Stanovení exprese receptoru Stanovení exprese receptoru epidermálního růstového faktoru epidermálního růstového faktoru ( EGFR )( EGFR )

Véghová B., Berkyová A., Kostelecká L.Véghová B., Berkyová A., Kostelecká L.

Ústav Patologie I.LF UK a VFN, Praha

Receptor epidermálního růstového Receptor epidermálního růstového faktoru faktoru (EGFR)(EGFR)

Stanovení EGFR :Stanovení EGFR :

→ → možnost moderní metody léčby nádorů na možnost moderní metody léčby nádorů na molekulární úrovni:molekulární úrovni:

vazba upravené protilátky a antigenu nádorové vazba upravené protilátky a antigenu nádorové buňky zabrání jejímu dalšímu růstu, vede k apoptózebuňky zabrání jejímu dalšímu růstu, vede k apoptóze

Léčebné využití :Léčebné využití :

karcinom plickarcinom plic

karcinom prsukarcinom prsu

karcinom tlustého střevakarcinom tlustého střeva

Využití EGFRVyužití EGFR v léčbě kolorektálního karcinomu v léčbě kolorektálního karcinomu

V léčbě kolorektálního karcinomu se jeví jako V léčbě kolorektálního karcinomu se jeví jako nejslibnější zablokování části receptoru pro nejslibnější zablokování části receptoru pro epidermální růstový faktor EGFR pomocí epidermální růstový faktor EGFR pomocí monoklonální protilátky monoklonální protilátky CetuximabCetuximab

Skupina EGFR bývá označována 1-4Skupina EGFR bývá označována 1-4

Prvním popsaným receptorem této skupiny byl Prvním popsaným receptorem této skupiny byl receptor pro epidermální růstový faktor receptor pro epidermální růstový faktor označovaný jako označovaný jako EGFREGFR (HER-1, erbB-1). Dalšími (HER-1, erbB-1). Dalšími receptory jsou HER2/neu nebo erbB-2, HER-3 a receptory jsou HER2/neu nebo erbB-2, HER-3 a HER-4.HER-4.

Skupina EGFRSkupina EGFR

Set EGFR pharmDx Set EGFR pharmDx (DakoCytomation)(DakoCytomation)

Set obsahuje :Set obsahuje :

primární protilátkuprimární protilátku proteinázu Kproteinázu K blok peroxidázyblok peroxidázy negativní kontrolunegativní kontrolu labbeled polymer HRPlabbeled polymer HRP DAB + chromogen, DAB + substrátový pufrDAB + chromogen, DAB + substrátový pufr promývací pufrpromývací pufr kontrolní podložní skla obsahující dvě linie kontrolní podložní skla obsahující dvě linie

lidských buněk s hodnotami intenzity zabarvení 2 lidských buněk s hodnotami intenzity zabarvení 2 + a 0+ a 0

Set EGFR pharmDxSet EGFR pharmDx

Set EGFR pharmDx Set EGFR pharmDx (DakoCytomation)(DakoCytomation)

Všechna dodaná činidla jsou připravena speciálně Všechna dodaná činidla jsou připravena speciálně pro použití s tímto testem, aby odpovídal pro použití s tímto testem, aby odpovídal uvedené specifikaciuvedené specifikaci→ → nelze tedy používat žádné jinénelze tedy používat žádné jiné

Jsou také optimálně naředěna a jejich další Jsou také optimálně naředěna a jejich další naředění může způsobit ztrátu zabarvení naředění může způsobit ztrátu zabarvení antigenuantigenu

Použití:Použití: vzorky fixované běžným způsobem a zalité vzorky fixované běžným způsobem a zalité v parafínuv parafínu

Cena:Cena: 38 335,- Kč bez DPH 38 335,- Kč bez DPH / / 35 vyšetření35 vyšetření

Set EGFR pharmDx Set EGFR pharmDx (DakoCytomation)(DakoCytomation)

Set uchováváme při teplotě + 4° až + 6°CSet uchováváme při teplotě + 4° až + 6°C

Před prováděním metody musíme všechna činidla Před prováděním metody musíme všechna činidla vyvážit na pokojovou teplotu, při které probíhá inkubacevyvážit na pokojovou teplotu, při které probíhá inkubace

Zpracováváme současně tři podložní skla:Zpracováváme současně tři podložní skla:vyšetřovaný vzorek s primární protilátkouvyšetřovaný vzorek s primární protilátkounegativní kontrolanegativní kontrolapositivní kontrolapositivní kontrola

Tkáňové řezy by měly být co nejtenčí, nejlépe na sklech Tkáňové řezy by měly být co nejtenčí, nejlépe na sklech se speciální úpravou: se speciální úpravou: silan, poly-L-lysin, skla s nábojemsilan, poly-L-lysin, skla s nábojem

..

Provedení reakce EGFRProvedení reakce EGFR

DeparafinaceDeparafinace Odhalení antigenních struktur proteinázou KOdhalení antigenních struktur proteinázou K

proteolytický enzymproteolytický enzym Blokování endogenní peroxidázyBlokování endogenní peroxidázy

3% peroxid vodíku3% peroxid vodíku Primární protilátkaPrimární protilátka

myší monoklonální anti-lidský EGFR, klon 2-myší monoklonální anti-lidský EGFR, klon 2-18C918C9

Sekundární protilátkaSekundární protilátkaznačený polymer HRPznačený polymer HRP

Mezi těmito jednotlivými kroky důkladně Mezi těmito jednotlivými kroky důkladně oplachujeme skla v promývacím pufruoplachujeme skla v promývacím pufru

Dokončení reakce EGFRDokončení reakce EGFR

Vizualizace roztokem chromogenu DAB+Vizualizace roztokem chromogenu DAB+

Dobarvení jader hematoxylinemDobarvení jader hematoxylinem

OdvodněníOdvodnění

ZamontováníZamontování

Kontrola kvality provedené reakce :Kontrola kvality provedené reakce :positivní kontrolapositivní kontrola

negativní kontrolanegativní kontrola

Hodnocení reakceHodnocení reakce

Kvalitativní zhodnocení :Kvalitativní zhodnocení :00 žádná pozitivitažádná pozitivita1+1+ pozitivita - slabápozitivita - slabá2+2+ pozitivita - středně silná pozitivita - středně silná 3+3+ pozitivita - silná pozitivita - silná

Lokalita zbarvení :Lokalita zbarvení :buněčná membránabuněčná membránacytoplazmacytoplazmamembrána i cytoplazmamembrána i cytoplazma

negativní 1+

2+ 3+

Hodnocení pozitivní reakceHodnocení pozitivní reakce

Heterogenní barvení :Heterogenní barvení :

různá intenzita barvení různá intenzita barvení v jednom nádoru v jednom nádoru (0 až 3+)(0 až 3+)

zbarvení různých zbarvení různých strukturstruktur membránmembrán cytoplazmycytoplazmy nebo obounebo obou

Homogenní Homogenní barvení :barvení :

zbarvení stejné zbarvení stejné intenzityintenzity

zbarvení jen jedné zbarvení jen jedné strukturystruktury

EGFR proteinEGFR proteinje exprimován v řadě normálních je exprimován v řadě normálních

tkánítkání

CYTOPLAZMA :CYTOPLAZMA :

kůžekůže tonzilytonzily plíceplíce endometriumendometrium

nadledvinynadledviny

BUNĚČNÁ MEMBRÁNA BUNĚČNÁ MEMBRÁNA ::

kůžekůže tonzilytonzily plíceplíce endometriumendometrium

jícenjícen pankreaspankreas játra (hepatocyty)játra (hepatocyty) děložní čípekděložní čípek prostataprostata

Vnitřní kontrola exprese EGFRVnitřní kontrola exprese EGFR

Pozitivní vnitřní kontrola u primárního Pozitivní vnitřní kontrola u primárního tumoru:tumoru:

– normální povrchové epitelie sliznice +/- slabá normální povrchové epitelie sliznice +/- slabá pozitivitapozitivita

– perineurální fibroblastyperineurální fibroblasty

Pozitivní vnitřní kontrola u metastáz v Pozitivní vnitřní kontrola u metastáz v játrech:játrech:– hepatocytyhepatocyty

Znázornění nespecifického pozadíZnázornění nespecifického pozadí

Difuzní nespecifické zabarvení tkáňových elementůDifuzní nespecifické zabarvení tkáňových elementů

Příčina - různé faktoryPříčina - různé faktory

BIOLOGICKÁ AKTIVITA TKÁNÍBIOLOGICKÁ AKTIVITA TKÁNÍpseudoperoxidázová reakce erytrocytůpseudoperoxidázová reakce erytrocytůendogenní peroxidázová reakce endogenní peroxidázová reakce

granulocytůgranulocytů

TECHNOLOGIE PROCESUTECHNOLOGIE PROCESUchybná fixace tkáněchybná fixace tkáněinkompletní deparafinizaceinkompletní deparafinizacepoužití jiného pufrupoužití jiného pufruvyschnutí tkáně během barvenívyschnutí tkáně během barvení

Interpretační artefaktyInterpretační artefakty

Nepřiměřené proteolytické natráveníNepřiměřené proteolytické natrávení zhmoždění tkánězhmoždění tkáně okrajový artefakt (zbarvení jen na periferii vzorku)okrajový artefakt (zbarvení jen na periferii vzorku) retrakční artefakt (retrakce stromatu kolem retrakční artefakt (retrakce stromatu kolem

nádorových buněk)nádorových buněk) termální artefakty (při odběru tkáně) - problém u termální artefakty (při odběru tkáně) - problém u

endobiopsiíendobiopsií nehodnotitelné oblasti nádoru nehodnotitelné oblasti nádoru

nekrotické buňkynekrotické buňky

izolované jen jednotlivé nádorové buňkyizolované jen jednotlivé nádorové buňky

špatně ukrojený nebo napnutý řezšpatně ukrojený nebo napnutý řez

Indikace k vyšetření exprese EGFRIndikace k vyšetření exprese EGFR

Karcinom tlustého střeva Karcinom tlustého střeva metastazující i po standartní metastazující i po standartní chemoterapiichemoterapii

Při pozitivní expresi EGFR léčba ERBITUXEM (Cetuximab) Při pozitivní expresi EGFR léčba ERBITUXEM (Cetuximab) – – vyžadují Zdravotní pojišťovnyvyžadují Zdravotní pojišťovny

Spádově vyšetření provádíme pro :Spádově vyšetření provádíme pro : PrahuPrahu Středočeský krajStředočeský kraj Severočeský krajSeveročeský kraj

Vyšetření prováděná v našem Vyšetření prováděná v našem ústavuústavu

20042004 15 případů 15 případů ( od zavedení ( od zavedení metody )metody )

20052005 61 případů 61 případů2006 2006 67 případů 67 případů20072007 47 případů 47 případů ( za první pololetí )( za první pololetí )

Díky archivaci parafinových bloků můžeme Díky archivaci parafinových bloků můžeme vyšetřit i více než 10 let staré primární vyšetřit i více než 10 let staré primární adenokarcinomy tlustého střeva nebo adenokarcinomy tlustého střeva nebo jejich metastázy (zejm. uzlinové, jaterní).jejich metastázy (zejm. uzlinové, jaterní).

Děkuji za pozornostDěkuji za pozornost