Upload
mitha-ghaly-slaluh
View
118
Download
1
Embed Size (px)
DESCRIPTION
spektroskopi analitik
Citation preview
Spektroskopi analitik
Spektroskopi analitik adalah ilmu mengenai penentuan jumlah senyawa yang terdapat di
dalam suatu sampel dengan cara mengukur secara ajurat/banyaknya cahaya yang diserap atau
diemisikan oleh atom-atom atau molekul-molekul yang terdaoat di dalam sampel tersebut.
Spektroskopi berbeda-beda, bergantung pada jenis atau panjang gelombang radiasi
elektromagnetik yang diserap atau diemisikan oleh atom atau molekul. Penjelasan rincian
mengenai smua jenis analisis instrumental modern berada di luar cakupan buku ini, akan
tetapi, kegunaan spektroskopi dalam analisis obat-obatan sangat penting dan akan dijelaskan.
Cahaya merupakan suatu bentuk radiasi elektromagnetik karena terdiri atas komponen
elektrik dan magnetik yang berosilasi dalam arah yang saling tegak lurus dan tegak lurus
terhadap arah perjalanan radiasi di sepanjang ruangan (lihat Gambar 7.1).
Gambar 7.1 Diagram radiasi elektromagnetik
Spektrum lengkap radiasi elektromagnetik ditunjukkan pada Gambar 7.2, dengan
kisaran mulai dari gelombang radio dan televisi berenergi rendah hingga sinar gamma yang
berenergi sangat tinggi. Bagian terkencil spectrum elektromagnetik yang dapat dideteksi
oleh mata manusia (kira-kira 400-700 nm) disebut spektrum tampak, dan spektroskopi
yang dilakukan pada panjang gelombang ini dinamakan spektroskopi tampak atau
“kolorimetri”. Bagian spektrum elektromagnetik yang melewati bagian ujung merah
spektrum tampak, disebut bagian infra merah, yang memiliki panjang gelombang lebih
panjang dan energi lebih rendah dari cahaya tampak. Sama halnya, bagian spektrum yang
melewati ujung violet, spektrum tampak, disebut bagian ultraviolet, yang memiliki yang
memiliki panjang gelombang lebih pendek dan energi lebih besar dari cahaya tampak.
1
Radiasi eloktromagnetik dapat dianggap sebagai suatu bentuk gelombang yang
mengitari ruangan, dan jenis radiasi yang digunakan pada suatu percobaan tertentu,
bergantung pada informasi yang dibutuhkan dari percobaan tersebut. Salah satu istlah pada
radiasi elektromagnetik yang sering digunakan adalah panjang gelombang cahaya. Panjang
gelombang didefinisikan jarak dari satu puncak gelombang ke puncak berikutnya (dari
palung ke palung). Dan biasanya dinyatakan nanometer (nm, 10-9 m) agar diperoleh bilangan
terukur yang masuk akal (Gambar 7.3). Simbol untuk panjang gelombang adalah λ, yang
berasal dari huruf Yunani ”lambda”. Energi yang terkandung dalam masing-masing kuantum
energi dari berkas radiasi pada panjang gelombang tertentu berbading terbalik dengan
panjang gelombang. Ini berarti gelombang radio dengan panjang gelombang beberapa ratus
meter memiliki energi yang rendah, sementara sinar gamma dan sinar -X adalah bentuk
radiasi dengan panjang gelombang pendek dan berenergi tinggi.
Gambar 7.3 Panjang gelombang cahaya.
Istilah lain yang sering digunakan dalam spektroskopi adalah bilangan gelombang dan
frekuensi. Bilangan gelombang didefinisikan sebagai jumlah gelombang per satuan panjang
(biasanya dinyatakan dalam satuan : “balikan sentimeter” (cm-1, 1 cm = 10-2 m) dan
merupakan balikan panjang gelombang dalam cm, yaitu 1/λ. Penggunaan bilangan
gelombang biasanya terbatas pada spektroskopi inframerah.
2
Frekuensi didefinisikan sebagai jumlah gelombang yang diemisikan dari sumber per
detik; satuan frekuensi adalah hertz (Hz; 1 Hz = 1 gelombang per detik ), dan simbol yang
digunakan adalah v (hurut Yunani “nu”).
Frekuensi dan panjang gelombang dihubungkan oleh suatu tetapan yang disebut
kecepatan cahaya dengan simbol c. Nilai ini (kira-kira 3 x 108 m/dtk) merupakan hasil kali
antara frekuensi dan panjang gelombang, yaitu :
Kecepatan cahaya = frekuensi x panjang gelombang
atau
c = v x λ
Karena frekuensi dan bilangan gelombang berbading terbalik dengan panjang gelombang,
energi foton berbanding lurus dengan keduanya.
Jika suatu atom molekul terpanjang dengan radiasi elektromagnetik, energy dapat
diserap melalui salah satu dari ketiga cara di bawah ini:
1. Energi dapat menaikkan elektron dari orbital ikatan menuju orbital antiikatan yang
berenergi lebih besar sehingga disebut transisi elektronik.
2. Energi dapat bekerja untuk meningkatkan getaran atau osilasi atom di sekitar ikatan
kimia. Ini diistilahkan sebagai transisi getaran.
3. Energi dapat menyebakan peningkatan putaran atom di sekitar ikatan kimia, yaitu
transisi putaran.
Perbedaan energi di antara efek-efek ini sangat besar, energi yang dibutuhkan untuk
menghasilkan transisi getaran kurang lebih 100 kali lebih besar dari yang dibutuhkan untuk
menghasilkan transisi putaran. Sama halnya, transisi elektronik memerlukan energi hampir
100 kali lipat lebih besar dari yang diperlukan untuk transisi getaran. Hal ini penting karena
dua alasan : pertama, tiap transisi elektronik harus dikaitkan dengan transisi getaran dan
putaran; kedua, karena transisi elektronik memerlukan energi yang sangat banyak, hanya
cahaya dengan panjang gelombang pendek yang memiliki energi yang cukup untuk dapat
melakukan transisi elektronik. Sebagai contoh, radiasi inframerah dapat mencapai getaran
dan putaran yang meningkat di sekitar ikatan kimia, tapi energi yang dimiliki tidak cukup
besar untuk menaikkan elektron ke orbital antiikatan dan menghasilkan transisi elektronik.
Ultraviolet atau cahaya tampak umumnya diperlukan untuk menghasilkan transisi elektronik.
3
Walaupun spektroskopi dapat dilaksanakan pada jenis senyawa yang berbeda-beda,
dengan konfigurasi elektronik yang berbeda-beda, kebanyakan dari pekerjaan kuantitatif (dan
semua contoh yang ada di dalam buku ini) akan melibatkan sistem elektron π (pi). Elektron π
(juga disebut “elektron gerak”) adalah elektron yang ditemukan dalam ikatan-ikatan rangkap.
Ikatan rangkap karbon-karbon terdiri atas satu ikatan σ (“sigma”) dan satu ikatan π,
sedangkan ikatan rangkap tiga terdiri atas satu ikatan σ dan dua ikatan π. Elektron-elektron π
ini dapat dieksitasi dan dinaikkan ke orbital antiikatan berenergi tinggi dengan mudah. Jika
elektron jatuh kembali keadaan dasar, energi ini dilepaskan dan dapat diukur dengan
spektrofotometer.
Bagian molekul yang bertanggung jawab terhadap penyerapan cahaya disebut kromofor
(lihat gambar 7.4), dan terdiri atas ikatan rangkap dua atau rangkap tiga, terutama jika ikatan
rangkap tersebut terkonjugasi (ikatan rangkap dan ikatan tunggal pada strukturnya berselang-
seling). Semakin panjang ikatan rangkap dua atau rangkap tiga terkonjugasi di dalam
molekul, molekul tersebut akan semakin mudah menyerap cahaya. Senyawa-senyawa
aromatik yang mengadung cincin benzen akan menyerap cahaya ultraviolet dengan panjang
gelombang 254 nm, dan sifat ini digunakan dalam berbagai analisis spektroskopik dan pada
detektor untuk sistem kromatografi. Jika kromofornya lebih luas, molekul akan tereksitasi
oleh cahaya berenergi rendah, hingga jika kromofornya sangat luas, energi yang berasl dari
cahaya tampak cukup kuat untuk mengeksitasi elektron kromofor dan senyawa tersebut akan
menyerap cahaya tampak.
Jenis molekul ini, yang menyerap cahaya pada bagian tampak dari spektrum
elektromagnetik, dikatakan berwarna karena mata kita akan mendeteksi cahaya yang
dipantulkan balik dari senyawa tersebut, yang akan menjadi warna komplementer terhadap
cahaya yang diserap. Ingat, cahaya putih berasal dari gabungan seluruh warna pelangi, dan
dapat terbagi menjadi warna-warna konstituennya oleh prisma atau tetesan air. Sebagai
contoh, jika molekul zat warna menyerap cahaya dengan panjang gelombang merah, jingga,
dan kuning, mata kita akan mendeteksi cahaya pantulan biru, hijau, dan ungu dan kuta akan
melihat zat warna tersebut berwarna biru. Sama halnya, zat warna berwarna merah akan
meyerap cahaya biru dengan panjang gelomban pendek dan memantulkan merah dan jingga
ke mata kita. Sifat-sifat ini dimanfaatkan pada penggunaan indikator untuk titrasi (lihat Bab
6) yang spektrum penyerapan (serta warna) indikatornya berubaha sesuai dengan pH larutan.
4
O
O
Benzen Antrakuinolon
O CH3
HO S N = N N
O CH3
Jingga metal
Gambar 7.4 Contoh-contoh kromoform
Efek pH terhadap spektrum
Jika suatu grafik tingkat penerapan cahaya (diukur sebagai yang diistilahkan dengan
“serapan”, akan didefinisikan pada halaman 162) diplotkan terhadap panjang gelombang,
akan diperoleh spektrum penyerapan lengkap suatu molekul (Gambar 7.5). Panjang
gelombang dengan serapan (A) terbesar disebut λmaks (dibaca “lambda maks”), dan
merupakan karakteristik kromofor. λmaks suatu senyawa terkadang digunakan dalam British
Pharmacopoeia untuk mengidentifikasi obat-obatan dan senyawa-senyawa yang belum
dikenal.
Gambar 7.5 Plot serapan cahaya vx λ
5
Panjang gelombang pada saat λmaks terjadi akan berupa suatu tetapan untuk tiap senyawa,
tapi seperti kebanyakan “tetapan” di dalam ilmu sains, λmaks dapat mengalami perubahan. Hal
ini tidak sepenuhnya berita buruk, karena banyak informasi yang berguna mengenai senyawa
dapat diperoleh hanya dengan mengamati geseran yang terjadi pada λmaks, contohnya, ketika
suatu senyawa mengalami ionisasi.
Geseran λmaks menuju panjang elombang yang lebih panjang dikenal sebagai geseran
batokromik atau geseran merah, karena merah adalah warna bagian ujung pada panjang
gelombang yang panjang, spektrum tampak. Geseran batokromik biasanya terjadi karena
kerja auksokrom. Auksokrom adalah gugus fungsi yang menempel pada kromofor yang tidak
menyerap energi cahayanya sendiri, tetapi memengaruhi panjang gelombang cahaya yang
diserap kromofor. Contoh auksokrom di antaranya adalah gugus –NH2, -OH, -SH. Gugus-
gugus fungsi ini memiliki pasangan elektron tidak terikat (non-bonded electron) yang dapat
berinteraksi dengan elektron π pada kromofor dan memungkinkan terjadinya penyerapan
cahaya yang memiliki panjang geombang yang lebih panjang. Contoh yang baik dari efek ini
adalah membandingkan nilai λmaka benzen dan anilin (juga disebut fenilamin atau
aminobenzen), ditunjukkan pada Gambar 7.6.
NH2
Benzen Anilin
Gambar 7.6 Strukur benzena dan anilin.
λmaks benzen adalah 204 nm, sedangkan λmaks anilin adalah 230 nm. Hal ini disebabkan
pasangan elektron menyendiri pada NH2 yang berinteraksi dengan elektron cincin untuk
meningkatkan densitas elektron di keseluruhan cincin, terutama pada posisi orto dan para dari
cincin, seperti yang ditunjukkan pada gambar 7.7.
6
∙∙ + + +
N NH2 NH2 NH2
-
-
Gambar 7.7 Efek + M analin
Efek mesomerik (atau M) ini terlihat jika anilin ditempatkan dalam larutan dengan pH 8-
14, yaitu ketika anilin basa tidak terion. Jika anilin ditempatkan di dalam larutan dengan pH
< 7 , λ maks kembali ke nilai sebenarnya yang diperoleh untuk benzen (203 nm). Dalam hal ini,
anilin di dalam larutan asam bereaksi dan membentuk garam anilinium. Pasangan elektron
menyendiri pada nitrogen kini terlibat dalam pembentukan ikatan dengan ion H+ dan tidak
lagi berfungsi sebagai auksokrom. Struktur anilin hidroklorida dutunjukkan pada Gambar 7.8.
+
NH3 Cl-
λ maks = 203 nm
Gambar 7.8 Struktur anilin hidroklorida dan nilai λ maks –nya.
Geseran λmaks menuju panjang gelombang yang lebih pendek disebut dengan efek hipsokromik atau geseran biru, dan biasanya terjadi jika senyawa dengan auksokrom basa terion, dan pasangan elektron menyendirinya tidak lagi dapat berinteraksi dengan elektron-elektron kromofor. Efek hipsokromik dapat juga terlihat jika spektrum digunakan pada pelarut-pelarut berbeda atau pada suhu elevasi. Jenis gesekan spektrum ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi obat-obatan yang menngandung gugus fungsi amin aromatic, misalnya anestetik benzokain lokal (lihat Gambar 7.9).
O
H2N C
O C2H5
7
Gambar 7.9 Struktur Benzokain.
Efek batokromik dan hipsokromik jarang terlihat dalam isolasi. Efek batokromik
biasanya terkait dengan adanya peningkatan intensitas cahaya yang diserap, sedangkan efek
hipsokromik biasanya terjadi dengan adanya penurunan serapan. Efek yang menyebabkan
terjadinya peningkatan serapan cahaya disebut efek hiperkromik, sedangkan efek yang
menyebabkan penurunan intensitas serapan cahaya disebut efek hipokromik. Mahasiswa
sering mengalami kebingungan dalam mengingat keempat kata yang digunakan untuk
menggambarkan geseran λ maks. Cara yang terbaik untuk mengingat istilah-istilah ini adalah
mungkin dengan mengingat hiper- berarti suatu peningkatan, hipo- suatu penurunan, dan
gesekan menuju panjang gelombang yang lebih panjang disebut geseran merah, sedangkan
geseran menuju panjang gelombang yang lebih pendek disebut geseran biru atau dengan
alternatif lain, yaitu dengan mengingat Gambar 7.10. Efek-efek hiperkromik digunakan
dalam penelitian obat-obatan antikanker untuk mengukur banyaknya obat yang diberikatan
dengan DNA. Jika larutan dupleks atau untai ganda, DNA, dipanaskan dengan hati-hati,
heliks ganda akan mulai terbuka. Sehingga memanjakan basa heterosiklik pada pusat
dupleks. Melalui percobaan dapat diamati bahwa jika serapan larutan DNA pada panjang
gelombang 260 nm maningkat, efek hiperkromik akan timbul. Obat-obatan yang terikat
dengan DNA menstabilkan molekul dan mengurangi tingkat hiperkromisitas yang teramati.
Gambar 7.10 Perubahan yang terjadi pada λmaks.
Obat-obatan yang mengandung gugus-gugus fenolik, misalnya perasetamol (lihat
Gambar 7.11), juga menunjukkan geseran spektrum pada ionisasi. Pada fenol, yang
merupakan suatu asam lemah dengan pKa kira-kira 10, ionisasi meningkat intensitas
penyerapan cahaya dan posisi λmaks bergerak menuju panjang gelombang yang lebih panjang.
Ini terjadi karena ionisasi dan hilangnya atom H dalam bentuk ion H+ menghasilkan muatan
negatif penuh pada oksigen (ion fenoksida) yang dapat berinteraksi dengan cincin secara
8
lebih efektif bila dibandingkan dengan pasangan elektron menyendiri yang terdapat pada
molekul yang tidak terion. Untuk fenol ditunjukkan pada Gambar 7.11.
O
H C N CH3
OH
Parasetamol
OH O-
+ H+
-
O O O O
- -
-
Gambar 7.11 Struktur parasetamol dan ionisasi fenol.
Peralatan
Alat yang digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang diserap oleh atom atau
molekul disebut spektrofotometer. Jenis spektrofotometer yang tersedia berbeda-beda,
bergantung pada cahaya yang digunakan, apakah berkas cahaya tunggal atau berkas cahaya
sampel dan pembanding secara terpisah, dan apakah pengukurannya dilakukan pada panjang
9
gelombang tetap atau memindai spektrum pada berbagai panjang gelombang. Seperti pada
sebagian besar alat analitik, akurasi, presisi, dan biayanya sangat bervariasi.
Secara umum, semua spektrofotometer memiliki gambaran serupa dengan yang
ditunjukkan pada Gambar 7.12
Sumber cahaya
Sumber cahaya atau lampu yang digunakan adalah dua lampu terpisah yang digunakan
secara bersama-sama, yang mencakup seluruh daerah tampak dan daerah ultraviolet spektrum
elektromagnetik. Untuk cahaya tampak putih, digunakan lampu tungsten. Lampu ini tidak
lebih canggih dibandingkan dengan lampu bola yang filamennya terbuat dari tungsten logam.
Anda munkin saja membaca buku ini dengan menggunakan cahaya dari salah satu lampu ini.
Lampu tungsten memancarkan cahaya dengan panjang gelombang 350 – 2000 nm dan
memadai untuk kolorimetetri.
Untuk senyawa yang menyerap pada daerah ultraviolet spektrum, diperlukan lampu
deuterium. Deuterium merupakan salah satu isotop berat hydrogen yang memiliki satu
neutron lebih banyak dari hidrogen biasa di dalam nukleusnya. Lampu deuterium merupakan
sumber berenergi besar yang mengemisikan cahaya dengan panjang gelombang kira-kira 200
– 370 nm dan digunakan pada semua spektroskopi di daerah ultraviolet spektrum.
Alat dengan panjang gelombang tetap, memungkinkan operator memilih lampu yang
diperlukan untuk suatu penetapan kadar, sedangkan alat pemindaian, yang menghasilkan
suatu plot seluruh spektrum penyerapan sampel, mengganti lampu secara otomatis.
10
Monokromator
Pada sebagian besar pengukuran kuantitatif, cahaya yang digunakan harus
monokromatik, yaitu cahaya dengan satu panjang gelombang tertentu. Cahaya mokromatik
ini didapatkan dengan melewatkan cahaya polikromatik (yaitu cahaya dengan berbagai
panjang gelombang) pada sebuah monokromator. Monokromator pada spektrofotometer
modern ada dua jenis, yaitu prisma atau kisi difraksi.
Prisma adalah suatu potongan kuarsa berbentuk segitiga, yang membiaska (atau
membelokkan) cahaya yang melaluinya. Tingkat pembiasan ini bergantung pada panjang
gelombang cahaya, sehingga seberaas cahaya putih dapat dipecah menjadi warna-warna
komponennya dengan melewati sebuah prisma. Prisma tersebut kemudian diputar untuk
memilih panjang gelombang tertentu yang diperlukan untuk penetapan kadar (Gambar 7.13).
Efek ini identik dengan pembentukan pelangi, saat cahaya dari matahari terpecah menjadi
tujuh komponen warna (merah, jingga, kuning, hijau, biru, nila dan ungu) melalui pembiasan
pada tetesan air hujan.
Gambar 7.13 Diagram sebuah prisma
Kisi difraksi adalah suatu potongan kecil gelas kaca yang di atasnya terdapat banyak
garis berjarak sama, telah dipotong-potong menjadi beberapa ribu per millimeter kisi, dan
menghasilkan suatu struktur yang tampak seperti sisir kecil. Jarak antara potongan-potongan
tersebut kurang lebih sama dengan panjang gelombang cahaya, sehingga seberkas cahaya
polikromatik akan dibiaskan menjadi panjang gelombang komponen-komponennya oleh kisi-
kisi tersebut. Kisi-kisi tersebut kemudian diputar untuk memilih panjang gelombang yang
penetapan kadar untuk pengujian (Gambar 7.14).
Gambar 7.14 Diagram kisi difraksi
11
Detektor
Setelah cahaya melewati sampel, penurunan intensitas yang terjadi karena penyerapan
diukur oleh detektor. Detektor biasanya berupa suatu alat elektronik yang pintar disebut
tabung fotopenggenda (photomultiplier tube) (lihat Gambar 7.15), yang mengubah intensitas
berkas cahaya menjadi sinyal elektrik yang dapat diukur dengan mudah, dan juga bertindak
sebagai amplifier (penguat) untuk meningkatkan kekuatan sinyal secara terus menerus.
Cahaya memasuki tabung dan meabrak katoda, sehingga melepaskan elektron yang bergerak
ke arah anoda yang berada di atasnya. Jika elektron menabrak anoda ini, elektron-elektron
tersebut melepaskan elektron lebih banyak lagi kemudian akan bergerak ke anoda yang
berada di atasnya, dan proses ini akan terulang kembali. Dengan cara inilah terbentuk
kaskade elektron dan sinyalnya diperkuat.
Gambar 7.15 Diagram tabung fotopengganda
Begitu meninggalkan tabung fotopengganda, sinyal elektrik segera dihubungkan dengan
suatu perekam jika diperlukan hasil cetakan, atau yang lebih umum, dihuungkan ke suatu
layar yang dapat menampilkan spektrum penyerapannya. Spektrofotometer modern saat ini
kebanyakan dihubungkan dengan computer pribadi (personal computer) agar dapat
menyimpan banyak data atau untuk menyediakan akses ke tempat kumpulan spektrum yang
tersimpan pada piranti keras computer tersebut. Ini memungkinkan pembandingan spektrum
yang tersimpan di piranti keras dengan spektrum yang dihasilkan melalui percobaan di
laboratorium dan membantu di dalam mengidentifikasi senyawa-senyawa tidak dikenal.
12
Pengukuran percobaan serapan
Tahapan pengukuran dengan spektrofotometer adalah sebagai berikut :
1. Monokromator diatur sesuai dengan panjang gelombang pengukuran, katupnya ditutup
untuk mencegah cahaya mencapai detektor, dan alat diatur untuk serapan yang tidak
terbatas. Ini sering dilakukan secara otomatis pada saat “pemanasan” oleh alat modern.
2. Katup dibuka, pelarut (atau “blangko”) ditempatkan pada jalan cahaya, dan alat diatur
sehingga serapan menjadi nol. Blangko biasanya hanya berupa pelarut yang digunakan
untuk penetapan kadar, tapi pada dasarnya, seharusnya semua komponen yang terdapat
di dalam matriks sampel kecuali sampel yang sedang ditentukan. Ini berarti dalam
penetapan kadar yang kompleks, larutan blangko harus dibuat tepat sesuai dengan
komposisi pelarut / medium sampel yang akan diujikan, dan harus diekstraksi atau
diperlakukan dengan cara yang sama persis dengan perlakuan terhadap sampel.
3. Larutan sampel (atau “uji”) ditempatkan pada jalan cahaya dan serapannya dibaca
langsung oleh alat.
Pengenceran
Bagian terpenting pada penetapan kadar spektroskopi bukanlah kinerja spektrofotometer
(walaupun akurasi alat diperiksa secara berkala), melainkan penyiapan larutan uji dan larutan
pengenceran yang akurat larutan stok dengan menggunakan peralatan gelas volumetrik, yang
diperkenalkan pada Bab 6, yaitu pipet dan labu ukur. Prosedur yang umum dilakukan adalah
menyiapkan serangkaian pengenceran untuk digunakan sebagai grafik kalibrasi seperti
contoh kerja di bawah ini.
Contoh kerja
Anda diberikan larutan stok yang mengandung larutan obat 50 μg/ml. siapkan 100 ml
larutan yang mengandung 5, 10, 20, dan 30 μg/ml obat.
Langkah pertama adalah menghitung volume larutan stok 50 μg/ml yang diperlukan
untuk masing-masing pengenceran. Ini dapat dilakukan dengan menggunakan hubungan di
bawah ini.
[Yang diperlukan]
x volume yang diperlukan
[Stok]
[ ] melambangkan konsentrasi obat. Hubungan ini akan lebih mudah diingat sebagai :
13
[Yang diinginkan]
x volume labu
[Yang dimiliki]
Dengan menggunakan hubungan ini, larutan 30 μg/ml disiapkan dari (30/50) x 100 = 60
ml larutan stok dan diencerkan dengan pelarut hingga mencapai volume 100 ml. Larutan 20
μg/ml disiapkan dari (20/50) x 100 = 40 ml larutan stok yang dengan pelarut diencerkan
hingga mencapai volume 100 ml, dan seterusnya untuk keseluruhan pengenceran.
Cara lain untuk menyiapkan pengenceran-pengenceran ini adalah dengan menyiapkan
masing-masing pengenceran dari larutan dengan konsentrasi terdekat. Cara ini dikenal
dengan pengenceran berseri dan dilaksanakan sebagai berikut. Larutan 30 μg/ml dan 20
μg/ml disiapkan seperti cara di atas. Larutan 10 μg/ml disiapkan dari larutan 20 μg/ml (50 ml
larutan 20 μg/ml diencerkan hingga 100 ml dengan pelarut) dan larutan 5 μg/ml disiapkan
dari larutan 10 μg/ml dengan cara yang sama. Pengenceran berseri ini mempunyai
keuntungan, yaitu penggunaan larutan stok yang lebih sedikit (100 ml dibandingkan dengan
130 ml yang dibutukan pada contoh ini), dan digunakan bilamana harga obat atau regen
mahal atau suplainya terbatas.
Aspek kuantitatif spektroskopi
Cahaya yang melewati suatu senyawa mengalami penurunan intensitas akibat tiga proses :
1. Pemantulan pada perbatasan fase (cairan/udara, kaca/cairan, dan lain-lain). Pemantulan
ini terjadi karena adanya perbedaan indeks bias pada bahan yang berbeda yang dilewati
cahaya.
2. Hamburan cahaya karena ketidakhomogenan sampel.
3. Serapan oleh atom atau molekul yang terdapat di dalam larutan.
Hilangnya intensitas karena nomor (1), dapat diatasi dengan menggunakan larutan
blangko yang tepat, karena efek perbatasan fase, pada larutan uji dan larutan blangko akan
sama.
Efek hambatan cahaya nomor (2) dapat diminimalkan dengan menyiapkan sampel secara
hati-hati, yaitu dengan memastikan bahwa sampel terlarut dengan sempurna di dalam pelarut
yang dipilih, yaitu tidak adanya gelembung udara yang menempel pada sel sampel, serta
tidak ada sidik jari, debu, maskara, ketombe, atau material yang tidak diinginkan lainnya
pada bagian luar sel yang akan memengaruhi keakuratan pengukuran serapan.
14
Kehilangan intensitas dengan alasan nomor (3) merupakan yang kita perhatikan dalam
pengukuran.
Hukum Beer dan Lambert
Aspek-aspek kuantitatif spektrofotometri didasarkan pada dua hukum yang sangat mirip.
Pertama adalah hukum Beer (Gambar 7.16), yang menyatakan bahwa “intensitas seberkas
cahaya monokromatik yang parallel menurun secara eksponensial dengan konsentrasi
molekul penyerap”. Hukum Beer dapat dinyatakan secara matematika sebagai :
I = I0e –kc
I0 adalah intensitas cahaya yang terdapat di dalam sampel, I adalah intensitas cahaya yang
ditransmisikan oleh sampel, k’ adalah suatu tetapan, dan c adalah konsentrasi sampel.
Gambar 7.16 Diagram hukum Beer
Dalam bentuk logaritma,
I0
Log = = k’c
I
Log (I0 / I) adalah kuantitas yang tidak berdimensi (logaritma perbandingan intensitas
cahaya), dan ditetapkan sebagai serapan. Serapan merupakan nilai yang diukur dan diplotkan
pada spektrofotometri.
Jadi Hukum Beer menyatakan bahwa serapan sebanding dengan konsentrasi.
Hubungan yang kedua adalah hukum Lambert, yang menyatakan bahwa “intensitas
seberkas cahaya monokromatik yang paralel menurun secara eksponensial pada saat melewati
cahaya ketebalan medium homogen”, secara metematika dinyatakan sebagai:
15
I = I0e –k”l (7.1)
I dan I0 sama dengan yang sebelumnya, l adalah ketebalan medium yang dilewati cahaya, dan
k” adalah tetapan (yang lain).
Dalam bentuk logaritma,
I0
Log = k”l (7.2)I
Serapan sebanding dengan ketebalan medium.
Kedua persamaan dasar ini sangat mirip sehingga dapat digabungkan menjadi satu, yaitu
hukum atau persamaan Beer – Lambert, yang dapat dinyatakan dengan:
I0
Serapan = Log = kcl (7.3) I
k disini adalah tetapan lainnya, nilainya bergantung pada satuan yang digunakan untuk
konsentrasi, c.
jika satuan knsentrasi adalah molaritas (yaitu jumlah mol per liter), tetapannya adalah ɛ
(huruf Yunani “epsilon”) dan dikenal dengan keterserapan molar. ɛ memiliki satuan L mol-1
cm-1, walaupun satuannya jarang digunakan. ɛ sama dengan serapan larutan 1 M di dalam sel
setebal 1 cm dan biasanya bernilai besar, yaitu kurang lebih 10.000 – 20.000. pada kasus ini,
persamaan Beer – Lambert dituliskan sebagai:
A = ɛcl (7.4)
Jika konsentrasi sampel dinyatakan dalam persen berat per volume (% b/v) (yaitu gr/100
ml), tetapan yang digunakan adalah A 1%, 1 cm, biasanya dituliskan sebagai A1 , dan disebut
serapan spesifik dengan satuan dl g-1 cm-1 walaupun nilai A1 biasanya juga dinyatakan tanpa
satuan. Nilai A1 sangat berguna dalam analisis farmasi dan farmaseutikal, untuk sampel yang
berat molekulnya mungkin sampel tiak diketahui (misalnya, ketika menganalisis suatu
makromolekul, seperti protein) atau suatu campuran beberapa komponene yang dianalisis di
dalam sampel yang sama. Hal ini menghasilkan bentuk persamaan Beer – Lambert yang
paling berguna :
A = A1 cl (7.5)
16
Dari persamaan diatas, nilai ɛ dan A1 saling berhubungan, dan salah satunya dapat
dihitung dari nilai lainnya dengan menggunakan persamaan (7.6) :
A1 x massa molekular relatifɛ = (7.6)
10
Seperti yang disebutkan diatas, serapan didefinisikan sebagai log I0 / I; buku teks lama
menggunakan istilah ekstingsi (punahan), sedangkan naskah lama menyebutkan rapatan
optis. Ketiga istilah tersebut memiliki arti yang sama, tapi “serapan” adalah istilah yang harus
digunakan dalam seluruh spektroskopi analisis.
Dua istilah lain untuk intensitas cahaya di dalam spektroskopi :
Transmitan, didefinisikan sebagai perbandingan I/I0
Persentase transmitan, merupakan perbandingan yang sama yang dinyatakan dalam
persentase, yaitu 100 I/I0
Penggunaan kedua istilah ini di dalam spektroskopi analitis terbatas untuk spektroskopi
inframerah karena tidak seperti serapan, kedua istilah ini tidak memberikan hubungan linear
jika diplotkan terhadap konsentrasi.
Metode penetapan kadar obat
Ada dua metode penggunaan pengukuran spektroskopik dalam analisis obat, yaitu metode
penerapan kadar absolut dan komparatif, dan metode mana yang digunakan bergantung pada
daerah mana di samudra atlantik anda melaksanakan analisis.
Di Inggris dan Eropa, persamaan Beer – Lambert cenderung digunakan pada metode
penetapan kadar absolut. Pada prosedur ini, serapan ditentukan melalui percobaan, dan
persamaan Beer – Lambert diselesaikan untuk mendapatkan nilai c, yaitu konsentrasi obat.
Dengan alasan ini, British Pharmacopoeia dan European Pharmacopoeia menggunakan
nilai A1 dalam monografi obat.
Pada US Pharmacopoiea, metode penetapan kadar komparatif lebih disukai. Pada jenis
penetapan kadar ini, larutan standar obat yang akan dianalisis disiapkan, serapan sampel dan
standar ditentukan pada kondisi yang sama, dan konsentrasi sampel dihitung dari hubungan.
Auji [uji]= (7.7)
Astd [standar]
17
[uji] adalah konsentrasi sampel dan [standar] adalah konsentrasi standar yang disiapkan.
Metode penetapan kadar komparatif memiliki keuntungan, yaitu tetap dapat digunakan
walaupun obat mengalami reaksi kimia selama penetapan kadar (misalnya, pembentkan
derivat berwarna agar dapat dilakukannya pengukuran di daerah tampak spektrum). Akan
tetapi, kekurangannya adalah harus tersedianya sampel asli obat untuk perbandingan.
Jika melakukan penetapan kadar obat secara spektroskopi, seringkali perlu dibuat sampel
standar analit dengan berbagai konsentrasi dan ditentukan serapan masing-masing sampel
larutan tersebut. Jika data-data ini diplotkan, akan diperoleh sebuah garis lurus dengan slop
positif yang melalui titik asal. Pembuatan grafik seperti ini tidak hanya menegaskan bahwa
hukum Beer – Lambert berlaku untuk penetapan kadar pada panjang gelombang pengukuran,
tetapi juga memungkinkan grafik tersebut untuk digunakan pada tujuan-tujuan kalibrasi.
Larutan dengan konsentrasi yang tidak diketahui, disiapkan dengan cara yang sama persis
dengan larutan standar. Kemudian serapannya dibaca dari grafik kalibrasi dan dihitung
konsentrasinya. Larutan standar yang disiapkan secara terpisah dari sampel dengan cara ini
dikenal sebagai standar eksternal.
Teknik yang lebih teliti melibatkan penggunaan standar internal. Standar internal adalah
senyawa yang memiliki struktur kimia dan sifat-sifat fisika yang sama dengan sampel yang
dianalisis. Standar internal harus ditambahkan ke dalam sampel yang akan dianalisis sebelum
ekstraksi atau penetapan kadar dimulai, dan kemudian berada di dalam matriks sampel
selama penetapan kadar berikutnya. Pada penetapan kadar sampel yang kompleks, biasanya
diperlukan beberapa perlakuan pendahuluan pada sampel dan pemulihan sampel dari proses
ekstraksi tidak dapat 100%. Jika digunakan standar internal, kehilangan sampel akan
tercermin dari kehilangan standar pada jumlah yang sama, dan perbandingan sampel terhadap
standar akan bernilai tetap. Standar internal digunakan terutama dalam analisis kromatografi
(terutama kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi). Pada analisis kromatografi,
fluktuasi parameter-parameter instrumental (misalnya, laju alir fase gerak) berpengaruh pada
keakuratan.
Pada analisis spektroskopi tertentu, digunakan pendekatan yang sama terhadap
penggunaan standar internal, yaitu teknik penambahan standar. Pada teknik ini, dilakukan
penambahan larutan standar analit dengan volume meningkat ke dalam suatu sampel
bervolume tetap, dan pembuatan grafik kalibrasi. Grafik pada penetapan kadar penambahan
standar memiliki kemiringan positif, tetapi memotong sumbu y pada nilai serapan positif.
Jumlah obat di dalam sampel diperoleh melalui ekstrapolasi grafik kalibrasi ke titik
18
perpotongan antara garis dengan sumbu -x (yaitu ketika y = 0 didalam persamaan garis),
seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7.17.
Gambar 7.17 Grafik kalibrasi yang menggunakan metode penambahan standar
Metode penambahan standar banyak digunakan dalam spektroskopi atom (misalnya,
penentuan ion-ion Ca2+ di dalam serum dengan menggunakan spektrofotometri emisi atom),
dank arena beberapa alikuot sampel dianalisis untuk menghasilkan grafik kalibrasi, akurasi
dan presisi penetapan kadar harus ditingkatkan.
Spektroskopi inframerah
Spektroskopi inframerah merupakan teknik yang sangat berguna untuk pengdentifikasian
senyawa-senyawa yang tidak dikenal, misalnya produk dari suatu sintesis atau metabolit
kemih dari seekor hewan percobaan, terutama ketika digunakan bersama-sama dengan teknik
elusidasi struktur lainnya, seperti resonans magnetik nuklir dan spektrometri massa.
Daerah inframerah spektrum elektromagnetik merupakan daerah cahaya dengan panjang
gelombang 2,5 – 15μm (yaitu 2,5 x 10-6 - 15 x 10-6 m) dan penyerapan cahaya ini oleh
molekul menyebabkan perubahan energi getaran molekul pada keadaan dasarnya. Seperti
yang telah dinyatakan sebelumnya, transisi getaran selalu terkait dengan perubahan pada
putaran atom di sekitar ikatan kimia. Ini analog dengan transisi elektronik pada penyerapan
energy ultraviolet yang juga menghasilkan transisi getaran dan putaran. Kegunaan inframerah
berdasarkan pada fakta bahwa masing-masing puncak pada spektrum dapat ditentukan
sebagai suatu ikatan atau gugus fungsi tertentu di dalam molekul. Ini sering berarti bahwa
spektrum inframerah adalah kompleks, dengan adanya kemungkinan sebanyak 20-30 puncak
berada pada satu spektrum. Akan tetapi, identifikasi senyawa-senyawa kimia yang tidak
dikenal dibuat menjadi mudah karena beberapa gugus fungsi selalu tampak pada daerah
spektrum inframerah yang sama.
Ikatan-ikatan tunggal (misalnya, O – H, N – H, C – H) menyerap pada bagian spektrum
berfrekuensi tinggi (kira-kira 4000 – 2100 cm-1). Ini disebabkan oleh rendahnya massa atom
hidrogen yang menyebabkan getaran terjadi pada frekuensi tinggi. Ikatan rangkap tiga
19
(misalnya, CN-) menyerap pada frekuensi kira-kira 2100 – 1900 cm-1 sementara ikatan
rangkap dua (misalnya C=O, C=C) menyerap pada frekuensi kira-kira 1900 – 1500 cm-1.
Deaerah spektrum inframerah memiliki bilangan gelombang kira-kira kurang dari 1500 cm -1
akibat peregangan molekul secara akurat. Daerah spektrum ini disebut daerah sidik jari,
karena pola puncak yang terjadi pada derah ini khas bagi senyawa yang diujikan dan tidak
ada senyawa lain yang memilikinya. Sifat-sifat ini digunakan di dalam British Farmacopoeia
yang menyatakan bahwa dua sampel akan dikatakn sama jika spektrum inframerah yang
diperoleh pada kondisi yang sama, serupa secara keseluruhan, yaitu puncak yang sama berada
pada posisi dan intensitas yang sama. Spektrum inframerah pembanding dari sampel otentik
sebuah obat dipublikasikan di dalam BP untuk pemeriksaan identitas sampel yang tidak
dikenal.
Analisis kuantitatif dengan menggunakan spektroskopi inframerah
Aturan Beer – Lambert yang diturunkan di atas (persamaan 7.3) berlaku juga pada
serapan radiasi inframerah obat molekul. Selain itu, spektrum penyerapan inframerah
memiliki kelebihan dibandingka dengan penyerapan ultraviolet yang lebih umum, yaitu
jumlah pita yang ada lebih banyak. Seringkali (dimungkinkan untuk) memilih pita
penyerapan untuk setiap komponen suatu campuran yang memiliki sedikit atau tidak
memiliki interferens di antara pita-pita tersebut. Karena alasan-alasan ini, spektroskopi
inframerah sering digunakan secara kuantitatif di laboratorium analitik untuk menentukan
konsentrasi obat di dalam larutan. Kurva kalibrasi untuk penetapan kadar dapat diperoleh
(dan berdasarkan hukum Beer) dengan mengubah spektrum yang tercetak menjadi I0 dan I
dengan menggunakan teknik garis dasar, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7.18. Jarak
dari garis dasar ke bagian paling bawah halaman ditunjukkan dengan I0, yaitu cahaya yang
tersedia untuk penyerapan, sedangkan jarak dari puncak ke bagian paling bawah halaman
ditunjukkan sebagai I, yaitu cahaya yang ditransmisikan melalui sampel. Bentuk logaritma
(bilangan dasar 10) perbandingan I0 / I diperoleh sebagaimana sebelumnya untuk
mendapatkan nilai serapan. Perhatikan bahwa spektrum inframerah biasanya diplot “terbalik”
sehingga serapan nol berada di puncak spektrum (seperti yang biasanya ditunjukkan) dan
serapan 100% berada pada bagian dasar. Perlu diperhatikan juga bahwa spektroskopi
inframerah memiliki idiosinkrasi (keanehan) karena menggunakan bilangan gelombang
(“kebalikan sentimeter”, cm-1) dan bukan panjang gelombang sumbu x, dan persentase
transmitan (bukan serapan) pada sumbu y.
20
Gambar 7.18 Penerapan teknik garis dasar
Perbedaan utama antara spektroskopi inframerah dan ultraviolet terletak pada
konsentrasi yang diperlukan untuk penetapan kadar. Pada spektroskopi inframerah, harus
disiapkan larutan sampel 10% b/v. Ini berarti panjang lintasan sel yang digunakan dalam
inframerah sangat pendek., biasanya 0,025 – 0,1 mm (kalau tidak, nilai serapannya akan
terlalu besar). Masalah lain pada spektrum inframerah adalah pelarut yang digunakan dalam
penetapan kadar (biasanya kloroform atau diklorometan) juga memiliki ikatan kimia dan
akan menyerap radiasi inframerah pada beberapa bagian spektrum sehingga mengaburkan
penyerapan sampel pada panjang gelombang tersebut. Sampel disiapkan di dalam larutan,
mull atau pasta yang dibuat dengan paraffin cair (Nujol), atau di dalam cakram padat yang
dibuat melalui trituasi dengan kalium bromide kering dan kemudian dilanjutkan dengan
pengempaan dalam pengempa hidraulik.
Fluorimetri
Fluorimetri adalah suatu teknik analitik yang berdasarkan pada emisi energi elektromagnetik
oleh molekul. Kromoform molekul dapat menyerap cahaya (biasanya pada daerah ultraviolet
spektrum elektromagnetik) dan mengemisikannya kembali (biasanya pada daerah tampak
spektrum) untuk diukur dengan sebuah detektor. Untuk melakukan hal ini, kromofor
(terkadang disebut fluorofor) harus dilindungi dari proses normal yang dapat menyebabkan
hilangnya energi pada keadaan tereksitasi (misalnya, benturan antar molekul). Cahaya yang
diemisikan oleh sampel selalu memiliki panjang gelombang yang lebih panjang (berenergi
lebih rendah) dibandingkan dengan cahaya yang diserap oleh molekul. Hal ini dikarenakan
proses transfer energi yang terjadi di dalam keadaan tereksitasi molekul tidak efisien 100%.
Sebagian energi yang terserap hilang (misalnya, pada transisi getaran) sehingga cahaya yang
21
diemisikan sebagai fluoresensi memiliki energi yang lebih rendah dibandingkan cahaya yang
diserap.
Alat yang digunakan untuk mengukur fluoresensi, yaitu spektrofluorimeter, memerlukan
sumber cahaya berenergi besar (biasanya lampu busur xenon) untuk membebaskan energi
yang diperlukan untuk mengeksitasi molekul, dan detektor alat tersebut biasanya ditempatkan
pada posisi 90o terhadap sumber cahaya untuk meminimalkan deteksi cahaya langsung dari
sumber cahaya. Spektrofluorimeter juga memerlukan dua monokromator, satu monokromator
untuk memilih panjang gelombang cahaya eksitasi, dan yang lainnya untuk memilih panjang
gelombang cahaya yang diemisikan oleh sampel. Spektrofluorimeter analitik banyak
digunakan dalam analisis farmaseutikal, terutama untuk penetapan kadar obat yang sangat
potensi (highly potent drug) yang terdapat di dalam obat-obatan dalam jumlah yang sangat
sedikit.
Ada dua kelebihan utama penggunaan fluorimetri dibandingkan dengan spektroskopi
ultraviolet :
1. Keberadaan dua monokromator, dan fakta bahwa tidak semua molekul dengan kromofor
berfluoresensi, menunjukkan bahwa fluorometri lebih spesifik dibandingkan dengan
spektroskopi ultraviolet biasa. Ini memungkinkan obat yang berfluoresensi tetap dapat
ditentukan kadarnya walaupun terdapat senyawa-senyawa lain yang dapat mengganggu
apabila menggunakan penetapan kadar spektroskopi ultraviolet.
2. Fluorimetri kira-kira 100 kali lebih sensitive dibandingkan dengan spektroskopi
ultraviolet dan ideal untuk analisis obat-obat potensi dalam jumlah yang sangat kecil.
Contohnya adalah steroid digoksin di dalam Tablet Digoksin BP dan senyawa
kontrasepsi etinil estradiol yang memiliki kadar hanya 30 μg per tabletnya.
Pemadaman
Sesuai dengan namanya, fenomena ini merupakan penguraian intensitas cahaya yang
diemisikan selama fluoresensi. Pemadaman ini ada dua jenis, yaitu pemadaman sendiri dan
pemadaman oleh yang lain, yaitu senyawa non-fluoresensi.
22