Starter kulture bakterija i kvasaca u proizvodnji vina

8/10/2019 Starter kulture bakterija i kvasaca u proizvodnji vina

1/27

TEHNOLOKI FAKULTET, NOVI SAD

Biologija proizvodnih

mikroorganizama- SEMINARSKI RAD -Starter kulture kvasaca i bakterija u

proizvodnji vina

PROFESOR: STUDENT:

prof. dr Sinia L. Markov MSc Marina RajiOktobar, 2014.


2/27

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMA

Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

SADRAJ

1.

Uvod......................................................................................................................................1

2.

Primena kvasaca kao starter kultura......................................................................................1

2.1. Selekcija sojeva kvasaca za proizvodnju vina...............................................................1

2.2. Karakterizacija kvasaca za vino....................................................................................2

2.3. Odabir aktivne suve starter kulture kvasca....................................................................3

2.4. Primena aktivne suve starter kulture kvasca..................................................................4

2.4.1. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca................................................................5

2.4.2. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca primenom rehidratiueg nutrijenta.......6

2.4.3. Primena vie sojeva Saccharomyces cerevisiaekao starter kulture..................7

2.4.4. Inokulisanje groanog mota sa Saccharomyces i ne-Saccharomyces

sojevima.......................................................................................................................8

2.4.5. Primena starter kultura kvasaca za nedovrene fermentacije............................9

3.

Primena bakterijskih starter kultura.....................................................................................11

3.1. Selekcija i karakterizacija bakterija mleno-kiselog vrenja za pripremu starter kultura

u proizvodnji vina................................................................................................................12

3.2. Priprema malolaktike starter kulture..........................................................................13

3.3. Odabir odgovarajue malolakti

ke starter kulture.......................................................15

3.4. Pokretanje zastale malolaktike fermentacije..............................................................17

3.5. Doprinos malolaktike starter kulture senzornom kvalitetu vina................................19

3.5.1. MLF otkriva arome sorte................................................................................20

3.5.2. Regulisanje diacetila uticaj brzine inokulacije MLB i vremena dodavanja na

profil arome................................................................................................................21

3.5.3. Uticaj post-MLF tehnika u proizvodnji vina na senzorne osobine.................23

4. Zakljuak.............................................................................................................................23

5.

Literatura.............................................................................................................................24


3/27


Starter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina1

1.

Uvod

Iako su kvasci za proizvodnju vina poznati od davnina, proizvodnja vina bila je vie umetnost

nego nauka sve do pre 50-ak godina. Proizvodnja i upotreba aktivnog suvog kvasca (ADY

Active Dry Yeast) poela je u Sjedinjenim Amerikim Dravama sredinom 1960-ih i odatle

se proirila po celom svetu (Degre 1993). U inokulisanim fermentacijama, odabrani sojeviSaccharomyces cerevisiae se dodaju obino do postizanja populacije od oko 10

510

6

elija/mL u motu kako bi se obezbedio bri poetak fermentacije, poveana brojnost i

dominacija u odnosu na autohtone sojeve kvasaca i kako bi se obezbedile karakteristine

osobine vina. Istorija kontolisane malolaktike fermentacije (MLF) je jo kraa. Uprkos

ranom otkriu bakterija mlene kiseline (LAB Lactic Acid Bacteria) od strane Mller-

Thurgau 1891. godine, koji doprinose redukciji kiseline u vinu tako to jabunu kiselinu

razgrauju na mlenu kiselinu i CO2, komercijalne starter kulture su dospele na trite tek

poetkom 1980-ih. Najee se koriste starter kulture Oenococcus oeni (ranije nazivan

Leuconostoc oenos), mada postoje i drugi laktobacili koji su se pokazali da daju dobre

rezultate (Prahl 1989). Malolaktike (ML) starter kulture za laku direktnu inokulaciju supostale dostupne tokom ranih 1990-ih. Santiago i sar. (2011) detaljno su se bavili problemom

proizvodnje starter kultura za vino. U jedanaestom poglavlju njihove knjige Molekularna

mikrobiologija vina mogu se nai podaci o izolaciji i selekciji sojeva, razvoju biomase,

procesima koji prethode pakovanju i prodaji, kao i o nainu upotrebe odabranih sojeva

kvasaca i bakterija mlene kiseline koji se koriste u proizvodnji vina.

2.

Primena kvasaca kao starter kultura

U spontanim alkoholnim fermentacijama postoji rana i brza sukcesija odreenih vrstakvasaca kao to suHanseniaspora, Kloeckera, Candida stellata,Metschnikowia pulcherrima,

Torulaspora delbrueckii ili Pichia, koji inae rastu u motu (Henschke 1997) ali na kraju

odumiru, dok Saccharomyces cerevisiae uglavnom dominira i zasluan je za kompletnu

alkoholnu fermentaciju (Fleet i Heard 1993).Kritina taka spontane alkoholne fermentacije

je oko 4% vol. alkohola (Dittrich i Grossmann 2005), kada ne-Saccharomyces kvasci

odumiru a sojevi Saccharomyces cerevisiae postaju dominantni. Ipak, dominacija

Saccharomyces cerevisiae ne garantuje uspenu alkoholnu fermentaciju; ona zavisi i od

genetske predispozicije dominantnih sojeva. Godinama su voene rasprave u kojima su se

razmatrali relevantni faktori za spontanu alkoholnu fermentaciju u odnosu na indukovanu

alkoholnu fermentaciju. Konano reenje ovog problema ne moe se ustanoviti jer zavisi odvrste groa, eljene vrste vina, sastava groanog soka i berbe.

2.1. Selekcija sojeva kvasaca za proizvodnju vina

Poznato je da Saccharomyces cerevisiae proizvode razliite koncentracije aromatinih

komponenti u zavisnosti od tretmana mota i uslova u kojima se izvodi fermentacija,


4/27



ukljuujui temperaturu, vrstu groa, mikronutrijente, vitamine i sadraj azota u motu

(Carrau i sar. 2010). Danas je irom sveta dostupno preko 200 komercijalnih sojeva kvasaca.

Ovi sojevi su odabrani zbog svojih specifinih osobina (Tabela 1) koje mogu biti podeljene u

dve grupe: poeljne i nepoeljne karakteristike (Degre 1993), kao i zbog tehnolokih i

kvalitativnih osobina koje su opisaliDittrich i Grossmann (2005).

2.2. Karakterizacija kvasaca za vino

Potrebe za kiseonikom i azotom: Kvasci mogu od amonijumovih jona da sintetiu gotovo

sve amino kiseline i azotne baze koje su im neophodne za rast i razvoj, iako je njihov rast bri

ukoliko u hranljivoj podlozi postoje ve spremni gradivni blokovi, amino kiseline. Sadraj

azota u motu moe biti limitirajui faktor (Amerine i sar. 1980); pronaena je veza izmeu

poetnih koncentracija i maksimalne brzine fermentacije (Bely i sar. 1991). Vrednost manja

od oko 150 mg/L usvojivogazota (YAN Yeast Assimilable Nitrogen) u motu ima veze sa

veim ansama za probleme u fermentaciji (Henschke i Jiranek 1993). Dodavanje azotatokom stacionarne faze moe biti efikasno, ali neki autori su demonstrirali to da ovaj efekat

zavisi od osobina samog soja (Jiranek i sar. 1991). Julien i sar. (2000) predloili su metod za

odreivanje koliina azota i kiseonika koje su potrebne kvascima u zavisnosti od soja

kvasaca. Potrebe azota su odreivane tokom stacionarne faze fermentacije. Kako bi se

odredila efikasnost usvajanja dodatog azota tokom ove faze, primenjena je fermentacija pri

konstantnoj brzini. Primeene su veoma bitne razlike: neki sojevi su imali dvostruko vee

potrebe za azotom u poreenju sa ostalim sojevima, pri istoj brzini fermentacije. Na osnovu

ovih saznanja sojevi kvasaca su klasifikovani kao nisko, srednje i visoko zahtevni za azotom.

Kiseonik je drugi bitan faktor za metabolizam kvasaca tokom proizvodnje vina jer je

neophodan za sintezu sterola i masnih kiselina.Sablayrolles i sar. (1996) dokazali su prednost

kombinovanog dodavanja kiseonika i azota u cilju spreavanja spore ili nepotpune alkoholne

fermentacije. I u ovom sluaju, razliiti sojevi kvasaca variraju u potrebama za kiseonikom

(Julien et al. 2001).

Tabela 1 | Kriterijumi za selekciju sojeva kvasaca za komercijalnu upotrebu

Poeljni Nepoeljni

Kvalitativne osobine:

Proizvodnja prijatnih vonih aroma i

estara

Proizvodnja -glukozidaze

Proizvodnja glicerolaProizvodnja mano-proteina


Proizvodnja sumpor dioksida

Proizvodnja vodonik sulfida

Proizvodnja komponenti sa S-derivatima

Proizvodnja isparljivih kiselina i etilacetata

Proizvodnja komponenti koje vezuju SO2(acetaldehid, piruvat...)

Formiranje prekursora etil karbamata

Proizvodnja polifenol oksidaze

Proizvodnja biogenih amina

Za specijalne primene:

Razgradnja jabune kiseline

Formiranje mlene kiseline

Formiranje izoamilacetata

Brza autoliza


5/27



Tehnoloke karakteristike:

Potpuna fermentacija eera

Visoka tolerancija na alkohol

Rezistentnost na sumpor dioksid

Minimalna lag-faza tokom rehidratacije

Fermentacija na niskim temperaturama

Tolerancija na visoke temperatureFermentacija pod pritiskom

Aktivnost tokom fermentacije

Fenomen ubice


Stvaranje pene

Stvaranje biofilma

Aktivnost tokom fermentacije

Za specijalne primene:

Svojstva aglomerizacije

Svojstva sedimentacije

Temperaturna i alkoholna tolerancija: Temperatura znaajno utie na rast kvasaca.

Saccharomyces cerevisiae moe da raste u temperaturnom opsegu od 0-45 C, dok je

optimalna temperatura za alkoholnu fermentaciju izmeu 20 i 30 C (Henick-Kling 1988).Vano je obratiti panju na temperaturnu toleranciju odabranih kvasaca, to se obino

odreuje rastom na sintetikoj podlozi na10, 12, 15, 20, i 30 C,kako bi se odabrao najbolji

soj kvasca za specifine uslove proizvodnje vina. Alkoholna tolerancija se testira na istoj

podlozi. Veina odabranih sojeva kvasca tolerie do 14% vol., ali se za fermentaciju sokova

veoma zrelog crnog groa preporuuju kvasci sa viom tolerancijom alkohola od 16% vol.

pa nadalje.

2.3. Odabir aktivne suve starter kulture kvasca

Tokom 70-ih i 80-ih godina, kada su se prve suve starter kulture koristile za proizvodnju

vina, kvasci su birani prvenstveno na osnovu prednosti u tehnolokom simislu; danas je

njihov doprinos senzornim karakteristikama i optem kvalitetu vina podjednako vaan. Tako

da sojevi koji su nedavno odabrani igraju veu ulogu od jednostavnog fermentovanja eera u

etanol. Iako postoji velika verovatnoe da e inokulisani S. cerevisiae da dominira u

fermentaciji (Schtz i Gafner 1993), njegovo zasejavanje nee obavezno garantovati 100%

dominaciju soja ili njegov iskljuiv doprinos fermentaciji. Znaajni faktor koji utie na

rezultat jeste populacija autohtonih kvasaca koji se venalaze u soku, izboru soja kvasca i

njegovoj adaptaciji specifinim uslovima u vinu. Neophodno je izabrati odgovarajui soj

kvasca koji e rasti i biti metaboliki aktivan u datim uslovima, npr. soj kvasca koji dobropodnosi niske temperature za fermentaciju belih vina, ili soj kvasca koji moe da podnese

vie temperature pri niskom pH i visokom % alkohola u fermentaciji crvenog vina. Kako nije

uvek lako odabrati soj kvasca za specifine uslove u vinu i za doprinos senzornim osobinama,

kompanija Lallemand, koja se izmeu ostalog bavi i proizvodnjom komercijalnih sojeva,

sastavila je tabelu kvasaca (Tabela 2)kako bi se olakalo proizvoaima vina da prevaziu

potekoe u odabiru odgovarajueg kvasca za svaku fermentciju.


6/27

BIOLOGIJA PROIZVODNIH MIKROORGANIZAMAStarter kulture kvasaca i bakterija u proizvodnji vina

4

Tabela 2 | Brza ocena kvasaca

Kriterijum za odabir soja kvasca Ocena

Odgovarajue za proizvodnju belog vina 1-4

Odgovarajue za proizvodnju roze vina 1-4Odgovarajue za proizvodnju crvenog vina 1-4Odgovarajue za restartovanje zastalihfermentacija

1-4

Senzorni efekti Neutralno estri EVCaTemperaturni opseg (C) Opseg ne indicira optimalni

temperaturni opsegBrzina fermentacije Spora srednja brzaFaktor kompetencije Senzitivni neutralni aktivniAlkoholna tolerancija Daje se najvii nivo alkohola

koji podnosiRelativni zahtevi za azotom Nisko srednje visokoProizvodnja H2S (60 ppm N) Nisko srednje visoko

Proizvodnja H2S (170 ppm N) Nisko srednje visokoNajvia ocena (kompatibilnost) = 4, Najnia ocena = 1. Sam proizvoa daje ocenu uzavisnosti od toga za koju je vrstu vina namenjen kvasac.aEVC= Enhances Varietal Character (pojaava karakter raznolikosti)b relativni zahtevi za azotom odnosi se na to koliko azota jedan soj zahteva u odnosu nadruge sojeve u tabeli u uslovima limitiranog azota

Mnogobrojnost i varijacije u moguim nainima pripreme odabranog aktivnog suvog kvascaza proizvodnju vina mogu biti jo vie zbunjujui jer razliiti proizvoai obezbeujurazliite informacije za svoje sojeve kvasaca. Kako bi se vinarima olakalo da napravenajbolji izbor, Istraivaki Centar Geisenheim napravio je jedinstveni sistem podataka kakobi se pratile najbitnije osobine odabranih kvasaca koji su dostupni na tritu u Nemakoj. Ovi

podaci su prikupljeni u bazu podataka i moe im se pristupiti u elektronskoj formi na webstranici istraivake stanice ili preko www.hefefinder.de. Sistem je napravljen tako dapredlae najpogodniji soj kvasca za specifine uslove i vrstu vina na osnovu detalja kojemoe bilo ko uneti na sajtu, a takoe vri i rangiranje izmeu sojeva kvasaca.

2.4. Primena aktivne suve starter kulture kvasca

Pored tradicionalne metode inokulisanja svee pripremljenog soka sa odreenom koliinomaktivnog fermentiueg soka, koriste se dva tipa starter kultura kvasaca: tene starter kulture ipripreme suvih starter kultura kvasaca. Veina starter kultura kvasaca su iste i sastoje se

samo od jednog soja Saccharomyces cerevisiae. Pripremljeni te

ni kvasci imaju ograni

enotrite jer imaju kratak rok trajanja. Tene starter kulture pripremaju same vinarije ilikomercijalni dobavljai (npr. lokalne laboratorije za vino ili instituti). Glavna razlika izmeuovih kultura i aktivnih suvih kvasaca jeste u tome to one nisu podvrgavane suenju tako daimaju veliku populaciju vijabilniih elija, ali samo u kratkom vremenskom periodu. Njihovaglavna primena je u fermentaciji specifinih sokova kao to su selekcije suvih bobica ili

Comment [m1]: KAKO SE OVA TABEKORISTIMENI JE JEDINO JASNO DA JE 4 DOBARKAKO STIEM DO BROJA 4

Comment [M2]: UKATALOGU NA SAJTUHTTP://WWW.LALLEMANDWINE.COM/SPIP.PHQUE33&ID_MOT=19&LANG=EN SU OCENE U***,**,*,0


7/27


5

hladna vina, pa ak i za pripremu penuavih vina. Aktivne suve starter kulture kvasaca seuzgajaju u vie koraka sa odgovarajuimizvorima kiseonika i nutrijenata kako bi se proizvelokvasci sa optimalnim sadrajem proteina, ergosterola, nezasienih masnih kiselina i rezervnihmaterijala (Monk 1986). Zatim se kvasac sui kako bi se ouvao tokom transporta iskladitenja. Pored soja, sadraj trehaloze u elijama je jedan od najbitnijih faktora koji utiu

na otpornost kvasca na suenje i naknadnu rehidrataciju. Iz tog razloga postoje dobreinicijativeza proizvoae kvasaca da stimuliu stvaranje trehaloze tokom proizvodnje kakobi se poveala rezistentnost elija kvasaca na stres dehidratacije i rehidratacije(Degre 1993).

2.4.1. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca

Komercijalno pripremljen suvi kvasac obino sadri manje od 8% rezidualne vlage, umnogim sluajevima ak i manje (6%). Zato se aktivni suvi kvasac mora rehidrirati kako bise revitalizirao. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca je veoma bitna, jer ako se ne odradikako treba moe dovesti do oslobaanja velikih koliina elijskog sadraja i gubljenjavijabilnosti i vitalnosti(Henick-Kling 1988). Iako je rehidratacija kvasca direktna operacija, iobjavljena je nekolicina naunih i tehnikih lanaka koji opisuju ispravne tehnike zaodravanje zdrave membrane i optimalnog tehnolokog procesa, uputstva proizvoaavariraju.

Degre (1993) je predloio optu proceduru u proizvodnji vina:

Posuti 500 g suvog kvasca u 5 L tople vode(35-40 C)

Promeati suspenziju nakon 5 min kako bi se resuspendovale sve elije

Ostaviti elije kvasca da stoje u suspenziji ne due od 30 min kako bi se izbeglokorienje rezervnih materija

Dodati kvasac u 20-25 hL mota koji treba da se fermentie, to odgovara dozi od 25-30 g/hL(oko 2-4 106CFU/mL). Neki proizvoai kvasaca precizno preporuuju da se kvasci dreu istoj vodi bez hlora tokom 15-30 min pre meanja. Drugi proizvoai preferirajunatapanje kvasca u meavini soka i vode na temperaturi 35-40 C, jer e pri dodatku sokaelije kvasca, koje bi teoretski poele pupljenje tokom rehidratacije, imati izvor nutrijenata imogu se prilagoditi na uslove soka/mota. Ova procedura moe imati prednosti ukolikorehidratacija traje due od preporuenih 30 min. Radler i sar. (1985) su u svom najdetaljnijemispitivanju rehidratacije kvasca za vino, dobili da maksimalne vrednosti temperature zarehidrataciju, pri kojima su elije kvasca jo uvek vijabilne i vre fermentaciju, iznose od 38

do 45 C. U toku 2 sata za rehidrataciju, nije uoena nikakva promena u ovim aktivnostima,ali je sastav rehidratiue podloge imao bitnog uticaja. Otkriveno je da meavina soka odgroa i vode, rastvori koji sadre eer, vitamine ili soli imaju uticaj na metabolikuaktivnost rehidratisanog kvasca. Najbolja aktivnost je postignuta rehidratacijom u 1%rastvoru KCl. Rehidratacija u vie od 50% soka se ne preporuuje zbog osmotskog pritiska,niskog pH i ponekad visokih koncentracija SO2ili fungicida.


8/27


6

2.4.2. Rehidratacija aktivnog suvog kvasca primenom rehidratiueg nutrijenta

Studije koje su sproveli Fornairon-Bonnefond i sar. (2002) pokazale su pozitivan uticajspecifinih sterola tokom faze rehidratacije na strukturu plazmatske membrane, to rezultuje

boljim kapacitetom fermentacije, pogotovo u tekim uslovima u vinu. Beker i sar. (1984), su

ukazali na to da,poto su membrane pod stresom tokom procesa dehidratacije i rehidratacije,kvasac mora da mobilie lipidne rezerve za obnavljanje. Soubeyrand (2005) je dokazao dakvasac moe takoe i da inkorporira ekstracelularne lipide, ukljuujui i sterole, to jeinteresantno jer ovi molekuli mogu da igraju vanu ulogu u vitalnosti elije kvasca i u

poslednjim fazama alkoholne fermentacije(Luparia i sar. 2004).

U groanom motu steroli su prisutni u obliku fitosterola, ali njihova priroda se razlikuje odsterola koji su sintetisani u kvascima tokom rasta. Zbog razlike u hemijskoj strukturi, ovifitosteroli nisu dovoljni za zagarantovan integritet kvasca tokom cele alkoholne fermentacije(Luparia i sar. 2004). Soubeyrand (2005) je prouavao mogunost inkorporiranja specifinihkvasnih sterola tokom rehidratacije tako to je u medijum za rehidrataciju dodavao specifineinaktivirane kvasce koje su bogati sterolima. Uticaj rehidratacije ADY u prisustvumikronitrijenata i/ili sterola i nezasienih masnih kiselina iz obogaene suspenzijeinaktiviranih kvasaca imalo je neverovatan uticaj na vijabilnost kvasaca (Kontkanen 2004).Korienjem ovog tipa rehidratacije primeena je poveana maksimalna gustina elija kvasca(Slika 1) i krai ukupni period fermentacije (Slika 2), naroito u uslovima visokekoncentracije eera. Uticaj na kasniji uinak kvasaca je odlian. Preporuen postupak zarehidrataciju kvasca korienjem rehidratiueg nutrijenta prikazan je u Tabeli 3.

Slika 1 | Uticaj rehidratacije ADY u suspenziji inaktiviranog kvasca, obogaenojmikronutrijentima i sterolima, na vijabilnost elija na kraju alkoholne fermentacije

(potencijalni sadraj alkohola 14% vol., temperatura fermentacije 28 C). Plava linijapredstavlja kontrolni uzorak (rehidratacija bez dodataka): 28 106 CFU/mL (42%). Crnalinija predstavlja rehidrataciju u prisustvu specifinih rehidratiuih nutrijenata: 42 106CFU/mL (50%)


9/27


7

Slika 2 | Promena koliine osloboenog CO2 od strane Saccharomyces cerevisiae sojaEC1118 u Chansanmotu (240 g/L eera i 266 mg/L slobodnog amino azota)poreenje

rehidriranih ADY u suspenziji inaktiviranih kvasaca obogaenih mikronutrijentima isterolima, i standardne rehidratacije u vodi. Plava linija je kontrola (rehidratacija bezdodataka); Crna linija predstavlja rehidrataciju u prisustvu specifinih rehidratiuihnutrijenata. Fermentacija je voena u fermentorima zapremine 1,1 L u izotermskim uslovima(28 C) uz lagano meanje (Sablyrolles 1993). Stopa proizvodnje CO2je automatski raunatana osnovu masenog bilansa fermentora, izraena je u funkciji vremena.

Tabela 3 | Uputstvo za optimalnu rehidratacaiju kvasca primenom rehidratiueg nutrijentaza inokulaciju 100 hL mota

Korak Radnja

1 Suspendovati 3 kg (30 g/hL) rehidratiueg nutrijenta za kvasac u 20 puta veojmasi iste vode (43 C).2 Kada se temperatura rastvora nutrijenta za rehidrataciju spusti na 40 C, dodati 2,5

kg aktivnog suvog kvasca (25 g/hL). Lagano promeati kako bi se razbileeventualno prisutne grudvice. Ostaviti suspenziju da odstoji 15-30 min i ponovolagano promeati.

3 U toku od 5 min polako sjediniti masu mota za fermentaciju sa suspenzijomkvasca. Ovo e pomoi kvascu da se prilagodi na hladniju temperaturu mota iizbei e se ok na hladnou koji se moe desiti kada temperatura naglo padne zavie od 10 C. Ovaj korak temperiranja trebalo bi ponoviti ukoliko je temperaturamota izuzetno niska. Svaki stepen temperiranja trebalo bi da traje oko 5 min.

4 Kada se pone punjenje sudova motom, dodati suspenziju kvasca na dno

fermentora

2.4.3. Primena vie sojeva Saccharomyces cerevisiae kao starter kulture

Sponatana alkoholna fermentacije obino je voena od strane vie sojeva kvasaca. Novemolekularne bioloke metode omoguavaju odreivanje razliitih populacija kvasaca u

prirodnim divljim fermentacijama u zavisnosti od faze fermentacije. Uinak razliitih


10/27


8

sojeva kvasca moe stvoriti veu kompleksnost arome vina na kraju, kako u pozitivnom takoi u negativnom smislu. Pored preporuka za postizanje kompleksnosti u kontrolisanimuslovima, pripremom odvojenih fermentacija sa odabranim sojevima kvasca i naknadnimspajanjem fermenata razliitih kultura Saccharomyces cerevisiae, razvijene su i tehnikekojima se imitira raznolikost spontane alkoholne fermentacije.

Sojevi kvasca se proizvode kao pojedinane kulture, a konana kombinacija se dobijameanjem suvih istih kultura. Ipak, trite za meane kulture Saccharomyces cerevisiae jemalo zbog razliite uspenosti ovakvih inokulacija. Zbog razliitosti matriksa sok/vino,uslovi u vinu mogu da vie pogoduju jednom od sojeva i da omogue njegovu dominaciju,kao i da negativno utiu na interakcije izmeu sojeva, to na kraju utie na senzornekarakteristike dobijenog vina.

2.4.4. Inokulisanje groanog mota sa Saccharomyces i ne-Saccharomycessojevima

U nekim sluajevima vina koja se proizvode pomou istih mono-kultura nemajukompleksnost ukusa kao to daju dobre prirodne fermentacije. Ali divlje fermentacijezahtevaju veu opreznost i predstavljaju rizik, mogu dovesti do stvaranja neprijatnih ukusa ilinepotpunih fermentacija sa visokim koncentracijama rezidualnog eera, a sve to zbog

prisustva preteno nepoeljnih ne-Saccharomycessojeva. Sojevi koji mogu obilno da rastu uvinu, a koji imaju potpuno aerobni metabolizam ili su slabo fermentujui organizmi (npr.

Pichia membranifaciens, Pichia anomala i Candidaspp.) su poznate po tome to formirajufilm na velikim povrinama vina i u polupopunjenim tankovima u kojima se ne nalazidovoljno sulfita za spreavanje njihovog rasta (Ocn i sar. 2010). Neke studije (Loureiro iMalfeito-Ferreira, 2003) su pokazale da sojevi kvasaca poput Dekkera/Brettanomyces spp.,

Zigosaccharomyces bailii i Saccharomycodes ludwigii, predstavljaju najopasnije sojeve zavino jer uzrokuju njegovo kvarenje. Ipak, ovi sojevi se retko nalaze na grou i u motu vina.

Nedavna istraivanja vina su otkrila egzotine sojeve ne-Saccharomyceskvasaca i pruilavee saznanje o njihovom stvarnom uticaju na senzorni profil vina (Ciani 1997). Neki odovih sojeva, kao to su Pichia fermentans, Candida stellata ili Torulaspora delbrueckii,

prouavani su zbog svojih interesantnih organoleptikih doprinosa (Clemente-Jimenez i sar.2005; Ciani i Ferraro 1996; Moreno i sar. 1991).

Iako neki od ovih sojeva mogu da doprinesu bukeu vina, veina njih nije sposobna da dovri

alkoholnu fermentaciju. Iz tog razloga je prouavano ukljuivanje sojava Saccharomycescerevisiae sa ne-Saccharomyces sojevima kako bi se prevaziao ovaj nedostatak. Prvemeovite komercijalne Saccharomyces cerevisiae/ne-Saccharomyces starter kulture

predstavljene su poetkom XXI veka sa razliitim uspehom usled nepredvidivih interakcijaizmeu populacija kvasca, koje su bile indukovane matriksom vina koji pospeuje dominaciju

jednog soja u odnosu na druge. Nedavna studija koju su sproveli Languet i sar. (2006)pokazala je da se dobar uspeh moe ostvariti reprodukovanjem prirodnog naslea populacijekvasaca sa sekvencijalnom inokulacijom prvo ne-Saccharomyessojeva a zatim dodavanjem


11/27


9

dobro fermentiuih sojeva Saccharomyces cerevisiae u kasnijim fazama alkoholnefermentacije. Ova sekvencijalna inokulacija pokazala je ne samo bolje rezultate u pogleduintenziteta, vei senzorne kompleksnosti.

Primena starter kultura kvasaca u proizvodnji penuavih vina: za proizvodnju penuavih vina

ili vina tipa ampanjca koriste se suve i tene starter kulture kvasaca za sekundarnufermentaciju u boci. Tene kulture moraju se napraviti u sterilnim uslovima ne samo da bi sepoveala zapremina inokuluma, vei da bi se prilagodili tekim uslovima u bazi penuavogvina. Takoe je neophodno i aklimatizovati kulture aktivnog suvog kvasca pre inokulacije zasekundarnu fermentaciju, jer direktno dodavanje suspenzije rehidratisanog kvasca u medijumkoji sadri vee koncentracije alkohola moe da oteti elije kvasca.

I u ovom sluaju postoje varijacije protokola, a jedna iroko primenjena je opisana dole: Rehidratisati ADY prema uputstvu proizvoaa, poeljno uz prisustvo rehidratiueg

nutrijenta

Dodati suspenziju kvasca u deo baze penuavog vina (3-10% ukupne zapremine) uzdodatak soka od groa (do 50 g/L) ili eera (50-100 g/L) i amonijum fostata (0,5-2g/L). Varijacija tradicionalne metode pripreme starter kulture sastoji se u upotrebi smee

jednakih delova baze vina, vode i tiranog likera (Wilkinson 1986). Aklimatizovati tokom 12-20 h (kvasci poinju da proizvode alkohol) na 20-25 C.

Suspenzija se mora povremeno promeati kako bi kiseonik stimulisao rast kvasca. Akosu uslovi veoma oteani ili je temperatura baze vina veoma niska, aklimatizovanje semoe izvesti i na konstantno niskim temperaturama.

Opet, neophodno je izbegavati temperaturne razlike vee od 5 C pri prenoenjususpenzije aklimatizovanog kvasca u konanu zapreminu vina.

2.4.5. Primena starter kultura kvasaca za nedovrene fermentacije

Dr. Paul Monk je govorio: Najbolje reenje za nepotpunu fermentaciju jeste njenaprevencija. Problemi se javljaju zbog izbistravanja mota, niske temperature fermentacije,visokih temperatura pogotovo u prisustvu alkohola, nedostatka azota, mikro-nutrijenata,sterola, visokih koncentracija eera ili alkohola, negativnoh interakcija sa drugim mikrobimau vinu, rezidua prskanja. Razliiti faktori mogu imati negativan uticaj na vitalnost kvasaca(Dittrich 1977), i koliko god okolnosti moe da uzrokuje nedovrene alkoholne fermentacije,toliko je protokola proueno i preporueno za ponovno pokretanje nedovrene fermentacije

(Graf i Bannister 1996; Leske i Henschke 1996; Bisson i Butzke 2000; Fischer 2000). Sviprotokoli preporuuju odbacivanjestarog kvasca i upotrebu alkohol-tolerantnog, energinogfermentiueg soja kvasca, kako bi se ponovo pokrenula nedovrena fermentacija. Veina

protokola takoe preporuuje i dodatak SO2(30 mg/L) i/ili lizozima kako bi se izbegao rastdivljih kvasaca ili bakterija koje izazivaju kvarenje. Ako se u vinu oekuju potencijalnoinhibotrne supstance, preporuuje se i dodatak 25 g/hL inaktiviranog kvasca (Lafon-Lafourcade i sar. 1984). Nakon to se inaktivirani kvasac istaloi (oko 48 h) vino se moraodliti ili filtrirati. Priprema novog kvasca varira meu razliitim proizvoaima kvasaca i


12/27


10

istraivakih grupa. Grossmann je u poglavlju 7.6. knjige o mikrobiologiji vina (2005) dao 4razliite preporuke koje su objavljene u literaturi o vinu.

Lallemand preporuuje:1.

Rehidratacija kvasca za spaavanje (50 g/hL) u rehidratiuem nutrijentu:

odgovarajua koliina rehidratiueg nutrijenta za kvasac iznosi 1,25 puta veu masuod mase kvasca koja e se koristiti. Suspenziju rehidratiueg nutrijenta rastvoriti u 20puta veoj masi iste vode na temperaturi od 45 C, uz lagano meanje,omoguavajui rastvoru da se ohladi do 40 C. Kvasac se zatim pospe po suspenzijiuz lagano meanje kako bi se izbeglo stvaranje grudvica. Ostaviti suspenziju daodstoji 15-30 min.

2.

U meuvremenu, u drugoj posudi pripremiti smeu starter kulture sa 2,5% zapreminevina sa nedovrenom fermentacijom i 2,5% zapremine vode i kompletnog kvasnognutrijenta (meavina 50 g/hL vina i vode). Koncentracije eera podesiti na 5 Brix (50g/L) pomou soka, koncentrata ili eera. Temperaturu smee podesiti na 25-30 C.

3. Suspenzija rehidratisanog kvasca za ponovno pokretanje fermentacije mora se polakododavati u smeu vino/voda/eer. Temperaturu bi trebalo odravati na 15-30 C.

Nivo era se prati i kada opadne za polovinu (oko 2,5 Brix odn. 25 g/L) vino sanedovrenom fermentacijom se dodaje starter kulturi u arama od po 20% od ukupnezapremine vina (ukupno 5 dodavanja starter kulturi). Temperaturu bi tada trebaloodravati izmeu 20 i 25 C. Veoma je bitno da se izbegne potpuna konverzija eera

pre dodatka nove are. Jedino je dozvoljeno da se pre dodatka poslednje are vinasa nepotpunom fermentacijom utroi sav eer.

Pre deset godina Gafnerova grupa (Stterlin et al. 2004) predloila je upotrebuZygosaccharomyces bailii za povratak odnosa glukoza-fruktoza na nivo iznad 0,1 zbog svogfruktofilnog karaktera. Najbolji rezultati su dobijeni kada je soj Zygosaccharomyces bailiiinokulisan zajedno sa sojem Saccharomyces cerevisiaejer jeZygosaccharomyces bailii gubiovijabilnost nakon korekcije glukoza-fruktoza odnosa, i tada soj Saccharomyces preuzimafermentaciju vina do suvoe. Prve starter kulture Zygosaccharomyces bailii za restartovanjenedovrene alkoholne fermentacije predstavljena je na nemakom tritu 2007. godine.

Jo jedan inovativni pristup jeste primena imobilizovanih sojeva kvasca Saccharomycescerevisiaekoji su odabrani na osnovu svojih fermentacionih mogunosti i visoke tolerancije

na alkohol. Jedna od tipinih naina imobilizacije jeste inkapsuliranje koje podrazumevaoblaganje mikroorganizama u alginatni matriks (prirodni polisaharid koji se ekstrahuje izmorskih algi). Inkapsuliranje omoguava supstratu i metabilitima da lako difunduju krozmatriks gela bez otputanja elija kvasca u mot ili vino. Prednost ove tehnike jeste u tometo se kvasac moe lako inokulisati i odstraniti iz vina nakon konvertovanja eera u alkohol.


13/27


11

3.

Primena bakterijskih starter kultura

Dugo vremena je spontano opadanje kiselosti vina bilo povezano samo sa taloenjem tartarnekiseline, iako je jo 1891. Mller-Thurgau pretpostavio da smanjenje kiselosti moe biti usled

bakterijske aktivnosti. Godine 1913. Mller-Thurgau i Osterwalder, su svojim epohalnim

ispitivanjem bakterija mlene kiseline u vinu, objasnili bakterijsku degradaciju jabunekiseline u mlenu i CO2prema formuli:

C4H6O5= C2H6O3+ CO2

Ovaj fenomen su nazvali bioloka deacidifikacija ili malolaktika fermentacija, aBacteriumgracile je opisan kao odgovorni organizam. Od ovih ranih otkria, istraivanje bakterijamlene kiseline (LAB Lactic Acid Bacteria) je napredovalo. ImeBacterium gracile koje jeu prolosti esto korieno za imenovanje organizma koji je zasluan za malolaktikufermentaciju, je revidirano. Radler (1963) je dokazao da bakterije mlene kiseline koje se

nalaze u motu i vinu pripadaju rodovima Lactobacillus,Leuconostoci Pediococcus, a netonovija istraivanja su dokazala i Oenococcus (Dicks i sar. 1995). Razliite LAB dospevaju ugroani sok i vino sa povrine groa, stabljika, lia, zemljita i opreme u vinarijama. Ipak,usled visoko selektivnih uslova u razliitim sokovima i vinima, samo nekoliko tipova LABmoe da raste u vinu (Wibowo i sar. 1985). Prouavanja u nekoliko drava pokazala su da jeOenococcus oeni predominantna vrsta koja vri malolaktiku fermentaciju u vinu, iako ukompoziciji LAB na poetku fermentacije dominiraju sojeviLactobacillus.

Istorijski posmatrano, MLF je opisana kao fenomen koji je nepredvidiv i nedovoljnorazumljiv, ali od velike vanosti za krajnji proizvod. U nedavnoj prolosti vinari su bili

zadovoljni preputanjem prirode da ide svojim tokom i jednostavno su ekali da se MLFodigra spontano (Rich Morenzoni 2005). Ovo strpljenje je bilo kljuno za komentare u vezisa MLF tipa ne odigrava se kad ja to hou i ne svia mi se ta napravi u vinu. Nedavnoistraivanje MLF pomoglo nam je da bolje razumemo ovaj proces bioloke deacidifikacijevina i limitirajue faktore u vinu koji su odgovorni za uinkovitost bakterija mlene kiselinekoje vre ovu biotransformaciju.

Kada se susretnemo sa vinom koje je prolo kroz spontanu malolaktiku fermentaciju, toznai da su bakterije mlene kiseline prevazile sve potekoe koje su se javile tokomnjihovog boravka u vinu. Ipak, to ne znai da e nam ove bakterije dati MLF koju moemoda predvidimo, niti e nam omoguiti ba onu koja pozitivno utie na senzorne iorganoleptike osobine koje mi elimo. To jedino znai da su bakterije mlene kiseline

prisutne u vinu, i da one, a ne vinar, imaju ultimativnu kontrolu na kvalitet gotovogproizvoda(Rich Morenzoni 2005).


14/27


12

3.1. Selekcija i karakterizacija bakterija mleno-kiselog vrenja za

pripremu starter kultura u proizvodnji vina

Oslanjanje na autohtone sojeve bakterija da na vreme dovre poeljnu malolaktikufermentaciju moe biti nepouzdano, ak i pri niskim pH vrednostima u motu i vinu. ak i

kada su poeljne bakterije jabune kiseline nastanjene u vinarijama, za poetak malolaktikefermentacije moe biti potrebno i do nekoliko meseci, i moe se dogoditi da se javi samo unekim buradima i tankovima dok u drugim ne. Iz tog razloga, preferira se opcija pokretanjaMLF primenom odabranih starter kultura bakterija. Oenococcus oenije organizam izbora zaMLF, ali nisu svi sojevi ove bakterije dobri kandidati za primenu kao starteri. Odabir sojaOenococcus oeni, koji je najbolji u pogledu uinka i proizvodnje najinteresantnijeg ukusa, jeviestruk i sloen zadatak (Bou i Powell 2005). Vano je da se izoluju i kultiviu samo

prirodni sojevi malolaktikih bakterija (MLB). Tako su Ruiz i sar. (2010) vrili su selekcijuautohtonih sojeva O. oeni prema njihovim enolokim osobinama i rezultatima vinifikacije.Analiziranli su 84 soja O. oenikoji su bili predstavnici svakog velikog klastera dobijenog u

dendogramu iz prethodne studije biodiverziteta (Izquierdo i sar. 2009). Vina koja imajuprirodno selektivni niski pH, nisku temperaturu u podrumu, visoku koncentraciju alkohola iSO2, koriste se kao izvor izolata malolaktikih bakterija. Fiziologija i genetski profil novihsojeva i sojeva od interesa odreuju se u laboratoriji i pilot vinarijama. Jedan od prvihkriterijuma za izolat odabranih bakterija jeste sposobnost da podnese rigorozni stres kojem seizlae tokom proizvodnje vina (Bou i Powell 2005) kao i korak liofilizacije (freeze-drying).Pored visoke rezistentnosti na limitirajue uslove u vinu kao to su pH, alkohol, SO2 itemperatura, bakterije se biraju i na osnovu eljenih metabolikih aktivnosti i odstustvaneeljenih osobina (Tabela 4).

Tabela 4 | Kriterijumi za selekciju malolaktikih bakterija za proizvodnju vinaPoeljni Nepoeljni


Otpornost na stres tokom proizvodnjeOtpornost na liofilizaciju

Otpornost na niski pHVisoka tolerancija na alkohol

Visoka tolerancija na SO2

Dobar uinak na niskim temperaturamaKratka lag-fazaBrza razgradnja jabune kiseline

Dobra tolerancija na kiseonik

Tolerancija na pesticidePoveana rezistencija na lizozime

Proizvodnja bakteriocina


Formiranje velikih koliinaegzopolisaharida

Domaini pro-fagaPrevisoka tolerancija na SO2

Prebrza degradacija jabune kiseline (imaulogu u crvenom vinu i za stabilizaciju

boje)


Aktivnost -glukozidazeAktivnost esterazeProizvodnja prijatnih vonih aroma

Smanjenje vegetativnih nota


Proizvodnja biogenih aminaProizvodnja etil karbamataProizvodnja komoponenti S-derivata

Proizvodnja isparljivih kiselina


15/27


13

Zaokruivanje oseaja u ustima

Smanjenje adstrigentnosti

Smanjenje gorinePoveanje kompleksnosti

Smanjenje ukupnog SO2(razgradnjaacetaldehida i keto-komponenti)

Proizvodnja acetaldehida (stabilizacijaboje crvenog vina)

Proizvodnja umerenih koliina diacetilaProizvodnja butandiolaNiski afinitet prema glukozi

Proizvodnja etil acetata

Proizvodnja mirisa na mievinu

Proizvodnja nestabilnih fenolaProizvodnja neprijatnih ukusa poreklom od

geranijuma

Proizvodnja (prekomernih koliina)

diacetilaBrza degradacija limunske kiseline

Proizvodnja/degradacija acetaldehidaDegradacija limunske kiseline

3.2. Priprema malolaktike starter kulture

Kontrola malolaktike fermentacije, koja je sastavni deo procesa proizvodnje vina, esto jebila ignorisana, sve dok nisu postale dostupne malolaktike starter kulture. Tene ML kulturebile su dostupne i koristile su se decenijama sve do ranih 1980-ih, kada su razvijeneliofilizirane starter kulture malolaktikih bakterija. 1990-ih razvijena je tehnika direktneinokulacije liofilizovanihML starter kultura i njihova upotreba je doslovno revolucionarnouticala na kontrolu i predvidivost malolaktike fermentacije u vinu (Specht 2005). U Tabeli 5sumirani su parametri koji se odnose na razliite tipove ML startera u proizvodnji vina.

Naveinu starter kultura koje su dostupne za proizvodnju vina povoljno utiu uslovi uvanjau friideru ili zamrzivau, u njihovom originalnom, neotvorenom pakovanju; ambalaa se ne

bi smela otvarati sve do samog momenta upotrebe. Pored toga, bakterije koje su pripremljeneliofilizacijom trebalo bi da se dre van kontakta sa kiseonikom, povienom vlagom i visokim

temperaturama, jer ti uslovi tetno deluju na preivljavanje bakterija. Kako bi se obezbediomaksimalni efekat starter kultura ML bakterija uvek se mora pratiti preporuka proizvoaa onainu uvanja i rukovanja. Dole je predstavljen pregled najee korienih uputstava za

pripremu ML starter kultura:

Zamrznute ML starter kulture

1. Odmrznuti u vodi na sobnoj temperaturi, ne u friideru. Pomeati 3 L vode, 3 L sokaod groa i 30 g ekstrakta kvasca. Podestiti pH na 4,0 pomou kalcijum karbonata ilinekog drugog dozvoljenog pufera i dobro promeati. Dodati 170 g odmrznute kulture,zatvoriti balon i dobro promeati. Drati na 18-24 C tokom 48 h pre inokulacije.

2.

Direktno dodati zamrznute pelete u vino.

Tena suspenzija ML starter kultura

Koristiti bistar istaloen sok bez dodatog SO2. Ako je mogue, zagrejati sok na 60 C.Podesiti nivo eera na 180 g/L dodatkom vode (ako je sok nedostupan, moe se zameniti sa50% gotovog vina (< 10 ppm bez SO2i niski ukupni SO2), 25% vode i 25% soka od jabuke).Podesiti pH na 3,5-3,6 primenom kalcijum karbonata. Ako je u inokulisanom vinu pH < 3,2


16/27


14

podesiti u meukoraku na 3,4. Dodati kulturu i odravati temperaturu na 22-26 C. Pratiti do100% razgradnje jabune kiseline, zatim uveati inokulum za 10% u svakoj narednoj fazi.Ako se koristi gotovo vino za pripremu starter kulture onda se starter uveava tako to sedodaje duplo vea zapremina vina sve dok se ne postigne 5-10% od ukupne zapremine kojase inokulie.

Direktna inokulacija starter kulturama (npr. malolaktike bakterije MBR firmeLallemand)Specijalna priprema NIJE POTREBNA, ali se radi olakanog rukovanja kultura moesuspendovati u istoj vodi bez hlora, na temperaturi od 20 C, najdue tokom 15 min.

Brza build-up starter kultura (1-STEPpribor)Faza rehidratacije: rastvoriti sadraj aktivatora u 100 L vode za pie na temperaturi od 18 i 25C. Dodati sadraj kesice sa bakterijama i paljivo suspendovati uz lagano meanje. Saekati20 min.Faza aklimatizacije: pomeati bakterije i rastvor aktivatora sa 100 L vina, pH > 3,5;temperatura izmeu 20 i 25 C. Saekati 18 do 24 h. Preneti aktivnu kulturu u 1000 hL vina.

Tradicionalna liofilizirana STANDARDNA starter kultura

Rehidratisati u smei 50:50 voda/vino. Vino bi trebalo da ima pH > 3,3 i ukupniSO2< 30mg/L. Pratiti opadanje koncentracije jabune kiseline, kada se ~2/3 konvertuje u mlenukiselinu, proiriti sa dodatkom 5% inokuluma u vino. Pobrinuti se da pH > 3,3 i sadrajalkohola bude < 12,5%. Pratiti opadanje koncentracije jabune kiseline, kada se ~2/3konvertuje u mlenu kiselinu, proiriti sa dodatkom 4% inokuluma u vino.

Tabela 5 |Osobine ML starter kultura (prilagoeno izSpecht 2005)

Osobina

Tip kulture malolaktikih bakterija

Zamrznutakultura

Tenasuspenzija

Direktnainokulacija(MBR)

Brza build-upkultura(umnoavanjeu 1 koraku)

Tradicionalnaliofiliziranakultura(standard)

Temp.skladitenja

Do 120 dana na-26 C ili do 1

Do 2 danana sobnoj

Do 18 mesecina -4 C ili

Do 18 mesecina -4 C ili do

Do 18 mesecina -4 C ili do

i rok trajanja godine na-29 C uzamrzivau bezleda

temp. ili do2 nedelje na-4 C

do 30 mesecina -18 C

30 meseci na-18 C

30 meseci na-18 C

Otvorena

ambalaa

Nakon otvaranja

iskoristitiodmah, nezamrzavati

Iskoristiti

odmah

Iskoristiti

odmah

Iskoristiti

odmah

Iskoristiti

odmah

Vreme zapripremustartera

48 h preinokulacije

desetostrukirast tokom3-7 dana

0-15 min 18-24 h 3-14 dana

Nutritivnisuplementi

30 g ekstraktakvasca na

podlogu za

1 gekstraktakvasca po

OdgovarajuiMLBnutrijenti koji

Odgovarajuiaktivator.MLB

OdgovarajuiMLBnutrijenti koji


17/27


15

aktivaciju litrupodloge zarast

supreporueniza zahtevnijeuslove MLF.

nutrijenti kojisu preporueniza zahtevnijeuslove MLF.

supreporueniza zahtevnijeuslove MLF.

Stepeniskorienosti

Crveno vino 1g/hL; Belo vino3-8,5 g/hL

2-5%zapremine

inokuluma,odn. 5-10%zapremineukoliko sekoristigotovo vinoza pripremustartera.

1 g/hL 0,5 g/hL 1 g/hL

3.3. Odabir odgovarajue malolaktike starter kulture

Postoje dve osnovne stavke koje se razmatraju pri odabiru malolaktike starter kulture:1.

Bezbednost kompatibilnost kulture sa uslovima u vinu2.

Senzorne osobine eljeni doprinos razliitih ML sojevaZa uspeno pokretanje malolaktikih fermentacija, najvanije je da se na to bolji nainmalolaktike bakterije pripreme za uslove sredine koji preovladavaju u vinu (Tabela 6).

Kako 4 limitirajua faktora (alkohol, pH, temperatura i SO2) imaju kumulativni uinak nastres bakterija, Lallemand je razvio tablicu, koja omoguava davanje ocene, kumulativnihbodova, uticaja razliitih parametara u vinu (Tabela 7). Rezultujui TOTAL odgovara

nivou oteanosti za poetak MLF u vinu:< 13 bodova = povoljna13-22 bodova = nepovoljna23-40 bodova = teka> 40 bodova = ekstremno teka

U zavisnosti od sojaOenococcus oeni, u uoptenom sluaju starter kulture prilikom direktneinokulacije imaju sledeu toleranciju:

Alkoholna tolerancija < 15 % vol.

pH tolerancija > 3,1

Tolerancija ukupnog SO2< 60 ppm

Temperaturna tolerancija > 12 C

Pored uslova u vinu koji su opisani u Tabelama 6 i 7, drugi uslovi koji se moraju uzeti u obzirkada se planira selekcija, priprema i inokulacija za MLF podrazumevaju:

Vina koja su imala oteanu alkoholnu fermentaciju imaju veu verovatnou da nesadre dovoljno nutrijenata koji su neophodni za odravanje bakterija tokom MLF.


18/27


16

Limitirani nutrijenti smatraju se jednim od glavnih uzroka nepotpunih malolaktikihfermentacija.

to je nii pH u vinu, ispod 3,5 to su vee nutritivne potrebe bakterija za MLF.

Sposobnost bakterija da rastu i vre MLF drastino opada sa padom temperature vina.U zavisnosti od alkoholnog sadraja vina, poviene temperature vina mogu takoe da

deluju inhibitorno na razvoj i aktivnost ML bakterija.

Tabela 6 |Opta karakterizacija uslova za MLF u vinu

Uslovi u vinu za

MLF Povoljna Teka Gruba

Izuzetno

oteana/nepotpuna

MLF

Alkohol (% v/v) < 13 13-15 15-17 > 17pH > 3,4 3,1-3,4 2,9-3,1 < 2,9Slobodni merljiviSO2(mg/L)

< 8 8-12 12-20 > 20

Ukupni SO2

(mg/L)

< 30 30-40 40-60 > 60-80

Temperatura (C) 18-22 14-18 10-14 < 10Problemi u vezi saalkoholnomfermentacijom

Nema Stres kvasaca Spora/prekinuta

Preporuenametoda zainokulaciju MBR

Direktna(MBR) bezaklimatizacije

Direktna(MBR) ili uzproceduru

aklimatizacije

Direktna(MBR) kulturauz proceduruaklimatizacije

MLF se neodigrava; metod

MBR aklimatizacijeza inokulaciju vinasa prekinutim MLF

Opte uputstvo za izbegavanje inhibitornih efekata glasi:

1.

Sadraj alkohola u vinu (% v/v), temperatura za MLF ne bi trebalo da osciluje:manje od 14,5 % 28 Cvie od 14,5 % 23 C

2. Sadraj isparljivih kiselina u vinu iznad 0,4 g/L (u obliku tartarne kiseline) verovatnoe inhibirati malolaktike bakterije

3.

Vina koja se due od 3 meseca uvaju na inaktiviranim kvascima najbolje je oistitipre pokuaja da se sprovede MLF.

Postoje razne procedure aklimatizovanja kako bi se prevazili limitirajui uslovi u vinu.Protokol koji je opisan dalje u poglavlju 3.4. razvijen je u cilju inokulacije MBR priprema

bakterija u vina, kako bi se pokrenula zastala malolaktika fermentacija.

Tabela 7 |Bodovna tablica za odreivanje lakoe fermentacije jabune kiseline

1 poen 2 poena 8 poena 10 poena Rezultat

Alkohol (% vol) < 13 13-15 15-17 > 17 =pH > 3,4 3,1-3,4 2,9-3,1 < 2,9 =Slobodni SO2(mg/L)

< 8 8-12 12-15 > 15 =

Ukupni SO2 < 30 30-40 40-60 > 60 =


19/27


17

(mg/L)Temperatura(C)

18-22 14-18 ili18-24

10-14 ili24-29

< 10 ili> 29

=

Nutritivnepotrebe kvasca

Niske Srednje Visoke Veomavisoke

=

Lakoa

alkoholnefermentacije

Bez

problema

Prolazni

stres kvasca

Spora/

nepotpunaAF

Produen

kontaktkvasca

=

Poetni nivojabune kiseline(g/L)

2-4 4-5 ili 1-2 5-7 ili 0,5-1 > 7 ili < 0,5 =

Maksimalni AFodnos (max.gubitakBrix/dan)

< 2 2-4 4-6 > 6 =

Napomena: Drugi, trenutno manje poznati faktori, koji nisu razmatrani u ovoj bodovnojtabeli, mogu se odnositi na nivo rastvorenog kiseonika, sadraj polifenola, sleganje taloga,

ostatke pesticida itd.Ukupni rezultat za lakou malolaktike fermentacije dobija se kao suma vrednosti izposlednje kolone.

3.4. Pokretanje zastale malolaktike fermentacije

Vinari su svesni toga da su bakterije Oenococcus oeni, koje su odgovorne za malolaktikufermentaciju, uspene samo ako se prilagode tekim uslovima u fermentujuem motu iligotovom vinu. Direktno dodavanje MLB sojeva od ozbiljnih proizvoaa, koji su odabranikako na osnovu njihovog doprinosa senzornim osobinama, tako i zbog njihove sposobnosti

da se prilagode nepovoljnim uslovima, opisano je ranije. Tokom proizvodnje kultura, elijeMLB prolaze kroz biofoziko stanje koje indukuje proizvodnju zatitnog proteina. U ovomfiziolokom stanju, elije se prikupljaju i zamrzavaju nakon ega se sue u smrznutom stanju.Kao rezultat toga, dobijaju se elije koje su sposobne da razviju prirodnu otpornost na usloveu vinu tako da se direktno mogu dodati u vino bez znaajnog gubitka vijabilnosti. Nekad se

prekinuta MLF moe pokrenuti jednostavnim dodavanjem svee rehidratisanih kultura MLB.U drugim sluajevima je potrebna neto vea adaptacija MLB da bi se postigao isti uinak.Ova adaptacija moe biti od presudnog znaaja za smanjenje uticaja nepovoljne sredine umatriksu vina na bakterije, i pospeiti zavravanje MLF. Lallemand je u saradnji sa MLFR&Dtimom u Australiji radio na razvijanju strategije aklimatizovanja MLB za dovravanjezastalih malolaktikih fermentacija u vinu.

Protokol adaptacije za rukovanje zastalim malolaktikim fermentacijama(Specht 2005)

I Faza

Izvriti predtretman vina i podesiti temperaturu

Pripremiti vino sa zastalom MLF odstranjivanjem taloga, potencijalnih inhibitornihtoksina i inhibitornih organizama kvarenja. Male koliine SO2 i/ili lizozim (ili


20/27


18

filtracija) mogu biti neophodni kako bi se kontrolisale nepoeljne bakterijeLactobacillusiliPediococcus.

Lizozim je veoma efikasan u inhibiranju bakterija mlene kiseline koje uzrokujukvarenje, naroito ako je pH vina > 3,5. Ukoliko se koristi lizozim, mora se voditirauna da ne ostaje nikakva rezidualna aktivnost u tretiranom vinu pre inokulacije

malolaktikih bakterija. U vinu sa zastalom MLF za koje se sumnja da sadrisupstance koje su toksine za MLB, preoruuje se predtretman sa inaktiviranimreziduama kvasca (inaktivirani kvasci) u koncentraciji 6,25-12,5 g/hL. Pripremitisuspenziju inaktiviranih kvasaca u vodi ili vinu, i zatim dodati u vino sa zastalomMLF uz meanje.

Konano, podesiti temperaturu vina sa zastalom MLF na18-22 C (65-72 F)

Lizozim je enzim koji se ekstrahuje iz belanceta jajeta a ima dokazano dejstvo na bakterijemlene kiseline. Postoje primeri koji ukazuju na to da korienje lizozima moe da spreiMLF i kada se koriste manje koliine SO2. Prema Gerbaux i sar. (1998), dodavanje SO2moe biti smanjeno kada je prisutan lizozim u vinu i dovoljna mikrobioloka zatita postiese i sa 30 ppm slobodnog SO2. Korienje lizozima nema nikakvog direktnog uticaja naalkoholnu fermentaciju. Kada se uzima u obzir da li koristiti lizozim u belom vinu, trebalo biuzeti u obzir sledee injenice (Preuzeto sa www.pavin.hr):

Lizozim nema antioksidativno dejstvo. Znai SO2se ne moe kompletno izostaviti.

Poto lizozim ima proteinsku strukturu, tretman bentonitom e ga odmah inaktivirati.

Lizozim je protein, i njegovo delovanje prestaje nakon nekoliko nedelja. Znailizozim moe biti blokiran ili inhibiran za vreme vinifikacije, a vino se mora filtrirati

pre punjenja u flae kako bi se spreila MLF u flai.

Aktivnost lizozima opada sa smanjenjem pH.

Postoji rizik od kontaminacije kada se kupairaju tretirana i netretirana vina.

Inaktivirani lizozim e preostati u vinu. Zbog proteinske strukture lizozima, tretiranavina e pokazati pozitivnu reakciju tokom zagrevanja. Meutim, brojnieksperimentikroz nekoliko godina nisu pokazali proteinsku nestabilnost vina u flai.

Najvea korist upotrebe lizozima uoava se u sanitarnom enolokom pogledu vina.UPOZORENJE: Dodatak metavinske kiseline, u svrhu stabilnosti vina na tartarate, u vinatretirana lizozimom prouzrokovae jae zamuenje vina.

II Faza

Napomena: Dole navedene zapremine odnose se na 10.000 L vina sa zastalom MLF.Aklimatizovati kulturu bakterija u tri koraka:1.

Pripremiti medijum za aklimatizovanje: Pomeati:

- 10 L soka od groa (bez SO2)- 10 L vode (bez hlora)- 20 L vina sa zastalom MLF

Nakon dodatka svih sastojaka podesiti pH izmeu 3,6 i 4,0. Temperaturu podesiti na25-30 C.


21/27


22/27


20

hemijskom analizom, sa senzornim percepcijama, i prua validno sredstvo za uporeivanjearomatskih profila vina (Capone i sar. 2013).

Smanjenje kiselosti vina i modifikacija njegovog ukusa usled sekundarne bakterijskefermentacije, esto se smatraju beneficijom za kvalitet vina. Prednost indukcije malolaktike

fermentacije (MLF) inokulacijom odabranih sojeva bakterija mlene kiseline je dvostruka.Prvo, bolja je kontrola vremena i brzine konverzije jabune kiseine; i drugo, pozitivno utiena ukus i kvalitet vina. Istraivanja tokom poslednjih godina pokazala su pozitivan uinakspecifinih bakterija starter kultura i uslova, ukljuujui brzinu i vreme inokulacije za MLF,na senzorni profil belog, crvenog i roze vina. Metabolika aktivnost malolaktikih bakterija(MLB), kao i kinetika MLF, utiu na profil vina u zavisnosti od razliitih tehnika proizvodnjevina, fizikog i hemijskog sastava vina (pH, alkohol, temperatura, sadraj limunske kiseline,SO2i aeracija) i prisustva taloga(Lallemand Winemaking Update 01/2007). Malo toga se znao uticaju stresa poput pH i etanola na mogunost proizvodnje isparljivih aromatinihkomponenti od strane LAB (Knoll i sar. 2011). Olgun i sar. (2009) su ispitivali uticajsadraja etanola i vrednosti pH na ekspresiju gena za citratni ciklus u O. oenii pokazali su dana ekspresiju ovih gena etanol ima velikog uticaja, dok je efekat pH neto manji.

3.5.1. MLF otkriva arome sorte

Od svih bakterija mlene kiseline koje su aktivne u vinu, Oenococcus oeni je najeeodgovoran za malolaktiku fermentaciju. Njegov sekundarni metabolizam ima veliog uticajana senzorne osobine vina (Bartowsky i Borneman, 2011). Analize strukture populacije O.oeni, putem genetske karaterizacije reprezentativnih vrsta, smatra se neophodnim korakom ucilju ispitivanja mikrobiologije MLF u odreenim podrujima gde se proizvode vina

(Borneman i sar. 2012). Iz tog razloga se poslednjih godina radi se na intenzivnijemispitivanju ovih bakterija. Cappello i sar. (2014) izvrili su bio-molekularnu karakterizacijuautohtonih O. oeni sojeva iz Negroamaro vina. Bakterije O. oeni smanjuju kiselost imodifikuju senzorni profil vina, to povoljno utie na njegov kvalitet. Na primer, intenziteticvetnih, vonih, zainskih i mednih nota arome (Slika 3), povezani su sa poveanjemisparljivih komponenti poreklom od glikozida, koje nastaju tokom MLF. Studija koju susproveli Ugliano i Moio (2006) potvruje ulogu O. oeni u razvoju isparljivih komponentikarakteristinih za sortu. Njihov rad je pokazao da koncentracije ukupnih glikozida drastinoopadaju tokom MLF. Dolazi do hidrolize glikozidnih aromatinih prekursora i kao posledicatoga oslobaaju se sortne arome iz groa. Vanost ovog fenomena zavisi i od bakterija koje

su se koristile za MLF i od sastava vina.

Drugim reima, ekspresija ovih razliitih aroma, koje su znaajne za ukupnu aromu vina,zavisi ne samo od potencijala sorte groa ve i od tipa malolaktike kulture. Ovim se

potvruju ranija posmatranja uticaja aktivnosti glukozidaze iz MLB. Na primer, tokom MLFaktivnost glukozidaze iz O. oeni dovodi do oslobaanja isparljivih komponenti koje su

povezane sa prekursorima arome groa, ukljuujui 3-hidroksidamaskon, -terpineol,vanilin, metil-vanilat, 4-hidroksibenzoat i tirozol iz Chardonnay ekstrakta (Bartowsky i


23/27


21

Henschke 2004), kao i linalool, -terpenol, nerol i geraniol iz Muscat ekstrakta (Ugliano i sar.2003). Ove studije ukazuju na mogunost glikozidne aktivnosti O. oeni, i naknadnogoslobaanja grupa aroma tokom MLF, da utiu na pojaavanje senzornih karakteristika vina.

Slika 3 |Krug aroma za senzornu ocenu vina (Preuzeto sa www.chaikenvineyards.com)

3.5.2. Regulisanje diacetila uticaj brzine inokulacije MLB i vremena dodavanja na

profil arome

Diacetil je jedna od glavnih aromatinih komponenti koje nastaju u toku malolaktikefermentacije, i odgovoran je za note putera i lenika koje su tipine za MLF. Njegov uticaj jeveoma bitan za profil vina, i u zavisnosti od eljene vrste vina, moe biti eljena ili veomanepoeljna komponenta. I zaista, razliite studije koje su sproveli Martineau i Henick-Kling


24/27


22

(1995) i Bartowsky i Henschke (2004) pokazale su da proizvodnja diacetila od stranerazliitih sojeva starter kultura O. oenimoe rezultovati potpuno drugaijim profilom arome.Pri odabiru malolaktike kulture kao kriterijum mora se uzeti u obzir potencijal svakog

bakterijskog startera za proizvodnju diacetila. Pored diacetila, tip startera koji se odaberemoe takoe da modifikuje i druge familije aroma.

Inokulacija visokim nivoom malolaktikih kultura ne samo da ubrzava poetak i tokmalolaktike fermentacije, ve i rezultuje niim nivoom diacetila. Uopteno se preporuujeda se vino inokulie populacijom od 106 CFU/mL kako bi se postigla kritina bakterijska

populacija, osigurala brza inicijacija MLF i pravilna razgradnja jabune kiseline. Krieger(2005 a, b) prouavao je nivo diacetila u Pinot noir vinu gde je MLF inicirana razliitimstopama inokulacije malolaktikih bakterija. Pri niskoj stopi inokulacije od 2 104CFU/mL

produena je lag-faza (14 dana) i proizvedeno je 3,9 mg/L diacetila, dok je inokulacijom 4 106 CFU/mL razgradnja jabune kiseline otpoela momentalno i proizvedeno je 0,8 mg/Ldiacetila. Inokulisanjem vie od 2 106CFU/mL rezultovalo je taloenjem diacetila u vinu sagranicom od skoro 1,5 mg/L za bela i roze vina.

Vreme kada se vri inokulacija moe biti jednako vano za krajnje senzorne osobine vina. Usaradnji sa DLR Neustadt & Trier pravljena su Rizling vina primenom razliitih tajmingainokulacije malolaktikih kultura (Krieger 2006). Ovi eksperimenti pokazali su dakoinokulacija istovremena inokulacija bakterija i kvasaca ne utie na alkoholnufermentaciju niti na poveanje isparljivih kiselina; ali smanjuje ukupno trajanje MLF.Koinokulisana Rizling vina nisu imala mlene ili puteraste arome, koje potiu od MLF, ali suimali jak intenzitet isparljivih vonih aroma. Diacetil koji je proizveden u takvim uslovima,tokom alkoholne fermentacije, momentalno je transformisan u butandiol, koji pri timkoncentracijama nema miris. Ista vina koja su inokulisana kulturama za MLF nakon

alkoholne fermentacije imala su tipiniji senzorni karakter za MLF, sa dominacijom notaputera i lenika dok je vona aroma nestala. Kontrolna vina bez MLF bila su vie kisela,zelena i vegetativna.

Neto novijeg datuma, Caas i sar. (2012) su ispitivali uticaj vremena inokulacije odabranihautohtonih bakterija mlene kiseline na senzorne osobine Tempranillo i Merlot vina upaniji. Vreme koje je bilo potrebno da sadraj eera u svakoj vrsti mota padne ispod 1 g/Li da koncentracija L-jabune kiseline bude < 0,1 g/L, bilo je mnogo krae u odnosu na

primenu koinokulacije. Sama duina trajanja MLF, koja je merena kao vreme od inokulacijeLAB do smanjenja koncentracije jabune kiseline, bilo je due u sluajevima ispitivanja

sekvencijalne inokulacije nego ukupno vreme fermentacije pri tretmanu koinokulacijom(Caas i sar. 2012). Ovi rezultati se podudaraju sa izvetajima drugih autora (Azzolini i sar.2010; Jussier i sar. 2006; Massera i sar. 2009) i znaajni su sa tehnoloke take gledita jer je

potrebno manje vremena za zavravanje procesa proizvodnje vina i potvrena je ranamikrobioloka stabilnost vina.


25/27


23

3.5.3. Uticaj post-MLF tehnika u proizvodnji vina na senzorne osobine

Izbor izmeu sazrevanja na talogu i filtriranja nakon malolaktike fermentacije utie nasenzorni profil vina. Kvasci iz taloga mogu da razgrade diacetil, i batona moe da smanji ili

ak eliminie puterastu aromu. Proizvodnja diacetila se poveava kada je vino u kontaktu sakiseonikom. Kiseonik doprinosi oksidaciji acetolaktata u diacetil. Nielsen and Richelieu(1999) pokazali su da akumulacija diacetila u semi-aerobnim uslovima moe biti i do 6 putavea nego u anaerobnim uslovima. Pored toga, redukcija diacetila u acetoin i butandiol zavisiod redoks potencijala vina. Niski redoks potencijal je u vezi sa niskim nivoom diacetila.

4.Zakljuak

irom sveta dostupno je vie od 200 sojeva aktivnog suvog vinskog kvasca, to vinskoj

industriji omoguuje znaajnu bioloku raznovrsnost. Broj komercijalno dostupnih aktivnihsuvih malolaktikih starter kultura je limitiran, ali se od nedavno poveao. Dok kultureaktivnog suvog kvasca uglavnom pripadaju Saccharomyces cerevisiae, starter kulture za

pokretanje malolaktike fermentacije uglavnom se sastoje od Oenococcus oeni. Sojevikvasaca i bakterija odabrani su na osnovu njihove tolerancije na limitirajue uslove u vinu,njihovih senzornih i enolokih sposobnosti da isprate kreativne i bezbednosne zahteve usavremenoj vinskoj industriji. Od sutinske vanosti je neophodno znati koji su parametrivina i osobine starter kultura kako bi se odabrao odgovarajui soj kvasca, bakterije iodgovarajui nain ishrane u cillju pogaanja groa, fermentacionih uslova i zadatih stilskihciljeva.

Razliiti komercijalni sojevi Saccharomyces cerevisiae su do sada primenjivani u proizvodnjivina, u nastojanju da se postigne dominanta populacija eljenog soja za poetak fermentacijei da se osigura potpuno iskorienje eera (Carrau i sar. 2010). U budunosti moemo sesusresti sa zahtevima za primenu drugih sojeva kvasaca, pored Saccharomyces cerevisiae ilikultura bakterija mlene kiseline koje nisu Oenococcus oeni.


26/27


24

5.

Literatura

Osnovna literatura:

Knig H., Unden G., Frhlich J. (editors), 2008.Biologyo f Microorganisms on Grapes, in

Must and in Wine, Springer, Heidelberg, Germany, pp. 489-510.

Dopunska literatura:

Azzolini M., Tosi E., Vagnoli P., Krieger S., Zapparoli G., 2010. Evaluation of technologicaleffects of yeastbacterial co-inoculation in red table wine production. Italian Journal of

Food Science 3(22), 257-263.Bartowsky E.J., Borneman A.R., 2011. Genomic variations of Oenococcus oeni strains and

the potential to impact on malolactic fermentation and aroma compounds in wine.

Applied Microbiology and Biotechnology, 92, 441-447.Borneman A.R., McCarthy J.M., Chambers P.J., Bartowsky E.J., 2012. Comparative analysis

of the Oenococcus oeni pan genome reveals genetic diversity in industrially relevanpathways.BioMed Central Genomics13: 373.

Caas P. M. I., Prez-Martn F., Romero E. G., Prieto S. S., Herreros M. L. P., 2012.Influence of inoculation time of an autochthonous selected malolactic bacterium onvolatile and sensory profile of Tempranillo and Merlot wines. International Journal of

Food Microbiology, 156, 245-254.Capone S., Tufariello M., Siciliano P., 2013. Analytical characterization of Negroamaro red

wines by Aroma Wheels.Food Chemistry, 141, 2906-2915.

Cappello M. S., De Domenico S., Logrieco A., Zapparoli G., 2014. Bio-molecularcharacterisation of indigenous Oenococcus oeni strains from Negroamaro wine. FoodMicrobiology, 42, 142-148.

Carrascosa A. V., Muoz R., Gonzlez R. G. (editors), 2011. Molecular Wine Microbiology,Acadamic Press, Madrid, Spain, pp. 279-302.

Carrau F., Medina K., Faria L., Boido E., Dellacassa E., 2010. Effect of Saccharomycescerevisiae inoculum size on wine fermentation aroma compounds and its relation withassimilable nitrogen content.International Journal of Food Microbiology,143, 81-85.

Franco M., Peinado R. A., Medina M., Moreno J., 2004. Off-vine grape drying effect onvolatile compounds and aromatic series in must from Pedro Ximnez grape variety.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 3905-3910.Gerbaux, V., Gerland, C., Villa, A., 1998. Le Lysozyme: Nouvel outil biotechnologique pour

matriser les bactries lactiques.Revue des nologues, 93, 44-46.Gomez-Mguez J. M., Cacho J. F., Ferreira V., Vicario I. M., Heredia F. J., 2007. Volatile

components of Zalema white wines.Food Chemistry, 100, 1464-1473.Izquierdo P.M., Ruiz P., Sesea S., Palop M. L., 2009. Ecological study of lactic acid

microbiota isolated from Tempranillo wines of Castilla-La Mancha. Journal ofBioscience and Bioengineering,108, 220-224.


27/27


25

Jussier D., Morneau A.D., Mira de Ordua R., 2006. Effect of simultaneous inoculation withyeast and bacteria on fermentation kinetics and key wine parameters in cool-climateChardonnay.Applied and Environmental Microbiology,72, 221-227.

Knoll C., Fritsch S., Schnell S., Grossmann M., Rauhut D., du Toit M., 2011. Influence of pHand ethanol on malolactic fermentation and volatile aroma compound composition in

white wines.LWT - Food Science and Technology, 44, 2077-2086.Loureiro V., Malfeito-Ferreira M., 2003. Spoilage yeasts in the wine industry. Review ofInternational Journal of Food Microbiology,86, 23-50.

Massera A., Soria A., Catania C., Krieger S., Combina M., 2009. Simultaneous inoculation ofMalbec (Vitis vinifera) musts with yeast and bacteria: effects on fermentation

performance, sensory and sanitary attributes ofwines. Food Technology andBiotechnology,47, 192-201.

Muoz D. M., Penaido R. A., Medina M., Moreno J. 2007. Biological aging of sherry winesunder periodic and controller microaerations with Saccharomyces cerevisiae var.capensis: effect of odorant series.Food Chemistry, 100, 1188-1195.

http://www.chaikenvineyards.com/http:/www.chaikenvineyards.com/archives/category/vinnez-newsletter (pristup 06.09.2014.)

http://www.pavin.hr/clanak/kontrola-malolakti%C4%8Dne-fermentacije-prakti%C4%8Dni-pristup (pristup 05.09.2014.)

Ocn E., Gutirrez A. R., Garijo P., Lpez R., Santamara P. 2010. Presence of non-Saccharomyces yeasts in cellar equipment and grape juice during harvest time. Food

Microbiology, 27, 1023-1027.Olgun N., Bordons A., Reguant C., 2009. Influence of ethanol and pH on the gene

expression of the citrate pathway in Oenococcus oeni.Food Microbiology, 26(2), 197-203.

Peinado R. A., Mauricio J. C., Moreno J. 2006. Aromatic series in sherry wines with gluconic

acid subjected to different biological aging conditions by Saccharomyces cerevisiaevar.Capensis.Food Chemistry, 94 (2), 232-239.

Ruiz P., Izquierdo P. M., Sesea S., Palop M. L., 2010. Selection of autochthonousOenococcus oeni strains according to their oenological properties and vinificationresults. International Journal of Food Microbiology, 137, 230-235.

Documents

Starter kulture bakterija i kvasaca u proizvodnji vina