SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA MOLECOLARE … · Relazione tra gli spettri di eccitazione e gli spettri di fluorescenza ... Le molecole libere dell’8-idrossichinolina in

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1 Analitica 26 16/17

SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA MOLECOLARE 27

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Spettroscopia di fluorescenza molecolare

La fluorescenza è un processo di fotoluminescenza, molto

importante dal punto di vista analitico, in cui gli atomi o le

molecole vengono eccitate mediante assorbimento di

radiazione elettromagnetica.

Le specie eccitate ritornano al loro stato fondamentale

emettendo l’energia in eccesso sotto forma di fotoni.

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✔enorme sensibilità; da uno a tre ordini di grandezza

migliore di quella offerta dalla spettroscopia di

assorbimento

✔elevato intervallo di linearità; significativamente

superiore a quello della spettroscopia di assorbimento

✖meno largamente applicabili rispetto ai metodi di

assorbimento per il ridotto numero di sistemi chimici in

grado di dare fluorescenza

Vantaggi e svantaggi dei metodi di fluorescenza

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La forma ridotta del coenzima Nicotibammide Adenin-

Dinucleotide (NADH) assorbe la radiazione a 340 nm

La molecola fluoresce emettendo una radiazione a 465 nm

Un esempio pratico

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Teoria della fluorescenza molecolare

La figura è una raffigurazione schematica parziale della distribuzione di energia per una specie molecolare ipotetica.

Con E0 esprimiamo lo stato fondamentale mentre E1 e E2 sono gli stati elettronici eccitati. A ciascuno degli stati elettronici sono associati q u a t t r o s t a t i e c c i t a t i vibrazionali.

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Nella figura (a) è evidente come l’irradiazione

della specie E0 mediante una banda di

radiazione di lunghezze d’onda da λ1 a λ5

origina un momentaneo popolamento dei

cinque livelli vibrazionali del primo stato

eccitato E1.

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Nella figura (a) è evidente come l’irradiazione della specie E0 mediante una banda di radiazione di lunghezze d’onda da λ1 a λ5 origina un momentaneo popolamento dei cinque livelli vibrazionali del primo stato eccitato E1.


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Allo stesso modo sempre sulla

figura (a) si osserva che quando

le molecole sono irradiate da

una banda di radiazione più

e n e rg e t i c a , c o s t i t u i t a d a

lunghezze d’onda più piccole da

λ’1 a λ’5, risultano popolati

rapidamente i cinque livelli

v i b r a z i o n a l i d e l l o s t a t o

energetico più elevato E2.


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Il tempo di vita di una specie

eccitata è molto breve poiché

sono numerosi i modi con cui

una molecola o un atomo

eccitato può perdere l’energia

assorbita e rilassarsi sino al

proprio stato fondamentale.

Due meccanismi importanti di

questo tipo di processo sono:

➲ rilassamento non-radiativo

[figura(b)]

➲ rilassamento fluorescente [figura(c)]


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L a d i s a t t i v a z i o n e v i b r a z i o n a l e o

rilassamento è indicata in figura (b) dalle

piccole frecce ondulate tra i livelli di

energia vibrazionale e avviene durante le

collisioni tra le molecole eccitate e le

molecole del solvente.

L’energia vibrazionale eccedente viene

trasferita alle molecole del solvente in una

serie di passaggi come indicato in figura

(b).

La vita media di uno stato vibrazionale

eccitato è solo di 10-15 sec.

Rilassamento non-radiativo

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Talvolta può avvenire il

rilassamento non-radiativo

tra il livello vibrazionale più

basso di uno stato elettronico

eccitato e quello più alto di

un altro stato elettronico.

Questo processo è detto

conversione interna ( vedi

figura b) ed è molto meno

efficiente del rilassamento

vibrazionale.

La vita media di uno stato

elettronico eccitato è tra i

10-9 e i 10-6 sec.

Rilassamento non-radiativo

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Come è mostrato in figura (c)

quando le molecole diventano

fluorescenti vengono prodotte

bande di radiazioni poiché le

m o l e c o l e e c c i t a t e

elettronicamente possono subire

un processo di rilassamento verso

uno qualsiasi dei numerosi stati

vibrazionali dello stato elettronico

fondamentale.

Rilassamento fluorescente

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Le linee con cui terminano le due bande di fluorescenza a lunghezza d’onda più piccola, o ad alta energia, (λ1 e λ’1) sono identiche in energia alle due linee indicate da λ1 e λ’1 nello schema di assorbimento della figura (a). Queste linee sono dette linee di risonanza in quanto l e l u n g h e z z e d ’ o n d a dell’assorbimento e della fluorescenza sono identiche.

Linee di risonanza e spostamento di Stokes

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Le bande di fluorescenza molecolare sono costituite

soprattutto da linee con lunghezze d’onda maggiori, e quindi

con minore energia, delle bande di radiazione assorbite

responsabili del loro eccitamento.

Questo spostamento verso lunghezze d’onda maggiori è

talvolta chiamato spostamento di Stokes.

Linee di risonanza e spostamento di Stokes

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Relazione tra gli spettri di eccitazione e gli spettri di fluorescenza

Le differenze tra gli stati vibrazionali sono simili sia

per lo stato fondamentale che per quelli eccitati per

cui l’assorbimento o spettro di eccitazione e lo

spettro di fluorescenza per un composto appaiono

come immagini approssimativamente speculari

l’uno dell’altro con sovrapposizione nella linea di

risonanza.

Antracene in alcol

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Specie fluorescenti

La fluorescenza è uno dei molteplici processi per il quale una

molecola ritorna allo stato fondamentale dopo che viene

eccitata mediante assorbimento di radiazione.

Tutte le molecole sottoposte a tale processo potenzialmente

possono emettere fluorescenza.

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Specie fluorescenti

La maggior parte tuttavia non lo fa perché la loro struttura

determina percorsi di rilassamento non-radiativi che avvengono a

velocità superiori rispetto all’emissione fluorescente.

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Specie fluorescenti

Il rendimento quantico di fluorescenza molecolare è semplicemente il rapporto tra il numero di molecole che emettono fluorescenza e il numero totale di molecole eccitate.

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Molecole altamente fluorescenti hanno efficienze quantiche che

raggiungono l’unità mentre specie non fluorescenti hanno valori

molto prossimi allo zero.

Specie fluorescenti

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Fluorescenza e struttura

I composti contenenti anelli aromatici

danno la più intensa e la più utile

emissione fluorescente molecolare.

I più semplici eterocicli (piridina, furano,

t iofene e pirrolo) non mostrano

fluorescenza molecolare mentre strutture

fuse contenenti questi anelli fluorescono.

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Una sostituzione su un

a n e l l o a r o m a t i c o

determina spostamenti

nella lunghezza d’onda

d e i m a s s i m i d i

assorbimento e variazioni

corrispondenti nei picchi

d i f luorescenza . La

sostituzione interferisce

talvolta sull’efficienza

della fluorescenza.

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Fluorescenza e struttura

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La fluorescenza viene favorita in modo

particolare dalle molecole rigide.

Nell’esempio riportato a fianco l’efficienza

quantica del fluorene è circa 1 mentre

quella del bifenile è circa 0.2.

La differenza di comportamento è

imputabile all’aumento di rigidità dovuto

al ponte del gruppo metilenico nel

fluorene.

Effetto della rigidità strutturale

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La rigidità fa diminuire la velocità di rilassamento non-radiativo sino ad un valore per cui diventa competitivo il rilassamento mediante fluorescenza. L’influenza della rigidità spiega anche l’aumento in fluorescenza di alcuni agenti organici chelanti quando questi sono complessati con uno ione metallico. Le molecole libere dell’8-idrossichinolina in soluzione vengono velocemente disattivate mediante le collisioni con le molecole del solvente e quindi non fluorescono. La rigidità del complesso Zn-8-idrossichinolina migliora la fluorescenza.

Effetto della rigidità strutturale

8-idrossichinolina

Complesso con lo zinco dell’8-idrossichinolina

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Temperatura ed effetti del solvente

L’efficienza quantica di fluorescenza decresce con l’aumentare della temperatura poiché l’aumento della frequenza delle collisioni a temperature elevate fa aumentare la probabilità di un rilassamento collisionale. La diminuzione della viscosità nel solvente porta agli stessi risultati.

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L’intensità della radiazione fluorescente F è proporzionale al potere radiante del raggio di eccitazione assorbito dal sistema:

F = K’ (P0 – P) dove P0 rappresenta il potere radiante incidente sulla soluzione e P il suo valore, dopo che il raggio ha attraversato una lunghezza b della soluzione. K’ dipende dall’efficienza quantica di fluorescenza. Per esprimere F in funzione della concentrazione c della particella fluorescente scriviamo la legge di Beer nella forma:

P/P0 = 10-εbc

Sostituendo si ha

F = K’ P0 (1- 10-εbc) Quando εbc = A < 0.05

F = Kc

Effetto della concentrazione sull’intensità di fluorescenza

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Un diagramma della potenza fluorescente di una

soluzione contro la concentrazione delle specie emettenti

mostra linearità a basse concentrazioni.


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Quando però c diventa abbastanza grande

da determinare un valore di assorbanza

superiore a circa 0.05( o una trasmittanza

inferiore al 90%) la linearità scompare ed F

si trova al di sotto della retta di

e s t r apo laz ione (ASSORBIMENTO

PRIMARIO).

A concentrazioni molto alte, F raggiunge un

massimo e può anche cominciare a

d i m i n u i r e c o n l ’ a u m e n t a r e d e l l a

c o n c e n t r a z i o n e a c a u s e

dell’ASSORBIMENTO SECONDARIO in

cui la radiazione emessa viene aasorbita da

latre molecole di analita.


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L’effetto precedentemente descritto è il risultato

dell’autospegnimento per cui le molecole dell’analita

assorbono la fluorescenza prodotta dalle altre molecole

dell’analita stesso.

In realtà, a concentrazioni molto elevate, F raggiunge un

livello massimo e poi comincia a decrescere man mano

che aumenta la concentrazione.


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Strumenti per la misura della fluorescenza

La figura a fianco mostra

una tipica configurazione

d e g l i e l e m e n t i c h e

compongono i fluorimetri e

gli spettrofluorimetri.

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La figura a fianco mostra una tipica configurazione degli elementi che compongono i f l u o r i m e t r i e g l i spettrofluorimetri.

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I f luor imet r i , cos ì come i l

fotometro, utilizzano i filtri per la

selezione delle lunghezze d’onda.

Gli spettrofluorimetri utilizzano

invece un filtro per selezionare la

radiazione di eccitazione ed un

monocromatore a reticolo per

d i s p e r d e r e l a r a d i a z i o n e

fluorescente emessa dal campione.


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Generalmente tutti gli strumenti per la fluorescenza sono del tipo a doppio raggio per compensare fluttuazioni nella potenza della sorgente.


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Il raggio diretto verso il

c a m p i o n e p a s s a p r i m a

a t t r a v e r s o u n f i l t r o o

monocromatore primario il

quale trasmette le radiazioni che

stimolano la fluorescenza ed

e s c l u d e o l i m i t a q u e l l e

corrispondenti alle lunghezze

d’onda della fluorescenza.


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La radiazione di fluorescenza viene

emessa dal campione in tutte le

direzioni ma può essere osservata in

modo conveniente ad angolo retto al

raggio di eccitazione; ad angoli

diversi l’incremento della diffusione

della radiazione da parte della

soluzione e dalle pareti della cella

genera grossi errori nella misura

dell’intensità.

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La radiazione emessa raggiunge

un rivelatore fotoelettrico dopo

essere passata attraverso il filtro,

o monocromatore secondario, che

isola un picco di fluorescenza per

la misurazione.


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Il raggio di riferimento passa

attraverso un attenuatore che

d i m i n u i s c e l a s u a p o t e n z a

approssimativamente fino a quella

della radiazione di fluorescenza.

I segnali provenienti dai fototubi del

riferimento e del campione sono

successivamente processati da un

amplificatore la cui uscita è

monitorata da un registratore.


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◆ I f l uo r ime t r i sono p iù sens ib i l i deg l i

spettrofluorimetri poiché i filtri hanno una maggiore

capacità di trasmissione della radiazione rispetto ai

monocromatori.

◆ La sorgente ed il rivelatore possono essere posti più

vicino al campione nello strumento più semplice e ciò

ne incrementa la sensibilità.


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Applicazione dei metodi di fluorescenza

I metodi di fluorescenza sono più sensibili dei metodi basati sull’assorbimento da uno a tre ordini di

grandezza poiché la loro sensibilità può essere

aumentata sia mediante l’aumento di potenza del raggio

di eccitazione sia amplificando il segnale del rivelatore.

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Metodi fluorimetrici per specie inorganiche

Esistono due diversi metodi fluorimetrici applicabili alle

specie inorganiche:

➲metodi diretti: basati sulla reazione dell’analita con un agente chelante per formare un componente che sia

fluorescente

➲metodi indiretti: basati sulla diminuzione o estinzione

della fluorescenza di un reagente come risultato della sua

reazione con l’analita

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Metodi fluorimetrici per specie inorganiche

✔ metodi diretti: vengono usati principalmente per la determinazione dei cationi ✔ metodi indiretti: vengono usati soprattutto per la determinazione degli anioni

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Reagenti fluorimetrici

I reagenti fluorimetrici più efficaci per la determinazione dei cationi sono composti aromatici con due o più gruppi funzionali donatori che permettono la formazione di chelati con lo ione metallo.

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Reagenti fluorimetrici

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Metodi fluorimetrici per specie organiche e biochimiche

Il numero delle applicazioni dei metodi fluorimetrici in questo

settore è notevole.

Indiscutibilmente la sensibilità e la selettività del metodo lo rendono uno strumento particolarmente valido per l’analisi di

prodotti alimentari, farmaceutici, campioni clinici e prodotti

naturali.

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Spettroscopia Molecolare di Fosforescenza

La fosforescenza è un fenomeno di fotoluminiscenza abbastanza simile alla fluorescenza. La fluorescenza avviene con transizioni da uno stato eccitato di singoletto ad uno stato fondamentale di singoletto (vita molto breve 10-5 s o meno) La fosforescenza molecolare coinvolge invece una transizione a uno stato eccittato di tripletto ad uno stato fodamentale di singoletto. Tale transizione è molto meno probabile (vita media da 10-4 s a 104 s)

Fondamentale singoletto

Eccitato singoletto

Eccitato tripletto

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Spettroscopia Molecolare di Fosforescenza

La lunga vita media della fosforescenza è anche uno dei suoi svantaggi. Iprocessi non radiativi possono competere per disattivare lo stato eccitato. Per aumentare questa efficienza generalmente si abbassava la temperatura in matrici rigide come I vetri. Oggi è possibile la fosforescenza a temperatura ambiente. In questa tecnica la molecola viene adsorbita su un asuperficie solida o racchiusa in un acavità molecolare (MICELLE o CAVITA’ della ciclodestrina)

Fondamentale singoletto

Eccitato singoletto

Eccitato tripletto

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