SPEKTROSKOPIA NMR - Politechnika Gdańska · 2018. 4. 16. · w widmie 13C NMR. 3. 1H-13C HMBC – pozwala na płynne poruszanie się pomiędzy izolowanymi układamispinowymi jąder1H

SPEKTROSKOPIA NMRPODEJŚCIE PRAKTYCZNE

CZĘŚĆ: IV DR INŻ. TOMASZ LASKOWSKImgr inż. Marcin Płosiński

PROLOGOS:

ODSPRZĘGANIE SPINÓW(DECOUPLING)

ODSPRZĘGANIE SPINÓW

Eliminacja zjawiska sprzężenia spinowo-spinowego występującego pomiędzy

wybranym protonem a jego sąsiadami poprzez selektywne naświetlanie tego protonu.

Naświetlanie – napromieniowywanie próbki falą elektromagnetyczną o częstotliwości

rezonansowej wybranego protonu przed rejestracją widma.

W efekcie:

1) sygnał rezonansowy protonu naświetlonego nie pojawia się w widmie;

2) w multipletowości dotychczasowych partnerów sprzężenia naświetlonego

protonu nie jest zawarta informacja o sprzężeniu z naświetlonym protonem.

ppm1.4 1.32.42.62.83.0

ppm1.4 1.32.42.62.83.0

O H

CH3

H

H

AC

BD

A

CB

D

CB D


ppm1.4 1.32.42.62.83.0

CD

A

ppm1.4 1.32.42.62.83.0

O H

CH3

H

H

AC

BD

A

CB

D


ppm1.4 1.32.42.62.83.0

BD

A

ppm1.4 1.32.42.62.83.0

O H

CH3

H

H

AC

BD

A

CB

D


ppm1.4 1.32.42.62.83.0

C

B

A

ppm1.4 1.32.42.62.83.0

O H

CH3

H

H

AC

BD

A

CB

D



▪ ZALETY1. Decoupling zwalnia z obowiązku określania multipletowości wszystkich

sygnałów rezonansowych.

2. Ustalanie sekwencji sprzężeń nie wymaga pomiarów stałych sprzężenia.

▪ WADY

1. Ustalenie sekwencji sprzężeń wymaga przeprowadzenia kilku eksperymentów.

2. Może zostać przeprowadzone jedynie na protonach znacznie różniących się

przesunięciem chemicznym.

EPEISODION I:

SPINOWO-SPINOWE SPRZĘŻENIA

HOMOJĄDROWE w 2D

COSY – CORRELATED SPECTROSCOPY

TOCSY – TOTAL CORRELATED SPECTROSCOPY

F 2 ( p p m )

1 . 21 . 41 . 61 . 82 . 02 . 22 . 42 . 62. 83 . 0

F 1

( p pm )

1 . 4

1 . 6

1 . 8

2 . 0

2 . 2

2 . 4

2 . 6

2 . 8

3 . 0

oś pierwotna (F2)

oś wtórna (F1)

diagonala

sygnał

korelacyjny

(crosspeak)

sygnał

autokorelacyjny

widmo 1H

COSY

F 2 ( p p m )

1 . 21 . 41 . 61 . 82 . 02 . 22 . 42 . 62. 83 . 0

F 1

( p pm )

1 . 4

1 . 6

1 . 8

2 . 0

2 . 2

2 . 4

2 . 6

2 . 8

3 . 0O H

CH3

H

H

AC

BD

AC

BD

A

C

B

D

A,B

B,A

COSY

F 2 ( p p m )

1 . 21 . 41 . 61 . 82 . 02 . 22 . 42 . 62. 83 . 0

F 1

( p pm )

1 . 4

1 . 6

1 . 8

2 . 0

2 . 2

2 . 4

2 . 6

2 . 8

3 . 0

AC

BD

A

C

B

D

A,B

B,A

C,B

B,C

O H

CH3

H

H

AC

BD

COSY

F 2 ( p p m )

1 . 21 . 41 . 61 . 82 . 02 . 22 . 42 . 62. 83 . 0

F 1

( p pm )

1 . 4

1 . 6

1 . 8

2 . 0

2 . 2

2 . 4

2 . 6

2 . 8

3 . 0

AC

BD

A

C

B

D

A,B

B,A

C,B

B,C

B,D

D,BO H

CH3

H

H

AC

BD

COSY

F 2 ( p p m )

1 . 21 . 41 . 61 . 82 . 02 . 22 . 42 . 62. 83 . 0

F 1

( p pm )

1 . 4

1 . 6

1 . 8

2 . 0

2 . 2

2 . 4

2 . 6

2 . 8

3 . 0

AC

BD

A

C

B

D

A,B

B,A

C,B

B,C

B,D

D,B

D,C

C,D

O H

CH3

H

H

AC

BD

COSY

F 2 ( p p m )

1 . 21 . 41 . 61 . 82 . 02 . 22 . 42 . 62. 83 . 0

F 1

( p pm )

1 . 4

1 . 6

1 . 8

2 . 0

2 . 2

2 . 4

2 . 6

2 . 8

3 . 0

AC

BD

A

C

B

D

A,B

B,A

C,B

B,C

B,D

D,B

D,C

C,D

NIEPRAWIDŁOWA

OBRÓBKA WIDMA

COSY

O H

CH3

H

H

AC

BD

F 2 ( p p m )

1 . 21 . 41 . 61 . 82 . 02 . 22 . 42 . 62. 83 . 0

F 1

( p pm )

1 . 4

1 . 6

1 . 8

2 . 0

2 . 2

2 . 4

2 . 6

2 . 8

3 . 0

F 2 ( p p m )

1 . 21 . 41 . 61 . 82 . 02 . 22 . 42 . 62. 83 . 0

F 1

( p pm )

1 . 4

1 . 6

1 . 8

2 . 0

2 . 2

2 . 4

2 . 6

2 . 8

3 . 0

AC

BD

A

C

B

D

A,B

B,A

C,B

B,C

B,D

D,B

D,C

C,D

D,AC,A

INNY

WARIANT OBRÓBKI

COSY

O H

CH3

H

H

AC

BD

▪ ZALETY

1. Bardzo mała różnica przesunięć chemicznych (nakładanie się) sygnałów

rezonansowych oraz ich nieczytelna multipletowość nie przeszkadzają (za

bardzo) w interpretacji wyników.

2. Do ustalenia sekwencji sprzężeń w danym układzie spinowym wystarcza

przeprowadzenie jednego eksperymentu.

3. Stosunkowo łatwe (choć nie zawsze) w wykonaniu, obróbce i interpretacji.

▪ WADY

1. Interpretacja skomplikowanych widm COSY drastycznie zwiększa

zapotrzebowanie mózgu na glukozę.

2. Niewielka rozdzielczość widm COSY – konieczność stosowania odmian

eksperymentu COSY (np. DQF-COSY) do badania bardziej złożonych układów.

COSY

▪ ZALETY

1. Duża ilość sygnałów korelacyjnych.

2. Możliwość szybkiego określenia przynależności protonów do poszczególnych

układów spinowych.

3. Możliwość rozpoznania struktury układów spinowych na podstawie ilości

sygnałów korelacyjnych bądź obecności sygnałów rezonansowych protonów

charakterystycznych.

▪ WADY

1. Duża ilość sygnałów korelacyjnych.

TOCSY

COSY

protony amidowe: 7-8 [ppm];

sprzężenie skalarne z α

TOCSY

protony amidowe: 7-8 [ppm];

sprzężenie skalarne z α

STASIMON I:

SPINOWO-SPINOWE SPRZĘŻENIA HETEROJĄDROWE

H

H

SPRZĘŻENIE 1H-19F

2JH,F = 40-50 Hz

4JH,F = 4-5 Hz

-CH3

-CH2-

dublet

dublet

dubletów

H

3JH,H

1JH,C

1JH,C

99 %

1 %

99 %0,5 % 0,5 %

widmo 1H NMR:linie satelitarne (sidebands)

SPRZĘŻENIE 1H-13C

12C

1H

12C

1H

13C

1H

12C

1H

1JH,C = 115-270 Hz

δ [ppm]

▪1H DECOUPLING; SPRZĘŻENIE 13C-1H PRZEZ JEDNO WIĄZANIE

SPEKTROSKOPIA 13C NMR

1JC,H = 110-320 Hz

▪ SPRZĘŻENIE 13C-1H PRZEZ WIELE WIĄZAŃ


2,3JC,H = 0-60 Hz

▪ DEPT (DISTORIONLESS ENHANCEMENT BY POLARIZATION TRANSFER)


CH

CH2

CH3

CHX

C


δ [ppm] typ C

2 – 50 sp3 (alkanowy)

50 – 90 sp3 (C-O), sp1

90 – 110 sp3 (O-C-O)

110 – 150 sp2 (nie: C=O)

> 160 sp2 (C=O)

SPRZĘŻENIE 13C-19F (CIEKAWOSTKA!)

▪ WIDMO 13C NMR, 1H-DECOUPLING, BRAK 19F-DECOUPLING

-CH3-CH2-

C=O

EPEISODION II:

SPINOWO-SPINOWE SPRZĘŻENIA

HETEROJĄDROWE w 2D

HSQC – HETERONUCLEAR SINGLE-QUANTUM COHERENCE

HMBC – HETERONUCLEAR MULTIPLE BOND CORRELATION

HMBC

H1,C2’

H3’,C1’

H1’,C3’

▪ KOMPLET EKSPERYMENTÓW gCOSY, gHSQC i gHMBC

DYWAGACJE STRUKTURALNE

2

2

2 2

6

1

C8H15OCl

?



3 4

12

5

6

7 8

1

1

1,2

2,1

2

2

3

3

3,4

4,3

4

5,6

4

gCOSY

5,6



3 4

12

5

6

7 8

1

C1

2,C2

5/6,C5/C6

2

C5/C6

3

C44,C4

1,C1

4 5,6

C2

gHSQC

C33,C3



3 4

12

5

6

7 8

1

C1

4,C3

2

C5/C6

3

C4

2,C1

1,C2

4 5,6

C2

gHMBC

C3 3,C4

4,C22,C4

1

3

2

45

6

7 8

?


δ [ppm] typ C

2 – 50 sp3 (alkanowy)

50 – 90 sp3 (C-O), sp1

90 – 110 sp3 (O-C-O)

110 – 150 sp2 (nie: C=O)

> 160 sp2 (C=O)



3 4

12

5

6

7 8

1

C1

4,C3

2

C5/C6

3

C4

2,C1

1,C2

4 5,6S

C2

gHMBC

C3 3,C4

4,C22,C4

1

3

2

45

6

7 8

1,C8

3,C8C8

C7

▪ ZALETY I ZASTOSOWANIE

1. 1H-13C HSQC – pomocne przy rekonstrukcji izolowanych układów spinowych

jąder 1H (bezlitośnie wskazuje diastereotopowe grupy –CH2–).

2. 1H-13C HSQC – pozwala na pełne przyporządkowanie sygnałów rezonansowych

w widmie 13C NMR.

3. 1H-13C HMBC – pozwala na płynne poruszanie się pomiędzy izolowanymi

układami spinowymi jąder 1H.

▪ WADY

1. 1H-13C HMBC – nie wszystkie teoretycznie możliwe sygnały korelacyjne

pojawiają się w widmie. ICH BRAK NIE JEST DOWODEM NA NIEPOPRAWNOŚĆ

ZAŁOŻONEJ STRUKTURY!

1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC

STASIMON II:

DIPOLOWE SPRZĘŻENIA

HOMOJĄDROWE

NOE – NUCLEAR OVERHAUSER EFFECT

Jądrowy efekt Overhausera – zjawisko wzmocnienia (bądź osłabienia) sygnału rezonansowego

protonu, który znajduje się blisko w przestrzeni protonu naświetlanego.

δ [ppm]

H

C

H

Hδ [ppm]

hv

NOE

NOE

Zasięg efektu Overhausera: ok. 4-5 Å.

Jego wystąpienie jest dowodem bliskości jąder w przestrzeni.

NUCLEAR OVERHAUSER EFFECT

B0

E

H0 HA

δ

B1

νA

νA

νA

stan równowagi

H0HA

δ

νA

νA


Naświetlenie protonu HA powoduje odejście od stanu

równowagi i wysycenie jego spinu, tj. liczba jąder w

stanie o niższej energii jest dokładnie równa liczbie

jąder w stanie o wyższej energii. Sygnał protonu HAznika z widma.

B0

E

H0 HA

δ

B1

νA

νA

νA

stan równowagi

νA

νA

W2

RELAKSACJA DWUKWANTOWA, W2 – efektywna w małych cząsteczkach

droga relaksacji polegająca na powrocie populacji jąder naświetlanych (HA) do

stanu równowagi przy jednoczesnym „ciągnięciu” ze sobą (wymuszeniu zmiany

orientacji) spinów jąder sąsiadujących (HO), znajdujących się w stanie o

wyższej energii.


B0

E

H0 HA

δ

B1

νA

νA

νA

stan równowagi

νA

νA

W2

W wyniku powrotu populacji jąder HA do stanu

równowagi na drodze W2 część jąder HO przechodzi ze

stanu o wyższej energii do stanu o niższej energii.


B0

E

H0 HA

δ

B1

νA

νA

νA

stan równowagi

νA

νA

W2


B0

E

H0 HA

δ

B1

νA

νA

νA

stan równowagi

νA

νA

W2

Następnie, proton HA po raz kolejny ulega naświetleniu

i następuje ponowne wysycenie populacji spinów tego

jądra w próbce. Ponownie, liczba jąder HA w stanie o

niższej energii jest dokładnie równa liczbie jąder w

stanie o wyższej energii.


B0

E

H0 HA

δ

B1

νA

νA

νA

stan równowagi

νA

νA

H0

HAδ

H0 HAδ

widmo różnicowe

Wreszcie, następuje rejestracja widma 1D i obserwacja

protonu HO. Ponieważ w populacji istnieje teraz większa

liczba spinów HO w stanie o niższej energii niźli było ich

przed naświetlaniem HA, sygnał protonu HO ma większą

intensywność!!!

OBSERWUJEMY DODATNI EFEKT OVERHAUSERA.


B0

E

H0 HA

δ

B1

νA

νA

νA

stan równowagi

νA

νA

W0

RELAKSACJA ZEROKWANTOWA, W0 – efektywna w dużych cząsteczkach

droga relaksacji polegająca na powrocie populacji jąder naświetlanych (HA) do

stanu równowagi przy jednoczesnym „ciągnięciu” ze sobą (wymuszeniu zmiany

orientacji) spinów jąder sąsiadujących (HO), znajdujących się w stanie o niższej

energii.


B0

E

H0 HA

δ

B1

νA

νA

νA

stan równowagi

νA

νA

W0

W wyniku powrotu populacji jąder HA do stanu

równowagi na drodze W0 część jąder HO przechodzi ze

stanu o niższej energii do stanu o wyższej energii.


B0

E

H0 HA

δ

B1

νA

νA

νA

stan równowagi

νA

νA

W0


B0

E

H0 HA

δ

B1

νA

νA

νA

stan równowagi

νA

νA

W0

Następnie, proton HA po raz kolejny ulega naświetleniu

i następuje ponowne wysycenie populacji spinów tego

jądra w próbce. Ponownie, liczba jąder HA w stanie o

niższej energii jest odkładnie równa liczbie jąder w

stanie o wyższej energii.


B0

E

H0 HA

δ

B1

νA

νA

νA

stan równowagi

νA

νA

H0HA

δ

H0 HAδ

widmo różnicowe

Wreszcie, następuje rejestracja widma 1D i obserwacja

protonu HO. Ponieważ w populacji istnieje teraz

mniejsza liczba spinów HO w stanie o niższej energii

niźli było ich przed naświetlaniem HA, sygnał protonu

HO ma mniejszą intensywność!!!

OBSERWUJEMY UJEMNY EFEKT OVERHAUSERA.


OAcO

AcOCH

2OAc

OC

O

CO

H

H

H

H3

1

3

4

5

6

2

2''

1''

3'

4'

2'

1'NOE

NOE



widmo NOE

widmo 1H NMR

(t-BuO)3SiSH

H2N(CH2)NH2

H2O

i-PrOH

wymiana chemiczna: NOE < 0 (ujemne)

▪ WYMIANA CHEMICZNA

▪ PODSUMOWANIE1. Jeżeli jądra HO oraz HA sąsiadują ze sobą w przestrzeni, to zjawisko odpowiedzialne za wymuszenie

zmiany orientacji spinu jądra sąsiadującego (HA) w wyniku naświetlania jądra HO nazywa się

sprzężeniem dipolowym i stanowi podstawę fizyczną efektu Overhausera.

2. Ww. wymuszenie zmiany orientacji może nastąpić zgodnie z mechanizmem relaksacji dwukwantowej

(W2) lub zerokwantowej (W0).

3. Dodatni efekt Overhausera (dodatnie NOE) obserwujemy dla małych cząsteczek (M < 1 kDa), a

konkretnie dla cząsteczek szybko obracających się w roztworach. Dla małych cząsteczek dominuje

relaksacja W2.

4. Ujemny efekt Overhausera (ujemne NOE) obserwujemy dla dużych cząsteczek (M > 2 kDa), a konkretnie

dla cząsteczek wolno obracających się w roztworach. Dla dużych cząsteczek dominuje relaksacja W0.

5. Wymiana chemiczna protonów labilnych również generuje sygnały w widmach NOE. Są one zawsze

ujemne.

6. Małe cząsteczki, które wolno obracają się w roztworach (np. w wyniku tworzenia agregatów), generują

ujemne NOE.


EPEISODION III:

DIPOLOWE SPRZĘŻENIA

HOMOJĄDROWE w 2D

NOESY – NUCLEAR OVERHAUSER EFFECT SPECTROSCOPY

ROESY – ROTATING-FRAME OVERHAUSER EFFECT SPECTROSCOPY

NOESY/ROESY

17

20b

NOENOE

12

NOE

▪ PRZYKŁADOWE WIDMO

CH3

O

OH

OH

OH

H

OH

HH

H

CH3

O

OH

OH

H

OH

OH

HH

HNOE

NOE

▪ ZASTOSOWANIE

1. Eksperymenty bardzo użyteczne w analizie konformacyjnej.

2. Wygodna metoda ustalania konfiguracji względnej centrów asymetrii, a niekiedy

– konfiguracji absolutnej.

NOESY/ROESY

▪ ZASTOSOWANIE




3. Wygodna metoda ustalania sekwencji aminokwasów w polipeptydach, a także –

sekwencji zasad w niewielkich odcinkach kwasów nukleinowych.

NOESY/ROESY

NOE (słabe)

NOE (silne)

▪ ZASTOSOWANIE






NOESY/ROESY

▪ ZASTOSOWANIE






▪ WADY

1. Nie wszystkie teoretycznie możliwe sygnały korelacyjne pojawiają się w widmie.

ICH BRAK NIE JEST DOWODEM BRAKU BLISKOŚCI JĄDER ATOMOWYCH W

PRZESTRZENI!

NOESY/ROESY

▪ CZYM RÓŻNI SIĘ EKSPERYMENT ROESY OD NOESY?

NOESY/ROESY

sygnał NOESY ROESY

diagonala ujemny* ujemny

małe cząsteczki dodatni dodatni

średnie cząsteczki BRAK dodatni

duże cząsteczki ujemny dodatni

wymiana chemiczna ujemny ujemny

* W rzeczywistości sygnały korelacyjne w widmach NOESY i ROESY mają fazy względne, ustalane względem

diagonali. Powyższa tabela jest prawdziwa dla sytuacji, w której diagonala znajduje się w fazie ujemnej (co jest

ustawiane domyślnie dla wszystkich eksperymentów).

▪ CZYM RÓŻNI SIĘ EKSPERYMENT ROESY OD NOESY?Eksperyment ROESY pozwala na obserwację korelacji w cząsteczkach o dowolnych masach, w

przeciwieństwie do eksperymentu NOESY, który „nie widzi” cząsteczek o masach z zakresu 1

kDa < M < 2 kDa (relaksacja dwukwantowa konkuruje wtedy z relaksacją zerokwantową, co

wygasza sygnał NOE).

Wadą stosowania eksperymentu ROESY w każdej możliwej okazji jest jego mniejsza czułość dla

„dużych” cząsteczek, co wymaga stosowania większych stężeń (co nie zawsze jest łatwe).

NOESY/ROESY

NOESY/ROESY

▪ POMIAR ODLEGŁOŚCI MIĘDZYATOMOWYCHDla krótkich czasów miksowania (τm) zależność intensywności NOE (I) od odległości między

atomami (r) da się wyrazić wzorem:

I = k∙rIS-6

Stałą k wyznacza się na podstawie wzorca.

STASIMON III:

ZESTAWIENIE WIDM 2D

ZESTAWIENIE WIDM 2D

eksperyment typ korelacji typ sprzężenia

COSY homojądrowe skalarne*

TOCSY homojądrowe skalarne*

HSQC heterojądrowe skalarne*

HMBC heterojądrowe skalarne*

NOESY homojądrowe dipolowe**

ROESY homojądrowe dipolowe**

* skalarne = spinowo-spinowe;

** dipolowe = przez przestrzeń.

EKSODOS:

ZAWIJANIE SYGNAŁÓW

pp m204 0608010 012 014 016 018 020 0

pp m2040608010 012 014 016 018 020 0

CDCl3

δ = 205,7 ppm

δ = 5,7 ppm

zawinięty sygnał

C=O


CH3

C=O

Szerokość okna spektralnego – zakres częstotliwości, w którym wykonano pomiar.

Szerokość okna spektralnego = 200 ppm.

(CH3)2C=O, 13C NMR

pp m2 040608 010 012 014 016 018 0

pp m204 0608010 012 014 016 018 020 0

CDCl3

δ = 205,7 ppm

δ = 15,7 ppm

zawinięty sygnał

C=O


CH3

C=O



(CH3)2C=O, 13C NMR

pp m204 0608010 012 014 0

pp m204 0608010 012 014 016 018 020 0

CDCl3

δ = 205,7 ppm

δ = 55,7 ppm

zawinięty sygnał

C=O


CH3

C=O



(CH3)2C=O, 13C NMR

pp m20406 08010 012 0

pp m204 0608010 012 014 016 018 020 0

CDCl3

δ = 205,7 ppm


CH3

C=O



(CH3)2C=O, 13C NMR

brak sygnału

C=O

Uwaga: szerokości okna spektralnego nie należy utożsamiać z szerokością skali wydruku. Te

dwie wielkości są sobie równe tylko wtedy, jeśli widmo zostało wydrukowane w całym zakresie

pomiarowym.


δrzeczywiste = δsygnału zawiniętego + szerokość okna spektralnego

δsygnału zawiniętego = δrzeczywiste - szerokość okna spektralnego

DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ!(...i powodzenia na kolokwium)

Documents

SPEKTROSKOPIA NMR - Politechnika Gdańska · 2018. 4. 16. · w widmie 13C NMR. 3. 1H-13C HMBC – pozwala na płynne poruszanie się pomiędzy izolowanymi układamispinowymi jąder1H