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Aus dem Institut für Physiologische Chemie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Stimulierbarkeit der Hormonsensitiven Lipase
bei Großpferd und Pony
im Hinblick auf das Hyperlipämie-Syndrom
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
NADINE RIEBANDT
aus Rotenburg / Wümme
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Dr. h. c. H.-P. Sallmann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h. c. H.-P. Sallmann
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
Tag der mündlichen Prüfung: 24. 05. 2005
Für meine Eltern
Gisela und Friedemann
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG Seite 1
2. LITERATURÜBERSICHT 2
2.1. Fettstoffwechsel der Equiden 2
2.1.1. Besonderheiten bei Equiden 2
2.1.2. Bedeutung der Lipasen im Fettstoffwechsel des Pferdes 3
2.1.2.1. Die Hormonsensitive Lipase 3
2.1.2.2. Die Hepatische Triglyceridlipase 10
2.1.2.3. Die Lipoprotein Lipase 11
2.1.3. Die Lipoproteine 11
2.1.4. Die Rolle des Insulins 13
2.2. Der Fettstoffwechsel des Pferdes im Hungerzustand 14
2.3. Das equine Hyperlipämie–Syndrom 16
2.3.1. Charakterisierung der Hyperlipämie-Erkrankung 16
2.3.2. Klinische Symptome und veränderte Blutwerte 18
2.3.3. Therapie und Prophylaxe 20
2.3.4. Pathologie und molekulare Pathogenese 21
3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN 23
3.1. Material und Methoden 23
3.1.1. Versuchstiere 23
3.1.2. Haltung und Fütterung 24
3.1.3. Probenentnahme 24
3.1.3.1. Probenentnahme am anästhesierten Pony 24
3.1.3.2. Probengewinnung von Schlachttieren (Großpferd und Pony) 25
3.1.4. Transport der Proben 26
3.1.5. Isolierung der Adipocyten 26
3.1.6. Bestimmung der Zellzahl 27
Inhaltsverzeichnis
3.1.7. Live / dead-Färbung 28
3.1.8. Messung der Lipolyserate 30
3.1.8.1. Vorversuche zur Auswahl des eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffes 30
3.1.8.2. Erstellen einer Eichkurve mittels Palmitinsäure 32
3.1.8.3. Eingesetzter Lipolyseansatz 35
3.1.9. Berechnung der Lipolyserate 37
3.1.10. Verschiedene DBcAMP-Konzentrationen 38
3.2. Statistische Auswertung 38
3.2.1. Deskriptive Statistik 38
3.2.2. Analytische Statistik 39
4. ERGEBNISSE 40
4.1. Vergleich verschiedener DBcAMP-Konzentrationen im Testansatz 41
4.2. Ergebnisse der Messung der Lipolyserate 44
4.3. Einfluss der Spezies auf die Lipolyserate 49
4.4. Vergleich der in vitro Daten (Schlachtponys) mit ex vivo in vitro Daten
(anästhesierte Ponys des Instituts) für das Inguinalfett
52
4.5. Einfluss des Geschlechts auf die Lipolyserate 55
4.6. Lipolyserate in Fettgewebeproben unterschiedlicher Lokalisationen 60
4.7. Vergleich der Lipolyserate in Kontroll-, Noradrenalin- und DBcAMP-
Ansätzen
62
5. DISKUSSION 68
5.1. Versuchsanstellung und Methodik 68
5.1.1. Versuchstiere 68
5.1.2. Schlachtung und Operation 69
5.1.3. Probenmaterial 70
5.1.4. Isolierung der Adipocyten 71
5.1.5. Bestimmung der Lipolyserate 72
5.2. Versuchsergebnisse 73
5.2.1. Die Lipolyserate 73
Inhaltsverzeichnis
5.2.2. DBcAMP als Stimulans der Lipolyse 77
5.2.3. Lipolyseraten bei Schlachtponys und anästhesierten Ponys 78
5.2.4. Der Einfluss des Geschlechts auf die Lipolyserate 80
5.2.5. Der Einfluss der Lokalisation des Fettgewebes auf die Lipolyserate 83
5.2.6. Der Einfluss der Spezies auf die Lipolyserate 85
5.3. Betrachtungen im Zusammenhang mit dem Hyperlipämie-Syndrom 87
6. ZUSAMMENFASSUNG 89
7. SUMMARY 91
8. LITERATURVERZEICHNIS 93
9. ANHANG 115
9.1. Bezugsquellen 115
9.1.1. Verwendete Geräte 115
9.1.2. Medikamente 117
9.1.3. Reagenzien 118
9.2. Stammlösungen 120
9.3. Tabellen 122
Abkürzungsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
In dieser Arbeit wurden die offiziellen Abkürzungen für chemische Elemente, deren
Verbindungen und übliche Einheiten verwendet.
α alpha
Aa. Arteriae
Abb.
AC
Abbildung(en)
Adenylatcyclase
ACTH Adrenocorticotropes Hormon
ADA Adenosindesaminase
ADRP adipose differentiation-related protein
ANOVA Analysis of Variance
AP Alkalische Phosphatase
Apo Apolipoprotein
AR Adrenorezeptor
AS Aminosäure(n)
AST Aspartat-Aminotransferase
ATP Adenosintriphosphat
β beta
BSA Bovines Serumalbumin
bspw. beispielsweise
BUN
bzw.
blood urea nitrogen
beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. circa
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
DBcAMP Dibuturyl-cyclisches Adenosinmonophosphat
dl Deziliter
Abkürzungsverzeichnis
DMF Dimethylformamid
EKG Elektrokardiogramm
et al. und andere (et alii)
FFS Freie Fettsäure(n)
FS
g
Fettsäure(n)
Gramm
GIP
Gi
Gs
Glucose-abhängiges Insulinotropes Polypeptid
inhibierendes G-Protein
stimulierendes G-Protein
γ-GT Gamma-Glutamyltransferase
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid
HDL high density lipoprotein, Lipoprotein hoher Dichte
HSL Hormonsensitive Lipase
HTGL Hepatische Triglyceridlipase
i.m. intramusculär
i.v. intravenös
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
KGW
KR-Lösung
Körpergewicht
Krebs-Ringer-Lösung
l Liter
LDH Lactatdehydrogenase
LDL low density lipoprotein, Lipoprotein geringer Dichte
LPL
M
Lipoprotein Lipase
Mol
mg Milligramm
min Minuten
ml Milliliter
mM, mmol Millimol
MW Mittelwert
n Anzahl
Abkürzungsverzeichnis
NA Noradrenalin
NE
NEFA
Norepinephrin
nonesterified fatty acid, nicht veresterte Fettsäure(n)
nm Nanometer
nmol Nanomol
NSAID nonsteroidal antiinflammatory drugs, Nichtsteroidale
Antiphlogistica
PKA Proteinkinase A
pCO2 CO2-Partialdruck
p
s
S
Irrtumswahrscheinlichkeit
siehe
Seite
SDH
s.o.
Sorbitoldehydrogenase
siehe oben
t Zeit
TGL Triglyceride
U Unit
u.a. unter anderem
v.a. vor allem
VLDL very low density lipoprotein, Lipoproteine sehr niedriger
Dichte
Vv. Venae
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
λ Lambda
µl
µmol
Mikroliter
Mikromol
1. Einleitung
1. EINLEITUNG
In ersten Studien zu den stoffwechselphysiologischen Grundlagen der extrem hohen
Blutlipidspiegel bei dem am Hyperlipämie-Syndrom erkrankten Pony haben
BREIDENBACH et al. (1999) eine 7fach erhöhte Empfindlichkeit der in vitro stimulierten
Lipolyseraten von Ponyadipocyten feststellen können. Zur Klärung der molekularen
Grundlagen der Hyperlipämie beziehen sich die Fragestellungen nun auf Faktoren, die eine
hohe Lipolyse auslösen können. Dabei müssen prä- bzw. rezeptoral eintretende Ereignisse
von post-rezeptoralen differenziert werden. Nachdem WRAGE (2002) eindeutig darlegen
konnte, dass Ponys im Vergleich zu Großpferden nicht über eine größere Zahl an zuständigen
β-Rezeptoren auf der Oberfläche der Adipocyten verfügen, wird nun in parallel laufenden
Studien noch abgeklärt, ob die stimulierenden Hormone des Nebennierenmarks (Adrenalin,
Noradrenalin) bei Pony und Pferd in sehr unterschiedlichem Maße zur Verfügung stehen oder
eine unterschiedliche Ausstattung hinsichtlich der inhibierenden α2-Rezeptoren besteht.
Ziel der vorliegenden Studie war es, post-rezeptoral zu prüfen, ob zwischen Pony und
Großpferd Unterschiede bei der direkten Stimulierbarkeit der Hormonsensitiven Lipase (HSL)
durch cAMP existieren.
Zu diesem Zweck wurde den Zellsuspensionen aus isolierten Adipocyten Dibutyryl–cAMP
hinzugefügt und die ablaufende Lipolyse über zwei Stunden fluorophotometrisch gemessen.
Die Untersuchung erfolgte vergleichend sowohl mit Bauch– als auch mit Inguinalfett.
Für die Probengewinnung standen institutseigene Ponys zur Verfügung, denen unter
Vollnarkose subkutanes Fettgewebe aus dem Inguinalbereich entnommen wurde. Auf die
Entnahme von Bauchhöhlenfett wurde bei diesen Tieren verzichtet.
Des Weiteren wurden zur Schlachtung bestimmte Pferde und Ponys zur Beprobung
herangezogen, wobei Gewebe beider Lokalisationen zur Verfügung standen, da sie direkt im
Anschluss an den Schlachtvorgang entnommen werden konnten.
1
2. Literaturübersicht
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1. Fettstoffwechsel der Equiden
2.1.1. Besonderheiten bei Equiden
Die mit der Nahrung aufgenommene verdauliche Zellulose wird im Dickdarm der Equiden zu
flüchtigen Fettsäuren (FS) abgebaut. Nach ihrer Absorption dienen sie der Energiegewinnung,
der Synthese von langkettigen FS (aus Acetat und Butyrat) und der Gluconeogenese (aus
Propionat). Die Aufnahme von langkettigen FS mit dem Futter ist gering. Diese können
jedoch von Pferden in Leber und Fettgewebe aus Glucose, Acetat und Butyrat gebildet
werden. Bei überenergetischer, insbesondere Kohlenhydrat-reicher Ernährung, werden aus
Glucose gebildete FS in den Depotfettgeweben gespeichert. Ist die Nahrungszufuhr nicht
ausreichend, werden diese langkettigen FS zur Energiegewinnung mobilisiert
(KOLB 1983).
Shetland-Ponys haben im Gegensatz zu Großpferden einen höheren Gehalt an Freien FS
(FFS) im Blut (KOLB 1983). Dieser ist von der Umgebungstemperatur abhängig. Während
der warmen Monate können weniger FS im Blut nachgewiesen werden als in der kalten
Jahreszeit (ROBIE et al. 1975 b). Daraus ist abzulesen, dass Pferde in der Lage sind, bei Kälte
vermehrt FS zu mobilisieren. Es existieren viele Hinweise in der einschlägigen Literatur, dass
insbesondere Ponys in unterschiedlichen Stresssituationen (Trächtigkeit, Infektion,
Wurminvasion, körperliche Aktivität etc.) schnell und effizient Fettsäuren lipolytisch aus den
Fettdepots freisetzen (FÜRLL u. SCHÄFER 1992; WATSON et al. 1992; HALLEBEEK u.
BEYNEN 2001).
2
2. Literaturübersicht
2.1.2. Bedeutung der Lipasen im Fettstoffwechsel des Pferdes
2.1.2.1. Die Hormonsensitive Lipase
Die Hormonsensitive Lipase (HSL) ist eine neutrale Hydrolase (YEAMAN 2004), die die
Hydrolyse der Triglyceride (TGL) (s. Abb. 1) katalysiert und dabei eine besondere Spezifität
zu 1-Ester- bzw. 3-Esterbindungen zeigt (FREDRIKSON u. BELFRAGE 1983; LANGIN et
al. 1996).
O
OO O
OO C (CH2)nCH3
C
CCH3(CH2)n
CH3(CH2)n
H3C
H3C
C OO
CH3(CH2)n
O
OO O
OO C (CH2)nCH3
C
CCH3(CH2)n
CH3(CH2)n
O
OO O
OO C (CH2)nCH3
C
CCH3(CH2)n
CH3(CH2)n
OO O
OO C (CH2)nCH3
C
CCH3(CH2)n
CH3(CH2)n
H3C
H3C
C OO
CH3(CH2)n
H3C
H3C
C OO
CH3(CH2)n
H3C
H3C
C OO
CH3(CH2)n
A:
B:
Abb. 1: Chemische Strukturen der Substrate für die Hormonsensitive Lipase (nach Yeaman
2004). A: Triacylglycerol. B: Cholesterolester.
3
2. Literaturübersicht
Darüber hinaus werden auch Diacylglycerole durch ihre Aktivität zu Monoacylglycerolen
abgebaut (FREDRIKSON et al. 1981; LANGIN et al. 1996). Da die physiologische Rate der
Hydrolyse von Diacylglyceriden wesentlich höher liegt als die der Hydrolyse der TGL, stellt
die Spaltung der Esterbindung am TGL-Molekül durch die HSL den limitierenden Schritt im
Ablauf der Lipolyse dar (FREDRIKSON et al. 1981; LANGIN et al. 1996).
Nach der Struktur stellt dieses Enzym ein Polypeptid dar. Die HSL des Menschen ist zu 82 %
identisch mit der von Ratte und Maus (LANGIN et al. 1996). Sie besteht aus 775
Aminosäuren (AS) mit einer Masse von 88 kDa. Die HSL der Ratte weist 768 AS bei einer
Masse von 84 kDa auf (YEAMAN 1990, 2004).
Die Aktivität des Enzyms wird über seine reversible Phosphorylierung kontrolliert, die an
unterschiedlichen Stellen im Molekül ablaufen kann. Dabei werden drei Bereiche
unterschieden (YEAMAN 2004) (siehe Abb. 2).
4
2. Literaturübersicht
N CSer 423 Ser 563Ser 565
Ser 659Ser 660
Asp 703His 733
Regulatorischeund basale Untereinheit
C-terminaler BereichN-terminaler Bereich
A: Primärstruktur
B: Strukturelle Bereiche
N CSer 423 Ser 563Ser 565
Ser 659Ser 660
Ser 563Ser 565
Ser 659Ser 660
Asp 703His 733
Regulatorischeund basale Untereinheit
C-terminaler BereichN-terminaler Bereich
A: Primärstruktur
B: Strukturelle Bereiche
Abb. 2: Die Struktur der Hormonsensitiven Lipase mit den drei Bereichen (modifiziert nach
Yeaman 2004).
A zeigt die lineare Aminosäurensequenz der HSL aus Adipocyten. Die Zahlen geben die
Abfolge der Aminosäuren im Enzym der Ratte wieder.
B zeigt die strukturellen Untereinheiten des Enzyms. Der C-terminale Bereich beinhaltet die
basale (Serinrest 565) und die regulatorische (Serinrest 563) Seite (siehe Text).
Die regulatorische Stelle im Molekül ist durch den Serinrest 563 charakterisiert und wird
durch die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) phosphoryliert (OLSSON u. BELFRAGE
1987). Dieser Vorgang wird durch Stimulation der Fettzelle mit lipolytisch wirkenden
Hormonen angeregt (STRALFORS u. HONNOR 1989; YEAMAN 1990). Dabei wird jeweils
ein Mol Phosphat pro Mol der regulatorischen Untereinheit der HSL inkorporiert
(STRALFORS u. BELFRAGE 1983). Das zur Phosphorylierung benötigte Phosphat wird
zuvor vom Adenosintriphosphat (ATP) abgespalten (siehe Abb. 3).
5
2. Literaturübersicht
Adenylat-
cyclase
G
ß2-Rezeptor
G
α2-Rezeptor
+ _
cAMP
PKA
ATP ADP
Pi
Triacylglycerinlipaseinaktiv
Triacylglycerinlipaseaktiv
Phosphoproteinphosphatase I
ATP Pi ~ Pi
Adenylat-
cyclase
Adenylat-
cyclase
GGG
ß2-Rezeptor
ß2-Rezeptor
GG
α2-Rezeptor
α2-Rezeptor
++ __
cAMP
PKA
ATP ADPATP ADP
Pi
Triacylglycerinlipaseinaktiv
Triacylglycerinlipaseinaktiv
Triacylglycerinlipaseaktiv
Triacylglycerinlipaseaktiv
Phosphoproteinphosphatase I
ATP Pi ~ Pi
Abb. 3: Hormonelle Regulation der HSL (Triacylglycerinlipase) des Fettgewebes (nach
Löffler 1999).
α- und β-Rezeptoren regulieren die Aktivität der Adenylatcyclase (AC) und erhöhen oder
erniedrigen so den intrazellulären cAMP-Gehalt. cAMP aktiviert die Proteinkinase (PKA), die
die HSL phosporyliert. Durch die Wirkung der Phosphatase wird die HSL inaktiviert.
cAMP = cyclisches Adenosinmonophosphat. G = G-Protein.
Durch die Phosphorylierung wird die HSL in den aktiven Zustand versetzt. Eine Erhöhung
der Aktivität der cAMP-abhängigen PKA durch Stimulation der Fettzelle ist also mit einer
vermehrten Phosphorylierung der HSL und folglich mit einer gesteigerten Lipolyserate
verbunden (STRALFORS u. HONNOR 1989).
6
2. Literaturübersicht
Werden Adipocyten dagegen ohne lipolytische Hormone inkubiert, so dass keine zusätzliche
Aktivierung der PKA stattfindet, kommt es zur Phosphorylierung des Serinrestes 565 der
basalen Untereinheit des Enzyms (OLSSON u. BELFRAGE 1987). Ihr Serinrest ist Teil einer
Dreiergruppe, die außerdem Reste von Aspartat und Histidin enthält (siehe Abb. 2) (LANGIN
et al. 1996; YEAMAN 2004). Die Phosphorylierung der basalen Untereinheit hat zwar keinen
Einfluss auf die Aktivität der HSL (OLSSON u. BELFRAGE 1987; YEAMAN 1990),
dennoch kann dieser Vorgang eine regulierende Funktion auf den Fettabbau ausüben, denn
die Phosphorylierung der einen Seite (regulatorisch oder basal) verhindert vollständig die der
anderen Seite (YEAMAN 1990; LANGIN et al. 1996; YEAMAN 2004). Das heißt
beispielsweise, wenn die basale Seite phosphoryliert ist, dann ist die regulatorische Seite nicht
zugänglich für die cAMP-abhängige PKA, so dass die Lipase nicht aktiviert werden kann. Auf
diese Weise wird ein antilipolytischer Effekt auf die HSL ausgeübt (GARTON et al. 1989).
Der dritte Bereich ist die N-terminale Untereinheit, deren Funktion unklar ist. Vermutet wird
eine Interaktion mit anderen Proteinen und die Vermittlung einer Bindung an Lipide
(YEAMAN 2004).
Nicht nur die Phosphorylierung der Serinreste übt eine Kontrolle über den aktiven Zustand
der HSL aus. Auch die örtliche Verschiebung innerhalb der Fettzelle und die Interaktion mit
anderen Proteinen nimmt Einfluss. So ist das Enzym unter basalen Bedingungen im Cytosol
lokalisiert, wandert jedoch nach lipolytischer Stimulation der Zelle zur Oberfläche des
intrazellulären Fetttröpfchens (YEAMAN 2004). Diese Ortsveränderung ist bspw. bei älteren
Ratten verringert (EGAN et al. 1992; CLIFFORD et al. 2000), woraus eine geringere
Lipolyserate resultiert.
Wie die HSL nach ihrer Aktivierung an Fetttröpfchen bindet, ist noch unklar, da die Struktur
keine hydrophoben Regionen aufweist, die eine Affinität erklären könnten (LANGIN et al.
1996). Es ist jedoch anzunehmen, dass für die Bindung so genannte Perilipine verantwortlich
sind. Dabei handelt es sich um spezifische, Adipocyten-assoziierte Proteine, die
möglicherweise als Andockstellen für die HSL fungieren (GREENBERG et al. 1991). Die
hydrophoben Perilipine werden ebenfalls nach Stimulation der Adipocyten durch lipolytische
Hormone über die cAMP-abhängige PKA phosphoryliert (LANGIN et al. 1996). Durch die
7
2. Literaturübersicht
Phosphorylierung dissoziieren sie vom Lipid, so dass die HSL Zugang zu diesem erhält
(CLIFFORD et al. 2000). Damit üben auch Perilipine unter basalen Bedingungen einen
hemmenden Einfluss auf die Lipolyse aus (BRASAEMLE et al. 2000). Nur die parallele
Phosphorylierung von Perilipinen und der HSL machen die Andockung des Enzyms an die
Fetttröpfchen möglich, da nur die aktive HSL am Lipid binden kann (YEAMAN 2004).
Neben Perilipin existieren weitere Lipid bindende Proteine. Das ADRP (adipose
differentiation-related protein) befindet sich ebenfalls in der Nähe der Lipidtropfen, kommt
jedoch nur in Vorläuferzellen der Adipocyten vor. In reifen Fettzellen wird es durch das
Perilipin ersetzt (BRASAEMLE et al. 1997). Des Weiteren wird das so genannte Lipotransin
(SYU u. SALTIEL 1999) ebenfalls über die PKA phosphoryliert. Lipotransin ist noch nicht
weitergehend erforscht worden, so dass nur wenig über dessen Funktion bekannt ist
(YEAMAN 2004).
Für die Phosphorylierung der HSL sind mehrere Proteinkinasen (PK) verantwortlich
(OLSSON et al. 1986; GARTON et al. 1989) (siehe Abb. 4).
8
2. Literaturübersicht
cAMP-abhängige Proteinkinase
cGMP-abhängige Proteinkinase
AMP-aktivierte Proteinkinase
Ca++/Calmodulin-abhängige Proteinkinase
GSK 4
- Met – Arg – Arg - Ser563 – Val - Ser565 – Glu – Ala -
Seite 1 Seite 2(regulatorisch) (basal)
cAMP-abhängige Proteinkinase
cGMP-abhängige Proteinkinase
AMP-aktivierte Proteinkinase
Ca++/Calmodulin-abhängige Proteinkinase
GSK 4
- Met – Arg – Arg - Ser563 – Val - Ser565 – Glu – Ala -
Seite 1 Seite 2(regulatorisch) (basal)
Abb. 4: Sequenz der HSL der Ratte und Serinreste, an denen die Phosphorylierung stattfindet
(nach Yeaman 1990). cAMP = cyclisches Adenosinmonophosphat. cGMP = cyclisches
Guanosinmonophosphat. AMP = Adenosinmonophosphat. GSK = Glycogen-Synthase-Kinase.
Während auf der regulatorischen Seite die cAMP-abhängige PKA agiert, wirken auf der
basalen Seite die Ca2+ / Calmodulin-abhängige PK II, die Glykogen Synthase-Kinase 4 und
die 5´-AMP-aktivierte PK (YEAMAN 1990; LANGIN et al. 1996), wobei letztere in vivo die
größte Rolle spielt (YEAMAN 2004).
Wie aus Abb. 3 ersichtlich wird, ist die HSL Substrat für Phosphoproteinphosphatasen, durch
deren Wirkung das Enzym inaktiviert wird, indem die Phosphatgruppe abgespalten wird.
Hierfür sind die Phosphatasen 1, 2A und 2C verantwortlich (LANGIN et al. 1996). Sie
dephosphorylieren sowohl den regulatorischen als auch den basalen Bereich im Molekül der
HSL, wobei jede der drei Phosphatasen eine größere Affinität zum basalen Bereich zeigt
(OLSSON u. BELFRAGE 1987; YEAMAN 1990). Gemäß OLSSON u. BELFRAGE (1987)
ist die Aktivität der Phosphatase 1 auf der basalen Seite um 20 % und die der Phosphatasen
2A und C sogar um 80 % höher als im regulatorischen Bereich. Die Phosphatase 2B hat
dagegen keinen Einfluss auf die HSL (STRALFORS u. HONNOR 1989).
9
2. Literaturübersicht
Insulin fördert die Phosphatasen, denn es verursacht eine Dephosphorylierung der HSL im
regulatorischen Epitop, in deren Folge die Aktivität der Lipase abnimmt (OLSSON u.
BELFRAGE 1987; STRALFORS u. HONNOR 1989).
Die HSL ist nicht nur im Fettgewebe nachgewiesen, sondern wurde auch in anderen Geweben
gefunden, wie z.B. Corpus luteum, Hoden, Herz, Nebennieren, Milchdrüse, Skelettmuskel
(COOK et al. 1983; HOLM et al. 1987; SMALL et al. 1991; YEAMAN 2004), sowie in der
Mukosa des Dünndarms (GROBER et al. 2003) und in β-Zellen des endokrinen Pankreas
(MULDER et al. 1999). Dagegen scheint diese Lipase in Leber und Niere nicht vorzukommen
(HOLM et al. 1987).
In diesem Zusammenhang soll noch erwähnt sein, dass die HSL nicht nur gegenüber Lipiden
aktiv ist, sondern ihre Wirksamkeit auch bezüglich Cholesterolestern entfaltet (s. auch Abb. 1
B) (YEAMAN 1990, 2004). Dies ist wichtig in Bezug auf die Bereitstellung von freiem
Cholesterol als Vorstufe für die Synthese von Steroiden in entsprechenden Geweben, wie
z.B. dem Corpus luteum (COOK et al. 1983).
2.1.2.2. Die Hepatische Triglyceridlipase
Die Leber stellt mit der Hepatischen Triglyceridlipase (HTGL) ein eigenes Enzym zur
Hydrolyse von TGL-reichen Lipoproteinen wie Chylomikronen- und VLDL-remnants und
Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) bereit (JACKSON u. McLEAN 1991). Es ist an der
sinusoidalen Oberfläche der Hepatocyten lokalisiert (TARRANT et al. 1998). Auch auf dieses
Enzym nimmt das Insulin in aktivierender Weise Einfluss.
Die Aktivität der HTGL ist im Plasma hyperlipämischer Ponys erhöht (WATSON et al.
1992).
10
2. Literaturübersicht
2.1.2.3. Die Lipoprotein Lipase
Die Lipoprotein Lipase (LPL) ist in vielen Geweben des Körpers präsent, v.a. in Fettgewebe
und Muskulatur, während sie in der Leber nicht nachgewiesen wurde. Das Enzym ist an der
luminalen Seite des Endothels der Gefäße lokalisiert und ist dort über die Bindung an
Heparansulfatproteoglycane in der Gefäßwand verankert (CAMPS et al. 1990; BRAUN u.
SEVERSON 1992).
Als Substrate dienen der LPL Chylomikronen und Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL).
Das Enzym katalysiert die hydrolytische Spaltung der darin enthaltenen TGL. Die
entstehenden Freien Fettsäuren (FFS) können von anderen Geweben aufgenommen und zur
Energiebereitstellung genutzt werden (SCHMIDT et al. 2001). Damit hat die LPL eher die
Aufgabe, Lipidsubstanzen in der Peripherie des höheren Organismus zu verteilen, während
die bislang betrachteten Lipasen direkt den Abbau der TGL bewirken.
Die Aktivität der LPL wird im Fettgewebe hormonell reguliert. Insulin und das Glucose-
abhängige Insulinotrope Polypeptid (GIP) sind in der Lage, das Enzym zu stimulieren
(NAYLOR 1982 a; ROBINSON u. SPEAKE 1989).
Durch die intravenöse Gabe von Heparin ist es möglich, die LPL aus ihrer Verankerung am
Endothel zu lösen (BENSADOUN 1991) und darüber ebenfalls eine Steigerung ihrer
Aktivität im Blut zu erreichen. Diese Wirkung des Heparins macht man sich bei der Therapie
der Hyperlipämie zunutze, obwohl ein derartiges Vorgehen fragwürdig ist, da bei betroffenen
Ponys die Aktivität des Enzyms bereits erhöht ist (WATSON et al. 1992).
2.1.3. Die Lipoproteine
Die Lipoproteine sind in drei Klassen einzuteilen, so dass Lipoproteine hoher Dichte (high
density lipoprotein, HDL), niedriger Dichte (low density lipoprotein, LDL) und sehr niedriger
Dichte (very low density lipoprotein, VLDL) unterschieden werden. Hinzu kommen die
Chylomikronen, die nach der Absorption von Nahrungsbestandteilen von Darmepithelien in
die Galle sezerniert werden und TGL zur Leber transportieren. Bei gefasteten Individuen sind
Chylomikronen in der Regel nicht nachweisbar. Die Lipoproteine werden durch die LPL
gespalten und die entstehenden FFS werden von den Geweben aufgenommen und gespeichert
oder dienen als Energielieferanten (McCULLAGH 1978). Die LDL lassen sich weiter in
11
2. Literaturübersicht
Unterklassen gliedern (LDL1, LDL2, LDL3), die sich in der aufgezählten Reihenfolge durch
eine abnehmende TGL-Masse und einen zunehmenden Gesamtcholesterolgehalt auszeichnen.
Es ist anzunehmen, dass auch bei den HDL Untergruppen bestehen (WATSON et al. 1991).
Da die Lipide nicht wasserlöslich sind, werden sie im Plasma an Apolipoproteine (Apo)
gebunden, wobei das jeweilige Apoprotein für das entsprechende Lipid charakteristisch ist.
Bspw. enthalten VLDL und LDL der Pferde das Apo B, HDL werden an Apo A-I gebunden
(WATSON et al. 1991).
Die dominierende Lipoproteinfraktion bei Tieren sind die HDL, beim Menschen dagegen
herrschen die LDL vor, gefolgt von VLDL und HDL (McCULLAGH 1978). Beim Pferd
nehmen die HDL etwa 61 % an der Gesamtmasse der Lipoproteine ein, die VLDL ca. 24 %.
Die LDL haben mit ungefähr 15 % den geringsten Anteil (WATSON et al. 1991). ROBIE et
al. (1975 a) ermittelten ähnliche Werte.
Bei gesunden Equiden sind im Plasma nur wenige VLDL vorhanden (McCULLAGH 1978;
BAUER 1983). Die Gehalte im Plasma gesunder Ponys liegen jedoch höher als die bei
Großpferden, während die Konzentrationen für LDL und HDL bei beiden Spezies etwa gleich
sind (WATSON et al. 1990, 1991).
Entzieht man Ponys für einige Zeit die Nahrung, ergeben sich keine Unterschiede bezüglich
der Gehalte an LDL und HDL verglichen mit gefütterten Tieren. Die Fraktion der VLDL
steigt jedoch an und es wurde eine veränderte Zusammensetzung nachgewiesen. Die VLDL
gehungerter Tiere sind größer, sie enthalten mehr Cholesterol und weniger Protein (BAUER
1983; FRANK et al. 2002).
Über einen Anstieg von leichten Lipoproteinfraktionen bei Nahrungskarenz wird auch bei
anderen Spezies berichtet. So kommt es bei Ratten nach Hungerphasen ebenfalls zum Anstieg
der VLDL, bei Kaninchen zusätzlich zu einer Erhöhung der LDL (ALADJEM u. RUBIN
1954). Bei Menschen kommt es zu einer signifikanten Zunahme der LDL, wohingegen die
Konzentrationen von HDL kaum verändert sind (RUBIN u. ALADJEM 1954). Bei Hunden
und Katzen bleibt eine derartige Reaktion auf Nahrungskarenz offensichtlich aus
(McCULLAGH 1978).
Für die Konzentrationen der Lipoproteine im Plasma ist auch die Körperkondition des Tieres
ausschlaggebend. WATSON et al. (1990) stellten bei ihren Untersuchungen an Eseln fest,
dass die Gehalte an VLDL positiv mit dem Körpergewicht korreliert sind. Je dicker die Esel
12
2. Literaturübersicht
waren, desto höher waren die VLDL-Werte. Für LDL und HDL gilt dieser Zusammenhang
nicht, die Konzentrationen waren unabhängig vom Körpergewicht der Tiere gleich.
Während der Trächtigkeit steigen die TGL im Plasma bei Ponys in Form von HDL und
VLDL an. Auch hier sind die VLDL TGL-reicher und ärmer an Protein, so dass sie denen
während des Fastens ähneln. Nach dem Abfohlen ist die Aktivität der LPL erhöht und somit
sinkt die VLDL-Konzentration wieder (WATSON et al. 1993).
Erkranken Ponys an Hyperlipämie, kommt es zu einem drastischen Anstieg der VLDL
(WATSON et al. 1990), weil die Leber ihre Synthese aufgrund der massiven Fettmobilisation
verstärkt (McCULLAGH 1978). WATSON et al. (1992) begründen diese Erhöhung mit dem
Auftreten einer weiteren VLDL-Fraktion (VLDL1), die bei gesunden Tieren nicht vorkommt.
Sie weist die oben erwähnten Veränderungen in der Zusammensetzung auf (größerer
Durchmesser, mehr TGL, weniger Protein) und unterscheidet sich auch in Bezug auf ihre
Apolipoproteine von denen gesunder Tiere. Die Gehalte an LDL und HDL sind dagegen bei
hyperlipämischen Tieren unverändert.
2.1.4. Die Rolle des Insulins
Das Peptidhormon Insulin wird bei Nahrungsaufnahme aus den β-Zellen des Pankreas
sezerniert. Hauptreize für seine Freisetzung stellen dabei erhöhte Blutglucose-, Aminosäuren-
(AS) und FFS-Konzentrationen dar.
Der physiologische Effekt des Insulins ist die Hemmung der durch Catecholamine induzierten
Lipolyse (Antilipolyse). Die antilipolytische Wirkung des Hormons erfolgt über die
Reduzierung der Phosphorylierung der HSL (NILSSON et al. 1980). Dabei kommt es nach
Bindung des Peptids an eigene Rezeptoren in der Membran der Fettzellen zur Aktivierung der
Phosphodiesterase (cAMP-cGI-PDE). Diese verursacht die Abnahme des intrazellulären
cAMP-Spiegels und folglich eine Reduzierung der Aktivität der cAMP-abhängigen PKA.
Daraus resultieren eine verminderte Phosphorylierung und gesenkte Aktivität der HSL
(ERIKSSON et al. 1995; BREIDENBACH et al. 1999). Darüber hinaus steigert es die
Funktion der LPL, was zu einer erhöhten Clearance der TGL aus dem Plasma führt
(FREESTONE et al. 1991). Die Wirkung des Insulins wird durch Corticosteroide (permissive
lipolytische Aktivität der Corticoide) antagonisiert (WEINBERG 1987).
13
2. Literaturübersicht
In Studien haben sich Ponys verglichen mit Großpferderassen als insulinresistent erwiesen
(JEFFCOTT et al. 1986), wodurch die Entstehung von Hufrehe und Hyperlipämie begünstigt
wird. Insulinresistenz bezieht sich in diesem Zusammenhang auf die geringere
Empfindlichkeit der Zellen gegenüber diesem Hormon und beschreibt einen Zustand, in dem
für das Auslösen biologischer Reaktionen eine höhere Konzentration notwendig ist als üblich
(FREESTONE et al. 1991). Besonders stark ausgeprägt ist diese Insulinresistenz bei Ponys,
die an Hufrehe erkrankt sind oder sich in einem adipösen Ernährungszustand befinden
(COFFMAN u. COLLES 1983; JEFFCOTT et al. 1986).
Die Insulinresistenz ist laut JEFFCOTT et al. (1986) vermutlich Resultat einer natürlichen
Selektion, in deren Folge sich Ponys in freier Wildbahn an eine ungenügende
Futterversorgung anpassen konnten. Zur Verteilung der Kohlenhydrate in die Muskulatur war
eine reduzierte Insulinaktivität erforderlich. Mit der Domestikation der Ponys ging erhöhte
Kolenhydratfütterung einher, was nunmehr – unter noch bestehender Insulinresistenz - zur
Umleitung großer Kohlenhydratmengen in die Leber und deren Umbau in TGL führte. Nach
Transport der TGL mittels VLDL in das Blut ist die Hyperlipämie eine logische Konsequenz
(JEFFCOTT et al. 1986).
Auch bei Menschen, die eine Hypertriglyceridämie aufweisen, wird über Insulinresistenz
berichtet (STEINER et al. 1984).
2.2. Der Fettstoffwechsel des Pferdes im Hungerzustand
Futterrestriktion, experimentell herbeigeführt, haltungs- oder krankheitsbedingt auftretend,
führt zur Mobilisierung von Depotfett. Dies ist vor allem die Folge der Aktivitätssteigerung
der HSL durch erhöhte Catecholamin- und Glucagonspiegel (WATSON u. LOVE 1994). In
diesem Zusammenhang werden FS und Glycerol an das Blut abgegeben. Beim Pferd sind
dies, wie auch bei anderen Spezies, vorwiegend langkettige FS (KOLB 1983). Die FS werden
an Albumin gebunden zur Leber und anderen Organen transportiert, wo sie entweder als
Energielieferanten dienen oder in unterschiedlichen Anteilen im Lebergewebe zu TGL
verestert werden. Die so entstandenen TGL werden in VLDL verpackt und wieder an das Blut
abgegeben (BAUER 1983; WATSON u. LOVE 1994). Bei Überforderung der VLDL-
14
2. Literaturübersicht
Synthese bleiben TGL-Anteile in der Leber zurück und können zur Entstehung der Fettleber
Anlass geben. Der höchste Anstieg an Serumlipiden in und nach Hungerperioden ist bei den
TGL zu verzeichnen, Cholesterol steigt in einem geringeren Ausmaß (NAYLOR et al. 1980;
BAUER 1983). Dabei ist bemerkenswert, dass die Veränderung der TGL-Gehalte im Serum
bei Pferden geringer ausfällt als bei Ponys (NAYLOR et al. 1980; JEFFCOTT et al. 1986).
Die Zunahme, die sich für die VLDL ergibt, zeigt sich nicht bei den HDL und LDL. Ihre
Konzentrationen bleiben unverändert (BAUER 1983; FREESTONE et al. 1991).
Beim Vergleich mit anderen Tierarten ergab sich, dass Schweine und Ponys ähnliche Werte
für Cholesterol und FFS im Serum aufweisen. Bei Nahrungskarenz steigen die Komponenten
bei beiden Spezies an, bei Ponys jedoch erheblich schneller und zu höheren Maximalwerten.
Sehr ähnlich verhält es sich mit den TGL, mit dem Unterschied, dass sich deren
Konzentration im Blut unter Normalbedingungen auf einem niedrigeren Level einstellt als bei
Schweinen (BAETZ u. PEARSON 1972). Auch bei Ratten und Menschen wird durch
Nahrungsentzug eine Erhöhung der FFS ausgelöst, bei Ratten verdoppelt sich ihre
Konzentration im Serum innerhalb von 24 Stunden (SZTALRYD u. KRAEMER 1994 b).
Die Veränderungen hinsichtlich der Blutparameter bei hungernden Ponys sind zwar
grundsätzlich in der beschriebenen Richtung ausgelenkt, andererseits kann das Ausmaß der
Veränderungen einzelner Komponenten bei den Individuen sehr stark variieren (MORRIS et
al. 1972).
Auffallend am Hungerstoffwechsel der Equiden ist, dass Ketonkörper während
Fastenperioden nicht ansteigen, weder im Blut noch im Harn. Auch bei Tieren, die an
Hyperlipämie erkrankt sind, kommt es nicht zur Ausbildung einer Ketonämie (GAY et al.
1978; NAYLOR et al. 1980; ROSE u. SAMPSON 1982; KOLB 1983). Es ist anzunehmen,
dass Pferde nur über eine geringe Fähigkeit zur Ketonkörpersynthese verfügen. Dies könnte
eventuell eine mögliche Erklärung dafür sein, dass die Mobilisation von FS bei Ponys sehr
leicht zur Ausbildung einer Hyperlipämie führt und nicht zu einer Ketose, wie sie unter den
genannten Bedingungen bei Rindern und Schafen auftritt (WATSON et al. 1992).
15
2. Literaturübersicht
2.3. Das equine Hyperlipämie–Syndrom
2.3.1. Charakterisierung der Hyperlipämie-Erkrankung
Bei der Hyperlipämie handelt es sich um eine Entgleisung des Fettstoffwechsels, über die
erstmals 1969 von SCHOTMAN u. WAGENAAR bzw. SCHOTMAN u. KRONEMAN
berichtet worden ist. Sie ist weltweit verbreitet (ERIKSEN u. SIMESEN 1970; GAY et al.
1978; NAYLOR et al. 1980; BARDIES et al. 1981; GILBERT 1986; FÜRLL u. SCHÄFER
1992; WATSON et al. 1992). Ihre Inzidenz beträgt etwa 5 % (WATSON u. LOVE 1994).
Betroffen sind in besonderem Maße Shetland–Ponys (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a) und Esel
(FORHEAD et al. 1994; WATSON u. LOVE 1994; TARRANT et al. 1998), aber auch andere
Ponyrassen wie z.B. Miniponys (MOORE et al. 1994; MOGG u. PALMER 1995), Welsh–
Mountain–Ponys (WATSON et al. 1992) und Australische Ponys (JEFFCOTT u. FIELD
1985 b). Äußerst selten manifestiert sich die Erscheinung bei Großpferden (NAYLOR et al.
1980; FIELD 1988; DUNKEL u. McKENZIE 2003).
Das Geschlecht nimmt ebenfalls Einfluss auf das Geschehen dieser Stoffwechselstörung. Es
erkranken hauptsächlich Stuten (FÜRLL u. SCHÄFER 1992), selten jedoch Wallache oder
Hengste (WATSON et al. 1992), was auf die hormonelle Beeinflussung des Stoffwechsels bei
Stuten, vor allem durch das Progesteron, zurückgeführt wird (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a).
Betroffene weibliche Tiere befinden sich zudem in der Mehrzahl der Fälle in Laktation oder
im späten Stadium der Trächtigkeit (GAY et al. 1978; BARDIES et al. 1981; JEFFCOTT u.
FIELD 1985 a).
Eine Altersdisposition scheint es nicht zu geben (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a; FÜRLL u.
SCHÄFER 1992), da die Hyperlipämie in allen Altersstufen vorkommt. Bei Jungtieren ist sie
allerdings eher rar (GILBERT 1986; MOORE et al. 1994; HUGHES et al. 2002) und wird
selten bei Tieren unter 18 Monaten beobachtet (WATSON u. LOVE 1994), da hier offenbar
prädisponierende Faktoren wie Krankheit oder erhöhte Anforderungen an den Stoffwechsel
durch Leistung fehlen und Depotfett wenig ausgebildet ist (HUGHES et al. 2002).
Als weiterer begünstigender Faktor gilt der Ernährungszustand. Es sind besonders Tiere
betroffen, die einen guten, zumeist jedoch adipösen Zustand aufweisen (SCHOTMAN u.
KRONEMAN 1969; JEFFCOTT u. FIELD 1985 a).
16
2. Literaturübersicht
ROBIE et al. (1975 b) und WATSON et al. (1992) nennen darüber hinaus eine jahreszeitlich
bedingte Häufung, wonach die Hyperlipämie in kalten Monaten vermehrt beobachtet wird als
in warmen.
Kennzeichnend für die Hyperlipämie ist eine Erhöhung von VLDL, TGL und FFS im Plasma
(WATSON u. LOVE 1994). Normalwerte von TGL im Plasma gesunder Tiere liegen
zwischen 6–78 mg / dl (NAYLOR 1982 b), wobei zwei Ausnahmen zu berücksichtigen sind.
Nach WATSON et al. (1990) kann die Konzentration bei gesunden Eseln bis zu 290 mg / dl
betragen und bei Ponystuten gegen Ende der Trächtigkeit auf Werte um 250 mg / dl ansteigen
(WATSON et al. 1993), ohne dass krankhafte Veränderungen auftreten.
Je nach Ausmaß der TGL–Erhöhung werden in der Literatur die Begriffe Hyperlipidämie und
Hyperlipämie unterschieden, wobei NAYLOR (1982 b) ersteres als milde Lipämie
bezeichnet, der sowohl die Opaleszenz des Plasmas als auch eine Dysfunktion der Leber
fehlen. TGL sind zwar erhöht, jedoch bleiben die Werte unter 500 mg / dl. Im Gegensatz dazu
definiert er die Hyperlipämie als einen Zustand, bei dem die Plasma–TGL–Werte auf weit
über 500 mg / dl ansteigen, eine Leberschädigung in Form der Fettinfiltration vorliegt und das
Plasma eine milchig–trübe, opake Erscheinung aufweist.
Die Hyperlipämie tritt selten als eigenständige Primärerkrankung in Erscheinung (FÜRLL u.
SCHÄFER 1992), sondern ist vielmehr als sekundäre Komplikation einer zugrunde liegenden
Erkrankung zu sehen, wobei hier v.a. Beeinträchtigungen des Magen–Darm–Traktes eine
Rolle spielen (SCHOTMAN u. WAGENAAR 1969; WATSON u. LOVE 1994), gefolgt von
Hufrehe. Eine seltene Ursache entdeckte NAYLOR (1982 b), der über eine durch einen
Tumor der Hirnanhangsdrüse ausgelöste Hyperlipämie eines Ponys berichtet. Ein Rückgang
der Futteraufnahme bis hin zum Sistieren, wie es bei der Entstehung der Hyperlipämie üblich
ist, fehlt bei dieser Primärerkrankung. Betroffene Tiere haben einen normalen oder sogar
gesteigerten Appetit. Der Grund für die Mobilisierung des Depotfettes liegt also nicht in einer
Anorexie, sondern vielmehr in hormonellen Imbalancen bedingt durch die tumoröse
Entartung der Hypophyse.
Die Prognose dieser Erkrankung hängt nicht nur von der Schwere der Hyperlipämie ab,
sondern auch von der auslösenden Primärkrankheit (SCHOTMAN u. WAGENAAR 1969).
Im Allgemeinen ist sie jedoch als schlecht zu bewerten. Die Mortalität liegt bei 60–80 %
17
2. Literaturübersicht
(JEFFCOT u. FIELD 1985 a), bei Eseln mit bis zu 95 % sogar noch höher (TARRANT et al.
1998).
Die Diagnose sollte über eine Blutuntersuchung gesichert werden, wobei sowohl der
Plasmagehalt von Gesamtlipiden, TGL, FFS und Glycerol bestimmt als auch Nieren– und
Leberwerte (Kreatinin, Alkalische Phosphatase, AST, SDH, LDH) untersucht werden sollten.
Denn klinische Störungen treten ab einer Gesamtlipidkonzentration von 5 g / l auf, diese
Grenze wird jedoch makroskopisch noch nicht durch die typischen Plasmaveränderungen
sichtbar (FÜRLL u. SCHÄFER 1992).
2.3.2. Klinische Symptome und veränderte Blutwerte
Die klinischen Symptome der Hyperlipämie sind unspezifisch (NAYLOR 1982 a; FÜRLL u.
SCHÄFER 1992), nicht pathognomonisch (SCHOTMAN u. KRONEMAN 1969) und
resultieren aus dem durch Fettinfiltration bedingten Leber– und Nierenversagen (siehe
Pathologie) (WATSON u. LOVE 1994). Nach JEFFCOTT u. FIELD (1985 a) werden sie in
schwerer Ausprägung ab einer Serum–TGL–Konzentration von > 500 mg / dl deutlich.
Die anfängliche Inappetenz kann sich zu völliger Anorexie steigern (GAY et al. 1978), die
Tiere erscheinen unfähig zu schlucken (ERIKSEN u. SIMESEN 1970) und verweigern z.T.
die Tränkeaufnahme, es kommt zum Verfall der körperlichen Kondition (JEFFCOTT u.
FIELD 1985 a). Sie sind schläfrig bis stuporös, zeigen Inkoordination der Bewegung (Ataxie)
und Muskelzittern, die Körpertemperatur ist z.T. erhöht (38,5–41°C), Tachykardie und
Tachypnoe sind zu beobachten, in einigen Fällen kommt es zum Festliegen (GAY et al.
1978).
Darmgeräusche sind ebenso verringert (GAY et al. 1978) wie die Kotmenge oder es stellt sich
eine schwere Diarrhoe ein (SCHOTMAN u. WAGENAAR 1969). Koliksymptome treten auf,
die bei Abwesenheit einer Magen–Darm-Erkrankung aus der Schwellung der Leber und der
damit verbundenen Dehnung ihrer Kapsel resultieren. Im Bauchbereich entstehen Ödeme
(WATSON u. LOVE 1994).
Des Weiteren berichten SCHOTMAN u. KRONEMAN (1969) von EKG–Veränderungen,
deren klinische Manifestationen als „Hegglin–Syndrom“ bezeichnet werden und von
DEEGEN (1972) mit der Hyperlipämie in Verbindung gebracht wurden.
18
2. Literaturübersicht
Betroffene Tiere weisen ikterische oder zyanotische Schleimhäute sowie Foetor ex ore auf
(SCHOTMAN u. KRONEMAN 1969).
Bei tragenden Tieren kann es, meist im Endstadium der Erkrankung, zum Abort kommen
(WATSON u. LOVE 1994).
Insgesamt zeigt die Hyperlipämie einen schnellen Verlauf und führt innerhalb von sechs bis
zehn Tagen zum Tod (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a).
Plasma hyperlipämischer Tiere zeigt sich milchig–trüb und opak, zuweilen ist ein
Blauschimmer erkennbar, der durch die Lichtstreuung der VLDL verursacht wird, deren
Gehalt, ebenso wie der von TGL, FFS und Cholesterol, erhöht ist (SCHOTMAN u.
WAGENAAR 1969; NAYLOR 1982 a). Da diese Veränderungen in leichteren Fällen mit
bloßem Auge noch nicht erkennbar sind, sollte eine Blutuntersuchung durchgeführt werden
(FÜRLL u. SCHÄFER 1992). Von besonderem Interesse sind dabei Leber– und Nierenwerte.
So sind aufgrund der Organschädigung die Plasmaaktivitäten von γ-GT, AP, LDH und SDH
erhöht (WATSON u. LOVE 1994), die Synthese von Gerinnungsfaktoren dagegen erniedrigt,
was sich in einer verlängerten Koagulationszeit (ERIKSEN u. SIMESEN 1970) und einer
gesteigerten Blutungsneigung (FÜRLL u. SCHÄFER 1992) widerspiegelt.
Harnstoff und Kreatinin steigen wegen gestörter Nierenfunktion an (NAYLOR et al. 1980).
BUN ist jedoch in der Anfangsphase der Erkrankung kein verlässlicher Parameter zur
Bestimmung einer Nierenfunktionsstörung, da auch die Leberbeeinträchtigungen zu
veränderten Werten führen können (WATSON u. LOVE 1994). In einigen Fällen kann eine
Azotämie auftreten, die eine TGL–Aufnahme in periphere Gewebe verringert, da sie einen
hemmenden Einfluss auf die LPL ausübt (NAYLOR 1982 b).
Blutglucosekonzentrationen können zu Beginn erniedrigt sein (GAY et al. 1978), sind aber
erhöht bei Tieren, deren Hyperlipämie sekundär zu einem Adenom der Hypophyse entstanden
ist (NAYLOR 1982 b).
Im Verlauf der Hyperlipämie entwickelt sich eine metabolische Azidose, der pH-Wert des
Blutes fällt ab (SCHOTMAN u. KRONEMAN 1969), Bikarbonat ist verringert, und der pCO2
sinkt ebenfalls (WENSING et al. 1973 b).
Trotz des Energiemangelzustandes, in dem sich hyperlipämische Tiere befinden, entwickelt
sich bei Pferden weder eine Ketonurie noch eine Ketonämie (GAY et al. 1978; NAYLOR et
al. 1980), wie es bei Rindern und Schafen der Fall ist (s.o.).
19
2. Literaturübersicht
2.3.3. Therapie und Prophylaxe
Die Therapie der Hyperlipämie sollte frühzeitig eingeleitet werden und eine Behandlung der
Primärerkrankung einschließen (NAYLOR 1982 a). Eine negative Energiebilanz muss
ausgeglichen werden (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a). Um den Stoffwechsel tragender Stuten
zu entlasten, sollte der Abort eingeleitet werden (SCHOTMAN u. WAGENAAR 1969),
Fohlen sind abzusetzen (WATSON u. LOVE 1994).
Ein weiterer, wichtiger Punkt der Therapie ist die Reduktion der Lipidkonzentration im
Plasma und das Verringern der Mobilisation FFS aus Depotfett. Zu diesem Zweck wird
hyperlipämischen Ponys exogenes Insulin verabreicht (BARDIES et al. 1981), um seinen
antilipolytischen Effekt (SALEH et al. 1999) auszunutzen. Die Wirksamkeit ist jedoch
umstritten, da sich Ponys in anderen Studien als insulinresistent (COFFMAN u. COLLES
1983; JEFFCOTT et al. 1986; FREESTONE et al. 1991) erwiesen haben.
Außerdem wird Heparin verabreicht, wodurch die Aktivität der LPL gesteigert und damit die
Spaltung von TGL verbessert wird. Jedoch ist auch diese Anwendung kritisch zu betrachten,
da die Aktivität der LPL bei hyperlipämischen Ponys normal, bisweilen sogar erhöht ist
(WATSON et al. 1992). Im Übrigen ist die Blutgerinnung bei diesen Tieren aufgrund der
Unfähigkeit der geschädigten Leber, Gerinnungsfaktoren zu produzieren, gestört. Heparin als
Antikoagulanz verschlechtert die Situation zusätzlich, was als Ursache für die in der Sektion
zu findenden Hämorrhagien angesehen werden kann (WATSON u. LOVE 1994; NAYLOR
1982 a). Folglich ist bei der Anwendung von Heparin Vorsicht geboten.
Glucocorticoide und NSAID (wie z.B. Metamizol) sind bei der Therapie der Hyperlipämie
ebenfalls kontraindiziert, da sie die Erkrankung verschlimmern können (FÜRLL u.
SCHÄFER 1992).
Zur Prophylaxe werden eine adäquate, leistungsgerechte Fütterung bei Vermeidung von
Adipositas und Energiemangelzuständen empfohlen. Außerdem sollten Stresszustände
weitgehend reduziert oder vermieden werden und drastische Maßnahmen zur schnellen
Gewichtsreduktion unterbleiben sowie eine regelmäßige Wurmprophylaxe erfolgen
(SCHOTMAN u. KRONEMAN 1969; FÜRLL u. SCHÄFER 1992; WATSON u. LOVE
20
2. Literaturübersicht
1994). FREESTONE et al. (1992) empfehlen darüber hinaus ein Bewegungsprogramm in
Kombination mit kontrollierter Futteraufnahme zur Verbesserung der Insulinsensitivität.
Da tragende Stuten besonders gefährdet sind, sollte eine regelmäßige Bestimmung der
Plasma–TGL–Werte Teil einer monatlichen Gesundheitsüberprüfung sein (WATSON u.
LOVE 1994).
2.3.4. Pathologie und molekulare Pathogenese
Die klinischen und biochemischen Veränderungen resultieren vor allem aus dem Versagen
von Leber und Niere, welche am stärksten betroffen sind. Ihre Gewebe sind blass,
geschwollen und von fettiger Struktur. Die fettige Degeneration der inneren Organe ergibt den
häufigsten Sektionsbefund bei hyperlipämischen Tieren und resultiert aus der direkten
Aufnahme der Fettsubstanzen aus den VLDL in die Zellen. An der Leber kann es zu Fissuren
kommen, bis hin zu Rupturen des Organs, die zu intraabdominalen Blutungen führen. Diese
stellen häufig die Todesursache dar.
Fettinfiltrationen zeigen sich aber auch im Skelettmuskel. Hier kommt es in der Folge zu
hyaliner Degeneration. In der Nierenrinde entstehen Nephrosen, Glomerulonephritis und
Niereninfarkt, im Myokard kann es zum Infarkt kommen. Lymphatische Gewebe wie Milz
und Lymphknoten degenerieren, was unter anderem Ursache für eine erhöhte
Infektanfälligkeit betroffener Tiere ist. In einigen Fällen sind des Weiteren Pankreatitis und
eine Atrophie des exokrinen Teils der Drüse zu finden, wodurch die Insulinsekretion
vermindert wird.
Häufige Befunde sind ebenfalls Schleimhautulzerationen in Speiseröhre, Magen und Darm,
Lungenödem, Gefäßläsionen und fokale Hämorrhagien (ERIKSEN u. SIMESEN 1970; GAY
et al. 1978; JEFFCOTT u. FIELD 1985 a; MURRAY 1985; FÜRLL u. SCHÄFER 1992;
WATSON u. LOVE 1994).
Die Pathogenese auf molekularer Basis kann gegenwärtig nur ungenügend beschrieben
werden.
Die Hyperlipämie entsteht, wenn durch Stressfaktoren wie z.B. Krankheit, Trächtigkeit,
Laktation, aber auch allein durch Transport (FORHEAD et al. 1995) die Futteraufnahme über
21
2. Literaturübersicht
mehrere Tage verringert ist oder gänzlich verweigert wird, und die Tiere so in eine negative
Energiebilanz geraten (SCHOTMAN u. KRONEMAN 1969; NAYLOR 1982 a). Um den
Energiebedarf decken zu können, kommt es zur Mobilisierung von Depotfett (JEFFCOTT u.
FIELD 1985 a), in deren Folge FFS in einem Umfang in das Plasma abgegeben werden, der
die Kapazität der Leber zu oxidativem und ketogenem Stoffwechsel übersteigt, so dass die
FFS zu TGL verestert und diese in Form von VLDL in das Blut sezerniert werden (WATSON
u. LOVE 1994). Im Plasma ergeben sich also erhöhte Werte von FFS, TGL und VLDL
(BAUER 1983; FREESTONE et al. 1991).
Als Grundlage für die massiv gesteigerte Lipolyse wird eine Aktivitätserhöhung der HSL
diskutiert, die durch stressbedingte Ausschüttung von ACTH, Glucocorticoiden und
Catecholaminen bedingt sein könnte (WATSON u. LOVE 1994). Es bleibt unklar, warum
dieses molekulare, für viele Spezies geltende Pathogeneseprinzip lediglich beim Pony zur
Hyperlipämieerkrankung führt. In diesem Zusammenhang sind die Wirkmechanismen der
lipolytischen Hormone beim Pony im Detail darzustellen. Diese Arbeit soll einen Beitrag
dazu leisten und insbesondere eine eventuelle postrezeptorale Empfindlichkeit im Bereich der
cAMP-Kaskade bei Ponyadipocyten beschreiben.
22
3. Eigene Untersuchungen
3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1. Material und Methoden
In dieser Studie sollte die Stimulierbarkeit der Hormonsensitiven Lipase durch von außen
zugeführtes Dibutyryl-cAMP bei Ponys und Großpferden verglichen werden. Die Messungen
erfolgten sowohl an Bauch– als auch an Inguinalfett, um eventuell vorhandene Unterschiede
zwischen Geweben dieser beiden Lokalisationen aufzudecken.
Um die Messung der Lipolyserate durchführen zu können, mussten die Adipocyten isoliert
werden. Hierfür kam die Methode nach RODBELL (1964) zum Einsatz, welche von
BREIDENBACH (1996) an die Verhältnisse beim Pferd adaptiert wurde.
3.1.1. Versuchstiere
Zur Verfügung standen sechs Shetlandpony-Wallache des Instituts für Physiologische Chemie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover im Alter zwischen fünf und zwölf Jahren. Die Tiere
waren klinisch gesund und befanden sich in einem guten Ernährungszustand bei einem
mittleren Körpergewicht von 155,8 ± 39,0 kg.
Die Tierversuche zur Entnahme von Adipocyten wurden unter dem Aktenzeichen
509c-42502-01/489 von der Bezirksregierung Hannover genehmigt.
Des Weiteren wurden 28 ebenfalls klinisch gesunde und zur Schlachtung bestimmte
männliche und weibliche Tiere, darunter 18 Pferde im Alter zwischen drei und 23 Jahren und
zehn Ponys im Alter zwischen neun und 26 Jahren, zur Probengewinnung herangezogen. Ihr
Ernährungszustand variierte von mäßig bis sehr gut, wobei das mittlere Körpergewicht der
Pferde 587,2 ± 78,9 kg betrug und das der Ponys bei 344,6 ± 97,7 kg lag.
Genaue Angaben über Größe, Gewicht und Alter der Tiere sind in den Tabellen 1, 2 und 3 im
Anhang (Seite 122, 123, 124) aufgeführt.
23
3. Eigene Untersuchungen
3.1.2. Haltung und Fütterung
Die Ponys des Instituts wurden in Einzelboxen auf Stroh gehalten und erhielten Auslauf
sowohl auf einem gepflasterten Paddock als auch auf einem Sandplatz. Die Futterrationen
setzten sich, dem Erhaltungsbedarf der Tiere entsprechend, aus Melasseschnitzeln,
Mineralfutter, Vollkornpellets und Heu zusammen. Die Wasserversorgung erfolgte ad
libitum.
Viele der Schlachttiere waren bereits einige Zeit vor dem eigentlichen Schlachttermin auf
dem Betriebsgelände eingestallt. Sie wurden in Boxen auf Stroh gehalten und mit
Melasseschnitzeln, gequetschtem Hafer und Heu gefüttert. Hinsichtlich der unmittelbar vor
ihrer Tötung angelieferten Tiere sind weder über Haltung noch Fütterung weitergehende
Details bekannt.
3.1.3. Probenentnahme
3.1.3.1. Probenentnahme am anästhesierten Pony
Die im Institut gehaltenen Tiere wurden zur Entnahme von Inguinalfett in Vollnarkose
versetzt. Die Gewinnung von Bauchhöhlenfett hätte einen Eingriff von erheblichem Umfang
bedeutet und wäre mit dem Risiko der gesundheitlichen Beeinträchtigung behaftet gewesen,
so dass zum Wohle der Ponys auf diese Maßnahme verzichtet wurde.
Vor dem Eingriff wurde den Ponys über Nacht das Futter entzogen und die Einstreu aus der
Box entfernt. Die Wasserversorgung erfolgte ad libitum. Außerdem wurden die Tiere einer
Allgemeinuntersuchung unterzogen.
Beginn der Operationsvorbereitungen war jeweils um zehn Uhr morgens.
Zunächst wurde den Ponys nach Rasur und Desinfektion der Punktionsstelle eine
Verweilkanüle in die Vena jugularis gelegt. Die Sedation erfolgte mit Sedivet ®
(Romifidin, 0,08 mg / kg KGW i.v.) mit anschließender Narkoseeinleitung durch Diazepam
(Diazepam - ratiopharm® 0,5 %; 0,04 mg / kg KGW i.v.) und Ketamin (10 % ; 2,2 mg / kg
24
3. Eigene Untersuchungen
KGW i.v.). Die eigentliche Narkose wurde mittels Triple Drip, bestehend aus 500 ml
Myolaxin ® (Guaifenesin 15 %), 30 ml Ketamin 10 % und 3 ml Sedivet ®, aufrechterhalten.
Nach Rasur und Desinfektion des OP-Feldes wurden im Inguinalbereich seitlich des Penis ein
etwa fünf Zentimeter langer Hautschnitt angelegt und ca. vier Gramm Fettgewebe
entnommen. Nach Instillation von Benzylpenicillin in die Wundhöhle zur
Infektionsprophylaxe erfolgte der Wundverschluss durch eine Hautnaht mittels U–Heften
unter Verwendung von Vicryl®. Die Naht wurde mit Wundspray abgedeckt und die Tiere
erhielten zur Schmerzlinderung und Entzündungshemmung Metacam®
(Meloxicam, 0,6 mg / kg KGW, i.m.). Des Weiteren wurden die Ponys antibiotisch mit
Tardomyocel® (Benzylpenicilin–Benzathin, 4 ml / 100 kg KGW, i.m.) versorgt. Zur
Tetanusprophylaxe wurden jeweils 5 ml Tetanus–Serum i.m. injiziert.
Nach Beendigung der Operation fand eine Überwachung der Tiere während der
Aufwachphase bis zur vollständigen Erholung statt.
Bei einem Pony kam es zu Schwellungen des Wundfeldes mit Ödembildung im Inguinal–
sowie Bauchbereich ohne Störung des Allgemeinbefindens. Es wurde daraufhin über einige
Tage lokal mit einer Heparin enthaltenden Salbe behandelt und der ödematisierte Bereich
wurde mehrmals täglich bis zur vollständigen Abschwellung gekühlt.
3.1.3.2. Probengewinnung von Schlachttieren (Großpferd und Pony)
Die Probenentnahme fand in einem auf Pferdeschlachtung spezialisierten Betrieb statt. Die
zur Schlachtung bestimmten Tiere wurden mittels Bolzenschuss betäubt, die Tötung erfolgte
durch Blutentzug nach Eröffnen der Vv. jugulares und Aa. carotides mittels
Entblutungsschnitt am kaudalen Rand der Drosselrinne.
Die Gewebeproben von jeweils etwa fünf Gramm wurden direkt im Anschluss an die
Ausweidung und Teilung der Tierkörper subkutan aus dem Inguinalbereich, Nähe Penis bzw.
Euter, sowie aus der Bauchhöhle, etwa im Bereich zwischen Nabel und Sternum, beidseits der
Linea alba, entnommen.
25
3. Eigene Untersuchungen
3.1.4. Transport der Proben
Sowohl bei den institutseigenen Ponys wie bei den Schlachttieren wurden die Gewebeproben
in 37°C warme physiologische Kochsalzlösung (0,9 %) gelegt, die Probengefäße in einem mit
ebenfalls körperwarmem Wasser gefüllten Isolierbehältnis zum Labor transportiert und bis
zur alsbaldigen Bearbeitung bei dieser Temperatur gehalten.
3.1.5. Isolierung der Adipocyten
Die Zusammensetzungen der im Folgenden genannten Puffer sind im Anhang (Seite 120)
aufgeführt.
Die Isolierung der Fettzellen geht auf die Methode von RODBELL (1964) zurück, die von
BREIDENBACH (1996) modifiziert wurde, um sie auch beim Pferd anwenden zu können.
Um eine Auskühlung des Probenmaterials zu verhindern und physiologische Bedingungen zu
gewährleisten, erfolgte die Präparation der Adipocyten in einem Brutraum bei 37°C.
Inguinal– und Bauchfett wurden in gleicher Weise bearbeitet.
Zunächst wurden die Gewebeproben von eventuell noch vorhandenen Faszien und
Blutgefäßen befreit. Jeweils 2 g Fett wurden anschließend mit einem Skalpell fein geschnitten
und in 10 ml Krebs-Ringer-HEPES-Puffer mit 3,5% Bovinem Serum–Albumin
(KR–Lösung I) unter Zugabe von 250 µl Collagenase–Stammlösung in 50 ml Falcon–
Röhrchen unter Carbogenbegasung (95 % O2, 5 % CO2) 60 Minuten bei 37°C im Wasserbad
inkubiert. Danach erfolgte das Filtrieren durch Nylon–Gaze, um die vereinzelten Fettzellen
von verbliebenen Gewebeverbänden zu trennen.
Damit die Zellausbeute erhöht werden konnte, erfolgte dieser Teil der Adipocytenpräparation
im Doppelansatz, zum anschließenden Waschen wurden beide Ansätze zu einer Probe in
10 ml–Falcon–Röhrchen vereinigt.
Die Waschung diente der Entfernung der Collagenase aus der Zellsuspension und erfolgte
durch Absaugen des Unterstandes nach Flotation der Fettzellen mittels Spritze und
26
3. Eigene Untersuchungen
aufgesetzter Kanüle und anschließender Zugabe von 10 ml Krebs–Ringer–HEPES–Puffer mit
1 % Bovinem Serum-Albumin (KR-Lösung II). Nach erneuter Flotation wurde dieser
Vorgang dreimal wiederholt. Im Anschluss an das letzte Waschen wurde der Unterstand so
weit wie möglich abgesogen.
3.1.6. Bestimmung der Zellzahl
Zur Bestimmung der Zellzahl und damit der Zellausbeute wurden 100 µl Zellsuspension in
einen Eppendorf–Cup pipettiert und 100 µl KR–Lösung II sowie 10 µl
Methylenblaumischung (bestehend aus 25 µl Methylenblau 2 % + 475 µl Krebs–Ringer–
HEPES–Puffer) hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von fünf Minuten wurden 10 µl
der Färbelösung in eine Thoma–Zählkammer überführt und jeder Ansatz unter dem
Mikroskop (Leica DM IRB) dreimal gezählt, wobei ausschließlich Adipocyten mit Zellkern
berücksichtigt wurden. Aus den Ergebnissen der drei Zählungen wurde der Mittelwert
gebildet und die Gesamtzellzahl der Präparation nach folgender Formel ermittelt:
Gesamtzellzahl = gezählte Zellzahl x Kammerfaktor x Volumen
Für die gezählte Zellzahl wurde oben genannter Mittelwert in die Formel eingefügt, das
Volumen ergab sich aus der Menge der verbleibenden Zellsuspension in den 10 ml–Falcon–
Röhrchen nach Absaugen des Unterstandes im Anschluss an den letzten Waschvorgang. Da
hier zur Zellzählung die Kammer nach Thoma verwendet wurde, betrug der Kammerfaktor
20.000. Aus der Berechnung ergab sich die Zellzahl im Ausgangsvolumen. Die Abb. 5 zeigt
eine typische Zellpopulation nach Färbung mit Methylenblau in 400facher Vergrößerung.
27
3. Eigene Untersuchungen
Abb. 5: Adipocyten nach der Färbung mit Methylenblau. 400fache Vergrößerung.
3.1.7. Live / dead–Färbung
Um die Lebensfähigkeit der Adipocyten nach den einzelnen Präparationsschritten
nachzuweisen, wurde eine live / dead–Färbung durchgeführt.
Hierbei handelt es sich um eine Simultanfärbung mit den beiden Reagenzien Ethidiumiodid
und Calcein–Acetoxymethyl. Jeweils 1 µl der Reagenzien werden zu 1 ml Fettzellsuspension
hinzugegeben und 30 bis 45 Minuten inkubiert.
Ethidiumiodid stellt einen Nukleinsäurefarbstoff dar, der nur durch geschädigte Membranen
toter Zellen zu penetrieren vermag. Entsprechende Zellen erscheinen rot. Calcein–
Acetoxymethyl ist ein Substrat für Esterasen, durch die es zu einem grün fluoreszierenden
Produkt, dem Calcein, hydrolysiert wird. Diese Grünfluoreszenz ist damit Indikator für
28
3. Eigene Untersuchungen
Zellen, die sowohl Esterase–Aktivität besitzen als auch eine intakte Zellmembran, um die
Produkte dieser Enzyme in der Zelle zurückzubehalten. Sie sind folglich lebensfähig (siehe
Abb. 6).
In den im Rahmen dieser Untersuchungen in geschilderter Weise gefärbten Präparaten lag die
Lebensfähigkeit der Adipocyten bei über 90 %.
Abb. 6: Adipocyten nach Simultanfärbung. 400fache Vergrößerung. Lebende Zellen grün,
tote Zellen und vereinzelte Zellkerne rot.
29
3. Eigene Untersuchungen
3.1.8. Messung der Lipolyserate
Wie bereits 1998 von BREIDENBACH et al. beschrieben, wurde zur Messung der
Lipolyserate ein fluorophotometrisches Verfahren angewendet, bei dem SNAFL-1 als
pH–sensitiver Farbstoff (Fluorochrom) eingesetzt wurde, der in Abhängigkeit zur Menge der
im Verlauf der Lipolyse freigesetzten Fettsäuren und der daraus resultierenden pH–
Wertsenkung im Inkubationsmedium seine relative Fluoreszenz ändert, was im
Spektrofluorophotometer gemessen werden kann.
Die Bezugsquellen aller verwendeten Reagenzien und Arbeitsmaterialien sind dem Anhang
zu entnehmen.
3.1.8.1. Vorversuche zur Auswahl des eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffes
In den vorliegenden Versuchen sollte die Lipolyserate an Fettgewebe von Großpferd und
Pony anhand der Fettsäurefreisetzung gemessen werden. Aus der Freisetzung von Fettsäuren
resultiert ein Ansäuern des Inkubationsmediums und damit verbunden eine pH-Wertsenkung.
Das geplante Vorgehen machte einen Farbstoff notwendig, der die pH-Verschiebung durch
Akkumulation von FS im Testansatz zu detektieren in der Lage war, so dass diese im
Spektrofluorophotometer gemessen und als Änderung der relativen Fluoreszenzeinheiten
notiert werden konnte. Der Farbstoff musste also ein pH-sensitives Fluorochrom mit einem
ausreichend großen Spektrum im benötigten pH-Bereich darstellen.
BREIDENBACH (1996) entschied sich in seinen Untersuchungen für
Seminaphthofluorescein-1 (SNAFL-1). Die von ihm verwendete Charge war jedoch nicht
mehr erhältlich. Um eventuell vorhandene Unterschiede zwischen verschiedenen Chargen
ausschließen zu können, wurden die nunmehr angebotene Charge von SNAFL-1 und andere
Farbstoffe in den Vorversuchen ausgetestet.
Zur Auswahl standen neben Seminaphthofluorescein-1 die Fluorochrome 5,6–
Carboxyfluorescein und Seminaphthorhodafluor (SNARF).
Um den geeigneten Farbstoff auszuwählen, wurden deren Spektren aufgezeichnet.
30
3. Eigene Untersuchungen
Zu diesem Zweck wurden von jedem Fluorochrom Stammlösungen mit Dimethylformamid
(DMF) in einer Konzentration von 20 mM hergestellt. Für diesen Teil der Arbeit wurden
Präzisionsküvetten aus Quarzglas eingesetzt, die mit 2,5 ml Krebs-Ringer-Lösung mit 0,5 %
Bovinem Serum-Albumin (KR-Lösung III) befüllt wurden. Die Konzentration an Farbstoff
betrug 3 µmol / l, wie diese auch in den Testansätzen zur Messung der Lipolyserate eingesetzt
werden sollte. Jeder Farbstoff wurde im dreifachen Ansatz ausgehend von drei
unterschiedlichen pH–Werten des Puffers, nämlich 6,5, 7,0 und 7,4, getestet. Die pH–Werte
wurden bei einer Temperatur von 37°C mit 0,1 M NaOH eingestellt. Die Messungen erfolgten
ebenfalls bei 37°C im beheizten Spektrofluorophotometer, um identische Bedingungen wie in
den Messungen der Lipolyserate in den Geweben zu gewährleisten. Die Zusammensetzung
der KR–Lösung III ist im Anhang (Seite 120, 121) aufgeführt.
Die jeweilige Küvette wurde in den Strahlengang des Spektrofluorophotometers gesetzt und
am Gerät wurden sowohl eine entsprechende Exzitations– wie auch Emissionswellenlänge
gewählt. Nach dem Öffnen des Strahlenganges wurde über einen angeschlossenen Schreiber
das Emissionsspektrum aufgezeichnet.
Die Einstellungen am Spektrofluorophotometer für die Messung mit 5,6-Carboxyfluorescein
betrugen für die Exzitationswellenlänge 488 nm, der aufgezeichnete Bereich erstreckte sich
von 580 nm bis 500 nm. Für die Bandbreite wurde sowohl für die Exzitation als auch für die
Emission eine Wellenlänge von 5 nm am Gerät gewählt. Die Einstellung Gain lag bei 5.
SNARF wurde mit einer Exzitationswellenlänge von 534 nm angeregt und sein Spektrum
ausgehend von 750 nm bis 580 nm verfolgt. Dabei lag die Bandbreite für beide Wellenlängen
bei 10 nm, Gain war auf 20 festgelegt.
Für SNAFL-1 wurde für die Exzitation eine Wellenlänge von 485 nm festgelegt. Sein
Emissionsspektrum wurde von 600 nm bis 500 nm aufgeschrieben, wobei mit einer
Bandbreite von jeweils 5 nm und Gain 50 gearbeitet wurde.
Aus den einzelnen Spektren war eine deutlich größere Dynamik des Fluorochroms SNAFL-1
im gewünschten pH-Bereich von 7,4 bis 7,0 ersichtlich, weshalb sich dieses als geeigneter für
die Messungen der Lipolyseraten erwies, als SNARF oder 5,6-Carboxyfluorescein. Die
letztgenannten Farbstoffe zeigten kaum Unterschiede in ihren Spektren. Da BREIDENBACH
31
3. Eigene Untersuchungen
(1996, 1998, 1999) ebenfalls diesen Farbstoff verwendete, konnte somit zusätzlich eine
Vergleichbarkeit der Daten gewährleistet werden. Alle Versuche wurden mit Farbstoff der
gleichen Charge durchgeführt.
3.1.8.2. Erstellen einer Eichkurve mittels Palmitinsäure
Um die Änderungen der relativen Fluoreszenz mit der Menge der zugesetzten Palmitinsäure
zur KR-Lösung III korrelieren zu können, wurde eine Eichkurve erstellt.
Hierfür wurde die Palmitinsäure in Ethanol gelöst und eine 20 mM Stammlösung hergestellt.
Die Messung erfolgte im dreifachen Ansatz, wobei zu 2,5 ml KR-Lösung III bei Anwesenheit
des Fluoreszenzfarbstoffes in 5 µl–Schritten Palmitinsäurestammlösung mittels Hamilton-
Pipette hinzugegeben und die jeweilige Änderung der relativen Fluoreszenzeinheit notiert
wurde. Als Kontrolle diente die Zugabe gleicher Mengen Ethanol. Die Gesamtmenge der
eingesetzten Palmitinsäurestammlösung bzw. des Ethanols betrug 80 µl. Die Ansätze in den
Küvetten und die Einstellungen am Photometer werden aus den nachstehenden Tabellen
ersichtlich.
Kontrolle
Probe
KR III in ml 2,5 2,5
SNAFL in µmol / l 3 3
Ethanol je 5 µl -
Palmitinsäure 20 mM in
Ethanol
-
je 5 µl
Tab. 4: Ansätze in den Küvetten zur Erstellung einer Eichkurve. Insgesamt wurden 80 µl
Ethanol bzw. Palmitinsäure hinzugefügt.
32
3. Eigene Untersuchungen
Wellenlänge
Exzitation Emission
Wellenlänge Bandbreite
Exzitation Emission
Gain
λ = 520 nm
λ = 600 nm
λ = 10 nm
λ = 10 nm
50
Tab. 5:Einstellungen am Spektrofluorophotometer zur Erstellung der Eichkurve.
Aus den Werten der drei Messungen wurde der Mittelwert gebildet und die Kontrolle davon
als Blindwert subtrahiert. Dabei ergaben sich die in Abb. 7 eingetragenen Messpunkte.
33
3. Eigene Untersuchungen
Palmitinsäure
6
8
10
12
14
16
18
20
22
y = 0,0131 x + 0,8582R² = 0,9705p < 0,001
34
600 800 1000 1200 1400 1600
rela
tive
Fluo
resz
enze
inhe
iten
nmol
Abb. 7: Mit Palmitinsäure erstellte Eichkurve. Es konnte eine lineare Regressionskurve an
die Messpunkte angepasst werden.
Die Steigung der an die Mittelwertkurve angelegten Regressionsgeraden zeigte einen linearen
Zusammenhang zwischen Fettsäureangebot und Höhe der relativen Fluoreszenzeinheiten,
wonach die Zugabe von 1 nmol Fettsäure einen Anstieg von 0,0131 relativen
Fluoreszenzeinheiten ergab.
3. Eigene Untersuchungen
3.1.8.3. Eingesetzter Lipolyseansatz
Zum Zweck der Messung der Lipolyserate in den jeweiligen Fettzellsuspensionen wurden die
Küvetten im Anschluss an das Auszählen in der Thoma–Kammer für die jeweiligen Ansätze
bestückt, wobei die Zellzahl in jedem Ansatz auf 250.000 eingestellt wurde. Nach dem
Überführen der eingestellten Menge der Zellsuspension in die Küvetten folgte die Zugabe von
jeweils 50 µl der Stammlösungen von N6, 2´-O–Dibutyryladenosin–3´:5´-Cyclomonophoshat
(DBcAMP) bzw. Noradrenalin (NA) und Adenosindesaminase (ADA). In jede Küvette wurde
die gleiche Menge des Fluoreszenzfarbstoffes Seminaphthofluorescein-1 (SNAFL-1)
pipettiert und das Volumen mit KR–Lösung III mit 0,5 % Bovinem Serum-Albumin (BSA)
auf 2,5 ml aufgefüllt. Ein Pipettierschema ist der Tabelle 6 zu entnehmen, welches sowohl für
die Proben aus dem Inguinal– wie auch aus dem Bauchbereich gilt.
Küvette 1
Kontrolle
Küvette 2
NA
Küvette 3
DBcAMP
Zellzahl jeweils 250.000
DBcAMP - - 50 µl
SNAFL-1 37,5 µl 37,5 µl 37,5 µl
NA - 50 µl -
ADA - 50 µl -
KR III Jeweils ad 2,5 ml
Tab. 6: Ansätze in den Küvetten zur Messung der Lipolyseraten in separierten Adipocyten
von Großpferd und Pony.
35
3. Eigene Untersuchungen
Dabei ergaben sich für die eingesetzten Reagenzien die in der Tabelle 7 eingetragenen
Konzentrationen.
Konzentration
DBcAMP 1 mmol / l
SNAFL-1 3 µmol / l
NA 0,3 µmol / l
ADA 200 U / l
Tab. 7: Konzentrationen der Reagenzien in den Küvetten zur Messung der Lipolyseraten in
separierten Adipocyten von Großpferd und Pony.
Die Messungen der Lipolyseraten wurden im beheizten Spektrofluorophotometer bei
folgenden Einstellungen des Gerätes durchgeführt: Exzitationswellenlänge 520 nm,
Emissionswellenlänge 600 nm, Bandbreite jeweils 10 nm, Gain 50. Die relativen
Fluoreszenzeinheiten wurden im Abstand von zehn Minuten über zwei Stunden gemessen und
protokolliert. Zwischen den Messzeitpunkten lagerten die Proben in einem auf 37°C beheizten
Magnetrührer. Noradrenalin wurde den jeweiligen Ansätzen nach der ersten Messung
hinzugefügt.
36
3. Eigene Untersuchungen
3.1.9. Berechnung der Lipolyserate
Um die Raten der Fettsäurefreisetzung berechnen zu können, wurde die folgende Formel
angewendet:
nmol FS rel. FE (Probe) nmol FS
────────── = ────────────── * ────────────── min min 0,0131 rel. FE
rel. FE = relative Fluoreszenzeinheiten; FS = Fettsäure.
Die Änderung der relativen Fluoreszenzeinheiten der Probe pro Minute ergab sich dabei aus
dem Wert der Steigung. Diese wurde für jeden Probenansatz derart bestimmt, dass für die
entsprechenden Messdaten aus der Lipolysemessung die lineare Regression angepasst wurde.
Aus der resultierenden Steigung der Geraden konnte die Lipolyserate bestimmt werden. Zur
Ermittlung dieser Steigung wurden die jeweils letzten sechs Messwerte herangezogen, also
die letzten 60 Minuten berücksichtigt.
Der Faktor 0,0131 nmol -1 ergab sich bereits in den Vorversuchen bei der Erstellung der
Eichkurve (siehe 3.1.8.2.). Er entspricht dem Anstieg der relativen Fluoreszenzeinheiten bei
Zugabe von 1 nmol Fettsäure zum Inkubationsansatz und folgte, wie schon beschrieben, aus
der Berechnung der Steigung der Mittelwertkurve aus den drei Messungen der relativen
Fluoreszenz von SNAFL-1 nach Zugabe von Palmitinsäure.
37
3. Eigene Untersuchungen
3.1.10. Verschiedene DBcAMP-Konzentrationen
Um den Einfluss verschiedener DBcAMP–Gehalte auf den Verlauf der Lipolyse zu testen,
wurden die Messungen bei den institutseigenen Tieren nicht nur in einer DBcAMP-
Konzentration von 1 mmol / l durchgeführt, sondern darüber hinaus sowohl mit 0,5 mmol / l
als auch mit 1,5 mmol / l, wobei sich die Konzentration von 1 mmol / l nach den bereits in der
Literatur beschriebenen Angaben richtete (FARIAS–SILVA et al. 1999; PORTILLO et al.
1999; MORIMOTO et al. 2001). Die übrigen Arbeitsschritte entsprechen dem oben
genannten Vorgehen. Weitergehende Details bezüglich der in den Messungen verwendeten
Konzentration befinden sich im Kapitel 4.1. auf Seite 41 des Ergebnisteils.
3.2. Statistische Auswertung
3.2.1. Deskriptive Statistik
Um die resultierenden Werte vergleichen zu können, wurden die Ergebnisse jeder
Einzelmessung der verschiedenen Ansätze in einer Kurve über den Verlauf der Lipolyse
festgehalten und die jeweilige Regressionsgerade, deren Funktion und ihr Bestimmtheitsmaß
dargestellt.
Aus den Funktionen der Regressionsgeraden waren ihre entsprechenden Steigungen, die ein
Maß für die freigesetzten Fettsäuren pro Zeiteinheit sind, abzulesen (s.o.). Diese konnten für
die einzelnen Ansätze der Gruppen (Kontrolle, Noradrenalin–vermittelte und DBcAMP–
induzierte Lipolyse) zusammengefasst werden. Daraus wurden sowohl der Mittelwert als auch
die Standardabweichung gebildet, aus denen die statistischen Berechnungen erfolgten.
Bei nicht normalverteilten Werten wurde der Median festgelegt.
38
3. Eigene Untersuchungen
3.2.2. Analytische Statistik
Anhand der sich ergebenden Mittelwerte, Standardabweichungen und Mediane erfolgte die
statistische Auswertung unter Anwendung des Programms Sigma Stat 3.01 des Herstellers
SPSS.
Zunächst wurde jeweils ein Überprüfen auf Normalverteilung vorgenommen.
Sofern die Daten der zu vergleichenden Gruppen diese Eigenschaft aufwiesen, wurde im
Zwei–Gruppen–Vergleich der t–Test angewendet oder im Fall eines Vergleichs zwischen
mehreren Gruppen eine ANOVA mit anschließendem Tukey–Test durchgeführt. Hier konnten
sowohl die arithmetischen Mittel als auch die Standardabweichungen zur Charakterisierung
herangezogen werden.
Lagen dagegen nicht normalverteilte Daten vor, wurde dementsprechend der Mann–Whitney
Rank Sum Test oder eine One Way ANOVA on Ranks (Kruskal–Wallis) durchgeführt, wobei
auf die Angabe des Medians als Gruppenwert zurückgegriffen werden musste.
Unterschiede, bei denen der p–Wert ≤ 0,05 beträgt, wurden als signifikant angesehen und in
Abbildungen mit gekennzeichnet.
39
4. Ergebnisse
4. ERGEBNISSE
Da die Probennahme nicht bei allen Tieren in vollem Umfang möglich war, konnte nicht bei
allen Pferden und Ponys auf vollständige Datensätze, das heißt Ergebnisse sowohl aus den
Messungen des Bauch– als auch des Inguinalfettes, zurückgegriffen werden.
So wurde bei den institutseigenen Ponys wegen des Ausmaßes des notwendigen chirurgischen
Eingriffs auf die Entnahme von Bauchhöhlenfett verzichtet und nur subkutanes Gewebe aus
dem Inguinalbereich verwendet.
Da der Ernährungszustand besonders bei den Schlachttieren stark variierte, war es in einigen
Fällen nicht möglich, Fettgewebe aus dem Bereich der Bauchhöhle aufgrund seiner z.T.
äußerst geringen Ausprägung bei mageren Tieren zu entnehmen. Bei solchen Pferden
beschränkte sich die Probengewinnung folglich auf die Entnahme von Inguinalfett.
Des Weiteren konnten bei der Präparation der Adipocyten in einigen Ansätzen keine oder nur
zu wenig Zellen isoliert werden, um die nötige Zellzahl von 250.000 für die Messungen zu
gewährleisten. Schwierigkeiten ergaben sich dabei vor allem bei der Bearbeitung des
Bauchfettes.
40
4. Ergebnisse
4. 1. Vergleich verschiedener DBcAMP–Konzentrationen im Testansatz
Um den Einfluss verschiedener DBcAMP–Konzentrationen auf den Verlauf der Lipolyse zu
untersuchen, wurde diese für die Messungen der Proben der institutseigenen Tiere variiert und
neben 1 mM auch die Konzentrationen 0,5 mM bzw. 1,5 mM untersucht.
0 20 40 60 80 100 120
rela
tive
Fluo
resz
enze
inhe
iten
0
5
10
15
20
25
30
MW 0,5 mM DBcAMP
t in min
MW 1,0 mM DBcAMP
0
5
10
15
20
25
30
MW 1,5 mM DBcAMP
Lipolyse Inguinalfett
Abb. 8: Graphische Darstellung des Verlaufs der Lipolyse bei drei unterschiedlichen
DBcAMP–Konzentrationen von Adipocyten aus Inguinalfett der Institutsponys. Die Zellzahl
wurde auf 250.000 eingestellt. Darstellung der Mittelwertkurven. MW = Mittelwert.
41
4. Ergebnisse
Wie die graphische Darstellung in Abb. 8 verdeutlicht, ist eine steigende DBcAMP-
Konzentration nicht mit einer Erhöhung der relativen Fluoreszenz verbunden. Zwischen den
drei abgebildeten Kurven besteht statistisch kein Unterschied.
Nach der Umrechnung der gemessenen relativen Fluoreszenzeinheiten in Fettsäurefreisetzung
in nmol / min wurden für die drei DBcAMP-Konzentrationen statistische Berechnungen
angestellt. Die Unterschiede erwiesen sich in einer ANOVA on Ranks und einem zusätzlich
durchgeführten t-test als nicht signifikant (siehe Abb. 9), weshalb für folgende Versuche die
mittlere Konzentration von 1,0 mM gewählt wurde, was auch dem Vorgehen anderer Autoren
entspricht (WAHRENBERG et al. 1989; FARIAS-SILVA et al. 1999).
42
4. Ergebnisse
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
5
10
15
20
25
30
b b b
a
Kontrolle 0,5 mM 1,0 mM 1,5 mM DBcAMP
Abb. 9: Vergleich verschiedener DBcAMP–Konzentrationen (0,5 mM, 1,0 mM, 1,5 mM),
Inguinalfett, Institutsponys. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen auf einen
signifikanten Unterschied hin (p < 0,05). n = jeweils 4.
43
4. Ergebnisse
4. 2. Ergebnisse der Messung der Lipolyserate
Nach Stimulation der Adipocyten in den Testansätzen mit Noradrenalin bzw. DBcAMP
erfolgte die Messung der Fettsäurefreisetzung im Spektrofluorophotometer über einen
Zeitraum von 120 Minuten jeweils in 10-minütigen Abständen. Die dabei eintretende
pH–Wertänderung wurde durch den Indikator SNAFL-1 detektiert und als relative
Fluoreszenzeinheit notiert.
Aus den ermittelten Werten wurden anschließend Graphen skizziert, um den Verlauf der
Fettsäurefreisetzung bildlich darzustellen.
Beispielhaft werden im Folgenden die Graphen für jeweils ein Pferd bzw. Pony angeführt.
Die zugrunde liegenden Einzelwerte sind den Tabellen 8 und 9 im Anhang (Seite 125, 126.)
zu entnehmen.
44
4. Ergebnisse
0 20 4 0 60 8 0 10 0 1 20
0
10
20
30
40
K on tro lle
0 20 40 60 80 100 120
0
10
20
30
40
N A / A D A
t in m in
0 20 4 0 6 0 8 0 10 0
rela
tive
Fluo
resz
enze
inhe
iten
0
10
20
30
40
D B cA M P
A: Lipolyse Bauchfett Pferd
1 2 0
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
0
1 0
2 0
3 0
4 0
K o n tro lle
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
0
1 0
2 0
3 0
4 0
N A / A D A
t in m in
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
rela
tive
Fluo
resz
enze
inhe
iten
0
1 0
2 0
3 0
4 0
D B c A M P
A, B: Graphische Darstellung des Verlaufs der Lipolyse von Adipocyten aus Bauch-
B: Lipolyse Inguinalfett Pferd
Abb. 10
und Inguinalfett des Pferdes 20 sowohl im Kontrollansatz als auch nach Stimulation mit
NA / ADA (0,3 µM / l; 200 U / l) bzw. DBcAMP (1,0 mM). Die Zellzahl wurde auf 250.000
eingestellt.
45
4. Ergebnisse
Wie aus den Graphen der Abb. 10 A und B ersichtlich wird, ergab sich für die Kontrollen
keine wesentliche Änderung der relativen Fluoreszenz während der Versuchszeit. Dieses
Resultat war zu erwarten, da im Inkubationsmedium keinerlei die Lipolyse aktivierenden
Substanzen enthalten sind.
Der Zusatz des Catecholamins NA in Verbindung mit ADA entwickelte bei den Großpferden
kaum Effektivität und es ergab sich kein wesentlicher Unterschied in der Fluoreszenz
zwischen den Adipocyten der beiden Lokalisationen. Lediglich beim Inguinalfett zeigte sich
eine schwache Tendenz zu höheren Werten am Ende der Inkubationszeit, diese lag aber nie
über zehn relativen Fluoreszenzeinheiten.
Ein deutlicher Anstieg der relativen Fluoreszenz war dagegen bei Zugabe von DBcAMP zum
Testansatz zu verzeichnen, der eine stärkere Ausprägung zeigte als bei Zusatz von NA / ADA.
Ein stetiger Anstieg der Kurven war aber in der Regel erst ab der 60. Minute zu erkennen.
46
4. Ergebnisse
47
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
K o n tr o l le
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 00
5
1 0
1 5
2 0
2 5
N A / A D A
t in m in
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
rela
tive
Fluo
resz
enze
inhe
iten
0
5
1 0
1 5
2 5
2 0
D B c A M P
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 00
5
1 0
1 5
2 0
2 5
K o n tro l le
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 00
5
1 0
1 5
2 0
2 5
N A / A D A
t in m in
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0
A: Lipolyse Bauchfett Pony
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
D B c A M P
rela
tive
Fluo
resz
enze
inhe
iten B: Lipolyse Inguinalfett Pony
Abb. 11 A, B: Graphische Darstellung des Verlaufs der Lipolyse von Adipocyten aus Bauch-
und Inguinalfett des Ponys 16 sowohl im Kontrollansatz als auch nach Stimulation mit
NA / ADA (0,3 µM / l; 200 U / l) bzw. DBcAMP (1,0 mM). Die Zellzahl wurde auf 250.000
eingestellt.
4. Ergebnisse
Die der Abb. 11 A und B zu entnehmenden Kurvenverläufe der Kontrollansätze der Ponys
stimmten mit denen der Großpferde überein, auch hier verliefen die Graphen während der
gesamten Versuchszeit weitgehend auf einem Niveau.
Dagegen waren deutliche Anstiege der relativen Fluoreszenz bei Zugabe von NA / ADA zum
Inkubationsmedium zu verzeichnen. Diese waren bei den Pferden in deutlich geringerer
Ausprägung ersichtlich.
Durch DBcAMP im Medium ließen sich die Adipocyten der Ponys noch intensiver als mit
NA / ADA, aber in ähnlich starker Intensität stimulieren wie die der Pferde.
Die Steigungen der Kurven erwiesen sich in einer ANOVA mit p < 0,01 als hoch signifikant.
48
4. Ergebnisse
4. 3. Einfluss der Spezies auf die Lipolyserate
Um zu prüfen, ob Unterschiede zwischen Großpferd und Pony bezüglich des Verlaufs der
Lipolyse existieren, wurden zunächst die DBcAMP–Ansätze der beiden Spezies getrennt nach
Bauch– und Inguinalfett miteinander verglichen.
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
10
20
30
40
50
n = 13 n = 4
Großpferd Pony
Abb. 12: Box Plot: Vergleich der Lipolyserate in den DBcAMP-Ansätzen (1 mM) des
Bauchfettes zwischen Großpferd und Pony. Der Punkt • im Diagramm kennzeichnet jeweils
einen Ausreißer.
49
4. Ergebnisse
Der Verlauf der Lipolyse des Bauchfettes (Abb. 12) ergab keinen statistisch signifikanten
Unterschied zwischen Pferd und Pony. Die Lipolyseraten liegen mit Medianen von 16,6 nmol
FS / min bei den Pferden und 14,9 nmol FS / min bei den Ponys etwa auf gleicher Höhe.
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
10
20
30
40
50
n = 16 n = 10
Großpferd Pony
Abb. 13: Vergleich der Lipolyserate in DBcAMP-Ansätzen (1 mM) des Inguinalfettes
zwischen Großpferd und Pony. Der Unterschied ist mit p = 0,007 signifikant.
50
4. Ergebnisse
Der in Abb. 13 gezeigte speziesspezifische Vergleich der Proben aus Inguinalgewebe ist
dagegen mit p = 0,007 als signifikant zu betrachten. Mit einem Mittelwert von 18,9 ± 9,0
nmol FS / min liegt die Lipolyserate bei den Pferden deutlich höher als bei den Ponys, bei
denen der Mittelwert 9,9 ± 4,0 nmol FS / min beträgt.
Da sich bei den bislang präsentierten Lipolyseraten zwischen Großpferd und Pony ein
Unterschied im Inguinalfett andeutete, sich jedoch beide Gruppen in Bezug auf das Bauchfett
beinahe gleich verhielten, wurde in einem weiteren Test der Einfluss der Lokalisation (4.6.)
näher untersucht.
51
4. Ergebnisse
4. 4. Vergleich der in vitro Daten (Schlachtponys) mit ex vivo in vitro Daten
(anästhesierte Ponys des Instituts) für das Inguinalfett
Der Vergleich zwischen Schlachtponys und narkotisierten Ponys diente der Überprüfung, in
welchem Maße der Abbau von Triglyceriden durch Narkose bzw. Schlachtvorgang
beeinflusst wird und ob ein Unterschied aus beiden Formen der Probengewinnung resultiert.
Hierzu wurden sowohl die Ansätze mit NA / ADA als auch mit DBcAMP verglichen.
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
5
10
15
20
25
30
35
NA / ADA-Ansätze des Inguinalfettes
n = 6 n = 5
Narkoseponys Schlachtponys
Abb. 14: Vergleich der Lipolyserate der NA / ADA–Ansätze des Inguinalfettes zwischen
geschlachteten und anästhesierten Ponys. Der Unterschied ist mit p = 0,023 signifikant.
52
4. Ergebnisse
In den Proben mit NA / ADA (Abb. 14) verlief die Lipolyse bei den narkotisierten Ponys im
Gegensatz zu den geschlachteten intensiver. Der Mittelwert ist hier mit 18,7 ± 6,4 nmol FS /
min doppelt so groß wie der der Schlachthoftiere mit 9,0 ± 5,0 nmol FS / min. Der
Unterschied ist mit p = 0,023 gesichert.
Das gleiche Resultat wie in den Ansätzen mit NA / ADA ergab sich bei DBcAMP-
Stimulation (siehe Abb. 15).
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
5
10
15
20
25
30
35
DBcAMP-Ansätze des Inguinalfettes
n = 6 n = 5
Narkoseponys Schlachtponys
Abb. 15: Vergleich der Lipolyserate der DBcAMP–Ansätze des Inguinalfettes zwischen
geschlachteten und anästhesierten Ponys. Der Unterschied ist mit p = 0,019 signifikant.
53
4. Ergebnisse
Auch bei Zugabe von DBcAMP zum Testansatz war, wie in Abb. 15 ersichtlich, eine höhere
Lipolyserate bei den von in Narkose befindlichen Tieren gewonnenen Proben deutlich. Die
Mittelwerte lagen bei den narkotisierten Ponys bei 20,1 ± 7,2 nmol FS / min, bei den
geschlachteten Tieren bei 9,4 ± 4,7 nmol FS / min. Mit p = 0,019 ist das Ergebnis ebenfalls
signifikant.
Aufgrund der signifikanten Unterschiede zwischen Schlachttieren und narkotisierten Ponys
wurden die letztgenannten nicht in die folgenden Gruppenvergleiche integriert, obwohl ihre
Ergebnisse aussagekräftiger waren.
Die anästhesierten Ponys wurden nicht zuletzt auch aus Gründen der Unsicherheit bezüglich
der verwendeten Narkosemittel von übrigen Erhebungen ausgeschlossen, da es nicht sicher
war, ob die einzelnen Substanzen selbst lipolytisch aktiv waren. Da sich bei diesen Tieren
erhöhte Lipolyseraten ergaben, konnte nicht ausgeschlossen werden, dass die verwendeten
Narkosemittel eventuell einen die Lipolyse steigernden Effekt hatten. Es erschien deshalb
angezeigt, bei den weiteren Studien nur Gewebe zu verwenden, die von Schlachttieren
stammten. Darüber hinaus verfügte das Institut nur über sechs eigene Tiere. Mit den
Schlachttieren stand eine deutlich größere Probandenzahl zur Verfügung. Des Weiteren war
diese Entscheidung auch im Hinblick auf den Tierschutz gefällt worden.
54
4. Ergebnisse
4. 5. Einfluss des Geschlechts auf die Lipolyserate
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
Um einen eventuell vorhandenen Einfluss des Geschlechts zu untersuchen, wurden die
DBcAMP-Ansätze weiblicher mit denen männlicher Tiere verglichen. Der Test wurde
getrennt nach Bauch– und Inguinalfett durchgeführt. Da keine Bauchfettproben männlicher
Ponys zur Verfügung standen, wurden Inguinal- und Bauchfettansätze von männlichen und
weiblichen Tieren zweimal miteinander verglichen. Beim ersten Versuchsdurchgang wurden
Proben gemessen, die sowohl von männlichen und weiblichen Ponys und Großpferden
stammten, während beim zweiten Versuchsdurchgang Proben nur von Großpferden
verglichen wurden.
10
20
30
40
50
n = 9 n = 17
(2 Ponys, (8 Ponys,
7 Pferde) 9 Pferde)
männlich weiblich
Abb. 16: Vergleich der Lipolyserate im Inguinalfett (1 mM DBcAMP) zwischen männlichen
und weiblichen Tieren. In den Daten sind Großpferde und Ponys enthalten.
55
4. Ergebnisse
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
10
20
30
40
50
n = 6 n = 11
(6 Pferde, keine Ponys) (4 Ponys, 7 Pferde)
männlich weiblich
Abb. 17: Box Plot: Vergleich der Lipolyserate im Bauchfett (1 mM DBcAMP) zwischen
männlichen und weiblichen Tieren. In den Daten sind Großpferde und Ponys enthalten. Der
Punkt • im Diagramm kennzeichnet jeweils einen Ausreißer.
56
4. Ergebnisse
In den Abbildungen 16 und 17 ist kein signifikanter Unterschied im Verlauf der Lipolyse in
Abhängigkeit vom Geschlecht feststellbar. Mittelwert und Standardabweichung aus den
Messungen mit Inguinalgewebe liegen bei 14,4 ± 10,7 nmol FS / min bei den männlichen
Tieren, bzw. betragen 16,0 ± 7,5 nmol FS / min bei den weiblichen Tieren.
Die Ergebnisse aus den Messungen mit Bauchfett wurden im Box Plot dargestellt (Abb. 17).
Der Median liegt bei den männlichen Tieren bei 14,5 nmol FS / min, bei den weiblichen
beträgt er 16,4 nmol FS / min.
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
10
20
30
40
50
n = 7 n = 9
männlich weiblich
Abb. 18: Vergleich der Lipolyserate in den DBcAMP-Ansätzen (1mM) aus Inguinalfett
zwischen männlichen und weiblichen Tieren. In den Daten sind nur Großpferde enthalten.
57
4. Ergebnisse
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
10
20
30
40
50
n = 6 n = 7
männlich weiblich
Abb. 19: Vergleich der Lipolyserate in den DBcAMP-Ansätzen (1 mM) aus Bauchfett
zwischen männlichen und weiblichen Tieren. In den Daten sind nur Großpferde enthalten.
58
4. Ergebnisse
Bei alleiniger Betrachtung der Daten von den Großpferden ergab sich ebenfalls kein
statistisch signifikanter Unterschied (siehe Abbildungen 18 und 19) hinsichtlich der
Geschlechterverteilung der Proben. Aufgrund der Normalverteilung der Daten konnten in
diesem Fall sowohl die Ergebnisse aus den Messungen an Bauch– als auch die des
Inguinalfettes im Säulendiagramm dargestellt werden.
Mittelwerte und Standardabweichungen betrugen für das Inguinalfett 16,1 ± 11,2 nmol
FS / min bei den männlichen bzw. 22,1 ± 6,1 nmol FS / min bei den weiblichen Tieren, für
das Bauchfett resultierten 19,2 ± 11,5 nmol FS / min bei den männlichen bzw. 21,2 ± 10,8
nmol FS / min bei den weiblichen Pferden.
Da sich für keine der genannten Testpaarungen statistisch signifikante Unterschiede ergaben,
wurden die Geschlechter in den nachstehend dargestellten Betrachtungen zusammengefasst
und nicht nach männlichen und weiblichen Tieren getrennt beurteilt.
59
4. Ergebnisse
4. 6. Lipolyserate in Fettgewebeproben unterschiedlicher Lokalisationen
Die Messungen der Lipolyserate erfolgten gleichermaßen an Bauch– und Inguinalfett in
Proben, die von Schlachtpferden genommen wurden. Mit diesem Versuchsansatz sollte
verifiziert werden, ob bei den beiden betrachteten Spezies –wie in Abb. 10 und 11 angedeutet-
tatsächlich unterschiedliche Lipolyseraten in Bauch- und Inguinalfettgewebe bestehen.
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
10
20
30
40
50
n = 16 n = 13
Inguinalfett Bauchfett
Abb. 20: Box Plot: Vergleich der Lipolyserate in DBcAMP-Ansätzen (1 mM) zwischen
Inguinal– und Bauchfett der Großpferde. Der Punkt • im Diagramm kennzeichnet jeweils
einen Ausreißer.
60
4. Ergebnisse
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
10
20
30
40
50
n = 10 n = 4
Inguinalfett Bauchfett
Abb. 21: Vergleich der Lipolyserate in DBcAMP-Ansätzen (1 mM) zwischen Inguinal– und
Bauchfett der Ponys. Der Unterschied ist mit p = 0,047 signifikant.
Bei den Großpferden ergab sich in dieser Studie kein signifikanter Unterschied zwischen den
Lipolyseraten aus Geweben verschiedener Lokalisationen (Abb. 20). Die Mediane der Daten
lagen mit 16,1 nmol FS / min (Inguinalfett) und 16,6 nmol FS / min (Bauchfett) annähernd
auf gleichem Niveau.
Ein mit p = 0,047 schwach signifikanter Unterschied war dagegen in der Gruppe der Ponys zu
verzeichnen (Abb. 21). Die Lipolyserate im Bauchfett war mit einem Mittelwert von 18,3 ±
11,0 nmol FS / min höher angesiedelt als im Inguinalfett (Mittelwert 10,0 ± 4,0 nmol FS /
min).
61
4. Ergebnisse
4. 7. Vergleich der Lipolyseraten in Kontroll-, NA / ADA- und DBcAMP-Ansätzen
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
10
20
30
40
In den nachfolgend referierten Testansätzen wurden die Inkubationen sowohl ohne
Mediatoren (Kontrollen) als auch mit NA / ADA einerseits und DBcAMP andererseits
durchgeführt. Diese Gegenüberstellung ermöglichte es, die Beeinflussung der Lipolyse
sowohl durch die Rezeptorebene als auch durch die postrezeptorale Ebene zu vergleichen.
Darüber hinaus sollte auch die Reproduzierbarkeit der Resultate, die mit NA / ADA erzielt
wurden, überprüft werden (BREIDENBACH et al. 1999).
b
a
n = 4 n = 1 n = 4
Kontrolle NA / ADA DBcAMP
Abb. 22: Box Plot: Vergleich der Lipolyserate in den drei verschiedenen Probenansätzen des
Bauchfettes der Schlachtponys. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen auf einen
signifikanten Unterschied hin. p = 0,029.
62
4. Ergebnisse
Bei den Schlachtponys (siehe Abb. 22) standen nur vier Proben aus Bauchhöhlengewebe zur
Verfügung und es konnte nur ein Ansatz nach NA-Stimulation gemessen werden. Daher war
es in diesem Fall nicht möglich, die Varianzanalyse durchzuführen. In einem separat
durchgeführten t-test ergab sich jedoch für Kontrollen und DBcAMP-Ansätze ein mit
p = 0,029 signifikanter Unterschied.
Trotz der sehr geringen Probenzahl für NA / ADA-Messungen (n = 1) wurde der Vergleich
aller drei Testansätze aufgeführt. Das Ergebnis hinsichtlich der Fettsäurefreisetzung der
Ponyzellen nach Inkubation mit NA / ADA bestätigte die Befunde von BREIDENBACH
(1996).
63
4. Ergebnisse
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
5
10
15
20
b
a b
a
Kontrolle NA / ADA DBcAMP
n = 6 n = 6 n = 10
Abb. 23: Box Plot: Vergleich der Lipolyserate in den drei verschiedenen Probenansätzen des
Inguinalfettes der Schlachtponys. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen auf einen
signifikanten Unterschied hin.
Beim Inguinalfett der Ponys (siehe Abb. 23) ist ein mit p = 0,006 signifikanter Unterschied
zwischen den mit DBcAMP stimulierten Ansätzen und den Kontrollen ersichtlich, während
sich die Lipolyseraten in NA / ADA- und DBcAMP–haltigen Medien nicht deutlich
voneinander unterschieden, was durch die Mediane von 7,6 nmol FS / min (für NA / ADA)
und 10,4 nmol FS / min (für DBcAMP) erkenntlich wird. Der Median der Kontrollansätze
betrug 0,46 nmol FS / min.
64
4. Ergebnisse
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
10
20
30
40
b
a a
n = 9 n = 9 n = 9
Kontrolle NA / ADA DBcAMP
Abb. 24: Box Plot: Vergleich der Lipolyserate in den drei verschiedenen Probenansätzen des
Bauchfettes der Großpferde. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen einen signifikanten
Unterschied auf.
Auch bei der Betrachtung des Bauchfettes der Pferde (Abb. 24) ergibt sich ein als signifikant
anzusehender Unterschied bezüglich der mit DBcAMP stimulierten Zellsuspensionen im
Vergleich zu den Kontrollen bzw. zu den NA / ADA–haltigen Ansätzen (p = < 0,001),
während dieser zwischen den Kontrollen und mit NA / ADA versetzten Proben nicht besteht.
65
4. Ergebnisse
Die Mediane von Kontrollansätzen und NA / ADA–stimulierten Proben lagen mit 0,3 nmol
FS / min bzw. 1,8 nmol FS / min auf ähnlicher Höhe, während eine deutlich höhere
Lipolyserate in den DBcAMP–haltigen Inkubationsansätzen durch einen Median von 16,6
nmol FS / min angezeigt wird.
Fetts
äure
frei
setz
ung
in n
mol
/ m
in
0
10
20
30
40
c
b
a
n = 9 n = 9 n = 9
Kontrolle NA / ADA DBcAMP
Abb. 25: Vergleich der Lipolyserate in den drei verschiedenen Probenansätzen des
Inguinalfettes der Großpferde. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen einen signifikanten
Unterschied auf.
66
4. Ergebnisse
Im Vergleich des Inguinalfettes der Großpferde (siehe Abb. 25) ist ebenfalls ein signifikanter
Unterschied erkennbar (p = < 0,001), der sich in diesem Fall jedoch auf alle gegeneinander
getesteten Probenansätze bezieht. Die Lipolyserate der DBcAMP–stimulierten Proben mit
einem Mittelwert von 19,3 ± 8,7 nmol FS / min erreicht dabei etwa die doppelte Höhe der
NA / ADA–haltigen Testansätze, bei denen der Mittelwert 8,7 ± 4,1 nmol FS / min beträgt.
67
5. Diskussion
5. DISKUSSION
Die vorliegende Studie sollte einen Beitrag zur Klärung der Frage liefern, inwieweit der
lipolytisch wirksamen cAMP-Kaskade für die Einstellung der Aktivität der Hormonsensitiven
Lipase beim Pony hinsichtlich der Hyperlipämieentstehung eine wichtige Rolle zukommt.
Nachdem die bisherigen Untersuchungen (s. Einleitung) nicht für einen ausschlaggebenden
Effekt auf die Lipolyse vor und an den Adipocytenrezeptoren sprechen (WRAGE 2002), war
nunmehr beabsichtigt, in einer ersten Studie eventuelle postrezeptorale Einflüsse vor allem
auf die Hormonsensitive Lipase aufzudecken. Wegen der unterschiedlichen
Empfindlichkeiten gegenüber der betrachteten Fettstoffwechselentgleisung wurde in dieser
Untersuchung wiederum der Speziesvergleich Pony-Großpferd durchgeführt. Aufgrund seiner
Lipidlöslichkeit und der Membrangängigkeit wurde isolierten Adipocyten beider Pferderassen
Dibutyryl-cAMP im Lipolysemedium zugesetzt. Somit konnte die Empfindlichkeit der
Lipolyse gegenüber dem Second-messenger cAMP überprüft werden. Zur Bestimmung der
Lipolyseraten eignete sich das von BREIDENBACH et al. (1998) entwickelte Messverfahren,
das die Freisetzung von langkettigen Fettsäuren aus TGL bestimmt.
5.1. Versuchsanstellung und Methodik
5.1.1. Versuchstiere
Da diese Studie das Ziel verfolgte, Unterschiede im Fettstoffwechsel zwischen Großpferden
und Ponys darzustellen, wurden Proben beider Spezies in die Versuche aufgenommen.
Die Gruppe der Schlachttiere stellte sich naturgemäß als weitgehend inhomogen dar. Um
dennoch möglichst einheitliches Material zu erhalten, wurden bei den Großpferden
ausschließlich Warmblutpferde, hier vorwiegend Hannoveraner, beprobt, während Kaltblüter,
Vollblüter und andere Zuchten keine Verwendung fanden. Für die Ponyproben wurden
Shetland–Ponys oder Kreuzungen aus dieser Rasse gewählt, da hier eine Prädisposition zum
equinen Hyperlipämie–Syndrom besteht (THILSTED et al. 1982; WATSON et al. 1992;
68
5. Diskussion
MOORE et al. 1994; DIETZ u. HUSKAMP 1999). Die Probengewinnung gestaltete sich
schwierig, da Ponys sehr selten zur Schlachtung angeliefert werden.
Es standen zusätzlich Ponys zur Verfügung, die im Institut für Physiologische Chemie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover gehalten wurden. Dabei handelte es sich ausnahmslos
um männliche Tiere (Wallache). Bei den Schlachttieren wurden allerdings Gewebeproben
sowohl von männlichen als auch von weiblichen Tieren genommen. Bei den Untersuchungen
im Rahmen dieser Arbeit war eine nach dem Geschlecht getrennte Betrachtung nicht
erforderlich, weil die vergleichende Fettsäurefreisetzung in den Fettgeweben männlicher und
weiblicher Tiere keine Einwirkung des Geschlechts erkennen ließ (s. S. 55, Kapitel 4.5.).
Dieser Sachverhalt wird unter Punkt 5.2.4. (Seite 80) der Diskussion näher erläutert werden.
5.1.2. Schlachtung und Operation
In dem auf die Pferdeschlachtung spezialisierten Betrieb wurden einmal wöchentlich Tiere
zur Gewinnung von Lebensmitteln geschlachtet. Zum Teil wurden diese unmittelbar vor der
Tötung angeliefert, andere waren bereits Tage oder Wochen auf dem Betriebsgelände
eingestallt. Da es sich um einen Familienbetrieb handelt und nur ein kleiner Schlachtraum
vorhanden ist, wurden die Pferde einzeln zur Schlachtung geführt und wie bereits beschrieben
(s. 3.1.3.2. auf Seite 25) getötet. Die Probenentnahme erfolgte direkt nach der Ausweidung
und Teilung der Tierkörper. Bei der Auswahl der Schlachttiere wurden vornehmlich solche
bevorzugt, die schon mehrere Tage im Betrieb eingestallt waren. Bei diesen Tieren war eine
einheitliche Fütterung gewährleistet (s. 3.1.2. S. 24) und somit ein variabler Einfluss der
Fütterung auf die Messwerte nicht anzunehmen.
Bei den Ponys des Instituts für Physiologische Chemie wurden ausreichend große Proben nur
von subkutanem Inguinalfett genommen, nachdem ein Hautschnitt angelegt wurde. Dies war
erforderlich, da eine Probennahme mittels Biopsienadel nicht ausreichend Gewebe geliefert
hätte und ein derartiger Eingriff mit Hinblick auf die Lokalisation (Nähe Penis)
wahrscheinlich von den Probanden nicht ohne Allgemeinnarkose toleriert worden wäre und
diese erheblichem Stress ausgesetzt hätte.
69
5. Diskussion
Zur Durchführung der Vollnarkose wurde eine Kombination aus Romifidin, Diazepam,
Ketamin und Guaifenesin gewählt und im so genannten Triple Drip angewendet. Dies erwies
sich nach eigenen Beobachtungen als sanfte Methode, bei der die Tiere ohne Vorkommnisse
ein ausreichend tiefes Toleranzstadium erreichten, während der gesamten Dauer der
Operation eine ruhige Lage zeigten und nach Beendigung der Infusion rasch erwachten. Die
Aufwachphase gestaltete sich dabei ohne Exzitationen und mit einer schnellen Erholung.
Auf die eventuelle Wirkung der eingesetzten Medikamente auf die für den Fettabbau
wichtigen Parameter wird auf Seite 78 im Abschnitt 5.2.3. eingegangen.
5.1.3. Probenmaterial
Jedem Probanden wurden etwa vier bis fünf Gramm Fettgewebe entnommen. Die Wahl fiel
dabei sowohl auf subkutanes Gewebe aus dem Inguinalbereich als auch auf Bauchhöhlenfett.
Ausschlaggebend für die Entscheidung zur Verwendung der Gewebe beider Lokalisationen
war dabei, dass im hiesigen Institut bereits Studien durchgeführt wurden, die beide Gewebe
betrafen, wobei BREIDENBACH (1996) Inguinalfett nutzte und WRAGE (2002) Bauchfett
bearbeitete. Darüber hinaus können bei gleichzeitigem Einsatz in der gleichen Studie evtl.
Unterschiede der beiden Lokalisationen hinsichtlich der lipolytischen Aktivitäten aufgedeckt
werden (s. S. 83 Kapitel 5.2.5.).
Auch CARPENE et al. beschrieben 1994 die Anwendung von subkutanem Inguinalfett für
Lipolysestudien beim Meerschweinchen. Eine Vielzahl von Autoren (u. a. NILSSON u.
BELFRAGE 1979; FREDRIKSON et al. 1981; SZTALRYD u. KRAEMER 1994 a;
FARIAS–SILVA et al. 1999) verwendete für ihre Lipolyseuntersuchungen epididymales
Fettgewebe der Ratte. Diese Lokalisation wurde v. a. deshalb beprobt, weil die Gewinnung
von Fettgewebe sehr leicht und schnell erfolgen kann. Depotfett aus dieser Region steht bei
Pferden jedoch nicht zur Verfügung, sondern stellt vielmehr eine Besonderheit bei Nagetieren
(POND 1987) dar.
70
5. Diskussion
5.1.4. Isolierung der Adipocyten
Die von RODBELL (1964) geschilderte Methode ist ein gängiges Verfahren zur Gewinnung
vereinzelter Zellen, das in der Literatur von einer Vielzahl von Autoren, darunter NILSSON
und BELFRAGE (1979), LANGIN et al. (1992), MORIMOTO et al. (2001) und auch zur
Separation von humanen Fettzellen (BURNS et al. 1972; WAHRENBERG et al. 1987;
KATHER 1988) beschrieben wurde.
Aufgrund der Dauer des Transports der Proben vom Schlachtbetrieb zum Labor erfolgte die
Isolierung der Fettzellen aus Schlachtmaterial im Vergleich zum operativ im hiesigen Institut
entnommenen Gewebe, welches unmittelbar nach der Gewinnung bearbeitet werden konnte,
mit einer zeitlichen Verzögerung von z.T. fünf Stunden. Es musste deshalb nach der
Vereinzelung der Zellen deren Lebensfähigkeit überprüft werden. Die durchgeführte
Live / dead-Färbung, die dem Nachweis der Lebensfähigkeit von Zellen dient, zeigte aber
eindeutig eine hohe Integrität der Adipocyten mit einem nur geringen Anteil toter Zellen (s.
Abb. 6 S. 29).
Abweichend von der nach BREIDENBACH (1996) geschilderten Durchführung der Methode
zum Isolieren der Fettzellen (Separieren der Adipocyten bei Zimmertemperatur) wurde dieser
Teil der Versuche im Brutraum bei einer Temperatur von 37°C vorgenommen.
Von ROCHON u. BUKOWIECKI (1990) wurde ein Einfluss niedriger
Umgebungstemperaturen auf die Lipolyse beschrieben. Die Autoren stellten eine Abnahme
der Sensitivität von Adipocyten gegenüber Catecholaminen fest, nachdem die Zellen von
Ratten gewonnen wurden, die sieben Tage lang einer Temperatur von 5°C ausgesetzt waren.
Für die Sensitivität gegenüber Dibutyryl–cAMP war in ihren Untersuchungen kein Einfluss
unterschiedlicher Umgebungstemperaturen nachweisbar.
Da die Lipolyse in der vorliegenden Studie nicht nur mit DBcAMP, sondern vergleichend
auch mit NA als Vertreter der Catecholamine stimuliert werden sollte, musste ein möglicher
Kälteeinfluss vermieden werden. Das Fehlen einer derartigen Einwirkung konnte aber für die
eigenen Versuche einerseits nicht gänzlich ausgeschlossen werden, weil oben genannte
Autoren die Auswirkungen der niedrigeren Temperaturen auf die Spaltung der Triglyceride
erst nach sieben Tagen überprüften und aus ihren Ergebnissen nicht hervorgeht, ob eine
frühere Beeinträchtigung der Lipolyse zu erwarten ist. Andererseits war der Einfluss einer
71
5. Diskussion
Umgebungstemperatur unterhalb 37°C auf die Spaltung von Fetten in dieser Arbeit nicht sehr
wahrscheinlich, da BREIDENBACH (1996) die Proben bei einer Temperatur < 37°C
bearbeitete und nicht über eine nachteilige Beeinflussung berichtete. Darüber hinaus waren
die für diese Studie beprobten Tiere nicht dauerhaft einer Temperatur von 5°C ausgesetzt.
Dennoch erfolgte das Separieren der Zellen im Brutraum, um möglichst konstant
physiologische Bedingungen einzuhalten.
Wegen der großen Empfindlichkeit von Fettzellen bedurfte die Bearbeitung höchster Sorgfalt.
So wurden sowohl für die Isolierung als auch für die Messungen der Lipolyserate
Plastikbehältnisse (Küvetten aus Acryl) verwendet, da dieses Material im Gegensatz zu Glas,
wie schon von RODBELL (1964) beschrieben, schonender für die Adipocyten ist,
wohingegen Oberflächen aus Glas einem Großteil der Zellen Membranschäden zufügte.
Die Carbogenbegasung erforderte ebenfalls ein hohes Maß an Sorgfalt und wurde für jeden
Ansatz neu reguliert, da ein zu starkes Aufwirbeln der Suspension ebenso zu Brüchen der
Adipocytenmembranen führte, was dann an einer über den Zellen schwimmenden homogenen
Fettschicht erkennbar war.
5.1.5. Bestimmung der Lipolyserate
Zur Messung der Lipolyse stehen einige Verfahren zur Verfügung.
So wird in der Literatur oftmals die Freisetzung von Glycerol aus Fettzellen in das
Inkubationsmedium beschrieben (ROCHON u. BUKOWIECKI 1990; LANGIN et al. 1992;
MORIMOTO et al. 2001) und NILSSON u. BELFRAGE (1979) entwickelten eine Methode,
bei der die Lipolyse über pH-stat-Titration gemessen wurde. Dabei werden die aus den
stimulierten Adipocyten zusammen mit einer äquivalenten Menge Fettsäuren abgegebenen
Protonen mit NaOH titriert. Die Menge NaOH, die benötig wird, um den vorher eingestellten
pH-Wert des Mediums konstant zu halten, entspricht dabei der Menge freigesetzter
Fettsäuren.
Bei all diesen Bestimmungsmöglichkeiten werden jedoch Adipocyten von Ratten verwendet,
so dass eine Methode entwickelt werden musste, die auch bei equinen Zellen angewendet
72
5. Diskussion
wird. Diese wurde erstmals von BREIDENBACH (1996) etabliert und kommt ebenfalls in der
vorliegenden Studie zum Einsatz. Hierbei wird die Fettsäurefreisetzung aus Adipocyten durch
die sich ergebende Abnahme des pH–Wertes (s.o.) fluorophotometrisch über das
pH–sensitive Fluorochrom SNAFL-1 bestimmt.
Zwar besteht ein inhibierender Einfluss von niedrigen pH–Werten auf die Lipolyse, der
sowohl in vitro (HJEMDAHL u. FREDHOLM 1976, 1977; FAIN u. SHEPHERD 1975) als
auch in vivo (HJEMDAHL u. FREDHOLM 1974) auftritt. Diesen stellte BREIDENBACH
(1996) in seinen Versuchen jedoch nicht fest und konnte ihn für seine Untersuchungen
ausschließen, obwohl die Messungen über einen Zeitraum von zwei Stunden andauerten.
In der eigenen Studie haben sich in einigen Versuchen teilweise gegen Ende der Messung
(110-120 Minuten) abfallende Kurvenverläufe ergeben, die darauf zurückzuführen sein
könnten, dass die Lipolyserate aufgrund des niedrigen pH–Wertes im Medium abnahm.
Bedeutend für die Fettsäurefreisetzung in das umgebende Medium ist weiterhin dessen
Albuminkonzentration. Albumin stellt seinerseits einen Puffer dar, der Fettsäuren zu binden
vermag. Eine zu hohe Konzentration würde die Messungen aufgrund der Pufferwirkung
verfälschen. Andererseits ist seine Anwesenheit jedoch erforderlich, da die FS über die
Bindung an Albumin aus der Fettzelle hinaustransportiert werden. Ohne Albumin findet keine
Fettsäurefreisetzung aus den Zellen statt (MEISNER u. TENNEY 1977).
Gemäß der früheren Ergebnisse von BREIDENBACH (1996) konnte eine niedrige
Albuminkonzentration (BSA) von 0,5% im Inkubationsmedium eingehalten werden, wobei
FS freies BSA (FS ≤ 0,02%) verwendet wurde.
5.2. Versuchsergebnisse
5.2.1. Die Lipolyserate
Die Messung der Lipolyserate in den Kontrollansätzen, die keine stimulierenden Agenzien im
Inkubationsmedium enthielten, ergab keine Änderung der relativen Fluoreszenz. Dieses
Resultat war zu erwarten, denn schon NILSSON und BELFRAGE (1979) und
BREIDENBACH et al. (1998, 1999) beobachteten bei ihren Untersuchungen weder in
73
5. Diskussion
Adipocyten von Ratten noch Pferden oder Ponys eine Fettsäurefreisetzung ohne vorherige
Stimulation der Lipolyse beispielsweise durch NA.
Die Messungen im NA-stimulierten Ansatz erfolgten gemäß BREIDENBACH (1996, 1998,
1999), der die Lipolyseraten vergleichend anhand von Rattenadipocyten und Fettzellen von
Großpferd bzw. Pony untersuchte und diese mit NA stimulierte, bei gleichzeitigem
Vorhandensein von ADA im Inkubationsmedium. Dabei beobachtete er, dass zur Messung
einer Fettsäurefreisetzung die alleinige Zugabe von NA zum Testansatz bei den Rattenzellen
ausreichend war. Selbiges ergab sich für Adipocytensuspensionen von Ponys. Dagegen war
bei den Zellen der Großpferde im NA-haltigen Ansatz keine Fettsäurefreisetzung messbar.
Hier bedurfte es darüber hinaus dem Hinzufügen von ADA zum Medium, um den
antilipolytischen Einfluss des sich in Fettzellsuspensionen anreichernden Adenosins
(KATHER 1988) auszuschalten.
Adenosin stellt ein Nukleosid dar, das über eigene Rezeptoren (A1-Rezeptoren) auf der
Oberfläche der Fettzellen eine inhibierende Wirkung auf die Lipolyse ausübt, indem durch
seine Bindung der intrazelluläre cAMP-Gehalt durch Hemmung der Adenylatcyclase gesenkt
wird (LONDOS et al. 1980).
Eine Anreicherung von Adenosin während der Inkubation von Fettzellen ist laut KATHER
(1988) unvermeidbar, da aus isolierten und geschädigten Zellen kontinuierlich
Adeninnukleotide abgegeben und diese außerhalb der Zellen durch Nukleotidasen zu
Adenosin metabolisiert werden. Dies führt zu seiner Anreicherung im umgebenden Medium.
Dabei ist das Ausmaß der Adenosinakkumulation abhängig von der Zelldichte im Testansatz
(KATHER 1988).
Der Adenosinantagonist ADA verdrängt Adenosin enzymatisch von seinen Rezeptoren
(SHECHTER 1982).
Auch Adipocyten von Ponys steigern bei Zusatz von ADA zum Inkubationsmedium ihre
Lipolyserate (BREIDENBACH et al. 1999). Um für die eigenen Versuche gleiche
Voraussetzungen für die Messung der Fettsäurefreisetzung zu schaffen und dabei eine
möglichst große Änderung der relativen Fluoreszenz messen zu können, wurde sowohl den
Ansätzen aus Pferdeadipocyten als auch denen aus Fettzellen der Ponys der
74
5. Diskussion
Adenosinantagonist hinzugefügt. Dabei wurde stets die gleiche Menge ADA eingesetzt, da
die Neigung der Verlaufskurven über die Fettsäurefreisetzung gemäß BREIDENBACH et al.
(1998) nicht durch unterschiedliche Konzentrationen beeinflusst wird.
Darüber hinaus macht die graphische Darstellung des Verlaufs der Lipolyse in NA-
stimulierten Testansätzen (Abb. 10 und 11) eine höhere Fettsäurefreisetzung bei Ponyzellen
im Gegensatz zu Adipocyten der Großpferde deutlich. Dieses Ergebnis der eigenen
Untersuchungen deckt sich mit den Aussagen von BREIDENBACH et al. (1998, 1999), die
ebenfalls von einer besseren Stimulierbarkeit der Ponyfettzellen mit NA berichteten. Sie
führen dies darauf zurück, dass der Gehalt an Adenosin in den Suspensionen aus Fettzellen
von Ponys entweder nicht ausreichend ist, um die Lipolyse zu hemmen oder diese Zellen
nicht sensitiv genug für den hemmenden Einfluss des Nukleosids sind. Diese These ist
durchaus schlüssig, berichten doch u.a. SHECHTER (1982), MERSMAN (1992) und
GOKMEN-POLAR et al. (1996) über Unterschiede hinsichtlich der Sensitivität gegenüber
Adenosin zwischen verschiedenen Spezies. BREIDENBACH et al. (1998) stimulierten
Rattenadipocyten ebenfalls nur mit NA und verzeichneten eine deutliche Fettsäurefreisetzung.
Auch Zellen dieser Spezies scheinen offensichtlich nicht auf die Gegenwart von ADA im
Inkubationsmedium angewiesen zu sein, was darauf hindeutet, dass sie hierfür weniger
empfindlich sind oder die stimulierenden Agenzien eine höhere Aktivierungspotenz
aufweisen. Diese Aussage wird durch Ergebnisse von GOKMAN-POLAR et al. (1996)
gestützt.
Nach Zugabe von ADA zum Inkubationsmedium ermittelten BREIDENBACH et al. (1999)
auch für die Ponyfettzellen eine deutlich höhere Lipolyserate verglichen mit der aus den
Messungen an Adipocyten von Großpferden.
Im Rahmen dieser Studie wurde zusätzlich ein Vergleich von Kontrollen, NA / ADA- und
DBcAMP- Ansätzen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 22-25 im Kapitel
4.7. dargestellt.
75
5. Diskussion
Die oben genannte Beobachtung, dass Ponyzellen stärker auf eine Anregung mit NA / ADA
reagieren als Fettzellen von Großpferden, scheint auf eine DBcAMP-vermittelte Stimulation
der Adipocyten nicht zuzutreffen, wurden doch in der vorliegenden Studie für die genannten
Ansätze ähnliche Lipolyseraten ermittelt.
Dennoch ergaben sich Unterschiede zwischen BREIDENBACHS und den eigenen
Untersuchungen in Bezug auf die Lipolyserate in den mit NA stimulierten Testansätzen.
Während er eine lineare Fettsäurefreisetzung über 120 Minuten messen konnte, war ein
Anstieg der Verlaufskurven in den eigenen Versuchen mit einer Verzögerung erst nach 50 bis
60 Minuten zu verzeichnen. Auch HONNOR et al. (1985) erwähnen eine derartige lag-Phase,
welche von BREIDENBACH et al. (1998) mit der Akkumulation von Adenosin im
Testansatz in Verbindung gebracht wird. Diese Erklärung erscheint jedoch für die vorliegende
Studie unwahrscheinlich, da diese Verzögerung nicht nur bei den Zellen der Großpferde
auftrat, sondern auch bei Adipocytensuspensionen der Ponys, obwohl sich diese als
weitgehend unbeeinflusst von Adenosin bezüglich ihrer Lipolyserate erwiesen haben
(BREIDENBACH et al. 1999). Ein anderer Erklärungsansatz für die verspätet einsetzende
Fettsäurefreisetzung in den eigenen Versuchen gilt dem verwendeten BSA. BSA besitzt
Puffereigenschaften und verfügt über mehrere Bindungsstellen für Fettsäuren (SPECTOR u.
FLETCHER 1978; BREIDENBACH 1996). BREIDENBACH (1996) verwendete ein
Albumin mit einem Restfettsäuregehalt von 0,1 %, in dieser Studie kam ein BSA mit
geringerem Gehalt, nämlich < 0,02 % zum Einsatz. Es wäre also denkbar, dass dieses
Albumin über mehr freie Bindungsstellen verfügt und folglich mehr Fettsäuren aufnimmt,
bevor diese als FFS über das Messsystem detektiert werden können und so eine Änderung der
relativen Fluoreszenz deutlich wird.
Des Weiteren kann derzeit nicht ausgeschlossen werden, dass die Charge des eingesetzten
Farbstoffes aufgrund von Schädigungen bei der Lagerung an Intensität gegenüber pH-
Wertverschiebungen eingebüßt hatte.
76
5. Diskussion
5.2.2. DBcAMP als Stimulans der Lipolyse
In dieser Arbeit wurden die Raten der Fettsäurefreisetzungen auch nach Zugabe von drei
unterschiedlichen Konzentrationen DBcAMP, nämlich 0,5 mM, 1,0 mM und 1,5 mM, zu den
entsprechenden Testansätzen miteinander verglichen. Die im Anschluss an die Messungen
erstellten Graphen zeigten einen wenig unterschiedlichen, beinahe parallelen Verlauf, was
darauf schließen ließ, dass die Lipolyserate durch steigende DBcAMP-Konzentrationen im
Medium nicht wesentlich erhöht werden kann. Folglich kam bei allen Messungen die mittlere
Konzentration von 1,0 mM DBcAMP zum Einsatz. Diese ist gleichzeitig die in der Literatur
am häufigsten beschriebene und von den Autoren verwendete Konzentration (BURNS et al.
1972; WAHRENBERG et al. 1989; TAVERNIER et al. 1995; BOUSQUET-MELOU et al.
1999; FARIAS-SILVA et al. 1999; PORTILLO et al. 1999; MORIMOTO et al. 2001), wobei
jedoch auch niedrigere (GOKO et al. 1984; HELLMER et al. 1992) bzw. höhere
Konzentrationen erwähnt werden (ROCHON u. BUKOWIECKI 1990).
Die Unterschiede der Lipolyseraten in Abhängigkeit von der DBcAMP-Konzentration haben
sich für die eigenen Versuche als nicht signifikant erwiesen. Ob hohe DBcAMP-Gehalte im
Inkubationsmedium, wie bspw. 5 mM (ROCHON u. BUKOWIECKI 1990) die Lipolyserate
tatsächlich in entscheidendem Maße erhöht hätte, kann hier nicht geklärt werden, da alle oben
genannten Autoren die Lipolyserate über die steigende Freisetzung von Glycerol im Medium
ermittelt haben, in der vorliegenden Studie jedoch die Fettsäurefreisetzung über den Abfall
des pH-Wertes detektiert wurde. Die resultierenden Graphen sind somit nicht unmittelbar
miteinander vergleichbar.
Das verwendete DBcAMP war für die Versuche besonders geeignet, da es durch die beiden
Butyrylgruppen genügend lipophil ist und ihm dadurch die Penetration von biologischen
Membranen möglich ist (BLECHER et al. 1970).
77
5. Diskussion
5.2.3. Lipolyseraten bei Schlachtponys und anästhesierten Ponys
Beim Vergleich der Lipolyseraten zwischen Geweben aus geschlachteten und narkotisierten
Ponys fiel auf, dass sowohl in NA-haltigen wie auch in DBcAMP-stimulierten Testansätzen
von in Narkose gewonnenen Zellen eine signifikant höhere Fettsäurespaltung ablief als bei
den von Schlachttieren entnommenen Gewebeproben.
Es lag die Vermutung nahe, dass diese erhöhte Lipolyserate auf den Einfluss der zur Narkose
eingesetzten Medikamente zurückzuführen sein könnte.
Tatsächlich berichten ADAMS et al. (1992, 1994) über eine derartige Beeinflussung beim
Menschen und von einer deutlichen Stressreaktion unter Ketaminnarkose. Sie stellten
signifikant höhere Werte für Adrenalin, NA, ACTH, Cortisol und freies Glycerol im Plasma
der Probanden fest als vor der Narkose.
Die ersten vier Substanzen sind nachweislich dazu in der Lage, die Lipolyse bei Säugern,
inklusive des Menschen, zu stimulieren (WATSON u. LOVE 1994; SAHLEH et al. 1999).
Wie man jedoch den Untersuchungen von TAYLOR et al. (1995) und LUNA et al. (1996)
entnehmen kann, die zur Narkose ihrer Versuchsponys eine Kombination aus Detomidin,
Ketamin und Guaifenesin verwendeten, geht von diesen Pharmazeutika keine positive
Einwirkung auf die Lipolyse aus. Anhand von Blutproben wurden vor, während und nach der
Narkose neben anderen die Plasmagehalte von Cortisol und Catecholaminen gemessen.
Jedoch ergaben sich für letztere aufgrund fehlender sympathischer Stimulation während der
Narkose keine Veränderungen und die Konzentration an Cortisol nahm signifikant ab.
Das beschriebene Narkoseregime verursachte darüber hinaus eine Hyperglycämie, von der
vermutet wird, dass sie eine normale Reaktion der Nebennierenrinde auf Stress verhindert
(TAYLOR et al. 1995), was eine sinkende Cortisolkonzentration erklären würde.
In der vorliegenden Studie wurde statt Detomidin Romifidin eingesetzt, das jedoch der
gleichen Wirkstoffgruppe entstammt. Basierend auf den genannten Ergebnissen von
TAYLOR et al. (1995) wird für die eigenen Versuche eine stimulierende Wirkung der
Narkosemittel als Begründung für die gesteigerte Fettsäurefreisetzung in der Gruppe der
operierten Ponys ausgeschlossen.
78
5. Diskussion
Ein weiterer Ansatzpunkt zur Erklärung ist die Tatsache, dass die zur Operation
herangezogenen Tiere bereits mehr als zwölf Stunden zuvor einer erheblichen Stresssituation
ausgesetzt waren. Ihnen wurde bereits am Nachmittag des Vortages das Futter entzogen und
die Einstreu aus der Box entfernt, während die Stallgefährten weiterhin die normale Ration
erhielten. Dieses Vorgehen erzeugte zweifelsohne mentalen Stress, was darauf schließen lässt,
dass das jeweils betroffene Tier schon vor Einleitung der Narkose eine erhöhte
Fettmobilisation aufgewiesen haben könnte. Denn durch Stress wird die Nebenniere aktiviert
und aus der Rinde Cortisol freigesetzt, welches die Lipolyse stimuliert und darüber hinaus die
Effektivität von zirkulierendem Insulin reduziert, so dass seine antilipolytische Wirkung
aufgehoben wird (JEFFCOTT u. FIELD 1985 a; MOGG u. PALMER 1995).
Die eingangs angeführte These wird gestützt durch die Ergebnisse von FARIAS-SILVA et al.
(1999), die die Lipolyserate an Ratten untersuchten, welche zuvor erheblichem Stress in Form
von Elektroschocks unterzogen worden waren. Sowohl basale als auch stimulierte Lipolyse
waren bei den gestressten Tieren deutlich höher als bei den Kontrolltieren. Es ist nicht
auszuschließen, dass sich diese Erkenntnisse auf Ponyfettzellen übertragen lassen, da sich die
Adipocyten beider Spezies in BREIDENBACHS (1996, 1998) Arbeiten ähnlich verhielten.
JEFFCOTT u. FIELD (1985 a) nennen des Weiteren operative Eingriffe als Ursache für eine
erhöhte Triglyceridmobilisation durch Stressinduktion.
Auch GOLENZ et al. (1992) erwähnen Stress als Auslöser für die Sekretion von Adrenalin,
NA, ACTH und Glucagon, die die Lipolyse über eine Aktivierung der HSL vorantreiben.
Außerdem führt Stress beim Menschen über Aktivierung des sympathischen Nervensystems
zu einer deutlichen Erhöhung der lipolytischen Aktivität im Fettgewebe, wobei sowohl
mentaler (HAGSTRÖM-TOFT et al. 1993) als auch physischer Stress (WAHRENBERG et
al. 1987; ARNER et al. 1990) dies auslösen können.
FORHEAD et al. (1995) berichten von gefasteten Eseln, bei denen ebenfalls erhöhte
Cortisolwerte im Plasma gemessen wurden, ähnlich wie bei Ponys (FREESTONE et al.
1992).
Darüber hinaus könnte das Fasten die institutseigenen Ponys bereits in eine negative
Energiebilanz geführt haben, woraus ebenfalls eine Triglyceridmobilisierung aus Fettgewebe
durch die HSL resultiert (MOGG u. PALMER 1995).
79
5. Diskussion
Ob bei den Institutsponys die Plasmawerte der genannten, die Fettmobilisation fördernden
Mediatoren vor der operativen Probenentnahme erhöht waren, kann hier abschließend nicht
bewiesen werden, weil keine Blutproben zu deren Bestimmung entnommen wurden.
Im Vergleich zu den operierten Tieren waren die geschlachteten Ponys weniger Stress
ausgesetzt, weil die Mehrzahl der Probanden bereits Tage oder Wochen vor der Schlachtung
in den betriebseigenen Stallungen untergebracht und daher mit der Umgebung vertraut waren.
Außerdem wurden sie weiterhin gefüttert.
Gerade bei den unmittelbar vor der Schlachtung angelieferten Tieren lässt sich eine
Stresseinwirkung dennoch nicht völlig ausschließen, angemerkt seien hier besonders der
Transportstress und seine Folgen auf die Fettmobilisation (FORHEAD et al. 1995), welche
jedoch möglicherweise über eine zu kurze Zeitspanne einwirkte, als dass sie über eine erhöhte
Lipolyse in den Messungen deutlich geworden wäre.
5.2.4. Der Einfluss des Geschlechts auf die Lipolyserate
Vom equinen Hyperlipämie-Syndrom sind vor allem Stuten betroffen (THILSTEDT et al.
1982; JEFFCOTT u. FIELD 1985 a; WATSON u. LOVE 1994), Hengste dagegen selten, und
Wallache scheinen eine mittlere Stellung zwischen beiden Geschlechtern einzunehmen
(FÜRLL u. SCHÄFER 1992).
Aufgrund dieser Erscheinung sollte in dieser Arbeit in einem Vergleich der Lipolyseraten
zwischen männlichen und weiblichen Tieren zu klären versucht werden, inwieweit das
Geschlecht die Fettmobilisation bestimmt. Die Untersuchungen konnten jedoch dahingehend
keinen Aufschluss bringen. Ein signifikanter Unterschied in dem Ausmaß der
Fettsäurefreisetzung zwischen Stuten und Wallachen konnte nicht ermittelt werden. Dabei
muss aber berücksichtigt werden, dass die Studie in vitro erfolgt ist, was keinen endgültigen
Schluss auf die in vivo-Verhältnisse zulässt.
Vielfach wird das gehäufte Auftreten bei Stuten mit der hormonellen Ausstattung der Tiere in
Verbindung gebracht, wobei besonders das Progesteron in Betracht gezogen wird (FÜRLL u.
SCHÄFER 1992). Dieses Hormon inhibiert die antilipolytische Wirkung des Insulins
80
5. Diskussion
(TARRANT et al. 1998; SCHMIDT et al. 2001), so dass sein hemmender Einfluss auf die
Triglyceridspaltung über eine Hemmung der Aktivität der HSL entfällt (PERLEY u. KIPNIS
1966; JEFFCOTT u. FIELD 1985 b; MOGG u. PALMER 1995; SCHMIDT et al. 2001) und
FS vermehrt aus dem Gewebe abgegeben werden können. Beim Menschen ist der
Progesterongehalt abhängig vom Zyklus, wobei die Werte in späteren Zyklusphasen ansteigen
(REBUFFE-SCRIVE et al. 1985). Auch den Östrogenen kommt eine stimulierende Wirkung
bezüglich der Lipolyse zu (SALEH et al. 1999).
Bei tragenden Stuten muss darüber hinaus die Bedeutung des Prolaktins beachtet werden, das
die Aktivität der LPL induziert (WATSON et al. 1993), woraus ein weiterer Anstieg der
NEFA im Blut resultiert, sofern deren Internalisierung in die Zielzellen nicht mit der
Freisetzungsrate korreliert. Eine positive Beeinflussung der Lipolyseraten durch Prolaktin
kann für die vorliegende Studie jedoch ausgeschlossen werden, da keine tragenden Tiere der
Schlachtung zugeführt worden sind und Gewebeproben somit nicht verfügbar waren.
Die Rolle des Geschlechts bezüglich der Fettmobilisation in humanen Adipocyten wird
kontrovers diskutiert. RICHELSEN (1986) fand in seinen Untersuchungen eine signifikant
höhere basale Lipolyserate bei Frauen als bei Männern und auch die Stimulation mit dem
β-Agonisten Isoproterenol zeigte bei weiblichen Probanden eine signifikant höhere
lipolytische Wirkung als bei männlichen. Dasselbe Ergebnis erhielt der Autor nach
Stimulation der α-Rezeptoren, wodurch eine Hemmung der Triglyceridspaltung ausgelöst
wird. Dieser Effekt war bei Frauen ebenfalls stärker als bei Männern, was auf den höheren
α-Rezeptorenbesatz der weiblichen Fettzellen zurückgeführt wurde. Auf den Adipocyten
beider Geschlechter ließen sich dagegen gleich viele β-Rezeptoren nachweisen.
Eine gegenteilige Feststellung machten HELLMER et al. (1992), die keine
geschlechtsspezifischen Unterschiede bezüglich der Lipolyse an menschlichen Fettzellen
beobachteten. Dieses Ergebnis könnte mit der Tatsache in Zusammenhang stehen, dass in
beiden Arbeiten Gewebe unterschiedlicher Lokalisationen verwendet wurden, die
unterschiedliche lipolytische Aktivität besitzen (TAVERNIER et al. 1995; BOUSQUET-
MELOU et al. 1999). Auch die Bedingungen der Probenentnahme variierten.
Ob der fehlende Geschlechtseinfluss in der vorliegenden Studie auf den Rezeptorenbesatz der
Zellen zurückzuführen ist, kann weder bestätigt noch ausgeschlossen werden, da derartige
81
5. Diskussion
Untersuchungen nicht durchgeführt worden sind. Von WRAGE (2002) wurde zwar ein
größerer Besatz der Zellmembranen der Pferde mit β-Rezeptoren nachgewiesen,
vergleichende Studien zur Anzahl der α-Rezeptoren liegen jedoch noch nicht vor. Des
Weiteren wurden von WRAGE (2002) nur Wallache beprobt, so dass kein Vergleich
zwischen den Geschlechtern gezogen werden kann.
Weiterhin sind Adipocyten von Frauen in einigen Körperregionen größer als die der Männer
(REBUFFE-SCRIVE et al. 1985) und auch die Menge des Fettgewebes überwiegt häufig bei
Frauen (REBUFFE-SCRIVE et al. 1985; RICHELSEN 1986), trotz vergleichbarer
Körpergewichte der in diesen Arbeiten getesteten Personengruppen.
Es ist bekannt, dass sowohl die Anzahl der Adipocyten als auch ihre Größe den Verlauf der
Fettsäurefreisetzung aus dem Gewebe bestimmen (ARNER u. ÖSTMAN 1978; ARNER et al.
1979; BRAY et al. 1977; ARNER et al. 1981), wobei die Größe der Zellen mit der
intrazellulären cAMP-Konzentration und der resultierenden Lipolyserate positiv korreliert ist
(ARNER u. ÖSTMAN 1978; GRUEN et al. 1980).
Über die Größe der in dieser Studie verwendeten Zellen kann keine Aussage gemacht werden.
Es ist zwar erwiesen, dass Adipocyten der Ponys größer sind als die der Pferde (WRAGE
2002), jedoch fehlt auch hier ein geschlechtsspezifischer Vergleich. Die in der vorliegenden
Untersuchung ermittelten annähernd gleichen Lipolyseraten bei Stuten und Wallachen
sprechen eher gegen verschieden große Fettzellen bei den Geschlechtern.
Die Tatsache, dass die Wirkung des Geschlechts auf die Fettmobilisation in dieser Arbeit
nicht aufgetreten ist, könnte darauf zurückgeführt werden, dass keine Hengste, sondern
Wallache für die Untersuchungen herangezogen worden sind, die keinem Testosteroneinfluss
unterliegen.
82
5. Diskussion
5.2.5. Einfluss der Lokalisation des Fettgewebes auf die Lipolyserate
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte auch ein möglicher Einfluss der Lokalisation des
untersuchten Fettgewebes auf die Lipolyserate von equinen Adipocyten nach Stimulation mit
DBcAMP ermittelt werden. Diesbezüglich sind Unterschiede für verschiedene Spezies in der
Literatur diskutiert worden. Die grundlegende Erkenntnis dabei ist, dass sich Fettgewebe aus
dem Inneren der Bauchhöhle als lipolytisch aktiver als subkutanes Fett erwiesen hat
(SZTALRYD u. KRAEMER 1994 a; TAVERNIER et al. 1995; BOUSQUET-MELOU et al.
1999).
Für die Situation beim Menschen liegen widersprüchliche Berichte vor.
Von einigen Autoren wurde übereinstimmend eine höhere basale Lipolyse im subkutanen
Fettgewebe als im abdominalen Gewebe ermittelt, während sich die Hormon-stimulierte
TGL-Spaltung als signifikant stärker in Gewebeproben des Bauchhöhlenfettes erwies
(EFENDIC 1970; KATHER et al. 1977; LAFONTAN et al. 1979; SMITH et al. 1979;
ENGFELDT u. ARNER 1988; SZTALRYD u. KRAEMER 1994 a; ARNER 1995; SALEH et
al. 1999). Dabei wurde vor allem die Stimulation mit NA betrachtet.
ÖSTMAN et al. (1979) stellten zwar ebenfalls eine stärkere lipolytische Aktivität nach
Inkubation der Zellen mit NA im Bauchfett im Gegensatz zum subkutanen Gewebe fest,
kamen darüber hinaus jedoch entgegen oben genannter Autoren zu dem Ergebnis, dass die
basale Lipolyserate in abdominalen Zellen bereits höher ist als in subkutanen Adipocyten.
Diese regionalen Unterschiede der Gewebe in ihrer lipolytischen Aktivität werden auf einen
verschieden starken Besatz mit β-AR-Subtypen zurückgeführt. Da diese Rezeptoren auf
Zellen des abdominalen Gewebes in höherer Dichte vorkommen, können Catecholamine im
Bauchfett stärker lipolytisch wirken als in Proben aus subkutanem Gewebe (WAHRENBERG
et al. 1989; HELLMER et al. 1992). Über verschiedene Verteilungen der β-AR wird auch
beim Hund berichtet (TAOUIS et al. 1987).
HELLMER et al. (1992) untersuchten des Weiteren die Fettsäurefreisetzung nach Inkubation
der Adipocyten mit DBcAMP. Sie stellten dabei keine signifikanten regionalen Unterschiede
in der lipolytischen Aktivität der Zellen fest und bestätigten damit frühere Ergebnisse von
83
5. Diskussion
WAHRENBERG et al. (1989). In ihren Studien blieben Unterschiede aufgrund der gewählten
Lokalisation nach Stimulation mit Mediatoren, die distal der Rezeptoren wirken, darunter
DBcAMP, ebenfalls aus.
Bei Ratten stellen sich verglichen mit humanen Fettzellen z.T. umgekehrte Verhältnisse dar.
Laut SZTALRYD u. KRAEMER (1994 a) weisen subkutane Adipocyten dieser Spezies im
Gegensatz zu Fettdepots aus dem Inneren des Körpers eine verminderte basale Lipolyserate
auf. Außerdem ist die Aktivität der HSL bei diesen Tieren sowohl im epididymalen als auch
im retroperitonealen Fettgewebe größer als in subkutanen Zellen. Das Gleiche gilt für die
Rate der HSL-Synthese, und die Autoren begründen dies mit der geringeren Expression von
HSL-Genen im subkutanen Fettgewebe.
Ähnliche Erkenntnisse bezüglich der Ratte gewannen LACASA et al. (1991), die Fettzellen
aus dem Parametrium mit Adipocyten aus subkutanem Gewebe vergleichend untersuchten. Es
ergab sich eine niedrigere cAMP-Produktion in den subkutanen Fettzellen und außerdem eine
geringere Anzahl an β-AR begleitet von einer reduzierten lipolytischen Aktivität dieses
Gewebes. TAVERNIER et al. (1995) bestätigten die Angaben hinsichtlich des Besatzes der
Adipocytenmembran des subkutanen Gewebes mit β-Rezeptoren und der Aktivität der HSL.
Eine wechselnde Reaktionsfähigkeit von Geweben unterschiedlicher Lokalisationen
gegenüber β-Agonisten ist auch beim Kaninchen gegeben (LANGIN et al. 1992). So ist die
lipolytische Aktivität nach Stimulation mit verschiedenen Mediatoren, inklusive DBcAMP,
bei diesen Tieren in retroperitonealem Fettgewebe signifikant höher als in Inguinalfett
(BOUSQUET-MELOU et al. 1999).
In der hier vorliegenden Studie konnte in der Gruppe der Großpferde kein Unterschied in
Bezug auf die freigesetzten FS zwischen Bauchhöhlen- und Inguinalfettgewebe nach
Inkubation der Zellen mit DBcAMP ermittelt werden. Diese Adipocyten gleichen damit
denen des Menschen, die ebenfalls in beiden genannten Lokalisationen keine bedeutenden
Unterschiede in der TG-Mobilisation zeigten (WAHRENBERG et al. 1989).
Bei den Ponys hingegen ergab sich für die Proben aus Bauchfettgewebe eine signifikant
höhere Lipolyserate als im Inguinalfettgewebe. Einerseits stimmt dieser Befund mit den in der
84
5. Diskussion
Literatur dokumentierten Ergebnissen überein (Bauchfettgewebe ist lipolytisch aktiver als
Inguinalfettgewebe bzw. subkutanes Fett, siehe oben). Andererseits scheinen sich die
Adipocyten der Ponys dahingehend von humanen Fettzellen zu unterscheiden, dass die Zellen
des Bauchfettgewebes nach DBcAMP-Zugabe deutlich mehr FS freisetzen als subkutane
Zellen aus dem Inguinalbereich. Bei menschlichen Zellen bestehen dagegen keine regionalen
Unterschiede nach DBcAMP-Zusatz zum Inkubationsmedium (WAHRENBERG et al. 1989;
HELLMER et al. 1992). Adipocyten der Ponys gleichen aber in ihrem Verhalten denen der
Ratte. Zellen beider Spezies zeichnen sich durch eine bessere Stimulierbarkeit mit
Catecholaminen gegenüber denen der Großpferde aus (BREIDENBACH et al. 1998, 1999).
Darüber hinaus wurde in Rattenzellen eine höhere Aktivität und Synthese der HSL in
Fettzellen aus dem Bereich der Bauchhöhle als aus subkutanem Gewebe nachgewiesen
(SZTALRYD u. KRAEMER 1994 a; TAVERNIER et al. 1995). Aufgrund der vorliegenden
Ergebnisse ist anzunehmen, dass sich die Adipocyten von Ratten und Ponys hinsichtlich der
Lipolyseaktivitäten ähneln. Die bessere Ansprechbarkeit auf DBcAMP in Bauchhöhlenfett
kann nicht, wie bei anderen Spezies im Fall der Catecholamine, auf einen höheren Besatz der
Membranen mit β-AR zurückgeführt werden, denn diesbezüglich liegen nur Angaben zum
Bauchfett vor (WRAGE 2002), nicht aber über den Besatz im Inguinalfett. Darüber hinaus
entfaltet cAMP seine Wirkung nicht über adrenerge Rezeptoren, sondern stellt vielmehr einen
direkten (postrezeptoralen) Aktivator der PKA und damit der HSL dar. Aufgrund dieser
Tatsachen liegt die Vermutung nahe, dass auch in Adipocyten aus dem Bauchhöhlenbereich
der Ponys im Gegensatz zum Inguinalfett und zu Großpferden eine höhere Aktivität der HSL
zugrunde liegt.
5.2.6. Der Einfluss der Spezies auf die Lipolyserate
Im Hinblick auf das Hyperlipämie-Syndrom ist der Speziesvergleich der Lipolyseraten das
zentrale Anliegen der vorliegenden Arbeit. Die Anregung der TGL-Mobilisation sollte mit
DBcAMP erfolgen, weil auf diese Weise ein erster Einblick in eventuelle postrezeptorale
Einflüsse auf die HSL-Aktivität erzielt werden kann. Die Inkubation der Zellen aus
Bauchhöhlenfettgewebe mit DBcAMP führte für beide untersuchten Spezies zu
85
5. Diskussion
vergleichbaren Lipolyseraten. Dieses Resultat steht im Gegensatz zu den Daten, die bei
Inkubation mit NA / ADA gemessen werden konnten (BREIDENBACH et al. 1999).
Ein besonders bemerkenswertes Ergebnis brachte der Vergleich der DBcAMP-Stimulation
von Adipocyten aus dem Inguinalbereich zwischen Pony und Großpferd. Hier konnte eine
signifikant höhere Lipolyserate bei den Fettzellen vom Großpferd festgestellt werden. Dieses
Resultat ist gerade im Hinblick auf die oben zitierten Lipolyseraten für die Bauchfettzellen bei
NA / ADA-Stimulation unerwartet, muss aber nicht unbedingt den früheren Feststellungen,
dass die hohe Lipolyserate bei Ponys mit der Hpyerlipämieentstehung in Zusammenhang
gebracht wird, entgegenstehen. Die größere Masse des Bauchhöhlenfettgewebes kann
durchaus bestimmend für die Stoffwechselentgleisung beim Pony sein, so dass eine höhere
Empfindlichkeit des Inguinalfettgewebes gegenüber DBcAMP beim Großpferd quantitativ
keine pathognomonische Bedeutung haben muss.
Eine mögliche Ursache für die oben genannte Diskrepanz zwischen NA / ADA- und
DBcAMP-Stimulation könnte das Alter der beprobten Tiere sein. Es konnte gezeigt werden,
dass Adipocyten älterer Tiere mit geringerer lipolytischer Aktivität auf Stimulation reagieren
als Zellen jüngerer Tiere (ENGFELDT u. ARNER 1988; LANGIN et al. 1992). Dies wird
aber mit einer Veränderung des Gleichgewichtes zwischen α- und β-Adrenorezeptoren
begründet (LANGIN et al. 1992), was als Ereignis zu bewerten ist, das der cAMP-Kaskade
vorgelagert ist. Darüber hinaus lag das Durchschnittsalter der Ponys (15,7 ± 5,8 Jahre) nur
geringgradig über dem der Pferde (13 ± 6,7 Jahre). Diese Differenz war nicht signifikant, so
dass eine Begründung des Versuchsresultats mit einem Altersunterschied nicht möglich ist.
Zur Abklärung dieser Frage sind weitere Untersuchungen erforderlich, die letztendlich zu
einer Beurteilung aller Aspekte der Regulation der HSL führen.
86
5. Diskussion
5.3. Betrachtungen im Zusammenhang mit dem Hyperlipämie-Syndrom
Das durch die Entgleisung des Fettstoffwechsels gekennzeichnete Hyperlipämie-Syndrom der
Ponys manifestiert sich mit stark erhöhten Fettsäure- und TGL-Gehalten im Plasma. Dabei
gelten Triglycerid-Konzentrationen von > 500 mg / dl als hyperlipämisch (NAYLOR 1982 b;
FIELD 1988; MOORE et al. 1994).
Die genauen Ursachen des massiven Fettabbaus im Zuge dieser Erkrankung sind bis heute
nicht eindeutig aufgeklärt. Der vorliegenden Arbeit lag die Hypothese zugrunde, dass die
HSL auslösend für das Syndrom sein könnte. Vermutet wurde eine sensiblere und gesteigerte
Reaktion des Enzyms auf erhöhte cAMP-Spiegel innerhalb der Fettzelle.
Ausschlaggebend für diese Annahme waren die Ergebnisse von BREIDENBACH (1996). Er
zeigte, dass Adipocyten der Ponys einen linearen Anstieg der Fettsäurefreisetzung nach
Stimulation mit NA aufwiesen. Dieses Resultat beobachtete er jedoch nicht bei Fettzellen der
Großpferde. Erst nach Zusatz von ADA zum Inkubationsmedium ließen sich auch diese
Zellen zur Fettsäurefreisetzung stimulieren. Die Lipolyserate der Ponys blieb jedoch
signifikant höher.
Die Bindung von Catecholaminen an β-Rezeptoren der Adipocytenmembran aktiviert über
eine Signalkaskade innerhalb der Fettzelle nach Erhöhung der cAMP-Konzentration die HSL.
Die erleichterte Stimulierbarkeit der Ponyzellen konnte nicht auf einen größeren Besatz der
Membranen mit β-Rezeptoren zurückgeführt werden, die die verantwortliche Kaskade durch
Kopplung an Gs-Proteine (stimulierende G-Proteine) in Gang setzen. Ponys weisen auf ihren
Adipocyten im Gegensatz zu Großpferden eine signifikant geringere Dichte an β-Rezeptoren
auf (WRAGE 2002).
Die Erkenntnisse ließen den Schluss zu, dass die über β-Rezeptoren bewirkte Stimulierung
der HSL an der Hyperlipämieentstehung beteiligt sein könnte.
Die HSL ist eine neutrale Lipase (SZTALRYD u. KRAEMER 1994 b), die die erste
Esterbindung in gespeicherten TGL hydrolysiert. Ihre Aktivierung wird über die PKA
vermittelt, die vom cAMP-Gehalt in der Zelle abhängig ist und eine Phosphatgruppe von ATP
auf das Enzym überträgt (STEINBERG u. HUTTUNEN 1972).
87
5. Diskussion
In dieser Arbeit wurden isolierte Adipocyten mit DBcAMP inkubiert. Dieses Vorgehen
erzeugte jedoch keine vermehrte Freisetzung von FS bei Ponyzellen im Vergleich zu Zellen
der Großpferde. Adipocyten beider Spezies ließen sich etwa in gleicher Weise stimulieren.
Die Hypothese, dass die HSL der Ponys verglichen mit der der Großpferde sensibler reagieren
und Fettgewebe daher mit gesteigerter Lipolyse auf Stresssituationen antworten würde, hat
sich anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht erhärten können.
Damit bleibt weiterhin zu untersuchen, ob die Gründe für eine gesteigerte Lipolyserate der
Ponys im Rahmen des Hyperlipämie-Geschehens an anderer Stelle der cAMP-Kaskade
lokalisiert sind.
Andere mögliche Wirkorte innerhalb der Signalkaskade, die Einfluss auf das Ausmaß der
Lipolyse nehmen könnten, sind die an die Rezeptoren der Membran gekoppelten G-Proteine,
die in Abhängigkeit zum Rezeptorliganden entweder stimulierende oder inhibierende
Wirkung ausüben können. Der Besatz mit β-Rezeptoren konnte aber bereits als Ursache für
die Hyperlipämie ausgeschlossen werden. Über den Besatz mit inhibierenden α-Rezeptoren
liegen dagegen noch keine Erkenntnisse vor. Dieser Aspekt wird gegenwärtig untersucht.
Außerdem kommt die in der Membran der Adipocyten verankerte Adenylatcyclase (AC) in
Betracht, die die Synthese von cAMP vermittelt.
Darüber hinaus sollten die PKA und die Phosphatasen als möglicher Auslöser für eine
unterschiedlich ablaufende TGL-Spaltung bei Großpferd und Pony beachtet werden.
Diese Möglichkeiten sollten weiter untersucht werden, um eventuell Erkenntnisse über
auslösende Faktoren der gesteigerten Fettmobilisation beim Pony zu gewinnen.
88
6. Zusammenfassung
6. ZUSAMMENFASSUNG
Nadine Riebandt
Stimulierbarkeit der Hormonsensitiven Lipase bei Großpferd und Pony im Hinblick auf
das Hyperlipämie-Syndrom
Gegenstand der vorliegenden Studie war die Inkubation von isolierten Adipocyten von
Großpferden und Ponys mit DBcAMP. Dadurch sollte die HSL postrezeptoral angeregt und
eine Freisetzung von FS aus den Zellen erreicht werden. Anhand eines pH-sensitiven
Messsystems wurde die resultierende pH-Wertabnahme im Medium fluorophotometrisch
detektiert, so dass vergleichend zwischen beiden Spezies Rückschlüsse bezüglich der
stattgefundenen Lipolyserate gezogen werden konnten. Für die Untersuchungen wurden
Gewebeproben aus Bauchhöhlen- und subkutanem Inguinalfett verwendet, die von
anästhesierten bzw. ausgeweideten Schlachttieren gewonnen worden sind. Ziel der Versuche
war es, einen weiteren Beitrag zur Aufklärung der Ätiologie des Hyperlipämie-Syndroms der
Ponys zu leisten.
Zur Auswertung der Ergebnisse erfolgte eine Gruppierung der beprobten Tiere gemäß
unterschiedlicher Gesichtspunkte.
So wurde ein möglicher Einfluss des Geschlechts auf die Lipolyse getestet, der jedoch,
entgegen der Berichte anderer Autoren, in dieser Studie ausblieb. Dagegen konnte eine
Abhängigkeit der Fettsäurefreisetzung von der Lokalisation des entnommenen Gewebes
nachgewiesen werden, wobei sich das Bauchfett als lipolytisch signifikant aktiver erwies als
das subkutane Gewebe aus dem Inguinalbereich. Dieser Befund entspricht den in der Literatur
gemachten Angaben. Erstaunlich war die Beobachtung, dass im Vergleich der Spezies das
Inguinalfett der Pferde in höherem Maße stimulierbar war als das der Ponys.
Obwohl in dieser Studie vorrangig die Stimulation der Adipocyten mit DBcAMP untersucht
wurde, wurde vergleichend auch die Anregung durch NA / ADA in die Betrachtungen
89
6. Zusammenfassung
einbezogen. Die Ergebnisse deckten sich mit der Erhebungen von BREIDENBACH et al.
(1999). Es wurde deutlich, dass die Zellen der Ponys mit auffallend höherer Lipolyse auf die
Inkubation mit NA / ADA reagierten als die der Pferde. Der Zusatz von DBcAMP zum
Inkubationsmedium bewirkte bei den Ponyfettzellen keinen Unterschied im Ausmaß der
Freisetzung von FS verglichen mit NA / ADA, während die Lipolyserate der Adipocyten von
Großpferden nach DBcAMP signifikant höher war als nach NA / ADA-Anregung. Die
DBcAMP-Stimulierung führte bei den Bauchhöhlenfettzellen zu vergleichbaren Lipolyseraten
beider Spezies.
Die vorliegende Studie kann demnach über die molekulare Basis der erhöhten
Lipolyseneigung des Ponys im Vergleich mit Großpferden noch keine schlüssige Antwort
geben.
Es bleibt zu prüfen, ob prärezeptoral die α-Rezeptoren eine entscheidende Rolle spielen.
Postrezeptoral muss geklärt werden, inwiefern weitere Regulationsfaktoren der HSL
(Gs-Proteine, Gi-Proteine, Insulin) von Bedeutung sind.
90
7. Summary
7. SUMMARY
Nadine Riebandt
Stimulation of hormone-sensitive lipase in horses and ponies with regard to the
hyperlipaemia syndrome
The topic of the present study was the incubation of isolated adipocytes of horses (wormblod)
and ponies (Shetland Pony) with dbcAMP. Thus should stimulate hormone-sensitive lipase
proximal to the receptors and cause a release of FA out of the cells.
With a pH-sensitive measuring system the resulting decrease in pH within the medium has
been detected by fluorophotometry so that comparative conclusions between both species
could be drawn concerning their rate of lipolysis.
For these investigations specimens from the subcutaneous adipose tissue of the inguinal
region and the abdominal cavity have been used. They were taken from anaesthetised ponies
and from horses and ponies delivered to a slaughterhouse following their evisceration.
The aim of these attempts was to contribute to the education of the aetiology of the
hyperlipaemia syndrome in ponies.
To analyse the results the animals have been grouped according to different aspects.
Thus an influence emanating from the gender on the lipolysis has been tested that however
has been lacking within this study.
On the other hand it has been possible to prove a dependance of the FA release to the location
of the collected tissue. Adipose tissue deriving from the abdominal cavity appeared to be
significantly more active as subcutaneous inguinal fat depots relating to lipolysis. This finding
corresponds to the multiple statements within the literature.
It has been astonishing that in the comparison of the species adipocytes from horses inguinal
tissue could be stimulated in a superior extent as cells of ponies.
91
7. Summary
Even though the stimulation of adipocytes with dbcAMP has been investigated prior in this
study the incitement comparing with NE / ADA has been integrated in the examinations as
well. The results align with the exaltations made by BREIDENBACH et al. (1999).
It was evident that ponies’ adipocytes react with explicitly larger rate of lipolysis to
stimulation with NE / ADA than cells from horses. The supplement of dbcAMP to the
incubation medium containing fat cells from ponies caused no difference referring to the
degree of FA release in comparison with NE / ADA. While the rate of lipolysis in horses’
adipocytes has been significantly greater following dbcAMP stimulation than incitement with
NE / ADA. The stimulation with dbcAMP leaded to comparable rates of lipolysis in
abdominal fat cells in both species.
According to this the present study can not give a conclusive response to the molecular basis
of the augmented tendency to lipolysis in ponies in comparison with horses.
Further investigations are necessary to elucidate whether the α-adrenergic receptors play an
important role. Distal to the receptors it has to be clarified how far other regulating
mechanisms of the hormone-sensitive lipase, such as Gs-proteins, Gi-proteins and insulin, are
of importance.
92
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114
9. Anhang
9. ANHANG
9.1. Bezugsquellen
9.1.1. Verwendete Geräte
Einmal–Küvetten aus Acryl,
4,5 ml, vier klare Seiten
photometrische Messung der
Lipolyseraten
Carl Roth GmbH, 76185
Karlsruhe, Deutschland
Spritzen Braun Injekt 5 ml Absaugen der Unterstände
zwischen den einzelnen
Waschvorgängen
Braun, 34209 Melsungen,
Deutschland
Einmal-Injektionskanülen
Sterican Ø 0,90 x 70 mm
Falcon–Röhrchen Inkubation der Probenansätze
und Waschen der Adipocyten
Becton Dickinson Labware
Europe, 38800 Le Pont De
Claix, France
Hamilton-Pipette Pipettieren der Palmitinsäure
Hellma Präzisionsküvetten Erstellen einer Eichkurve mit
Palmitinsäure
Magnetrührer des Cary 1E
UV-Visible
Spectrophotometer Varian
Aufbewahrung der Küvetten
zwischen den Messungen
Mikroskop Leica DM IRB Auszählen der Fettzellen nach
Methylenblaufärbung und
Beurteilung des Zellkerns
Nylon–Gaze Filtration der Adipocyten-
suspension im Anschluss an
die Inkubation
Eckert GmbH, 79183
Waldkirch, Deutschland
115
9. Anhang
Operations– und
Infusionsbesteck, Tupfer und
Nahtmaterial
Operation der Institutsponys Wirtschaftsgenossenschaft
Deutscher Tierärzte (WDT),
30827 Garbsen, Deutschland
Schreiber Aufzeichnen der Spektren der
Fluorochrome
Spektrofluorophotometer
Shimadzu RF–510
Messung der Lipolyserate Shimadzu Seisakusho LTD,
Kyoto, Japan
Wasserbad Braun Inkubation der Proben Braun, 34209 Melsungen,
Deutschland
Zählkammer Modell Thoma Auszählen der Fettzellen und
Zellzahleinstellung
WDT, 30827 Garbsen,
Deutschland
Zeiss Axiovert 35 M Beurteilung der Live / dead–
Färbung
116
9. Anhang
9.1.2. Medikamente
Diazepam
Narkoseeinleitung ratiopharm GmbH, 89079
Ulm, Deutschland
Ketamin
Narkoseeinleitung und
-aufrechterhaltung im Triple
Drip
CP-Pharma, 31303 Burgdorf,
Deutschland
Metacam®
Schmerzlinderung,
Entzündungshemmung
Boehringer Ingelheim
Vetmedica GmbH, 55216
Ingelheim / Rhein,
Deutschland
Myolaxin®
Narkoseaufrechterhaltung im
Triple Drip
Vétoquinol/ Chassot, 88212
Ravensburg, Deutschland
Procain–Benzylpenicillin
(Euterinjektor)
lokale Wundversorgung WDT, 30827 Garbsen,
Deutschland
Sedivet®
Sedation und Narkose-
aufrechterhaltung im Triple
Drip
Boehringer Ingelheim
Vetmedica GmbH, 55216
Ingelheim / Rhein,
Deutschland
Tardomyocel® comp. III
postoperative Antibiose Bayer Vital, 51368
Leverkusen
Tetanus–Serum
Tetanusprophylaxe WDT, Serumwerk Memsen,
27318 Hoyerhagen
vetren® gel
Heparin–haltige Salbe,
Behandlung p. o.
Altana Pharma, Konstanz
Zinkoxyd–Salbenspray
Wundspray, Abdeckung der
Operationsnaht
CP–Pharma, 31303 Burgdorf,
Deutschland
117
9. Anhang
9.1.3. Reagenzien
Alle Reagenzien hatten den Reinheitsgrad pro analysi.
NaCl Transport der Proben (0,9 %);
Pufferlösungen
Sigma–Aldrich Chemie
GmbH, 89552 Steinheim,
Deutschland
Palmitinsäure Erstellen der Eichkurve
Collagenase Typ II
HEPES
Glucose
BSA
Adipocytenpräparation
DBcAMP
[±]Norepinephrin[+]-
Hydrogentatrat (NA)
Messung der
Lipolyserate
ADA Typ II Boehringer Mannheim GmbH
Biochemica, 6800 Mannheim,
Deutschland
SNAFL-1 pH–sensitives Fluorochrom
zur Messung der Lipolyserate
Molecular Probes Europe BV,
2333 AA Leiden, The
Netherlands
SNARF
5,6-Carboxyfluorescein
pH–sensitive Farbstoffe
Live / dead-Färbung Simultanfärbung zum
Nachweis der Lebensfähigkeit
Methylenblau Anfärben der Adipocyten zum
Auszählen in der Thoma-
Kammer
Merck KgaA, 64295
Darmstadt, Deutschland
DMF Lösen von SNAFL-1 Sigma–Aldrich Chemie
GmbH, 89552 Steinheim,
Deutschland
118
9. Anhang
NaOH Einstellen der pH-Werte der
Puffer
Carl Roth GmbH, 76185
Karlsruhe, Deutschland
KCl Ansetzen der Pufferlösungen Sigma–Aldrich Chemie
GmbH, 89552 Steinheim,
Deutschland
MgSO4*7H2O
CaCl2*2H2O Merck KgaA, 64295
Darmstadt, Deutschland
KH2PO4
119
9. Anhang
9.2. Stammlösungen
Im Folgenden aufgeführte Stammlösungen wurden aliquotiert und, mit Ausnahme des
DBcAMP, bei – 20°C eingefroren. DBcAMP wurde vor jedem Messdurchgang neu angesetzt.
- Krebs–Ringer-Stammlösung (NaCl 590 mM):
- 590 mmol / NaCl
- 24,8 mmol / l KCl
- 12,7 mmol / CaCl2*2H2O
- 5,59 mmol / l KH2PO4
- 5,59 mmol / l MgSO4*7H2O
- Aqua bidest
- Krebs-Ringer-Stammlösung (NaCl 655 mM)
- 655 mmol / l NaCl
- 24,8 mmol / l KCl
- 12,7 mmol / CaCl2*2H2O
- 5,59 mmol / l KH2PO4
- 5,59 mmol / MgSO4*7H2O
- Aqua bidest
Die nachstehend aufgeführten Stammlösungen wurden in den angegebenen Konzentrationen
angesetzt und die Reagenzien dabei, wenn nicht anders beschrieben, in Aqua bidest gelöst.
- HEPES 150 mmol / l
- Glucose 140,mmol / l
- BSA 70 g / l
120
9. Anhang
- Collagenase 20 g / l, gelöst in 0,9 %iger NaCL
- SNAFL-1 20 mmol / l , gelöst in DMF
- DBcAMP 50 µmol / l, gelöst in KR-Lösung III
- NA 6,26 mmol / l
- ADA 10 U / l, gelöst in 0,9 %iger NACl
Die Puffer für das Separieren (KR-Lösung I) und Waschen (KR-Lösung II) der Fettzellen
wurden zu jedem Messdurchgang frisch hergestellt und bestanden aus der erstgenannten KR-
Stammlösung (NaCL 590 mmol /l) und aus den Stammlösungen von HEPES, Glucose und
BSA. Mit A. bidest wurde auf das erforderliche Endvolumen aufgefüllt. Die
Endkonzentration des BSA betrug für den Puffer, der für das Isolieren der Zellen verwendet
wurde, 3,5 %. Der Puffer zum Waschen der Adipocyten enthielt 1 % BSA.
Die zweite KR-Stammlösung (NaCl 655) diente der Herstellung des für den Messvorgang
bestimmten Puffers (KR-Lösung III), der darüber hinaus Glucose- und BSA-Stammlösung
enthielt. Auch hier wurde mit A. bidest bis zum Endvolumen aufgefüllt. Die
Endkonzentration des BSA lag in diesem Puffer bei 0,5 %.
Die pH-Werte der geschilderten Puffer wurden mit 0,1 M NaOH bei 37°C auf 7,4 eingestellt.
121
9. Anhang
9.3. Tabellen
Tiernummer
Geschlecht
Alter (Jahre)
Größe (cm)
Gewicht (kg)
1 Wallach 6 100 172
2 Wallach 5 102 175
3 Wallach 10 111 214
4 Wallach 10 89 145
5 Wallach 6 87 109
6 Wallach 12 91 120
Tab. 1: Daten der Ponys aus dem Institut für Physiologische Chemie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover. Das durchschnittliche Alter betrug 8,2 ± 2,9 Jahre. Das
Durchschnittsgewicht lag bei 155,8 ± 39,0 kg.
122
9. Anhang
Tiernummer
Geschlecht
Alter (Jahre)
Größe (cm)
Gewicht (kg)
7 Wallach 9 115 220
8 Stute 20 134 360
9 Stute 11 146 470
10 Stute 11 130 380
11 Stute 20 107 250
12 Stute 15 133 396
13 Stute 26 99 170
14 Stute 9 134 400
15 Wallach 15 143 430
16 Stute 21 134 370
Tab. 2: Daten der Schlachtponys. Das durchschnittliche Alter betrug 15,7 ± 5,8 Jahre. Das
Durchschnittsgewicht lag bei 344,6 ± 97,7 kg.
123
9. Anhang
Tiernummer
Geschlecht
Alter (Jahre)
Größe (m)
Gewicht (kg)
17 Wallach 12 1,66 580
18 Wallach 5 1,70 640
19 Wallach 5 1,70 550
20 Wallach 23 1,68 630
21 Stute 20 1,67 690
22 Wallach 3 1,63 510
23 Stute 19 1,68 630
24 Stute 13 1,52 530
25 Wallach 16 1,76 720
26 Stute 17 1,49 420
27 Wallach 3 1,60 510
28 Wallach 11 1,82 730
29 Stute 15 1,59 560
30 Stute 15 1,61 520
31 Stute 13 1,80 610
32 Wallach 3 1,68 580
33 Stute 21 1,58 570
34 Stute 20 1,67 590
Tab. 3: Daten der Schlachtpferde. Das durchschnittliche Alter betrug 13 ± 6,7 Jahre. Das
Durchschnittsgewicht lag bei 587,2 ± 78,9 kg.
124
9. Anhang
relative Fluoreszenzeinheiten
Bauchfett Inguinalfett
t in min Kontrolle NA DBcAMP Kontrolle NA DBcAMP
0 0,3 1,7 2,4 1,1 1,3 0,4 10 1,6 0,3 2,6 0,5 1,2 1,1 20 1,2 0,4 3,3 0,7 1,4 1,1 30 1,2 0,0 4,0 0,7 1,0 2,0 40 1,1 0,0 6,1 0,6 0,5 3,6 50 1,6 0,1 9,3 0,7 0,6 6,1 60 1,9 0,7 15,4 0,6 0,3 8,8 70 2,3 1,0 20,3 0,1 0,4 13,5 80 2,1 1,2 24,5 0,4 1,4 16,3 90 2,1 1,3 30,9 0,5 2,3 21,6 100 1,8 1,8 36,0 0,5 4,2 27,8 110 1,9 3,1 40,0 0,4 5,8 32,4 120 2,9 3,6 42,6 0,0 7,7 36,2
Tab. 8: Einzelwerte des Pferdes Nr. 20, dessen Verlauf der Lipolyse in Kapitel 4.2. auf Seite
45 graphisch dargestellt ist.
125
9. Anhang
relative Fluoreszenzeinheiten
Bauchfett Inguinalfett
t in min Kontrolle NA DBcAMP Kontrolle NA DBcAMP
0 1,4 0,0 1,1 0,0 1,3 0,6 10 0,4 1,2 0,5 1,3 0,1 0,5 20 0,5 1,4 0,0 1,2 0,0 0,0 30 0,5 1,5 0,5 1,0 0,6 0,2 40 0,3 3,0 1,5 1,3 0,2 0,3 50 0,4 3,5 4,4 1,4 1,2 1,0 60 0,4 4,4 8,0 1,8 1,6 2,0 70 0,3 6,6 9,7 1,8 1,7 4,3 80 0,3 8,5 13,1 2,0 2,8 6,5 90 0,3 11,1 16,9 2,0 3,8 8,7 100 0,1 12,7 17,6 2,1 4,8 10,5 110 0,1 15,0 19,2 1,8 6,2 11,9 120 0,0 16,6 20,7 1,7 7,6 13,2
Tab. 9: Einzelwerte des Ponys Nr. 16, dessen Verlauf der Lipolyse in Kapitel 4.2. auf Seite 47
graphisch dargestellt ist.
126
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Dr. h. c. H.-P. Sallmann danke ich herzlich für die Überlassung dieses
interessanten Themas. Die angenehme und freundliche Atmosphäre, die in seiner
Arbeitsgruppe herrschte, wird mir ebenso in dankbarer Erinnerung bleiben, wie die
Möglichkeit, zu jeder Zeit meine Angelegenheiten vorbringen und Lösungsansätze
diskutieren zu können.
Herrn Dr. R. Busche danke ich, der mit seinen Anregungen zur Durchführung der Versuche
zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat und besonders bei computertechnischen
Problemen Hilfe gewährte.
Den Mitarbeitern des Instituts für Physiologische Chemie möchte ich für ihre freundliche
Aufnahme in das Team und für die stets offenen Ohren, denen ich begegnen durfte, und die
gewährte Hilfe danken. An dieser Stelle sei besonders Frau Andrea Widdel–Bigdely genannt,
die mit ihrer herzlichen Art einen schier endlosen Optimismus versprühte und mir immer mit
Rat und Tat zu Seite stand.
Auch meiner Mitdoktorandin Britta Zahn sei für viele fröhliche Momente gedankt, die immer
von herzhaftem Lachen begleitet waren. In besonders heiterer Erinnerung werden mir unsere
beinahe nächtlichen Fahrten zum Schlachthof bleiben. Für ihre private und berufliche Zukunft
wünsche ich ihr das Beste.
Zu besonderem Dank bin ich der Roßschlachterei Knoche und Sohn in Helmstedt verpflichtet,
ohne die diese Arbeit wohl nicht entstanden wäre. In äußerst kooperativer und hilfsbereiter
Weise sorgten die Mitarbeiter dafür, dass ich ausreichend Probenmaterial sammeln konnte
und vermittelten mir darüber hinaus das Gefühl, willkommen zu sein.
Ich möchte auch meiner Freundin Kathrin danken, die in ihrer Eigenschaft als Deutschlehrerin
das Übel der so genannten „Rechtschreibreform“ in meine Arbeit einziehen ließ und letzte
Fehler ausmerzte.
Danksagung
Ich danke meiner Freundin Wiebke. Sie verfügt über den Magister in Englisch und war meine
erste Anlaufstelle, als es um die Korrektur des Summary ging, bei der sie mir hilfreich zur
Seite stand.
Ein liebevolles Dankeschön gebührt Mario, der während dieser Zeit nicht nur meine guten
Launen geduldig ertragen hat und dabei trotzdem nicht den Glauben an mich verlor und mich
statt dessen mit unermüdlichem Eifer umsorgte.
In herausragender Weise und aus ganzem Herzen möchte ich meinen Eltern danken, ohne die
ich nicht bis hierher gekommen wäre, die voller Stolz auf das blicken, was ich geschafft habe
und auf deren Rückhalt, Unterstützung und Hilfe ich immer bauen konnte. Danke.