Spektroskopija elektronska paramagnetna resonanca (EPR) -

spinsko označevanje in

spinsko lovljenje pri študiju

supramolekularnih sistemov

Janez Štrancar

Laboratory of Biophysics, IJS / CO NAMASTE

Zakaj EPR?

• Radikali ter različni elektronski defekti v trdni snovi so strukture z nesparjenimi elektroni, torej imajo spin.

• Spinska stanja so občutljiva na lokalna električna polja in druge spine, zato se spreminjajo, če se spreminjajo pogoji v okolici.

• Interakcije med spini so odvisne od razdalj, zato so odvisne od translacijske difuzije.

• Interakcije med spini in polji so večinoma anizotropne, zato so odvisne od orientacije, torej tudi od rotacijske difuzije.

• Vse te pojave lahko raziskujemo z metodo, ki komunicira z elektronskimi spini, to pa je eletronska paramagnetna/spinska resonanca (EPR/ESR)

Spektroskopija elektroska paramagnetna resonanca (EPR)

Princip EPR

• Potreba po nesparjenem elektronu s spinom in zato magnetnim momentom

• Potreba po magnetnem polju, s katerim detektiramo magneni moment (spin)

• Potreba po mikrovalovnem sevanju, ki vzbudi prehode med spinskimi stanji

• Prosti radikali

• nitroksidi

magnetno polje B

Energija E

B = 0

MI=+1MI= 0MI=-1

MI=-1MI= 0MI=+1

∆E = hν = µBBg + AMI

Absorbcijski spekter

Odvod absorbcijskega spektra

Mikrovalovna motnja !!!

Interakcije z drugimi magnetnimi momenti!

N O

R1

R2

N O

R1

R2

Nitroxide synthesis avoiding radical site (Lebedev & Kazarnovsky 1959,

Rozantsev & Neiman 1962)

Občutek za razpone polj, frekvenc in energij

• Magnetno polje med 0.04 – 40 T

– zemeljsko magnetno polje: 0.025-0.065 mT,

– X-band EPR: 0.3 T,

– novorojena hitrovrteča se nevtronska zvezda: 100 MT

• Frekvenca/valovna dolžina/energija med 1 -1000 GHz / 30 – 0.03 cm / 3 – 3000 µµµµeV

– VHF (RF) svetloba: 100 MHz 3 m 0.3 µeV (100 000 x manj od kT)

– X-band EPR: 10 GHz 30 mm 0.03 meV (1000x manj od kT)

– IR svetloba: 10 THz 30 µm 30 meV (skoraj kT)

– Vidna svetloba: 600 THz 500 nm 2 eV (energija kemijskih vezi)

– UV svetloba: 10 PHz 30 nm 30 eV (ionizirajoče!)

EPR spektrometer

• Izbira polja / frekvence je odvisna od:– vdorne globine valovanja, ki se s

frekvenco zmanjšuje

– občutljivosti, ki s frekvenco močno narašča;

– Dielektričnih izgub (v vodnih vzorcih), ki preprečujejo sklopitev resonatorja na valovanje v valovodu in ki tudi močno naraščajo s frekvenco;

– željene ločljivost magnetnih sklopitev, ki narašča z magnetnim poljem;

– uporabljena tehnologija izvorov in transporta valovanja ter izdelave resonatorjev (RF, MW, IR).

– uporabljena tehnologija magnetov (elektromagneti, superprevodni magneti)

ALI GUN DIODA

• Namen modulacije in fazne detekcije je omogočiti ozkopasovno filtriranje signala

• Posledica modulacije je detekcija odvodaabosrbcijske krivulje;

EPR okna

• Časovno okno

– anizotropije magnetnih sklopitev zaradi rotacij molekul (10-30 G) ustrezajo Larmorjevim frekvencam 30-100 MHz, kar generira časovno okno 10 ns

• Krajevno okno

– interakcije z nesparjenimi elektroni so modulirane preko kontaktnih ali dipolnih interakcij z dosegom pod 10 nm, zaradi česar je EPR občutljiva na lokalno strukturiranost, difuzijo in reologijo na molekularni skali

• Občutljivost

– absolutna občutljivost EPR spektrometra je 1010 spinov (20 fmol) v 10 µµµµl vzorcu, kar ustreza koncentraciji 2 nM

Ko radikali ne živijo dovolj dolgo...

• Če je življenski čas vzbujenih stanj nesparjenega elektrona (radikala) skrajši od EPR časovnega okna, takih stanj ne moremo videti direktno

• Kratkožive radikale ulovimo in spremenimo v dolgožive radikalske adukte, ki jih lahko detektiramo z EPR

R˙

oxoamonium kot spinski lovilec

Spinsko lovljenje in EPR

N

O+-

N

O

R

. Nitroksidni radikalski adukt

Spinsko lovljenje za merjenje učinkovitosti fotovzbujanja

• Fotovzbujanje titanoksidnih nanocevk v vodi z O2 povzroči generacijo radikalov

• Radikale lovimo in njihove adukte detektiramo z EPR

• Z vzbujanjem z različno svetlobo lahko določimo spektralno odvisnost fotovzbujanja

λλλλ

Spinsko lovljenje ni vedno povsem učinkovito

• Ozadje:

– difuzija radikalov in pasti

– razpad pasti in radikalskih aduktov

– radikalske reakcijeN

O

R5

H

H20

N

O

Rβ

bβ

nanomaterial

H∙, HO∙ , HOO∙

β

N

O

R (or -OOR)

R5

N

OH

R5

R (or -OOR)

H

N

O

R5 H

N O

R5

N

OH

R5 H

N O

R5

N

OOH

R5 H

N O

R5

N

OOH

R5

R (or -OOR)

H

N O

R5

N

O

R5

N

O

R 5

H

R (or -OO -R )

Vzporedna detekcija različno dolgoživih radikalov

• Kafeična kislina + lakaza :

Dolgoživi radikal na kafeični kislini

• Kafeična kislina + lakaza + DMPO (spinski lovilec):

Kratkoživi radikali se pretvarjajo v hidroksilni radikal, ki ga lovi DMPO

(hidroksilni je najbolj stabilen med kratkoživimi radikali)

1 mT

Tipični EPR spektri različnih kisikov radikalov

• Lovljenje z DMPO in DEPMPO, kjer se lepo vidi pretvorba OOH. v OH.

Spinsko označevanje in študij lokalne mobilnosti

N O

R1

R2

N O

R1

R2

N O

R1

R2

N O

R1

R2

• Ker sta sklopitvi elektronskega spina in zunanjega magnetnega polja ter elektronskega in jedrskega (dušikovega) spina pri nitroksidnem radikalu zelo anizotropni, bo spekter nitroksida zelo odvisen od orientacije proti zunanjem magnetnem polju

EPR in anizotropija rotacijskega gibanja

• In bioloških sistemih so orientacije neenakomerno usmerjene glede na magnetno polje, zato je EPR spekter superpozicija spektrov pri različnih orientacijah

• Zaradi ns časovnega okna so oblike EPR spektrov hitro opletajočih se spinkih označevalcev odvisne tako od anizotropije kot tudi od hitrosti rotacijskega gibanja

Korelacijski čas rotacijskega gibanja

An

izo

tro

pij

aro

taci

jske

ga g

iban

ja

5 ns

Časovno okno

Študij premreževanja polimerov

• PRIMER: zamreževanje želatinskih (biopolimernih) gelov z EDC zamreževalcem

• PROBLEM: stopnja zamreževanja in neznana lokalna mobilnost polimernih verig

• PRISTOP: uporaba spinskega označevalca, ki se veže na isto skupno, kot EDC, in poroča o mobilnosti

Spinsko označevanje in študij translacijske difuzije

Močna spinska izmenjava

Šibka spinska izmenjava

Rezultirajoči spekterkot utežena vsota

+=

Korelacija oblike EPR spektrov in spinske izmenjave

Nanoreologija in translacijska difuzija v morskem gelu

• Počasna difuzija koncentrirane raztopine označevalca v gel generira različna koncentracijska stanja, iz njih pa lahko zaradi omejitev difuzije izluščimo velikost kletk

Razglednica za spomin

Nanoreologija preko

spinske izmenjave

EDC/NH2-1/1_fosfatni_puf

nedial

dial_1x

dial_2x

izotropno gibanje

anizotropno gibanje

Gibljivost polimerov preko

anizotropije rotacijskega gibanja

Magnetno polje

Ener

gija

+

=

Detekcija radikalov

s spinskim lovljenjem

Nastanek EPR spektra

Our team

Laboratory of Biophysics @ F5.IJS, FFA.UNI-LJ, CO NAMASTE

Tilen KokličSlavko Pečar

Zoran Arsov

Iztok Urbančič

Marjeta Šentjurc

Janez Mravljak

Stane Pajk

Ivan Kvasić

Darija Jurašin

Alma Mehle

Ajasja LjubetičMaja Garvas

Daniele Biglino

Jana Mlakar

Janez Štrancar

http://lbf.ijs.si

Jure Zdovc

http://www.conamaste.si