Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Saiw;dm£ Teklwlagi Menuju Era 1Ynggal Laudas

Baudung, 8 -10 Oktober 1991PPTN - BATAN

STANDAR THYROID STIMULATING HORMONE UNTUKIMMUNORADIOMETRIC ASSAY

Misyetti, Rukmini Iljas, Entit SusihiwatiPusat Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional

AHSTRAKSTANDARTHYROIDSTIMULATING HORMONE UNTUK IMMUNORADIOMETRIC

ASSAY.Preparasi suatu standar ditentukan oleh penggunaan standar itu sendiri. Pada tahun1924 perserikatan beberapa negara sudah menentukan preparasi standar untuk bioassay.Pada tahun 1968 WHO Expert Committee on Biological Stand8rdization mengatakan bahwastandar untuk bioassay tidak sesuai digunakan untuk radioimmunoassay. Oleh karena itusebelum pembuatan suatu standar perIu diketahui untuk apa standar itu akan digunakan.Dalam pembuatan suatu standar perIu diperhatikan pelarut,larutan pengencer serta bahanmaterial yang digunakan. Dalam percobaan ini pe buatan standar TSH untuk IRMA dicobamenggunakan serum kuda sebagai pengencer. Untuk uji kualitas dan standardisasi diguna­kan produk Netria sebagai pembanding. Hasilnya dievaluasi dari perbandingan kurva stan­dar dan hasil penentuan terhadap beberapa cuplikan. Untuk menentukan kondisi penyim­panan, dilakukan pengujian dengan menyimpan standar tersebut pada beberapa kondisiyaitu dalam bentuk padat dan cair pada temperatur kamal', _20°C,4 °c dan 37°C. Kestabilandari setiap kondisi penyimpanan tersebut ditentukan setiap dua bulan dengan menggunakanmetode IRMA. Hasil percobaan menunjukkan bahwa standar yang dibuat memberikan hasilpenentuan yang sesuai dengan standar Netria yang berarti bahwa serum kuda dapatdigunakan sebagai pengencer. Dari uji kestabilan, kondisi penyimpanan yang baik adalahpada 4 °c meliputi kedua bentuk tersebut yaitu padat dan cair, sehingga sampai satu tahunmasih memberikan hasil penentuan yang baik.

AHSRACTSTANDARD FOR THYROID STIMULATING HORMONE IN IMMUNORADIO

METRIC ASSAY.Preparation ofstandards depend on their intended use.In 1924 a committeerepresenting a number of countries established standard preparation for bioassay. In 19G8theWHO Expert Committee on Biological Standardization stated that standards for bioassay arenot suitable for purposes of radioimmunoassay. In the preparation of stand aI'Sdue attentionshould be paid to the types of solvent, diluent and materials used. In the present study TSHstandards for IRMAwere prepared by using horse serum as diluent and standardized againstNetria products. The parameters compared were those of the standard curves and assay valuesfor quality control samples. Stability studies were carried out in the solid as well as liquidphase under several storage conditions i.e at room temperature, _20°C, 4 °c and 37°C. Thestandard were retested after 2 month interval using IRMA. Experimental results showed thatthe standards are very similar to those obtained from Netria, implying that horse serum is asuitable diluent. Both the liquid and solid from were found to be stable for one year whenstored at 4°C.

PENDAHULUAN

Standar adalah materi pembanding yangmempunyai sifat yang sarna dengan cuplikan.Secara teoritis bahan yang digunakan untukpembuatan standar harus mempunyai kesta­bilan dan kemurnian yang tinggi, dan mempu­nyai struktur yang tertentu (1,2). Syarat inihanya dapat terpenuhi pada senyawa yang cia­pat disintesis.

Sifat yang berbeda alum ditemui pada se­nyawa biologis seperti thyroid stimulating Iwr­mone (TSI-I),follicle stimulating hormone (FSH)dan luteinizing hormone (LH). Senyawa-senya­wa seperti ini belurn dapat disintesis clan bia-

sanya diperoleh clarihasil ekstraksi bahan sum­bernya, seperti urine, plasma clan sebagainya.Struktur kimia clari senyawa biologis ini sulitdiketahui seCal'a pasti. Bahkan senyawa yangsama, tapi diperoleh dari sumber yang berbeda,misalnya hasil ekstraksi dari plasma clan dariurine, akan menunjukkan struktur yang berbe­da. Biasanya yang satu merupakan isomer clariyang lain (1). Oleh karena itu pembuatan stan­dar clari senyawa biologis jauh lebih sukar cli­bandingkan dengan senyawa hasil sintesis.

Satuan untuk senyawa yang bukan hasilsintesis clitentukan oleh efek biologisnya,

319

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas

biasanya dalam bentuk unit. Standar ini harusdikalibrasi dengan standar lain.

Preparasi suatu standar juga ditentukanuntuk apa standar itu akan digunakan. Padatahun 1924 perserikatan beberapa negara su­dah menentukan preparasi standar untuk bio­assay. Pada tahun 1968 WHO Expert Commit­tee on Biological Standardization mengatakanbahwa standar untuk bioassay tidak sesuai un­tuk radioimmunoassay (1).

Keandalan suatu standar merupakantanggung jawab dari laboratorium yang mem­buatnya. Untuk standar immunoassay harusdiperhatikan beberapa faktor a.l : kehomogen­an, stabilitas dan kemiripan matriks denganmaterial yang akan ditentukan dan harus dika­librasi dengan benar.

TATAKERJA

Bahan dan perala/anBahan yang digunakan untuk pembuatan

standar TSH adalah :TSH, serum kuda, standarpembanding (Netria), solid phase anti TSH(Netria), anti TSH monoklonal bertanda 1-125(PPTN) dan dapar fosfat.

Peralatan yang diperlukan antara lain :mikro pipet ependorf, pengering beku (LabConco), sentrifuga IEC Centra-7R, alat penca­cah y mini assay type 6-20.

Preparasi larutan pengencerSebagai pengencer digunakan serum kuda

yang diperoleh dari pemrosesan darah kuda.Serum kuda ini disaring dan ditentukan kadarTSH yang dikandungnya dengan metode immu­noradiomericassay. Prosedur kerja adalah sbb:ke dalam tabung polietilen dimasukkan ber­turut-turut : 50 !!l standar TSH, 50 !!l mono­klonal anti-TSHI-125, 50 !!l solid phase anti­TSH, 300 !!ldapar fosfat pH 7,5 ,diinkubasi satumalam, dicuci dengan 2x2 ml dapar fosfat, di­sentrifugasi dan endapan dicacah .

Preparasi standarTSH dilarutkan dalam dapar fosfat pH 7,5

kemudian ditentukan dengan metode IRMAun­tuk menentukan konsentrasinya. Larutan inidiencerkan sampai 100 lUlL dengan dapar fos­fat ( dijadikan larutan induk ). Dari larutaninduk ini dibuat larutan standar konsentrasi 0- 60 mlUIL dengan menggunakan pengencerserum kuda di atas. Standar ini dibagi-bagidalam vial kecil masing - masing 0,5 ml. Sebagi­an dikeringkan dengan pengering beku dansebagian dibiarkan dalam bentuk cairo

Bandung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BATAN

Uji kualilas StandarKualitas standar yang dibuat selalu diuji

dengan metode IRMA menggunakan prosedurkerja seperti pada uji kualitas pelarut. Uji kua ..litas ini dilakukan beberapa kali yaitu sebelumdibagi-bagi pada vial kecil,sebelum dan sesudahpengeringan.

Penentuan Kondisi PenyimpananUntuk menentukan kondisi penyimpanan

yang baik dicoba beberapa macam variasi tern-·peratur dalam bentuk padat dan cair yaitu pada.temperatur kamar, -20 °C,4°C dan 37 °C.Untuksetiap macam kondisi penyimpanan ini dilaku ..kan uji kualitas setiap dua bulan secara teraturselama kira-kira satu tahun.

HASILDAN DISKUSI.

Standar sangat menentukan akurasi hasilpenelitian. Oleh karena itu dalam pembuatanstandar penting sekali diperhatikan ketelitianyang tinggi, baik dari segi pengeIjaan, maupunmaterial dan peralatan yang digunakan.

Untuk memperoleh standar yang andaluntuk immunoradiometricassay, perlu diper­hatikan pelarut dan pengencer yang digunakan.

Pelarut dipilihyangdapat melarutkan ma·terial d::mganbaik, sedangkan pengencer haru!;mempunyai syarat-syarat sebagai berikut (3):1. mengandung material yang mencegah ad·

sorbsi pada tabung/ gelas.2. mengandung bahan pengemban yang juga

dapat mencegah degradasi standar.3. semirip mungkin dengan pelarut dimana

cuplikan berada.Larutan pengencer yang biasa digunakan

untuk pembuatan standar TSH adalah serumyang bebas dari TSH. Ada beberapa cara yangdapat ditempuh untuk hal ini antara lain:1. dari serum manusia dengan menarik TSH

dengan cara imunokromatografi. Prinsip da­ri metode ini yaitu melewatkan serum kekolom yang sudah berisi anti TSH yang di­ikatkan dengan bahan penyangga sepertisellulosa, sehingga antibodi ini akan meng­ikat TSH yang ada dalam serum tsb. Serumyang keluar dari kolom sudah bebas dariTSH. Metode ini membutuhkan biaya yangtinggi sekali untuk pembuatan kolomnya.

2.serum manusia yang diinjeksi Ta dengan do­sis 150 !!g/hari selama dua minggu (4). De­ngan cara ini, kadar Ta dalam darah akanmeningkat ( hipertiroid ). Oleh karena kan­dungan Ta yang tinggi dalam darah, makakelenjar hipofisa tidak akan mengeluarkanTSH, sehingga kadar TSH dalam darahjadikecil dan mendekati nol. Pada saat ini darah

320

Gambar 1. Perbandingan kurva standar TSHyang baru dengan acuan.

Tabel1: Studi perbandingan standar TSH yangbaru dibuat dengan standar acuan dievaluasihasil penentuan beberapa cuplikan denganmetode IRMA.

bi!. Dari hasil percobaan ini maka standar tidakdibenarkan disimpan pada temperatur kamar,apalagi untuk daerah tropis seperti daerah pa­dang pasir, pengiriman standar harus dalamkondisi dingin ( dikemas dengan menyertai eskering)

Pada uji coba terhadap 382 cuplikan donordarah dari PMI cabang Bandung padaumumnya hasil yang diperoleh di bawah 4

cup-rep-Hasil assay TSH dalam cuplikan

lik-li- menggunakan standar

ankat

Netria baru

konst.

CVkonst.CV(mIUjL)

(mlU/L)

A

60,85 ± 0,210,250,77 ± 0,220,28B

65,81 ± 0,370,125,87 ± 0,390,07C

616,92± 0,880,0516,66 ± 0,970,06D

60,34 ± 0,310,910,26 ± 0,200,77E

66,40 ± 0,910,146,45 ± 0,660,10F

623,97 ± 2,680,1124,28 ± 2,370,10

Bandung, 8 -10 Oktober 1991PPTN - BATAN

30

,,.,1 ~

, .0'

;~.;!"

o •. 'oj

o •.,..

o{..:!,':.0

:!01... '..

",j

"'rI •. ,

I •,.i!, '

,j

'53Ji.1:In •• ntrni (mIU/L)

,0

I"!

iI.,

1"]!

volunter diambil dan serumnya dapat digu­nakan sebagai pengencer untuk pembuatanstandar TSH. Menggunakan metode ini,volunter harus selalu dalam pengawasandokter .

3. ada beberapa binatang yang kandunganTSH nya tidak mengalami reaksi silangdengan TSH manusia, diantaranya kuda.Hasil pengujian kandungan TSH dalam se­rum kuda dengan metode IRMA mengguna­kan anti-HTSH monoklonal yang diproduksipada mencit, bertanda 1-125 tidak menun­jukkan adanya kandungan TSH dalam se­rum. Hal ini berarti bahwa TSH yang adadalam serum kuda tidak bereaksi denganhuman anti-TSH. Oleh karena itu serumkuda dapa t digunakan sebagai larutan peng­encer untuk standar TSH seperti yang dila­kukan pada percobaan ini.

Material yang digunakan dalam pembu­atan standar ini adalah human pituitary TSH.Material ini sangat heterogen, di dalamnya ter­kandung FSH, LH, hCG dan prolaktin. Hor­mon-hormon ini mempunyai struktur yang mi­rip sehingga sulit dipisahkan satu sarna lain (6).

Sesuai dengan kegunaan standar ini ada­lah untuk immunoradiometricassay, materialya.ng heterogen tersebut tidak mengurangi ke­andalan standar karena dalam sistem IRMAdigunakan antibodi yang monoklonal, sehinggaakan bereaksi spesifik hanya dengan TSH saja.Berbeda halnya bila standar ini digunakan un­tu k radioimmunoassay (menggunakan antibodipoliklonal) material yang heterogen ini akanmemberikan kesalahan yang sistematis.

Gambar 1 adalah hasil kurva standar,menggunakan standar Netria dan standar yangbaru dibuat. Perbandingan kedua kurva terse­but menunjukkan bahwa diluen yang diguna­kan mempunyai matriks yang mirip denganstandar Netria.

Pengeringan dengan pengering beku sela­ma satu malam tidak merusak TSH ataupunmatriks dari pelarut. Hal ini terbukti dari hasilyang sarna sebelum dan sesudah pengeringanyang ditunjukkan pada Tabel1.

TSH tennasuk senyawa yang mudah rusak(Ei). Oleh karena itu perlu dicari kondisi pe­nyimpanan yang sesuai sehingga standar inidapat stabil dalamjangka waktu yang panjang.

Hasil pengujian kondisi penyimpanan me­nunjukkan bahwa standar TSH cukup stabilpad a 4°C dan -20°C untukjangka waktu lebihdari satu tahun (Gambar 2), sedangkan padatemperatur kamar dan 37°C sangat tidak sta-

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsclan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Landas

321

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Landas

mUI/L. Populasinya ditunjukkan pada Gambar3 '6;

,. J7° C cau2. !olin" kama'J. 37° . pad.1••• ",hu kamA' pada'

5. 0° C ,ai r6. 4° C pad.11. 0° C p.d.t

8••• 0 C cair

g, ~hlr i. (,.u,ene.)

Bandung, 8 -10 Oktober 1991PPTN - BATAN

!'0

n

,,[o ----1L- __ IL0_1 1-2 2 - 3 J-" 4- ~

Itadlu TSH (mIU/l)J;15-6

Gambar 2. Uji kestabilan standar TSH denganbeberapa kondisi penyimpanan dilihat darihasil a8say cuplikan ( A dan B ).

Kadar TSH yang normal dalam serumdarah untuk orang dewasa adalah 6 mIU/L danuntuk bayi dan anak-anak <13 mIU/L (5)

DAFTAR PUS TAKA

Gambar 3. Kadar TSH yang diperoleh padaanalisis serum darah 382 orang donor darahpada PMI cabang Bandung.

KESIMPUIAN

1.Serum kuda dapat digunakan sebagai larut­an pengencer pada pembuatan standar TSHuntuk analisis dengan metode immunora­diometric a8say.

2.Standar yang dibuat mempunyai matriksyang mirip dengan acuan.

3.Perbandingan hasil penentuan dari bebera­pa cuplikan tidak menunjukkan adanya per­bedaan yang nyata, baik menggunakanstandar yang dibuat sendiri maupun stan­dar Netria.

4.Kondisi penyimpanan yang terbaik adalah 4°c.

1. Cotes P.M., Standards and reference reagents for radioimmunoassay, IAEA-SM-124/57

2. Thorel J.I., Radioimmunoassay design and quality control, Pergamon Press, Paris (1982)

3. Thorel J.I and Larson S.M., Radioimmunoassay and Related Techniques, The C.V.MosbyCompany, Saint Louis (1978)

4. Heinz Breuer , Daisy Hamel and Hans Ludwig Kruskemper , Method of Hormoe Analysis,John Wiley and Sons, New York (1978)

5. Vining Ross. F., Hormone Assay Service Handbook, Garvan Institute of Medical Research, StVincent's Hospital, Darlinghurst (1984)

6. Devlin Thomas M., Textbook of Biochemistry with Clinical Correlation, 2nd, John Wiley &Sons, Singapore (1986)

322

Proceedings Seminar Reaktvr Nllklir dalum Penditian Suinsckm Teknolagi Menlljll Era Tinggal L(mda.~

DJSKUSI

Baudung, 8 -10 Oktvber 1991PPTN - BATAN

Rntnawati K.:1. Apakah perbedaan standar bioassay dengan standar radioimmunoassay?2. Apakah perbedaan standar IRMAdengan standar radioimmunoassay?3. Pada RIA untuk menguji bahwa matriks standar sarna dengan cuplikan dilakukan tesparalelism. Apakah tes paralelism ini dapat juga dilakukan untuk ~enguji matriks standarIRMA ?

Misyetti :1. Bioassay bisa secara in vitro dan in vivo. Bila menggunakan secara in vivo, maka standarharus memenuhi syarat in vivo ( harus diperhatikan hal-hal yang mengganggu keselamatanbinatang percobaan ). Hal ini tidak dibutuhkan untuk RIA dan IRMA. Secara in vitro metodebioassay sangat bervariasi, termasuk RIA dan IRMA. Untuk metode RIA dan IRMA adanyaadsorbsi pada tabung sangat mempengaruhi hasil assay. Oleh karena itu standar untuk RIAdanIRMA harus diusahakan tidak mudah terserap oleh tabung. Hal ini tidak dibutuhkan untukbioassay yang lain. Metode RIAdan IRMAdipengaruhi oleh komposisi protein di dalam sistem,oll~hkarena itu pelarut untuk standar RIA dan IRMA harus memperhatikan hal ini. Pelarutuntuk standar RIA dan IRMA tidak bisa, misalnya hanya dengan menggunakan dapar saja,kecuali dengan penambahan sejumlah protein ke dalamnya. Untuk beberapa bioassay yang lainhal ini tidak dibutuhkan. Adajuga bioassay yang harus memperhatikan kejernihan, yang dalamRIA dan IRMA tidak diperlukan. Karena bioassay sangat bervariasi, maka persyaratanstandarpun bermacam-macam. Oleh karena itu pada pembuatan standar harus diketahuiterlebih dahulu untuk apa standar itu mau digunakan.2. Persyaratan standar IRMAsarna dengan untuk RIA.3. Dalam pembuatan standar IRMAperlu diadakan tes paralelism, tujuannya untuk menentukanmatriks yang sesuai sebagaimana yang dilakukan untuk RIA. Uji keparalelan ini bisa dilakukandengan cuplikan yang mempunyai kadar tinggi dan bisa juga terhadap standar pembanding.Dalam percobaan ini saya melakukan cara membandingkan dengan standar pembanding(Gambar 1).

Nanny Kartini H. :Pada percobaan penentuan kestabilan dari standar dilakukan penyimpanan pada 37°C. Apakahitu perlu ? Karena kita mengetahui bahwa pada suhu itu senyawa biologis paling reaktifberartipaling tidak stabil. Jadi dasar pemikiran apakah sampai dilakukan percobaan pada 37°C?Misyetti :Penentuan stabilitas pada suhu tinggi perlu dilakukan. Hal ini sangat penting pada pengemasansewaktu pengiriman. Terutama ke clan atau dari negara-negara tropis yang suhunya sangattinggi, bahkan diatas 40°C. Pemikiran ini timbul dari pengalaman sewaktu menerima kit RIAdari Irak tanpa dikemas dalam kondisi dingin, dan sampai diterima di Lab. kami ( Bandung)sudah tidak mempunyai ikatan yang sesuai. Pemilihan suhu 37°C adalah untuk memudahkanpercobaan, karena fasilitas disini, untuk suhu 37°C dapat kami pakai tanpa ada gangguan danbersamaan dengan kebutuhan yang lain.

323