dit typique apparaît classiquement après un épisode de diarrhée aiguë
prodromique, souvent sanglante.
- Le SHU atypique, quant à lui, survient sans prodrome diarrhéique et sans
prédominance saisonnière. Il apparaît après des symptômes respiratoires, de la fièvre
ou des vomissements et son diagnostic n’est pas aussi aisé que pour la forme typique
(Amirlak et Amalrik, 2006).
Aucun traitement spécifique, préventif ou non, ne permet de modifier l’évolution du SHU.
Bien que certains essais thérapeutiques, tels que l’utilisation d’anticorps anti-shiga toxines,
soient prometteurs, du moins lors de SHU typique (Trachtman et al., 2003, Tzipori et al.,
2004), le traitement actuellement recommandé reste uniquement symptomatique (Tarr et al.,
2005, Amirlak et Amirlak. 2006,).
1-3-4 Purpura thrombotique thrombocytopénique
Le purpura thrombotique et thrombocytopénique (PTT) est une entité clinique décrite pour la
première fois par Moschcowitz en 1925. Comme pour le SHU, l’étiologie du PTT peut être de
diverses origines (toxique, auto-immune...), et la relation entre l’infection par E. coli O157:H7
et l’apparition de ce syndrome est récente (Kovacs et al., 1990).
Le PTT touche essentiellement l'adulte. C’est un syndrome caractérisé par une anémie
hémolytique microangiopathique, une thrombocytopénie, une fièvre, des troubles
15
neurologiques avec une insuffisance rénale aiguë. La diarrhée prodromique est généralement
absente (Hofmann, 1993).
La durée du PTT est habituellement de quelques jours à quelques semaines, mais il peut
parfois se prolonger pendant des mois. Quand la maladie progresse, elle peut toucher le
système nerveux central et les reins, et leur atteinte est dans la plupart des cas, la cause
principale de la mort.
1-3-5 Autres aspects cliniques
Des souches EHEC ont été incriminées dans certaines infections urinaires ayant évoluées vers
un SHU (Chiurchiu et al., 2003, Miedouge et al., 2000).
1-3-6 Les pathologies animales à STEC
Les STEC sont responsables de diarrhées chez le veau mais la production de toxines Stx ne
semble pas intervenir dans la pathologie due aux STEC chez les ruminants (Dean-Nystrom et
al., 1997). L’absence de récepteur pour les toxines Stx expliquerait que les ruminants ne
développent pas de toxémie ou de dommage vasculaire systémique.
2- Facteurs de virulence, pouvoir pathogène des STEC
2-1- Facteurs de virulence des EHEC
2-1-1 Les Shiga-like toxines (stx)
Actuellement les principaux facteurs de virulence des EHEC sont les stx qui sont des
cytotoxines inhibant in vitro les cellules Vero (cellule rénale du singe vert d’Afrique) en
stoppant de façon irréversible leur multiplication.
Les Stxs regroupent deux principaux types (Strockbine et al., 1986): Les Stxs de type 1 les
toxines Stx1, qui sont neutralisables par des anticorps anti-Shiga-toxine de Shigella
dysenteriae 1, (Takao et al., 1988); et les Stxs de type 2 qui présentent moins de 60%
d’homologie avec la séquence en acides aminés des Stx1.
Elles se distinguent par leurs propriétés immunologiques, mais leur mécanisme d’action et
leurs propriétés biochimiques sont similaires. Cependant, les toxines Stx1 et Stx2 ne semblent
pas traverser de la même façon la barrière de l’épithélium intestinal (Hurley et al., 1999).
Certaines études, de Wadolkowski et al., 1990 et de Lindgren et al., 1993, ont montré que
Stx2 serait 1000 fois plus cytotoxique sur les cellules endothéliales rénales humaines que la
toxine Stx1(Louise et Obrig, 1995).
16
Tableau 4. Génotype stx des STEC et leur fréquence relative parmi les isolats cliniques depatients atteints de SHU et de diarrhées (1996-2004) (Karch et al., 2006, Saltet de Sablet,2007).
Génotype SHU (%) Diarrhées sans SHU (%) Nb total d'isolats (%)
stx1stx1c
stx1c + stx2stx1c + stx2d*
stx1dstx2
stx1 + stx2stx2c
stx1 + stx2cstx2 + stx2c
stx1 + stx2 + stx2cstx2d*
stx2d activablestx1 + stx2d*
stx2estx2f
TOTAL
23 (4,5)0000
311 (60,9)42 (8,2)16 (3,1)
1593 (18,2)8 (1,6)
03 (0,6)
000
0511 (100)
151 (34,6)11 (2,5)1 (0,2)
22 (5,0)1 (0,2)
120 (27,5)12 (2,7)17 (3,9)15 (3,4)19 (4,3)5 (1,1)
15 (3,4)9 (2,1)
26 (5,9)12 (2,7)1 (0,2)
437 (100)
174 (18,3)11 (1,2)1 (0,1)
22 (2,3)1 (0,1)
431 (45,5)54 (5,7)33 (3,5)30 (3,2)
112 (11,8)13 (1,4)15 (1,6)12 (1,3)26 (2,7)12 (1,3)1 (0,1)
948 (100)
A l’heure actuelle, un nombre conséquent de variants génétiques des toxines Stx1 et Stx2 ont
été décrits (Beutin et al., 2007). Au sein de la classe des toxines Stx2, 11 variants (Brett et al.,
2003) sont à l’heure actuelle différenciés, dont les variants Stx2 NV206 et Stx2g qui ont été
récemment décrits (Leung et al., 2003; Bertin et al., 2001). Concernant la classe des toxines
Stx1, les variants sont moins divers puisqu’ils sont au nombre de 6, les plus fréquents étant
Stx1, Stx1c et Stx1d. (Montet, 2009).
2-1-2 Les facteurs d’adhésion
2-1-2-1 Lésions d’attachement-effacement
La colonisation du tube digestif par certaines souches STEC s'accompagne du développement
de lésions spécifiques des entérocytes dites d’attachement-effacement (A/E), qui se limitent
au côlon et au caecum (figure 2). Les lésions A/E. Les lésions provoquées par le mécanisme
de résorption des microvillosités intestinales, en diminuant la surface d’absorption, pourraient
entraîner les symptômes diarrhéiques observés lors des infections. (Donnenberg et Kaper,
1992 ; AFSSA, 2003)
17
Figure 2. Lésions d’attachement-effacement induites par une souche E. coli O157:H7 sur des
cellules rectales de mouton (Wales et al., 2001).
.
Les bactéries adhèrent à la surface des entérocytes (E). Les microvillosités sont effacées et
certaines bactéries sont sur un piédestal (P). La bordure en brosse normale est présente (M)
sur les entérocytes adjacents non colonisés (Wales et al., 2001).
Les gènes responsables des lésions A/E sont portés par le locus chromosomique LEE, codant
un système de sécrétion particulier, le système de type III, et trois classes de protéines
sécrétées par l’intermédiaire de celui-ci :
- Le gène eae (E. coli attaching and effacing) code une protéine de membrane externe de
94 kDa appelée intimine (Jerse et al., 1991).
- Le gène tir code le co-récepteur spécifique de l’intimine, Tir (Translocated Intimin
Receptor), une protéine de 78 kDa injectée dans le cytoplasme de la cellule eucaryote
grâce à un système de sécrétion de type III (Kenny et al., 1997).
- Les gènes esp (EPEC-secreted protein) codent pour une seringue moléculaire (espA,
espB, espD) impliquée dans la translocation des effecteurs dans la cellule hôte.
- Le système de sécrétion de type III : les protéines Esp ne comportant pas de séquence
signal, leur sécrétion a été attribuée au système de type III dont les gènes sont
également portés par le LEE (Jarvis et Kaper, 1996 ; Montet, 2009).
18
2-1-3 Les entérohémolysines :
Différentes hémolysines (α, β, etc…) sont produites par des souches d’E. coli pathogènes
(Kaper et al., 2004) et sont actifs sur différents types cellulaires tels que les lymphocytes, les
granulocytes, les érythrocytes et les cellules épithéliales rénales.
Certaines sont actives seulement sur des érythrocytes lavés, elles ont été retrouvées chez des
souches EHEC et sont dénommées entérohémolysines (Ehly). La protéine E-hlyA est codée
par le gène ehxA de l’opéron plasmidique ehxCABD (Schmidt et al., 1995). Différents types
d’Ehly ont été décrits mais seule l’EHEC-Ehly (ou Ehx) est spécifique des souches EHEC
(Mainil et al., 2005).
2-2 Les éléments mobiles de pathogénicité
Les données récentes de la génomique soulignent l’extrême plasticité du génome des E. coli et
en particulier des souches EHEC (Dobrindt, 2005). Ainsi, les souches EHEC pourraient avoir
acquis la majorité de leurs facteurs de virulence par transfert horizontal de matériel génétique.
2-2-1- Ilots de pathogénicité
Un îlot de pathogénicité (PAI) se définit comme un bloc indissociable de gènes portés par le
chromosome bactérien, ayant pour propriétés (Mainil, 2003, Kern-benaibout, 2006) :
- d’être généralement absent des bactéries non pathogènes appartenant à la même
espèce ;
- d’être constitué d’un groupe de gènes de virulence, dont les gènes codant pour des
toxines, des adhésines, des invasines, des systèmes chélateurs du fer, et des systèmes d’export
de protéines de virulence ;
- d’avoir un pourcentage de G+C différent de celui de la bactérie hôte, attestant d’une
origine étrangère ;
- d’occuper généralement une région chromosomique de plus de 30kb, avec des tailles
allant de 5 à 200 kb ;
- d’être souvent encadré par de courtes séquences répétées ;
- de se situer à proximité de loci codant pour des ARNt, et au niveau de séquences
d’insertion;
- de contenir également des gènes cryptiques ou exprimés, codant pour des fonctions
d’intégrases ou de transposases, et des séquences d’insertion entières ou partielles ;
- d’être souvent instable et de s’exciser à des fréquences variables selon les PAI.
Lorsqu’ils s’excisent, toutes les fonctions pour lesquelles ils codent sont perdues.
19
Plus que de véritables éléments mobiles du génome, les PAI se présentent plutôt comme le
fruit de l’intégration de plasmides ou de prophages au coeur du chromosome bactérien, avec
perte des gènes requis pour la transmission horizontale (réplication ou auto-transfert), au
profit d’une association plus stable et d’une possibilité de transmission verticale (Beutin et al.,
2004 ). Le fait que l’on retrouve des gènes codés dans les PAI sur des plasmides conforte
cette hypothèse.
Les îlots de pathogénicité codent pour tout le spectre des facteurs de virulence : adhésines,
toxines, systèmes de séquestration du fer, systèmes de sécrétion, stratégies pour échapper aux
défenses immunitaires de l’hôte (Dobrindt, 2005). Ils jouent un rôle important dans
l’évolution des différents pathovars: des fractions importantes du génome sont représentées
par des PAI.
2-2-2- Plasmides
La plupart des souches EHEC O157:H7 possèdent un plasmide de 92 kb dénommé pO157.
D’autres plasmides de 2 à 90 kb ont été mis en évidence chez les souches non-O157, en
particulier des plasmides de haut poids moléculaires proches de pO157 mais présentant des
combinaisons de facteurs de virulence différentes (Brunder et al., 1999).
2-2-3- Bactériophages
Le matériel génétique des bactériophages, incorporés au chromosome ou au plasmide,
apportent de l’information génétique supplémentaire à leur bactérie hôte (Guiraud, 1993).
Chez les EHEC O157 ils portent plus de la moitié des séquences spécifiques aux souches
(Hayashi et al., 2001, Ohnishi et al., 2001).
En plus, plusieurs études ont montré que les gènes stx pouvaient être transmis
horizontalement au sein de la population des E. coli (Herold et al., 2004, Muniesa et al.,
2004).
20
3- Données sur l’élevage en AlgérieL’élevage, en Algérie, concerne principalement les ovins, les caprins, les bovins et lescamelins. Les effectifs recensés durant les dernières années sont représentés dans le tableau 5.
Tableau 5. Evolution du cheptel bovin en Algérie entre 2002 – 2009 (Unité de mesure :Têtes), [ ] = Donnée officielle, F = estimation FAO source : FAO database 2011
Le tableau 6 résume les quantités de viandes rouges (ovines et bovines) produites cesdernières années.
Tableau 6. Production de viandes rouges en Algérie (tonnes). Source : FAO database 2011
ovins bovins2009 187 000 121 6122008 187 000 124 1432007 187 000 122 5052006 184 739 119 6832005 178 075 114 9662004 172 295 115 2462003 164 900 118 7302002 164 900 115 914
3-1- L’importation de la viande congelée en chiffres :La filière des viandes rouges en Algérie, reposent globalement sur les élevages bovins etovins ainsi que, marginalement, sur des élevages camelins et caprins dont les niveaux deproduction restent modestes. De ce fait, la production de viandes rouges provientessentiellement des élevages extensifs ovins (56%) et bovins (34%) (Élevage caprin, 8 %, etcamelin, 2 %).
L'élevage bovin en Algérie n'arrive pas à satisfaire les besoins de la population en viande, deplus en plus croissants. Ce qui à poussé le gouvernement à importer de la viande bovine dedifférents pays pour satisfaire à la demande.
produit 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009
Bovins 1572000 1560550 1613700 1586100 1607890 1633810 1640730 1 650 000 F
Camélidés 245000 F 249975 273200 268600 286670 291360 295085 295 000 F
Caprins 3280540 3324740 3450580 3590000 3754590 3837860 3751360 3 800 000 F
Ovins 17587700 17502800 18293300 18909100 19615700 20154900 19946200 20 000 000 F
21
Tableau 7. Importation de la Viande et abats comestibles en kilogramme. Source :Statistiques du Commerce Extérieur de la douane Algérienne.
Uruguay Brésil Argentine Irlande Australie N. Zélande
2010 3 132 578 35 286 252 898 018 264 996 305 513 683 373 57 477 991
2009 5 962 627 50 575 322 4 513 975 / 355 593 69 403 62 300 859
2008 5 789 295 44 884 759 1 507 202 188 452 1 112 096 3 387 028 57 195 657
2007 1 447 131 52 682 479 2 224 248 710 646 2 084 149 5 621 560 64 975 971
2006 9 553 939 41 037 139 4 361 884 3 657 684 3 117 982 4 055 268 66 431 700
2005 1 568 962 53 161 869 16 625 471 3 544 530 6 180 230 9 129 079 95 387 178
2004 3 579 337 34 248 610 33 203 341 675 170 7 280 929 3 810 853 85 338 791
2003 18 195 587 3 471 889 13 339 550 / 1 279 140 722 678 38 519 831
2002 10 453 646 / 1 036 557 24 984 1 735 654 1 456 027 18 029 594
Tableau 8. Importation viandes bovines en Algérie (tonnes). Source : FAO database 2011
bovins2009 61 3392008 55 3702007 56 4702006 58 1222005 78 2732004 71 6612003 38 0602002 15 220
22
4- Interactions E. coli O157:H7, bactéries lactiques
4-1 Rappel sur les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont un groupe hétérogène de microorganismes produisant de
l’acide lactique comme produit principal du métabolisme (Stiles et al., 1997).
Actuellement, les bactéries lactiques regroupent treize genres bactériens différents
Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Weissella,
Oenococcus, Vagococcus, Pediococcus, Carnobacterium, Aerococcus, Tetragenococcus et
Bifidobacterium.
Elles produisent de nombreux métabolites aux propriétés antimicrobiennes tels que les acides
organiques, le peroxyde d’hydrogène, le dioxyde de carbone, la reutérine, le diacétyl et les
bactériocines. Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens inhibant la croissance de
bactéries altérantes ou pathogènes.
Les souches produisant les bactériocines peuvent donc également être utilisées dans des
produits non fermentés en tant que culture protectrice. Une culture protectrice est une culture
antagoniste ajoutée à un produit alimentaire pour inhiber les bactéries pathogènes et/ou
altérantes et ainsi prolonger sa durée de vie en respectant ses propriétés organoleptiques
(Rodgers, 2001 ; 2003 ; Vermeiren et al., 2004).
4-2 Classification et mécanismes d’action des bactériocines
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont réparties en quatre classes, comme
proposé par (Klaenhammer, 1993). Ces quatre classes sont :
4-2-1 Classe I. Les lantibiotiques : peptides de taille inférieure à 5 kDa, stables à la
chaleur et qui contiennent des acides aminés inhabituels soufrés formés post-
traductionnellement, c’est-à-dire la lanthionine, la β-méthyl lanthionine, la déhydrobutyrine et
la déhydroalanine (Twomey et al., 2002).
4-2-2 Classe II. Peptides de taille inférieure à 10 kDa, stables à la chaleur, ne
contenant pas d’acides aminés modifiés. Leur point isolélectrique varie entre 8 et 10 (Richard
et al., 2006).
4-2-3 Classe III. Protéines de taille supérieure à 30 kDa et sensibles à la chaleur. La
structure et le mode d’action de ces bactériocines diffèrent complètement des autres
bactériocines produites par les bactéries lactiques. (Nilsen et al., 2003).
23
4-2-4 Classe IV. Peptides requérant une partie carbohydratée ou lipidique pour avoir
une activité. Aucune bactériocine de cette classe n’a été décrite (Papagianni, 2003 ; Nigutova
et al., 2007).
4-3 Applications des bactériocines dans l’industrie alimentaire.
Les bactériocines sont habituellement reconnues comme sûres, sont sensibles aux protéases
digestives et ne sont pas toxiques pour les cellules eucaryotes (Wijaya et al., 2006). Elles ont
une grande tolérance aux variations de pH et aux traitements thermiques. Leur spectre
antimicrobien peut être large ou étroit, elles peuvent donc cibler sélectivement des bactéries
pathogènes ou altérantes sans inhiber les bactéries indispensables et ont un mode d’action
bactéricide (Galvez et al., 2007).
Les bactériocines doivent cependant être considérées comme un moyen de préservation
complémentaire à ceux déjà existant (Deegan et al., 2006).
5- Antibiorésistance
L’étude de la résistance aux antibiotiques est devenue un test de routine de laboratoire, pour
contrôler le passage des bactéries résistantes de l’animal à l’homme. Ce passage s’opère
principalement par la chaine alimentaire. (Agence nationale du médicament vétérinaire).
5-1 Définition rapide des additifs alimentaires antibiotiques
Les antibiotiques administrés aux animaux d’élevage en tant qu’additifs alimentaires le sont à
faibles doses. Si leurs effets bénéfiques sur la productivité sont clairement observés, leur
mode d’action reste encore mal connu.
Enfin, des antibiotiques sont rajoutés à l’alimentation des animaux pour accélérer leur
croissance, que ce soit dans les élevages de porcs, de poulets de chair, de dindes ou de bovins
(Situation analysis of antibiotic misuse in US food animals: APUA background paper. APUA
Newsletter 2010:28(2):1-7.) . Cette pratique est particulièrement grave car les antibiotiques
utilisés comme additifs alimentaires pour favoriser la croissance sont utilisés sans prescription
et administrés pendant des périodes prolongées, à des quantités faibles, à des troupeaux
entiers, ce qui favorise la sélection et la propagation de bactéries résistantes (APUA
Newsletter, 2010).
5-2 Utilisation des antibiotiques en élevage
L’utilisation d’antibiotiques en élevage de rente a deux objectifs.
Les antibiotiques ont tout d’abord une utilisation thérapeutique visant à l’éradication d’une
infection présente (but curatif) (Corpet, 1999) ou à la prévention d’une infection possible, à
24
l’occasion d’un transport, d’une vaccination ou d’un stress (but prophylactique). Ceci vise à
éviter que les infections présentes dans l’élevage ne se déclarent et se propagent à une vitesse
vertigineuse, compte tenu de la densité des animaux dans des locaux dans la grande majorité
des cas entièrement clos. Elle est utilisée à des étapes clés de la vie des animaux les animaux
étant plus fragiles et donc plus sensibles aux infections (Schwarz et Chaslus-dancla 2001).
Elle est très fréquente en élevage laitier, avec l’application de pommades intra mammaires
contenant un ou plusieurs antibiotique(s) lors du tarissement des vaches.
L’utilisation des antibiotiques thérapeutiques est sous le contrôle des vétérinaires. La voie
d’administration la plus rapide pour traiter un grand nombre d’animaux, est l’eau de boisson
ou l’incorporation dans l’aliment. Cet aliment de traitement est considéré comme un
médicament. Les principales familles d’antibiotiques sont représentées mais le nombre de
molécules est très restreint si on le compare avec celui des molécules à usage humain (Bories
et Louisot 1998 ; Millemann, 2002).
A côté de cette utilisation thérapeutique, on trouve une utilisation propre à l’élevage de rente :
l’usage zootechnique c'est-à-dire comme facteurs de croissance sous forme d’additifs
alimentaires.
5-3 Risques liés aux antibiotiques
Toute utilisation d'antibiotiques en médecine vétérinaire ou en médecine humaine accroît les
risques d'apparition de bactéries résistantes. Les risques les plus grands sont associés à
certaines pratiques d'administration des antibiotiques, comme celles qui consistent à
administrer simultanément le produit à tout un troupeau, à administrer le produit de façon
prolongée ou de sur-utiliser un même antimicrobien. Aucun lien direct n'a été établi entre
l'usage d'antibiotiques comme stimulateurs de croissance dans les élevages et les
antibiorésistances apparues chez les humains. Des chercheurs étudient cependant la possibilité
qu'un tel lien puisse exister. ( Klotis, 2006).
Mais l'usage intensif et non thérapeutique d'antibiotiques en agriculture conduit à l'apparition
de résistances aux antibiotiques, surtout chez les bactéries du tube digestif, comme le groupe
de bactéries appelées entérocoques. Ces bactéries résistantes peuvent infecter les humains. Il
peut aussi arriver que leurs gènes résistants se propagent à d'autres bactéries qui infectent les
humains. La résistance aux antibiotiques limite les possibilités de traitement, retarde la
guérison et s'accompagne d'une augmentation des coûts. Ce qu'il y a de plus troublant, c'est
que cette résistance aux antibiotiques peut s'accroître avec l'usage continu et généralisé des
antibiotiques comme stimulateurs de croissance (OMS, 2003).
25
5-3-1 Risques pour la santé animale et humaine
La conséquence immédiate de la résistance aux antibiotiques en élevage est l'échec
thérapeutique. Pour la santé humaine, le risque peut être de deux ordres : risques posés par les
résidus dans la viande de consommation et risques dus à la contamination de l'homme par des
bactéries zoonotiques résistantes à des antibiotiques utilisé chez l'homme.
Ces bactéries résistantes se propagent ensuite, au sein des basses-cours, des troupeaux ou des
fermes marines et viennent polluer l’environnement, notamment suite à l’épandage du fumier
(European Food Safety Authority 2011). Les microorganismes résistants peuvent survivre
pendant des périodes prolongées et transmettre leur résistance à d’autres bactéries présentes
dans l’environnement (Cassone et Giordano, 2009). A titre d’exemple, des études menées aux
Pays-Bas, ont montré que la proportion de bactéries résistantes présentes dans des
prélèvements de sol avait considérablement augmenté depuis 1940 (Knapp et al., 2010).
Les bactéries résistantes peuvent également se transmettre directement aux humains en
contact avec les animaux.
5-3-2 Bactéries résistantes
La résistance des bactéries aux antibiotiques est connue depuis fort longtemps et son
importance clinique survient très peu de temps après le début de l'antibiothérapie.
Il existe deux types de résistances :
- Résistance naturelle
La résistance naturelle ou intrinsèque correspond à la capacité de résister à la présence d'un
antibiotique pour toutes les souches d'une espèce ou d'un genre bactérien. La Société
Française de Microbiologie (SFM) définit la résistance naturelle comme la caractéristique
d’une espèce bactérienne qui se traduit par des concentrations minimales inhibitrices (CMI)
supérieures à la concentration critique supérieure des tests de sensibilité pour l’antibiotique
concerné
- Résistance acquise
On oppose à la résistance naturelle, propriété d'espèce ou de genre, la résistance acquise qui
est une propriété de souche. Cette dernière correspond à la capacité de supporter une
concentration d'antibiotique beaucoup plus élevée que celle supportée par les autres souches
de la même espèce.
Elle peut s'acquérir soit par mutation chromosomique, soit par acquisition de matériel
génétique exogène par conjugaison, transformation ou transduction (Prescott, 1999).
26
5-4 Principales pathologies microbiennes bovines rencontrées en Algérie (Standardisation
de l'antibiogramme en médecine vétérinaire a l'échelle nationale, 2003)
- Mammites (Benhamed et al, 2011)
- Diarrhées néonatales
- Entérites chez les ovins
- Affections respiratoires
- Affections podales
5-5 Principaux antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire en Algérie
5-5-1 Antibiotiques utilisés à titre curatif
Des études ont été menées pour déterminer pour quelles espèces et indications le manque de
médicament était le plus important. Il en ressort que les bovins font partie des espèces dites
majeures, peu touchées par le manque de spécialités. Il est possible de dresser la liste des
antibiotiques utilisables chez les bovins dans le tableau ci-dessous. (Standardisation de
l'antibiogramme en médecine vétérinaire a l'échelle nationale 2003)
Tableau 9. Antibiotiques utilisés à but thérapeutique en élevage bovin en Algérie
(Standardisation de l'antibiogramme en médecine vétérinaire)
Famille Molécule
Bêta-lactamines
Ampicilline/AmoxicillineAmoxicilline + acide clavulaniqueOxacillinePenicillineCefalexine
AminosidesStreptomycineNeomycineGentamicine
Aminocyclitols Apramycine
TétracyclinesTetracyclineDoxycyclineOxytétracycline
SulfamidesSulfonamidesTrimethoprime +Sulfamethoxazole
Quinolones
Acide NalidixiqueAcide OxoliniqueFlumequineEnrofloxacineDanofloxacineNorfloxacine
Glycopeptides Vancomycine
27
Polypeptides ColistineBacitracine
Phénicoles ChloramphenicolFlorfenicol
Macrolides
TylosineTilmicosineErythromycineSpiramycine
5-5-2 Antibiotiques utilisés comme facteurs de croissance (Standardisation de
l'antibiogramme en médecine vétérinaire a l'échelle nationale, 2003)
Les substances médicamenteuses appartenant au groupe des antibiotiques, autorisées à être
incorporées dans l’alimentation animale comme facteurs de croissance, sont les suivantes :
- Avilamycine.
- Flavophospholipol. : (molécule flavomycine) optimise la valeur de l’aliment etaméliore les performances de croissance des animaux d’engraissement (volaille,bovins, porcins et lapin).
28
Matériel et méthodes
29
Matériel et méthodes
Des souches de référence ont été utilisées dans le but de valider toutes les techniques réalisées
dans cette étude, les souches ATCC provenaient de l’American Type Culture collection ; et
les souches ECL du Laboratoire de référence des Escherichia Coli Canada.
- E. coli O157: H7 ATCC 35150 : utilisé pour comparer les caractères phénotypiques ;
- E. coli ATCC 25922 : utilisé lors de la réalisation de l’antibiogramme ;
- E. coli ECL3463 virotype négatif et E. coli ECL6611 virotype positif (EAST1 : Stx1 :
Stx2 : Eae : Paa : EhxA : EfaA-11), utilisées comme témoin positif et négatif pour la
caractérisation des gènes de virulence lors de la réalisation de la pcr.
1 Recherche de E. coli O157:H7 dans la viande :
1-1 Echantillonnage :
Tous les prélèvements provenaient du Laboratoire vétérinaire régional de Tlemcen (LVRT) et
ont été analysés au sein du même laboratoire.
Entre 2001 et 2010, sept cents cinquante six échantillons de viande bovine surgelée importée
de différents pays ont été testés dans le but de rechercher une éventuelle présence d’E. coli
O157 :H7.
La surface du morceau de viande surgelée est flambée à l’aide d’un bec Bunsen et un morceau
est découpé dans des conditions stériles. Vingt cinq grammes sont mélangés avec 225 ml
d’eau peptonée dans un stomacher.
Tableau 10. Nombre de prélèvements en fonction de leur pays d’importation.
Uruguay Brésil Argentine Irlande Australie N.Zélande Total
Nombred’échantillons 365 243 105 21 16 06 756
1-2 Isolement des E. coli O157 :H7
Les échantillons ont été soumis à une étape d’enrichissement dans du milieu EPT (eau
peptonnée tamponnée), après 24 heures d’incubation dans du milieu Mac Conkey au sorbitol,
les colonies transparentes sorbitol négatives, sont identifiées sur galerie API 20E et un test est
effectué pour la recherche de l’activité β-glucuronidase. Enfin une agglutination au latex anti
O157 et anti-H7 pour la détection de l’antigène H7 des souches isolées a été réalisée. (Karch
and Bielaszewska M., 2001)
30
1-3 Méthodes phénotypiques
Chacun des 756 prélèvements réalisés, après homogénéisation dans un stomacher stérile, a
fait l’objet d’une recherche systématique des E. coli O157 : H7, en utilisant la méthode ISO
16654:2001 (figure 3).
1-3-1 EnrichissementUne étape d’enrichissement a été effectuée sur eau peptonnée additionnée du supplément
VCC selectavial (SV 55, MAST Diagnostic) contenant de la vancomycine, céfixime et de la
céfsulodine, et on incube 24 heures à 41.5°C. (Blanco et al., 1996b; Chapman and Siddons,
1996)
1-3-2 Isolement sur milieu Mac Conkey sorbitol
La plupart des réactions biochimiques de E. coli O157:H7 sont typiques des E. coli à
l'exception toutefois de la fermentation du sorbitol. De ce fait nous avons utilisé le milieu
SMAC (biokar diagnostics) qui permet de mettre en évidence colonies lisses, incolores
sorbitol négatives ainsi que des colonies rouges sorbitol positives. (Karch et Bielaszewska,
2001)
1-3-3 Recherche de la β-glucuronidase
Du milieu MacConkey (Biokar diagnostics) est additionné du 4-méthylumbelliféryl- β-D
glucuronide MUG (Biokar diagnostics) pour la recherche de la β-Dglucuronidase.
Escherichia coli possédant une ß-Dglucuronidase hydrolyse le MUG en 4-
méthylumbelliférone et en son glucuronide correspondant. La production de 4-
méthylumbelliférone, composé à fluorescence bleue, peut être observée à l'aide d'une lampe
UV proche du visible (366 nm). Sachant que les E. coli O157 :H7 sont dépourvus de ß-
Dglucuronidase l’observation des boites de culture sous UV montrera des colonies non
fluorescentes. (Okrend et al., 1990)
31
25 g 225 ml EPT+ vancomycine+céfixime+ céfsulodine
Incubation 24h 41.5°C
Ensemencer 1 ml dans SMAC
Incubation 24h 37°C
Galerie API 20 E pour les colonies SOR-
Mac Conkey + MUG
Agglutination O157
Agglutination H7
PCR pour les souches
Figure 3. Schéma d’isolement et de caractérisation des souches basé sur la méthode ISO
16654:2001, modifiée.
1-4 Utilisation des propriétés biochimiques d’E. coli O157:H7
Toutes les souches présentant les caractères sorbitol négatif et β-Dglucuronidase négatif ont
été identifiées par le système API 20E (Biomérieux, Marcy L’Etoile, France).
Ce qui a permis de confirmer le fait que se sont des souches sorbitol négatives et de dresser
leurs différents chimiotypes. (Edwards et Ewing., 1986)
32
1-5 Utilisation Tests immunologiques d’E. coli O157:H7
Il existe actuellement sur le marché un grand nombre de tests permettant la détection de E.
coli O157:H7 dans les aliments et/ou dans les échantillons environnementaux. Nous avons pu
réaliser la recherche des antigènes O157 et H7 grâce au E. coli O157:H7 latex kit (« Statens
Serum Institute », Copenhague, Danemark). En suivant le protocole nous avons d’abord testé
nos souches avec le sérotype O157 et une fois que c’est positif nous avons répéter la même
opération avec le sérotype H7. (Guinée et al., 1981)
2- Etude des caractéristiques biochimiques des E. coli O157 :H7 :
2-1 Température
Les souches isolées ont été ensemencées dans du TSB avec un inoculum de 0.5 mcfarland qui
équivaut à 108 ufc/ml (unité formant colonies) et incubées 24h à des températures allant de 30
à 41 °C. Le but est de déterminer la température optimale de croissance.
2-2 pH
On a étudié la croissance des E. coli O157 :H7 dans du TSB préparé à différents pH (qui est
ajusté par du NaOH 1N et du HCl 1N), et stérilisé à 110°C pendant 10 min. L’inoculum initial
était de 108 ufc/ml (0.5 mcfarland) et les souches sont incubées 24 h à 37°C. Leur densité
optique est mesurée après incubation.
2-3 Activité de l’eau (Aw)
Pour étudier l’aw nous avons préparé du TSB avec différentes concentrations de NaCl selon
le tableau ci-dessous, après stérilisation du milieu à 120°C pendant 15 minutes les souches
sont inoculées et incubées à 37°C pendant 24 h.
L’inoculum de départ est 0.5 macfarland.
Tableau 11. Diminution de l’activité de l’eau par le NaCl (USFDA, The Bad Bug Book).
NaCl (g) Eau % NaCl Aw
0.9
1.7
3.5
7.0
10.0
13.0
99.1
98.3
96.5
93.0
90.0
87.0
0.9
1.7
3.5
7.0
10.0
13.0
0.995
0.99
0.98
0.96
0.94
0.92
33
16.0
22.0
84.0
78.0
16.0
22.0
0.90
0.86
2-4 Recherche du pouvoir hémolytique
Le but est de rechercher une éventuelle présence d’hémolyse c’est à dire la capacité à détruire
les globules rouges (rappelant qu’il existe 3 types α, β et γ).
Comme milieu nous avons utilisé la gélose nutritive additionnée de 5% de sang de mouton
fraichement collecté. Les souches sont ensuite ensemencées en spot est incubées 24 h à 37°C.
(Beutin et al., 1998)
3- Interactions avec les bactéries lactiques
3-1 Bactéries lactiques utilisées
Les espèces de Lactobacillus (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus johnsonii,
Lactobacillus paracasei, Leuconostoc.) proviennent de la collection du laboratoire de
microbiologie appliquée du département de biologie de la faculté des sciences, de l’université
d’Oran, Algérie. La souche de Leuconostoc provient d’une collection de souches de
l’Université Abou Bekr Belkaid Tlemcen.
3-2 Technique utilisée
La recherche de l’effet des bactériocines produites par les bactéries lactiques est réalisée par
la méthode de la double couche. (Barefoot et Klaenhammer, 1983)
Les souches d’E. coli O157 :H7 sont ensemencées sur milieu BHIB liquide est incubées 18
heures à 37°C, tandis que les bactéries lactiques sont ensemencées en spot sur MRS solide
tamponné afin d’écarter l’effet de l'acide lactique (pH 5,4) ensuite, elles sont incubées à 30°C
entre 24 h.
Après incubation les E. coli O157 :H7 sont inoculées dans du BHIB semi solide et les boites
de MRS sont inondées par les souches à étudier et laisser incubées 24 h à 37°C.
4- Etude de l’antibiorésistance
4-1 Technique utilisée
Nous avons utilisé la méthode par diffusion de disques imprégnés, décrite pour la première
fois par Bauer et Kirby en 1966, et utilisée actuellement par différents organismes de
recherche avec des modifications mineures.
34
-A partir d’une culture pure de 18 heures, prélever à l’aide d’une pipette Pasteur 3 à 4
colonies ayant le même aspect.
-Décharger la pipette dans tube d’eau physiologique à 9 ‰.
-Homogénéiser la suspension bactérienne, la mettre dans le densitomètre pour avoir une
opacité de 0.5 mcfarland ce qui correspond à 108 ufc/ml.
-Tremper un écouvillon stérile dans la suspension, et éliminer l’excédent en pressant
l’écouvillon sur la paroi du tube.
-Ensemencer en stries sur toute la surface gélosée d’une boite de Mueller Hinton à trois
reprises en faisant tourner la boite et l’écouvillon de 60o après chaque application.
-Appliquer les disques d’antibiotiques à l’aide d’un distributeur ou d’une pince stérile. IL ne
faut pas mettre plus de 6 disques dans une boite de 90 mm.
4-2 Lecture
La lecture se fait par la mesure du diamètre d’inhibition à l’aide d’un pied à coulisse
métallique, puis on compare les diamètres obtenus aux valeurs critiques figurant dans la
référence selon les normes (NCCLS, 1999).
Pour vérifier la validité du procédé, l’antibiogramme des souches de référence est réalisé le
même jour dans les mêmes conditions.
Dans notre étude on a complété avec une lecture interprétative, c’est à dire en comparant les
diamètres des souches étudiées avec celui de la souche de référence pour éviter les erreurs
surtout quand il y a présence de résistances de type « Border Line ».
5- Méthodes génétiques de la détection des E. coli O157:H7
Les gènes de virulence des souches d’E. coli O157 :H7 isolées ont été mis en évidence par
amplification génique (pcr) au Laboratoire Structure-Activité des biomolécules Normales et
Pathologiques INSERM-UEVE U829 Université Evry-Essonne, France.
Extraction de l’ADN :
Les bactéries sont étalées dans un premier temps sur milieu Mac Conkey sorbitol, puis un
clone est cultivé dans 5 ml de milieu LB. 1 ml de chaque culture est centrifugé 2500 g x 10
min, ensuite le culot est récupéré et traité par un tampon de lyse (SDS 20%, Tris pH 7.5
10mM, EDTA 1M) et de la protéinase K à 10mg/ml (Fermentas). Après chauffage à 56°C
pendant 2 heures, on rajoute du phénol-chloroforme-isopropanol suivi d’une centrifugation à
2500 g x 10 min. Le surnagent est additionné de chloroforme et centrifugé à 2500 g x 30 sec.
35
On récupère encore une fois le surnagent auquel on rajoute de l’acétate de sodium pH 5.2 3M
et de l’éthanol à 100% ; on laisse 15 min à -20°C et on centrifuge 15 min à 3000 g et à +4°C ;
on récupère le culot et on rajoute de l’éthanol à 70% suivi d’une centrifugation à 3000 g x3
min, on jette le surnagent et on laisse sécher le culot à température ambiante pendant 20 min.
L’ADN est récupéré dans 50 μl d’eau milli-Q stérile.
La détection de l’ADN pour toutes les PCR à été réalisée dans un volume de 50 μl sur un
appareil Gene Amp PCR System 9700 (Applied biosystems), elle est suivie d’une migration
sur gel d’agarose (TAE 1x, 1.5 g Agarose « Invitrogen » + bromure d’éthidium), tous les
échantillons sont colorés par du xylène cyanol 6x. (Padola et al., 2004)
Un dosage comparatif des ADN génomique extraits a été effectué sur gel d’agarose pour être
sur que d’éventuels résultats négatifs en PCR étaient bien dus à l’absence du gène et non à un
manque d’ADN génomique.
5-1 Détection des gènes spécifiques du sérotype E. coli O157:H7 par pcr
Les ologonucléotides utilisés en pcr proviennent de Sigma Aldrich. Nous avons pu tester les
gènes les plus important pour les E. coli O157 :H7, à savoir ceux codant pour la shigatoxine
(ou vérotoxine), l’intimine et l’entérohémolysine.
La mise au point de la pcr à été réalisée après plusieurs essais sachant que la température de
fusion (Tm) des oligonucléotides était différente, c’est le cas notamment pour VT1A et VT1B
ainsi que pour EAE-1 et EAE-2 (tableau 10).
Tableau 12. Oligonucléotides utilisés en PCR pour l’amplification des gènes.
Gene Primer Oligonucléotide séquence (5′–3′) Fragment
size (bp)
Tm Référence
stx1a VT1-A
VT1-B
CGCTGAATGTCATTCGCTCTGC
CGTGGTATAGCTACTGTCACC
302 71.2
58.5
Blanco et al.
(2003)
stx2b VT2-A
VT2-B
CTTCGGTATCCTATTCCCGG
CTGCTGTGACAGTGACAAAACGC
513 64.2
69.1
Blanco et al.
(2003)
ehxA HlyA1
HlyA4
GGTGCAGCAGAAAAAGTTGTAG
TCTCGCCTGATAGTGTTTGGTA
1551 62.7
63.4
Schmidt et al.
(1995)
eaec EAE-1
EAE-2
GAGAATGAAATAGAAGTCGT
GCGGTATCTTTCGCGTAATCGCC
775 52.4
72.6
Blanco et al.
(2003)
36
a : détecte Stx 1 et les variants Stx 1c et Stx 1d
b : détecte Stx 2 et les variants Stx 2c, Stx 2d, Stx 2e et Stx 2g
c : pour le détection du gène eae. Oligonucléotide universel, détecte tous les variants eae
décrits jusqu’à présent.
bp : paire de base ; Tm : température de fusion.
Les concentrations des solutions utilisées pour la détection de tous les oligonucléotides était la
même voir tableau ci-dessous.
Tableau 13. Concentrations des solutions utilisées en pcr pour tous les oligonucléotides.
5-1-1 stx1 et stx2 :
La détection des gènes stx1 et stx2 a été faite en utilisant les oligonucléotides VT1-A et VT1-
B pour stx1 et les oligonucléotides VT2-A et VT2-B pour stx2. (Blanco et al., 2003)
Le cycle d’amplification pour stx1 était de 95°C 5 min, 95°C 15 sec, 52°C 1 min, 72°C 1min
30sec, et celui pour stx2 était de 95° 5 min, 95°C 15 sec, 55°C 30 sec, 72°C 1min 30sec.
5-1-2 eae : Le gène eae code l’intimine, protéine responsable de l’association des
EHEC avec la membrane cytoplasmique de certaines cellules. (Blanco et al., 2003)
On a utilisé les oligonucléotides EAE 1 et EAE 2.La taille du fragment amplifié par le couple
EAE1 et EAE2 : 775 bp
Cycle PCR : 95° 5 min, 95°C 15 sec, 45°C 1 min, 72°C 1min 30sec.
5-1-3 ehx : Le gène hlyA code pour une entérohémolysine Hly dont l’activité est
moins puissante que l’α-hémolysine. (Schmidt et al., 1995)
Les oligonucléotides utilisés sont HlyA-1 et HlyA-4. Avec un Cycle PCR : 95° 5 min, 95°C15 sec, 55°C 1 min, 72°C 1min 30sec
5-2 Recherche des plasmides :
L’étude du profil plasmidique, nous permet en plus de tous les caractères phénotypiques,
biochimiques et la recherche des gènes de toxicité, de pouvoir comparer les souches isolées.
Un kit Qiagen miniprep à été utilisé pour l’extraction de l’ADN plasmidique, selon le
protocole suivant :
ADN Oligo 110mM
Oligo 210mM
dNTP (à25mM)
Tp 10x MgCl250mM
Taq PolyméraseEurobio 5 UI/ μl
H2O milli-Q stérile
3μl 2.5μl 2.5μl 0.8 μl 5 μl 1.5 μl 0.7 μl 35 μl
37
2 ml de culture de 18 h sur milieu LB sont centrifugés 3 min x 13000 g
Culot repris dans 250 μl de tampon P1, mélangé
Ajouter 250 μl tampon P2, mélanger
Ajouter 350 μl tampon N3, centrifuger 10 min x 13000 g
Prélever le surnagent, mettre dans la colonne et centrifugé 1 min x 13000 g
Ajouter 0.5 ml de tampon PB et centrifugé 1 min x 13000 g
Laver la colonne en additionnant 0.75 ml de tampon PE et centrifugé 2 fois 1 min x 13000 g
Placer la colonne dans un nouveau tube et récupérer l’ADN dans 50 μl d’eau milli-Q stérile
Ensuite le matériel a été digéré par l’enzyme BglII (fermentas) selon le protocole suivant :
- 15 μl d’ADN
- 2 μl Tp 10x
- 0.7 μl BglII
- 2.3 μl H2O milli-Q
Après une incubation au bain Marie à 37°C pendant 1 heure, une électrophorèse est effectuée.
38
5-3 Séquençage :
Le séquençage de l’ADN, est la détermination de la succession des nucléotides le composant.
L’ADN purifié de certaines de nos souches a été envoyé à Beckman Coulter Genomics pour
un séquençage afin de voir s’il y a une différence au niveau des séquences.
Les ADN une fois séquencés ont été étudiés sur le site
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/). En utilisant l’option Basic Local Alignment Search
Tool (BLAST), cette fonction ne considère que les séquences présentant une région de forte
similitude avec la séquence recherchée. Elle applique ensuite localement à chacune de ces
meilleures zones de ressemblance un algorithme d'alignement optimal. Une fois l’alignement
réalisé on obtient un pourcentage de concordance qui nous renseigne sur la similitude des
séquences.
39
Résultats
40
1- Recherche de E. coli O157:H7 dans la viande.
Sur les sept cents cinquante six échantillons testés, nous avons obtenu cinq souches (tableau
14) qui sont transparentes sur SMAC donc sorbitol négative (Figure 4).
Tableau 14 : Nombre et pourcentage des E.coli O157 :H7 détecté par pays.
Uruguay Brésil Argentine Irlande Australie N.Zélande Total
E. coliO157 :H7 3 1 1 0 0 0 5
Pourcentaged’E. coli
O157 :H70.82 0.41 0.95 0 0 0 0.66
Les souches ne sont pas fluorescentes sur du Mac Conkey+MUG, donc elles sont β-
Dglucuronidase négative et le sérotypage a permis de confirmer qu’il s’git du sérotype
O157 :H7. La souche de référence E. coli O157: H7 35150 incubée dans les mêmes
conditions nous à permis de s’assurer des caractères phénotypiques des colonies isolées.
La figure 5 présente les 2 chimiotypes rencontrés lors de l’identification par la galerie API
20E.
Le tableau 15 résume les différents résultats obtenus comparés avec des E. coli non O157 :H7
isolées au LVRT.
Figure 4. Photo montrant l’aspect des colonies sorbitol négatif sur SMAC
41
Figure 5. Photo des différents chimiotypes E. coli O157 :H7 isolées
Tableau 15. Caractères phénotypiques, biochimiques et sérologiques des E. coli O157 :H7,
ainsi que de la souche 29 E. coli non O157 :H7.
N° de la souche Aspect des
colonies
Sorbitol Chimiotype β-
Dglucuronidase
(MUG)
Sérotype
O157 :H7
25 Incolore - 5144172 - +
26 Incolore - 5144172 - +
27 Incolore - 5144112 - +
28 Incolore - 5144172 - +
29 Violet + 5144572 + -
30 Incolore - 5144172 - +
ATCC 35150 Incolore - - +
Il est important de rappeler qu’il n’existe actuellement aucun critère microbiologique
applicable à la viande bovine surgelée pour E. coli O157:H7 et les autres STEC en Algérie.
Ainsi, on a utilisé les méthodes, qui sont habituellement employées pour la recherche d’autres
pathogènes (i.e. Salmonella, Listeria) ou le dénombrement des flores indicatrices d’hygiène
(i.e. Enterobacteriaceae, E. coli).
Le milieu EPT additionné de vancomycine, céfixime et de la céfsulodine nous a permis de
détecter 5 souches, qui seront confirmé par la suite par l’isolement sur SMAC,
En effet le caractère primordial est avant tout de rechercher la présence de colonies sorbitol
négative sur milieu SMAC. Les 5 souches isolées répondent à ce critère.
42
L’étude de la dégradation du MUG par ces bactéries nous à montrée après observation sous
UV (pas de fluorescence) qu’elles ne possèdent pas de β-Dglucuronidase.
Ensuite les souches sont identifiées par le système API 20E qui nous permet d’un coté de
confirmer le caractère sorbitol négatif et surtout d’avoir le chimiotype de ces souches.
Une seule souche possède le chimiotype 5144112, en effet on constate que cette souche en
plus du sorbitol, elle ne fermente pas le saccharose le mélibiose et l’Amygdaline. Alors que
les 4 autres souches ont le même chimiotype 5144172.
La recherche des sérotypes O157 et H7 à l’aide du latex kit nous à bien révélé la présence de
ses 2 sérotypes.
Tous ces caractères nous mènent à dire qu’il s’agit bien d’E. coli O157 :H7. Reste à vérifier si
ces souches possèdent des gènes de virulence, une partie qu’on verra un peu plus loin.
Sur les 756 échantillons étudiés nous avons isolé cinq E. coli de sérotype O157 :H7, avec un
pourcentage de 0.82 pour l’Uruguay, 0.41 pour le Brésil et 0.95 pour l’Argentine. Ce qui fait
un total de 0.66 % pour l’ensemble des échantillons testés.
2- Etude des caractéristiques biochimiques des E. coli O157 :H7 :
Notre but dans l’étude des facteurs de croissance et de déterminer les conditions optimales et
létales pour les souches isolées. Ces conditions comme l’aw nous donneront une idée sur les
conditions de stockage sachant qu’il s’agit de viande surgelée qui à été conditionnée par
abaissement de la température à -18°C en moins d’une heure, ce procédé permet une bonne
conservation mais ne tue pas les bactéries. Donc si ces bactéries sont présentes avant la
surgélation elles peuvent se développer une fois ingérer. La température du corps humain
ainsi que l’environnement gastrique qui est acide peuvent avoir un effet sur le développement
de ces germes.
On a remarqué que presque toutes les souches se développent normalement à des
températures comprises entre 30 et 40°C avec des optimums à 38°C pour les souches 25, 26 et
28 ; alors que l’optimum pour la souche 30 est de 34°C, et pour la souche 27 il est de 35°C.
La figure 6 montre la croissance des 5 souches en fonction de pH différents, on constate que
toutes les souches ont un pH optimum compris entre 6 et 7, et leur croissance est inhibée à pH
acide (< 3) et à pH alcalin (>11).
43
Figure 6. Graphique représentant l’influence du pH sur la croissance des E. coli
O157 :H7
L’étude de l’activité de l’eau dans milieu rajouté de NaCl révèle une croissance optimale pour
toutes les souches à des valeurs de l’aw proche de 0.995. (Figure 7)
Figure 7. Graphique représentant l’influence de l’Aw sur la croissance des E. coli O157 :H7
Nous avons tracé une courbe regroupant les conditions optimales de croissance de chaque
souche (figure 8) et nous les avons mises à incubation durant 24 h avec un inoculum de départ
0.5 Macfarland (108 ufc). On constate que la phase de latence est assez courte elle ne dure que
44
2 heures suivie de la phase exponentielle qui a une durée de 4 h. la phase stationnaire dure en
moyenne un peu plus de 8 h.
Figure 8. Graphique représentant la croissance en fonction du temps dans les conditionsoptimales.
Figure 9. Recherche du pouvoir hémolytique par ensemencement des E. coli O157 :H7 enspot sur gélose au sang frais
L’étude des caractères biochimiques de la croissance nous ont permis de constater que les
souches isolées se développent toutes a la même activité d’eau qui est de 0.995, par contre
elles ont une température optimale de croissance qui est différente ; 38°C pour les souches 25,
45
26 et 28, 35°C pour la 27 et enfin 34°C pour la souche 30. Concernant le pH, il n’y a pas de
grande différence entre les souches il est de 6.5 pour la 25, la 26 et la 30 ; tandis que les
souches 27 et 28 se développent à un pH de 7.
Dans cette étude nous avons constaté que nos souches se développent dans un intervalle de
température assez large, Même constatation pour le pH, les souches isolées se développent à
un pH optimum de 6.5 à 7 et maximum de situé entre 9 et 10. Le pH minimum reste inférieur
à 3. L’aw optimale est de 0.995 et à tendance à diminuer pour atteindre 0.86. Tous ces
résultats correspondent aux valeurs de développement des E. coli.
Concernant le pouvoir hémolytique, aucune hémolyse n’a été observée pour les souches
isolées.(figure 9)
3- Interactions avec les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques peuvent agir de 2 façons sur d’autres bactéries, par la production soit
d’acides organiques soit des bactériocines. Ces dernières inhibent la flore indésirable et les
bactéries Gram+ potentiellement pathogènes (Enan et al., 1996).
La figure 10, nous montre des zones d’inhibition autour des spots ou été ensemencés les
bactéries lactiques il semblerait qu’elles produisent des substances inhibant la croissance des
E. coli O157 :H7.
Figure 10. Photo montrant les interactions des bactéries lactiques avec les souches 26 et 28
A4 : Lactobacillus johnsonii, 5 : Lactobacillus plantarum, 58 : Lactobacillus paracasei, 68 :
Lactobacillus plantarum, leu : Leuconostoc.
46
Toutes les souches isolées et testées sont inhibées en présence des bactéries lactiques utilisées.
Il semble que les bactéries lactiques utilisées dans nos tests produisent des bactériocines
capables de bloquer la croissance des E. coli O157 :H7 en 24 h.
4- Etude de l’antibiorésistance
Etudier la résistance des bactéries aux antibiotiques est devenus un test en routine dans la
plupart des laboratoires de microbiologie. Cela permet de suivre l’évolution de la résistance
des bactéries à travers le monde. Les souches que nous avons isolées provenaient de
l’Uruguay, Brésil et Argentine, sachant que nous n’avons pas obtenu des données concernant
l’utilisation des antibiotiques chez l’animal dans ces pays, nous avons testés nos souches en se
basant sur des molécules qui sont recommandées en Algérie.
Le choix des antibiotiques testés à été fait suivant les directives du comité de standardisation
de l'antibiogramme en médecine vétérinaire à l'échelle nationale.
Pour standardiser notre technique nous avons utilisé la souche ATCC E. coli 25922 dans les
mêmes conditions que nos souches.
Une lecture interprétative c’est la comparaison des diamètres des antibiotiques pour des
souches avec les diamètres obtenus pour la souche de référence, elle nous renseigne sur la
sensibilité ou la résistance de notre souche pour confirmer les résultats obtenus.
Le tableau 16 nous montre les diamètres d’inhibition de la souche de référence et de la souche
26, en effet on constate que toutes les souches sont sensibles aux antibiotiques testés, sauf la
souche 25 qui est résistante à la tétracycline.
Tableau 16. Récapitulatif des diamètres des zones d’inhibition (en mm), R = résistante
AntibiotiqueCharge du
disque
Numéro de la souche
25 26 27 28 30 25922
Diamètres en mm
Enr 5 μg 34 33 35 32 33 37FT 300μg 25 24 25 26 24 22NA 30 μg 27 24 28 25 25 26SXT 1.25/23.75 μg 32 32 30 31 32 26AM 10 μg 22 21 26 23 24 24C 30μg 30 30 30 28 29 25
47
TE 30 μg 13 R 24 26 26 26 24NOR 5 μg 38 36 40 32 37 38CS 10 μg 15 15 16 15 15 15OFX 5 μg 32 34 32 32 34 34KAN 30 UI 33 34 34 31 32 32KF 30 Ug 18 20 21 19 22 25EFT 30μg 22 21 23 22 24 28UB 30 μg 30 29 33 29 30 31N 30 μg 22 22 22 20 21 22CN 10μg 22 20 24 22 24 25
5- Méthodes génétiques de la détection des E. coli O157:H7
La figure 11 nous montre les tailles des plasmides après extraction. On remarque que pour
toutes les souches nous avons une bande qui fait 600bp et une autre qui fait autour des 700bp.
M 25 26 27 28 30 M
Figure 11. Electrophorèse sur gel d’agarose montrant le profil plasmidique
1500 bp
500 bp
700 bp
600 bp
48
Pour la recherche des gènes de virulence l’utilisation de témoins positif et négatif (ECL 6611
et ECL 3463) ainsi que la souche 29 qui est une E. coli non O157 :H7 à été primordial pour
valider les résultats obtenus.
Les techniques génétiques réalisées dans cette étude montrent que toutes les souches isolées
possèdent les gènes stx2 et ehxA (figures 13 et 15), par contre seule la souche n° 27 possède le
gène stx1 (figure 12) mais par contre ne possède pas le gène eae (figure 14) qu’on trouve chez
toutes les autres souches ; tous les résultats sont reportés dans le tableau 17.
Ces résultats qui nous révèlent qu’il s’agit de souches productrices de vérotoxines (VTEC ou
STEC). Il suffit de la présence d’un des gènes de stx pour qualifier la souche comme
productrice de shigatoxine ou vérotoxine (STEC ou VTEC). Dans notre étude on peut
considérer que les souches isolées sont pathogènes pour l’homme.
Tableau 17. Gènes détectés chez les différentes souches E. coli O157 :H7
gène
N°Stx1 Stx2 Stx1 et Stx2 eae ehxA
25 - + - + +
26 - + - + +
27 + + + - +
28 - + - + +
30 - + - + +
E. coli ECL6611 + + + + +
E. coli ECL3463 - - - - -
49
M 25 26 27 28 29 30 3463 6611 M
Figure 12. Recherche du gène stx1 par amplification génique (PCR). M (1 kb), Le contrôlepositif est la souche d’E. coli ECL6611. Le contrôle négatif est la souche d’E. coli ECL3463.Seule la souche 27 possède le gène stx1.
M 25 26 27 28 29 30 3463 6611 M
Figure 13. Recherche du gène stx2 par amplification génique (PCR). M (1 kb), témoin positifest la souche d’E. coli ECL6611, témoin négatif est la souche d’E. coli ECL3463. Les souches25, 26, 27, 28 et 30 sont positives.
1500 bp
500 bp
302 bp
1500 bp
500 bp 516 bp
50
M 25 26 27 28 29 30 3463 6611 M
Figure 14. Recherche du gène eae par amplification génique (PCR). M (1 kb), le témoinpositif est la souche d’E. coli ECL6611. Le témoin négatif est la souche d’E coli ECL3463.Les souches 25, 26, 28 et 30 sont porteuses du gène.
M 25 26 27 28 29 30 3463 6611 M
Figure 15. Recherche du gène ehxA par amplification génique (PCR). Recherche de laprésence HlyA par PCR. M (1 kb), le témoin positif est la souche d’E. coli ECL6611. Letémoin négatif est la souche d’E. coli ECL3463. Les souches 25, 26, 27 28 et 30 sontpositives.
775 bpbbpbbdssdbpbp
500 bp
1500 bp
bp
1500 bp
bp
1500 bp
500 bp
1551 bp
51
Le séquençage effectué sur les souches montre une forte similitude avec les oligonucléotides
testés le tableau résume les résultats obtenus.
Tableau 18. Résultats des souches séquencées.
N° de la souche Oligonucléotide % d’homologie27 VT1B 9825 VT2A 9925 EAE1 9925 HlyA4 9726 VT2B 10026 EAE2 9926 Hly1 9527 VT2B 9927 Hly1 9628 VT2B 9928 EAE1 9930 EAE2 9930 VT2B 99
En prenant la souche 27, on remarque qu’il y a une homologie à 98% pour les
oligonucléotides VT1 (stx1), et 99% pour les oligonucléotides VT2 (stx2).
En général à chaque début de séquence d’alignement on constate des nucléotides non liés
c’est le cas (en jaune) des souches séquencées.
Alignement des séquences nucléotidiques de la souche 27 avec l’oligonucleotide VT1
Query 45 CTGGAAAGGTAACATGTGAAAAATCAGCAAAGC-GATAAAAAACATTATTTGTCCTGTTA 103|||| || |||||||||| |||||||||||| | ||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 19 CTGGTAA-GTAACATGTG-AAAATCAGCAAACCAGATAAAAAACATTATTTGTCCTGTTA 76
Query 104 ACAAATCCTGTCACATATAAATTATTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGATTATTAAACCGC 163||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 77 ACAAATCCTGTCACATATAAATTATTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGATTATTAAACCGC 136
Query 164 CCTTCCTCTGGATCTATCCCTCTGACATCAACTGCAAACAAATTATCCCCTGTGCCACTA 223||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 137 CCTTCCTCTGGATCTATCCCTCTGACATCAACTGCAAACAAATTATCCCCTGTGCCACTA 196
Query 224 TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCCTGATGAAATAGTCTGTAATGGAGTACCTATTGCA 283||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 197 TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCCTGATGAAATAGTCTGTAATGGAGTACCTATTGCA 256
Query 284 GAGCGAATGACATTCAGCG 302|| ||||||||||||||||
Sbjct 257 GA-CGAATGACATTCAGCG 274
52
Alignement des séquences nucléotidiques de la souche 27 avec l’oligonucléotide VT2
Query 1 CTTCGG-TATCCTATTCCCGGGAATTTACGATAGACTTTTCGACTCAACAAAGTTATGTA 59|||||| |||||||||||||||| |||||||||||||||||||| ||||||||||||||
Sbjct 497 CTTCGGTTATCCTATTCCCGGGAGTTTACGATAGACTTTTCGACCCAACAAAGTTATGTC 438
Query 60 TCTTCGTTAAATAGTATACGGACAGAGATATCGACCCCTCTTGAACATATATCTCAGGGG 119||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 437 TCTTCGTTAAATAGTATACGGACAGAGATATCGACCCCTCTTGAACATATATCTCAGGGG 378
Query 120 ACCACATCGGTGTCTGTTATTAACCACACCCCACCGGGCAGTTATTTTGCTGTGGATATA 179||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 377 ACCACATCGGTGTCTGTTATTAACCACACCCCACCGGGCAGTTATTTTGCTGTGGATATA 318
Query 180 CGAGGGCTTGATGTCTATCAGGCGCGTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAGCAAAAT 239||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 317 CGAGGGCTTGATGTCTATCAGGCGCGTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAGCAAAAT 258
Query 240 AATTTATATGTGGCCGGGTTCGTTAATACGGCAACAAATACTTTCTACCGTTTTTCAGAT 299||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 257 AATTTATATGTGGCCGGGTTCGTTAATACGGCAACAAATACTTTCTACCGTTTTTCAGAT 198
Query 300 TTTACACATATATCAGTGCCCGGTGTGACAACGGTTTCCATGACAACGGACAGCAGTTAT 359||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 197 TTTACACATATATCAGTGCCCGGTGTGACAACGGTTTCCATGACAACGGACAGCAGTTAT 138
Query 360 ACCACTCTGCAACGTGTCGCAGCGCTGGAACGTTCCGGAATGCAAATCAGTCGTCACTCA 419||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 137 ACCACTCTGCAACGTGTCGCAGCGCTGGAACGTTCCGGAATGCAAATCAGTCGTCACTCA 78
Query 420 CTGGTTTCATCATATCTGGCGTTAATGGAGTTCAGTGGTAATACAA 465||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 77 CTGGTTTCATCATATCTGGCGTTAATGGAGTTCAGTGGTAATACAA 32
53
Discussion
54
1- Les protocoles de recherche de E. coli O157:H7 dans la viande.
Environ 93 % des souches de E. coli d'origine humaine fermentent le sorbitol en 24 heures et
sont β-glucuronidase positives; à l'inverse, E. coli O157:H7 ne fermente pas le sorbitol (Tesh
et al., 1991 ; Neaves et al., 1994) et sont β-glucuronidase négatives.
L’absence de fermentation du sorbitol a, par exemple, justifié l'utilisation de la gélose
MacConkey au sorbitol (SMAC) qui a subi plusieurs modifications dans l'objectif
d'augmenter le caractère sélectif vis-à-vis de O157:H7. Ainsi les méthodes biochimiques sont
intéressantes et fondamentales pour la détection d’E. coli O157:H7(Barka et Kihal, 2010).
La plupart des études faites sur la viande bovine concerne en premier lieu la viande hachée,
d’autres études concernent des prélèvements dans des abattoirs ; nous allons comparer nos
résultats avec ceux d’autres auteurs ayant utilisés le même protocole de recherche.
Sur les 756 prélèvements testés 5 E. coli O157 :H7 ont été isolées soit un taux de 0.66 %, le
taux des E. coli O157:H7 est variable d’un pays à un autre. La seule étude connue concernant
les E. coli O157:H7 en Algérie à été faite en 2006 par Chahed après avoir analysé 230
échantillons de carcasse bovine provenant d’abattoir dans la région d’Alger ou elle à isolée 2
E. coli O157:H7. en France on à détecté un taux de 0.12 % dans de la viande hachée
industrielle (Vernozy-Rozand et al., 2002) et 1,9 % des carcasses (Rogerie et al., 2001), en
Suisse aucune E. coli O157:H7 n’a été détecté à partir de 400 échantillons (Fantelli et
Stephan, 2001). En Espagne 1 % des échantillons étaient porteur de E. coli O157:H7
(Azucena Mora et al., 2007), 1 % et 0.4 % en Angleterre (Chapman et al., 2000 ; Chapman et
al., 2001); 1 % en Hollande (Heuvelink , 1999) ; 0.4 % et 2 en Italie (Conedera et al., 2004 ;
Stampi et al., 2004) ; 0.3% en République Tchèque (Lukásová et al., 2004).
D’autres études ont révélées des taux beaucoup plus élevés notamment celle faite en
Argentine avec 3.8% (Chinen et al., 2001), Chine 5% (Zhou et al., 2002) , Pérou 19% (Mora
et al., 2007) , et au Canada, avec deux études respectivement de 2% et 29% (Doyle et
Schoeni , 1987 ; Sekla et al., 1990).
Selon (Nastasijevic, Mitrovic et Buncic, 2009) la présence de E. coli O157: H7 est en général
le résultat d'une contamination pendant le processus d'abattage. Il a été précédemment
rapporté que cette contamination est corrélée avec la présence de STEC dans les selles cuirs et
(Elder et al., 2000).
55
2- Etude des caractéristiques biochimiques des E. coli O157:H7
Le but principal de l’étude de ces facteurs de croissance (température, pH et Aw) est de voir
leur effet dans l’environnement gastrique de l’homme qui constitue un milieu à pH acide est
dont la température corporelle est de 37°C.
Le taux de croissance des E. coli O157:H7 augmente lorsque la température augmente. La
température optimale de ce germe est de 37°C et la température maximale permettant son
développement est de 45°C (Doyle et Schoeni, 1984). En milieu synthétique de laboratoire, la
majeure partie des souches de STEC étudiées montre une température optimale de croissance
de 40°C (Gonthier et al., 2001 ; Nauta et Dufrenne, 1999), une température minimale de
croissance de 6-7°C et une température maximale de croissance à 45.5°C (Nauta et Dufrenne,
1999 ; Gonthier et al., 2001 ; Bouvier, 2011).
Le pH minimal (obtenu avec de l’acide chlorhydrique) permettant la croissance d’E. coli
O157:H7 est de 4.5 quand les autres paramètres physico-chimiques sont favorables (Glass et
al. 1992 ;Abdul-Raouf et al., 1993 ; Cheville et al., 1996), les valeurs de pH optimum sont de
6,9 et de pH maximum de 9,4 (Nauta et Dufrenne, 1999).
Le gène rpoS régule les gènes mis en œuvre pour la survie de la bactérie en milieu acide et
permet une survie de la bactérie à des pH inférieurs à 2.5 pendant plus de 2 heures. Une fois
induite, la résistance à l’acidité est stable pendant le stockage au froid. La bactérie en phase
stationnaire de croissance est 1000 fois plus résistante à l’acidité qu’en phase exponentielle et
n’a pas besoin d’un contact ultérieur avec l’acidité pour maintenir cette résistance. Des
mutations des gènes rpoS semble également impliquée dans la résistance acide de O157:H7
(Waterman and Small, 1996 ; De Biase et al., 1999; Price et al., 2000; Price et al., 2004).
Concernant l’effet de l’activité de l’eau sur la croissance des STEC on ne dispose que de très
peu d’informations. Les études ont essentiellement porté sur des milieux et des produits dont
l’Aw était contrôlée par l’ajout de NaCL. L’activité de l’eau minimale pour la croissance d’E.
coli O157:H7 est de 0.953 (Nauta et Dufrenne, 1999). L’Aw optimun pour sa croissance est
de 0.995 selon les données de l’International Commission on Microbial Spécification for
Foods (ICMSF 1996).
3- Interactions avec les bactéries lactiques
Toutes nos souches ont été inhibées en contact avec les bactéries lactiques utilisées. Nous
avons utilisé des Lactobacillus qui sont les espèces les plus majoritairement isolées à partir de
lait (Badis et al, 2004; Marroki et al, 2011) D’autres études ont montrés l’inhibition des
56
bactéries gram négatif par des bactériocines (Skyttä et al., 1991; Malik et al., 1995; Todorov
et al., 2004) ; des bactéries gram positif (Mami et al, 2010) ; ainsi que sur des espèces type
Listeria monocytogenes qui sont parfois présent dans les produits laitiers (Moussa Boudjemaa
et al 2004)
Actuellement pour éviter la contamination des aliments par les bactéries pathogènes en
l’occurrence les E. coli O157 :H7 certains auteurs recommandent d’utiliser en plus des
barrières employées dans la sécurité alimentaire sont la température, l'activité de l'eau (Aw),
le pH, le potentiel redox (Eh), les conservateurs chimiques, les emballages sous vide,
l'atmosphère modifiée, la haute pression hydrostatique (HHP), les UV et la flore compétitive
(LAB productrice de composés antimicrobiens) ; l'utilisation combinée des bactériocines
produites par la flore compétitive avec les méthodes de conservation citées ci-dessus pour
créer une série d'obstacles lors du processus de fabrication afin de réduire la détérioration des
aliments par les micro-organismes. En effet, ces différentes barrières influent positivement sur
l'activité de nombreuses bactériocines en augmentant la perméabilité des membranes
cellulaires des bactéries cibles (Chawla et al., 2004, Ananou et al., 2009).
4- Etude de l’antibiorésistance
Une seule résistance à été observée à la tétracycline pour la souche 25. Ces résultats diffèrent
d’autres obtenus par des études à travers le monde ou un taux assez élevé de résistance a été
observé. Des études récentes ont révélé une tendance accrue des E. coli O157: H7aux
antibiotiques. (Amornrut et al., 2000; Magwira et al., 2005).
Par exemple, en 2005, environ 35% des E. coli O157: H7 isolées de viandes et produits carnés
à Gaborone, Botswana, étaient résistants à la céphalothine, sulfatriad, le sulfate de colistine et
la tétracycline (Magwira et al., 2005). En Corée une étude a révélé un taux de 71% de
résistance à au moins un antibiotique ; c’est le taux le plus élevé qui a été reporté à l’heure
actuelle (Ju-Yeon You, et al., 2006). Une étude américaine a montré un taux de résistance de
20% à la tétracycline et 14% aux sulfamides (Schroeder et al., 2002).
5- Méthodes génétiques de détection des E. coli O157:H7
Dans cette étude toutes les souches isolées possèdent les gènes stx2 et ehxA, une seule souche
ne possédant pas le gène eae mais en revanche elle possède c’est la seule souche qui possède
le gène stx1. On peut en conclure que toutes les souches isolées portent un ou plusieurs gènes
de pathogénicité. Ces résultats sont semblables à ceux obtenus par (Blanco et al., 1996a,
57
1997) , 0% des vaches, 0,6% des veaux, cependant inferieur obtenus par (Oporto et al., 2008)
chez les veaux (6.7%) et (Sánchez et al., 2010) 2.8% des 268 prélèvements analysés.
Dans une étude menée par Khan en 2002 en Inde, il a trouvé 44.5% des souches isolées
portant les à la fois les stx1 et stx2.
Le gène stx2 et les gènes eaeA sont plus fréquemment isolés que stx1 dans la plupart des
études réalisées dans le Etats-Unis, le Japon et les pays européens (Zhao et al., 1995;
Sekiya,1997; Bonardi et al., 1999; Barkocy-Gallagher et al., 2001;Chapman et al., 2001;
Johnsen et al., 2001; Keen et Elder, 2002). Dans une étude américaine le gène stx1 n’as été
detecté dans aucun des échantillons alors que 93.1 des souches isolées portait le gène VT2
(Keen et Elder, 2002).
Certaines études montrent que la présence du gène stx2 était la plus part du temps associée à
la présence du gène eaeA. (Sekiya, 1997; Barkocy-Gallagher et al., 2001; Chapman et al.,
2001; Johnsen et al., 2001; Omisakin et al., 2003).
Très peu d’études ont montré la présence dans la même souche les gènes stx1, stx2 et eaeA
(Chapman et al., 2001; Guyon et al., 2001; Tutenel et al., 2003).
Dans notre étude le gène stx2 et le gène eaeA ont été détectés dans la plupart des
souches analysées. Ceci est important car la présence de ces gènes est fortement associée aux
maladies humaines. (Boerling et al., 1999; Philips, 1999).
58
Discussion générale
59
Le travail réalisé dans ce mémoire était un travail de longue haleine, à cause de toutes les
difficultés qu’on à rencontrées depuis le commencement.
En effet il a fallut beaucoup de temps pour réunir assez de prélèvements pour avoir un
échantillonnage conséquent.
Les protocoles de recherche d’E. coli O157 :H7 sont plus au moins différents mais utilisent
les mêmes réactifs.
Pour l’isolement nous avons utilisé le protocole ISO 16654:2001, il permet avec une étape
d’enrichissement, qu’on considère la plus importante, d’augmenter les chances d’isoler des E.
coli O157 :H7, en effet l’ajout des trois antibiotiques agissent dans le milieu d’enrichissement
permet, en ralentissant la croissance de la flore annexe, une meilleure croissance du
pathogène, évitant ainsi l’apparition de « faux négatifs ».
Une fois cette étape effectuée, l’ensemencement sur SMAC qui est actuellement le milieu de
référence pour l’isolement des STEC a permis de voir des colonies sorbitol négatives qui avec
la β-glucuronidase sont les deux principaux caractères qui permettent d’identifier les E. coli
O157 :H7. Les cinq souches que nous avons isolées à partir des 756 prélèvements effectués
répondent à ces principaux critères. L’identification biochimique en utilisant le système API
20E nous à montrée qu’en est en présence de 2 chimiotypes différents.
L’étude de la croissance de nos souches en fonction des 3 paramètres (Température, pH et
aw), qui sont très important pour connaitre la réaction de la bactérie en contact avec l’homme
ou lors du stockage de la viande, nous a renseignées sur les critères qui permettent une
croissance optimale de nos souches. Ainsi pour ces 3 facteurs la croissance optimale est
voisine de celle des E. coli. Cependant la recherche du pouvoir hémolytique sur milieu au
sang frais était négatif caractère qui s’est révélé positif lors de la détection du gène ehxA
codant pour l’entérohémolysine. Au vu de ce test, on peut dire qu’il ne s’agit pas de la même
enzyme hémolytique.
L’interaction avec les bactéries lactiques qui est un domaine de plus en plus étudié ces
dernières années, a permis de constater que les 5 souches isolées ont été inhibées par des
bactériocines. Ce résultat est intéressant sachant qu’on pourrait purifier et introduire ces
bactériocines en les utilisant comme inhibiteurs de croissance d’E. coli O157 :H7 durant le
stockage de la viande.
Par ailleurs, la caractérisation génétique des souches isolées en recherchant les gènes de
toxicité, stx1, stx2, eae et ehxA, était très importante d’une part pour confirmer qu’il s’agit
bien d’ E. coli O157 :H7 et d’autre part pour confirmer le caractère pathogène de ces souches.
60
Ceci nous a amené dresser un profil plasmidique qui a révélé la présence de deux plasmides
dont la taille est de 600 et 700 bp.
Enfin le séquençage des souches oligonucléotides des gènes de virulence laisse apparaitre des
séquences parfaitement alignées donc stable qui peuvent être transmises à la descendance sans
mutation possible.
61
Conclusion
62
L’épidémie qui à touchée l’Allemagne en mai 2011 à donner un aperçu sur le pouvoir
pathogène des Escherichia coli appartenant au groupe STEC. En effet plus de 2325 infections
à STEC dont 642 cas de SHU ont été rapportés à l’Institut Robert Koch (Berlin) et ceci en
l’espace de deux mois.
Le sérotype O157 :H7 reste à ce jour le plus étudié à travers le monde car il a été la cause de
milliers de d’infections et de dizaines de décès car il été isolé non seulement dans la viande
bovine mais presque dans tous les types d’aliments consommés par l’homme.
Nos travaux ont permis de déterminer la prévalence de la contamination de la viande surgelée
d’importation en Algérie par E. coli O157 :H7 car peu d’études ont été faites sur ce sujet et sa
recherche au niveau des laboratoires de contrôle de qualité, ne se fait pas de façon routinière.
Les méthodes de détection phénotypique et biochimiques ont montré la présence de cinq E.
coli O157 :H7 provenant de trois pays et possédant deux chimiotypes différents. L’étude de
l’influence des facteurs physico chimiques sur la croissance, (température, pH et Aw,) à
révélé des valeurs optimales proches des E. coli qui nous permettront de mieux connaitre la
réaction de ces E. coli O157 :H7 à ces facteurs. L’étude de l’interaction avec les bactéries
lactiques à montré la sensibilité de ces bactéries à des substances produites par les LAB,
beaucoup d’auteurs disent qu’il s’agit de bactériocines et tendent à les employer en industrie
alimentaire lors de la conservation des aliments pour inhiber la flore pathogène si présente
lors du stockage.
La caractérisation génotypique qui est devenu une étape contournable dans toute étude, nous à
montré l’aspect dangereux de ces bactéries après avoir décelé des gènes de toxicité stx1, stx2,
eae et ehxA qui sont considérés comme les gènes responsables de graves maladies pouvant
causer la mort des personnes infectées, chez les souches isolées. Le séquençage des gènes de
toxicité nous montre un pourcentage d’alignement très élevé qui témoigne de la stabilité de
ces gènes au sein de ces bactéries.
Au vu des résultats obtenus il est important de souligner l’importance de la recherche non
seulement des E. coli O157 :H7 mais également des différents sérotypes de STEC pathogènes
dans tous les aliments consommés car ils constituent un risque permanent pour la santé
humaine.
63
Perspectives
64
A la suite de tous ces résultats, on recommande :
- l’application de la recherche systématique non seulement des E. coli O157 :H7 mais aussi
des bactéries appartenant au groupe STEC dans les laboratoires d’hygiène et de contrôle
de qualité en Algérie;
- étudier les interactions avec d’autres bactéries lactiques, et pouvoir isolé et purifier les
bactériocines pour une éventuelle utilisation lors du stockage des aliments ;
- Du point de vue médical, la mise en place d’une recherche systématique de ces bactéries
dans les selles sanglantes ;
- Mettre en place une cellule pour la surveillance du syndrome hémolytique et urémique au
niveau des CHU ce qui permettra d’appréhender l’incidence des infections à E. coli
O157 :H7.
65
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80
ANNEXES
81
Gélose MacCONKEY Sorbitol
Pour 1 litre de milieu :
Tryptone…………………………………………………………………... 17,0 gPeptone pepsique de viande………………………………………………. 3,0 gD-Sorbitol………………………………………………………………… 10,0 gSels biliaires n°3………………………………………………………….. 1,5 gChlorure de sodium………………………………………………………. 5,0 gRouge neutre……………………………………………………………… 30,0 mgCristal violet……………………………………………………………… 1,0 mgAgar agar…………………………………………………………………. 13,5 g
pH final à 25°C : 7,1 ± 0,2.
Mueller-Hinton Agar :Pour 1 litre de milieu :Infusion de viande de boeuf déshydratée………………………………... 300 gHydrolysat de caséine……………………………………………………. 17,5 gAmidon de maïs………………………………………………………….. 1,5 gAgar agar………………………………………………………………… 13 g
pH final : 7,2 - 7,4
Milieu MRS liquide (Man, Rogosa, Sharpe)
Pour 1 litre de milieu :
Peptone de viande………………………………………………….. 10 gExtrait de viande …………………………………………………... 10 gExtrait de levure …………………………………………………… 5 gAcétate de sodium ………………………………………………… 5 gPhosphate bipotassique……………………………………………. 2 gCitrate d’ammonium ……………………………………………… 2 gSulfate de magnésium……………………………………………… 0,1 gSulfate de manganèse……………………………………………… 0,05 gGlucose ……………………………………………………………. 20 gTween 80 (ou teepol ) …………………………………………….. 1 ml
pH final à 25°C : 7,1 ± 0,2.Composition du milieu BHIB (Brain Heart Infusion Bouillon)Pour 1 litre de milieu :
Infusion de cervelle de veau………………………………………. 12,5 gInfusion de coeur de bœuf………………………………………... 5gProtéose-peptone…………………………………………………. 10gGlucose…………………………………………………………… 2gChlorure de sodium………………………………………………. 5gPhosphate disodique…………………………………………….... 2,5gpH final à 25°C : 7,1 ± 0,2.
82
Composition du milieu TSB (Tryptic Soy Broth)Pour 1 litre de milieu :
Tryptone.......................................................................................... 17,0gPeptone papaïnique de soja………………………………………. 3,0gGlucose…………………………………………………………… 2,5gChlorure de sodium………………………………………………. 5,0gPhosphate dipotassique…………………………………………... 4,0g
pH final 25°C : 7,4 ± 0,2.
Composition milieu LB (Luria Bertani)Pour 1 litre de milieu :
Tryptone…………………………………………………………… 10 gExtrait de levure…………………………………………………… 5gNaCl………………………………………………………………. 10g
pH final : 7,2
Composition Eau peptonée tamponnéePour 1 litre de milieu :Peptone............................................................................................. 10,0gSodium chlorure…………………………………………………… 5,0gPhosphate disodique hydraté……………………………………… 9,0gPhosphate monopotassique……………………………………….. 1,5gPhosphate disodique anhydre…………………………………….. 3,56g
pH final à 25 °C : 7,2 ± 0,2.
Eau peptonée tamponnée + Antibiotiques :Pour 1 litre de milieu :Vancomycine.................................................................................... 8 mgCéfixime…………………………………………………………... 0,05 mgCefsulodine……………………………………………………….. 10,0 mg
MUG- 4-méthylumbelliféryl-ß-D glucuronide ....................................................50,0 mgReprendre le lyophilisat en y ajoutant aseptiquement 5 mL d'eau distillée.Agiter le flacon plusieurs fois de façon à assurer une complète dissolution, tout en évitant laformation de mousse.-Au moment de la réhydratation de la poudre, ajouter 1 mL de supplément à :100 mL de gélose de MacConkey,
83
Tampon de lyse
KCl 1M 2ml(50mM)
TRIS HCl pH 8.0 2M 200 μl (10mm)
MgCl2 50mM 1.2 ml (1.5 mM)
NONIDET P40 180 μl (0.45%)
TWEEN 20 180 μl (0.45%)
dH2O 36.4 ml
84
Tableau 19. Croissance des souches isolées à différentes températures (mesure en
mcfarland, 0.5macfarland= 108 ufc/ml)
°C
N
30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
25 3.8 4.0 3.9 3.8 4.1 4.1 3.9 4.0 4.1 4.0 3.9 3.3
26 4.0 3.9 4.1 4.2 4.2 4.1 4.0 4.0 4.4 4.2 4.1 3.3
27 3.7 3.6 3.7 3.8 4.0 4.2 3.7 3.9 3.9 3.9 4.2 3.3
28 3.7 4.0 4.0 3.9 4.2 4.0 3.9 4.0 4.2 4.1 4.0 3.3
30 3.7 3.9 4.1 3.9 4.2 4.1 3.8 4.0 4.0 3.9 3.8 3.2
Tableau 20. Croissance des souches isolées à différents pH (mesure en mcfarland,
0.5macfarland= 108 ufc/ml)
pH
N
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
25 1.2 0.5 2.3 3.1 3.9 3.9 3.5 3.0 0.8 0.5
26 0.4 0.5 2.3 3.1 3.9 3.9 3.4 3.0 0.7 0.5
27 1.3 0.5 1.8 2.9 3.2 3.7 3.3 2.9 0.8 0.3
28 1.1 0.7 2.3 3.2 3.6 3.7 3.5 2.7 0.8 0.1
30 1.1 0.7 1.9 3.0 3.7 3.7 3.4 2.9 0.7 0.3
85
Tableau 21. Croissance des souches isolées à différentes concentrations de NaCl (mesure en
mcfarland, 0.5macfarland= 108 ufc/ml)
Aw
N
0.995 0.99 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90 0.86
25 4.1 4.0 3.9 3.8 3.4 1.2 1.0 0.3
26 4.0 4.0 4.0 3.9 3.6 1.9 1.1 0.4
27 4.0 3.9 4.0 3.8 3.5 1.6 1.0 0.3
28 4.1 4.0 3.9 3.8 3.4 1.6 1.0 0.3
30 4.2 4.1 4.0 3.8 3.5 1.4 0.9 0.2
Tableau 22. Valeurs critiques des diamètres des zones d’inhibition pour les Entérobactéries(espèce ruminants)
Antibiotique Sigle Chargedu disque
Diamètres critiques(mm)
R S
Ampicilline AM 10 μg ≤ 13 ≥ 17
Ceftiofur EFT 30μg ≤ 17 ≥ 21
Gentamycine CN 10μg ≤ 12 ≥ 15
Néomycine N 30 μg ≤ 13 ≥ 18
Kanamycine KAN 30 μg ≤ 15 ≥ 17
Trimethoprime/sulfamethoxazole SXT 1.25/23.75μg
≤ 10 ≥ 16
Tétracycline TE 30 μg ≤ 14 ≥ 19
Acide nalidixuque NA 30 μg ≤ 13 ≥ 19
Fluméquine UB 30 μg < 21 ≥ 25
86
Enrofloxacine ENR 5 μg ≤ 16 ≥ 21
Norfloxacine NOR 10 μg ≤ 12 ≥ 17
Ofloxacine OFX 5 μg ≤ 22 ≥ 25
Colistine CS 10 μg ≥ 15
Nitrofurantoine FT 300μg ≤ 14 ≥ 17
Chloramphénicol C 30μg ≤ 12 ≥ 18
Céphalotine KF 30μg ≤ 12 ≥ 18
Tableau 23. Température, pH et aw optimales pour les souches isolées.
T° pH aw25 38 6,5 0,99526 38 6,5 0,99527 35 7 0,99528 38 7 0,99530 34 6,5 0,995
Tableau 24. Croissance des souches isolées (mesure en mcfarland, 0.5macfarland= 108
ufc/ml) à Température, pH et Aw optimales en fonction du temps (heures)
0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 14h 16h 18h 20h 24h25 0,5 1 1,8 3,8 4 4,1 4,1 4 3,9 3,7 3,7 3,426 0,5 0,9 1,9 3,9 4,1 4,2 4,2 4,1 4 3,8 3,7 3,327 0,5 1 2,1 4 4,1 4,3 4,2 4,2 4,1 3,9 3,8 3,628 0,5 1,1 2,3 4,2 4,2 4,2 4,1 4,1 4 3,8 3,8 3,530 0,5 0,8 1,7 3,7 4,2 4,2 4,2 4,1 4 3,9 3,8 3,4
