BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Saat ini informasi yang diperoleh dari bidang mikrobiologi memberikan

sumbangan yang sangat besar, khususnya dalam mengawasi penyakit menular. Selain

itu, mikroorganisme telah digunakan untuk mempelajari berbagai proses biokimia

yang diketahui terjadi pula pada bentuk kehidupan yang lebih tinggi. Banyak fakta

tentang metabolisme manusia yang diketahui sekarang mula-mula diketahui terjadi

pada mikroorganisme. Demikian pula dengan teknologi yang sekarang sedang

popular, misal Rekayasa Genetik, yang tidak lain merupakan perkembangan genetika

molekuler yang menjelaskan bagaimana gen mengatur aktivitas sel. Semua ini berasal

dari studi tentang mikroorganisme. Jadi, bidang mikrobiologi tidak hanya studi

tentang penyebab penyakit tetapi merupakan studi tentang semua aktivitas hayati

mikroorganisme.

Sterilisasi yang baik dapat mencegah tumbuhnya mikroba lain yang tidak

diharapkan dalam bahan yang telah disterilisasi. Teknik sterilisasi yang digunakan

berbeda antara satu dengan lainnya, tergantung dari jenis material yang digunakan.

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi juga harus dalam keadaan

steril atau bebas dari kuman serta bakteri, virus dan jamur. Dan untuk

mensterilkannya diperlukan pula pengetahuan tentang cara-cara dan teknik sterilisasi.

Hal ini dilakukan karena alat- alat yang digunakan pada laboratorium mikrobiologi

memiliki teknik sterilisasi yang berbeda.

Steril merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam laboratorium

mikrobiologi. Dalam melakukan sterilisasi, diperlukan teknik-teknik agar sterilisasi

dapat dilakukan secara sempurna, dalam arti tidak ada mikroorganisme lain yang 

mengkontaminasi media. Oleh karena itu untuk lebih memahami tentang sterilisasi

pada praktikum kali ini akan di pelajari tentang sterilisasi.

DRAFT

Nama : FAISAL RAHMAD H.NPM/Semester : 1231010038/IVRomb./Grup : II/HNPM/Teman Praktek :1231010001/RAHMA Y. M.

LABORATORIUM TEKNIKKIMIAFAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI

UPN “VETERAN” JAWA TIMUR

Praktikum : MIKROBIOLOGIPercobaan : STERILISASI DAN PEMBUATAN

ZATTanggal : 07 APRIL 2014Pembimbing :

I.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dalam praktikum kali ini adalah :

a. Mengetahui tentang apa yang dimaksud dengan sterilisasi.

b. Mengetahui macam-macam sterilisasi.

c. Mengetahui tata cara pembuatan zat.

I.3 Manfaat Praktikum

a. Praktikan dapat mengetahui tentang apa yang dimaksud dengan sterilisasi.

b. Praktikan dapat mengetahui macam-macam sterilisasi.

c. Praktikan dapat mengetahui tata cara pembuatan zat.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Pengertian dan Peranan Sterilisasi Dalam Mikrobiologi

Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang

terdapat pada suatu benda, atau juga dapat membebaskan suatu bahan atau benda

dari semua bentuk kehidupan atau yang biasanya.

Yang dimaksud dengan steril dalam mikrobiologi ialah semua proses untuk

mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda.

Ketika untuk pertama kalinya melakukan pemindahan biakan bakteri secara

aseptik, sesungguhnya telah menggunakan salah satu cara sterilisasi, yaitu

pembakaran. Namun kebanyakan peralatan dan media yang umum dipakai

dalam pekerjaan mikrobiologis akan menjadi rusak bila dibakar untungnya

tersedia berbagai metode lain yang efektif.

Steril yang akan didapatkan melalui sterilisasi, sedangkan cara

sterilisasi yang umum dilakukan adalah sebagai berikut :

1. Sterilisasi secara fisik, misal dengan pemanasan, penggunaan sinar

bergelombang pendek seperti sinar-X, sinar γ, sinar UV, dan sebagainya.

2. Sterilisasi secara kimia, misal dengan penggunaan desinfektan, larutan

alkohol, larutan formalin, larutan AMC (campuran asam klorida dengan

garam Hg) dan sebagainya.

3. Sterilisasi secara mekanik, misalnya dengan penggunaan saringan atau filter.

II.2. MACAM-MACAM STERILISASI

Sterilisasi secara fisik, yaitu selama senyawa kimia yang akan disterilkan

tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur tinggi dan atau tekanan

tinggi, selama itu sterilisasi secara fisik dapat dilakukan. Cara sterilisasi

dengan uap air panas dan tekanan tinggi merupakan yang paling banyak

digunakan, misalnya dengan menggunakan alat yang sudah dikenal, yaitu

otoklaf yang merupakan alat berupa tangki minyak yang dapat diisi dengan

uap. Medium yang akan disterilkan ditempatkan di dalam otoklaf ini selama

15 sampai 20 menit, hal ini tergantung pada banyak sedikitnya barang yang

perlu disterilkan. Perhitungan waktu 15 atau 20 menit itu dimulai semenjak

termometer pada otoklaf menunjukkan 121ºC. Setelah cukup waktu maka

kran uap ditutup, dan dengan demikian suhu mulai turun sedikit demi

sedikit, demikian pula termometer. Jika manometer menunjukkan 0, barulah

otoklaf dibuka.

Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.

Pemanasan

a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara

langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.

b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi

panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya

erlenmeyer, tabung reaksi dll.

c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang

mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak

terjadi dehidrasi.

d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf

Penyinaran dengan UV

Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi,

misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan

interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV.

Sterilisasi secara kimia, yaitu banyak digunakan sebagai desinfektan antara

lain larutan CuSO4, AgNO3, HgCl2, ZnO, dan sebagainya serta larutan

alkohol dan campurannya, juga formalin atau formaldehida yang merupakan

senyawa yang mudah larut di dalam air tetapi sangat efektif sebagai

desinfektan dengan kadar antara 4 sampai 20% .

Biasanya sterilisasi secara kimiawi menggunakan senyawa desinfektan

antara lain alkohol. Antiseptik kimia biasanya dipergunakan dan dibiarkan

menguap seperti halnya alkohol. Umumnya isopropil alkohol 70-90% adalah

yang termurah namun merupakan antiseptik yang sangat efisien dan efektif.

Penambahan yodium pada alkohol akan meningkatkan daya disinfeksinya.

Dengan atau iodium, isopropil tidak efektif terhadap spora. Solusi terbaik

untuk membunuh spora adalah campuran formaldehid dengan alkohol, tetapi

solusi ini terlalu toksik untuk dipakai sebagai antiseptik.

Pemilihan antiseptik terutama tergantung pada kebutuhan daripada

tujuan tertentu serta efek yang dikehendaki. Perlu juga diperhatikan bahwa

beberapa senyawa bersifat iritatif, dan kepekaan kulit sangat bervariasi. Zat-

zat kimia yang dapat dipakai untuk sterilisasi antara lain yaitu halogen

(senyawa klorin, iodium), alkohol,fenol,hidrogen feroksida,zat warna ungu

kristal, derivat akridin, rosanalin, detergen, logam berat (hg,Ag,As,Zn),

aldehida, dll.

Sterilisasi secara mekanik (filtrasi), di dalam sterilisasi secara mekanik

(filtrasi), menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron

atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses

ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim

dan antibiotik.

Jika terdapat beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau

tekanan tinggi akan mengalami perubahan atau penguraian, maka sterlisasi

yang digunakan adalah dengan cara mekanik, misalnya dengan saringan.

Didalam mikrobiologi penyaringan secara fisik paling banyak digunakan

adalah dalam penggunaan filter khusus misalntya filter berkefeld, filter

chamberland, dan filter seitz. Jenis filter yang dipakai tergantung pada tujuan

penyaringan dan benda yang akan disaring.

Penyaringan dapat dilakukan dengan mengalirkan gas atau cairan

melalui suatu bahan penyaring yang memilki pori-pori cukup kecil untuk

menahan mikroorganisme dengan ukuran tertentu. Saringan akan tercemar

sedangkan cairan atau gas yang melaluinya akan steril. Alat saring tertentu

juga mempergunakan bahan yang dapat mengabsorbsi mikroorganisme.

Saringan yang umum dipakai tidak dapat menahan virus. Oleh karena itu,

sehabis penyaringan medium masih harus dipanasi dalam otoklaf. Penyaringan

dilakukan untuk mensterilkan substansi yang peka tehadap panas seperti

serum,enzim,toksin kuman,ekstrak sel,dsb.

Menyaring cairan

Hal dapat dilakukan dengan berbagai filter seperti saringan Seitz, yang

menggunakan saringan asbestos sebagai alat penyaringannya; saringan

berkefeld, yang mempergunakan filter yang terbuat dari tanah diatom;

saringan chamberland, yang mempergunakan filter yang terbuat dari

porselen; dan fritted glass filter, yang mempergunakan filter yang terbuat

dari serbuk gelas. Saringan asbes lebih mudah dan lebih murah daripada

saringan porselen. Saringan asbes dapat dibuang setelah dipakai, sedangkan

saringan porselen terlalu mahal bila dibuang, tetapi terlalu sulit untuk

dibersihkan.

Menyaring udara

Untuk menjaga suatu alat yang sudah steril agar tidak tercemar oleh

mikroba atau untuk menjaga agar suatu biakan kuman tidak tercemar oleh

kuman yang lain, maka alat-alat tersebut harus ditutup denagn kapas, karena

kapas mudah ditembus udara tetapi dapat menahan mikroorganisme. Harus

dijaga agar kapas tidak menjadi basah, oleh karena kapas yang basah

memungkinkan kuman menembus kedalam. Untuk mencegah pencemaran

oleh kuman-kuman udara pada waktu menuang perbenihan, dapat

dipergunakan suatu alat yang disebut laminar flow bench dimana udara yang

masuk kedalamnya disaring terlebih dahulu dengan suatu saringan khusus.

Saringan ini ada batas waktu pemakaiannya dan harus diganti dengan yang

baru apabila sudah tidak berfungsi lagi.

BEBERAPA PRINSIP KERJA DALAM STERILISASI

Prinsip cara kerja autoklaf

Autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam

alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm)

dan suhu 1210C.

Cara Penggunaan :

1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu

banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang

dari batas yang ditentukan, maka dapat

ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air

hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.

2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir,

maka tutup harus dikendorkan.

3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada

uap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan

terlebih dahulu.

4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu

121oC.

5. Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen

autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman

ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15’

dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.

6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam

kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan

(jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep

pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.

Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang

disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel

dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan

suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan

digunakan suhu 1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada suhu

tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di

permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk

autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi

maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini hanya berlaku

untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu, maka

pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada

ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya

tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati

jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit.

Pada saat sumber panas dinyalakan, air

dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih

dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang

mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam

autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara

ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf

naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang

sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer

mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses

sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan

hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai

0 psi.

Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat

digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora

yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara

komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam

autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media.

Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.

Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :

- Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim

- Paelarut organik, seperti fenol

- Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS

Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan

hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sebagai berikut :

- Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa

fosfat

- Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau

senyawa garam mineral lain.

- Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar

- Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf

- Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0

Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya,

sisa ruang dibirkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada

erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit.

Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan

untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika

terkena panas atu mudah menguap (volatile).

Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu

saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau

pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang

cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak

akan tersaring dengan metode ini.

Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara :

Non-disposable filtration apparatus

Disedot dengan pompa vakum

Volume 20-1000 ml

Disposable filter cup unit

Disedot dengan pompa vakum

Volume 15-1000 ml

Disposable filtration unit dengan botol penyimpan

Disedot dengan pompa vakum

Volume 15-1000 ml

Syringe filters

Ditekan seperti jarum suntik

Volume 1-20 ml

Spin filters

Ditekan dengan gaya setrifugasi

Volume kurang dari 1 ml

Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration apparatus

Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan

Bekerfeld, Chamberland Zeitz), membran

penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer

penampung.

Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis

(sesuai gambar), lalu isi corong dengan larutan

yang akan disterilkan.

Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa

vakum kemudian hidupkan pompa.

setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer,

maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah

steril dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.

Tyndalisasi

Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Bahan yang

mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan

dengan metode ini. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan

mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan

pada kondisi pH asam akan terhidrolisis.

Cara kerja :

Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan

sumbat atau aluminium foil.

Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar

menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang).

Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu

1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang

terbentuk akan mematikan mikroba).

Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan.

Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama,

sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel

vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.

Sterilisasi dengan udara panas ( Dry heat sterilization )

Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas

seperti cawan petri, pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi

dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air

(embun) didalam alat gelas.

o Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil

o Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam.

B. Pembuatan Zat

1. Methylene Blue Solution

Bahan yang digunakan adalah 1 gram methylene blue dan 100 cc

aquades.

Cara pembuatannya adalah 1 gram methylene blue dilarutkan dengan

aquades sampai 100 cc.

2. Crystal Violet Solution

Bahan yang digunakan adalah 1 gram crystal violet dan 100 cc

aquades.

Cara pembuatannya adalah 1 gram crystal violet dilarutkan dengan

aquades sampai 100 cc.

3. Hucher’s Crystal Violet Solution

Disini ada dua jenis larutan :

Larutan A : bahannya adalah crystal violet 2 gram dan alcohol 95 % 20

cc

Cara pembuatannya adalah 2 gram crystal violet ditambahkan

dengan alcohol 95 % sampai volumenya 20 cc.

Larutan B : bahannya adalah ammonium oxalate 0,8 gram dan aquades 80

cc.

Cara pembuatannya adalah 0,8 gram ammonium oxalate

ditambahkan aquades sampai volumenya 80 cc.

4. Lugol’s Iodine Solution

Bahan yang digunakan adalah I2 1 gram KI2 gram dan aquades 300 cc.

Cara pembuatannya adalah haluskan kristal I2 dalam KI lalu campur

dengan aquades sampai volumenya 300 cc.

5. Acid alcohol / Alkohol asam

Bahn yang digunakan adalah HCl 3% 30 cc atau HCl 37% 2 cc dan

alcohol 100 cc.

Cara pembuatannya adalah campurkan kedua bahan diatas sampai

larut semua.

6. Carbol Fuchsin Solution

Baha yang digunakan adalah basic fuchsin 0,3 gram, alcohol 95% 10

cc fenol 5 gram dan aquades 100 cc.

Cara pembuatannya adalah mula-mula larutkan basic fuchsin dalam

alcohol, lalu larutkan fenol dalam aquades dan terakhir keduanya

dicampur.

7. Loeffert’s Methylene Blue

Bahan yang digunakan adalah methylene blue 0,3 gram, alcohol 95%

30 cc dan aquades 100 cc.

Cara pembuatannya adalah campur ketiga bahan diatas sampai larut

semua.

8. Negrosin Solution

Bahan yang digunakan adalah negrosin 10 gr, formalin 0,5 c dan

aquades 100 cc.

Cara pembuatannya adalah 10 gram negrosin di tambahkan 100 cc

aquades diatas water bath selama kurang lebih 0,5 jam lalu ditambah

dengan 0,5 cc formalin.

9. Fehling Solution

Terdiri dari 2 macam larutan fehling yaitu :

Fehling A : bahan yang digunakan adalah CuSO4 5 H2O 69,3 gram dan

aquades 1000 cc.

Cara pembuatannya adalah Kristal CuSO4 5 H2O kita

tambahkan dengan aquades sampai 1000 cc campur hingga

homogen.

Fehling B : bahan yang digunakan adalah KNa tartrat 3 gram NaOH 100

gram dan aquades 1000 cc.

Cara pembuatannya adalah KNa tartrat dan NaOH dilarutkan

dalam 1000cc aquades hingga homogen.

( UPN.2014.modul pembuatan zat, Surabaya:UPN”Veteran Jawa

Timur )

DAFTAR PUSTAKA

Academia.2012.Sterilisasi.http://www.academia.edu/4776324/Sterilisasi.

( diakses pada tanggal 30 Maret 2014 pukul 21.10)

Organiksmakma.2013.macammacamsterilisasi.http://

organiksmakma3c08.blogspot.com/2013/04/macam-macam-sterilisasi.html.

( diakses pada tangga 30 Maret 2014 pukul 21.15 )

http://alatalatlaboratorium.com/Blog/sterilisasi-laboratorium-mikrobiologi

( diakses pada tanggal 30 Maret 2014 pukul 21.00)

http://nikku92.wordpress.com/2010/10/21/sterilisasi-alat-dan-bahan-pada-

pengujian-mikrobiologi/

( diakses pada tanggal 30 Maret 2014 pukul 21.05)

UPN.2014.modul pembuatan zat, Surabaya:UPN”Veteran Jawa Timur.