Stolbur del pomodoro in Emilia-RomagnaRisultati di uno studio triennale

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Lavoro svolto nell’ambito del Progetto “Studi sulla fitoplasmosi dello Stolbur sulpomodoro da industria in Emilia-Romagna” finanziato dalla Regione Emilia-Roma-gna (Legge Regionale 28/98) e coordinato da CRPV

In copertina:

1) pianta di pomodoro da mensa con portamento eretto e fusti ingrossati

2) fiori malformati a forma di vescica con sepali giganti

3) grappoli fiorali con ramificazioni dicotomiche

4) frutti piccoli con polpa dura e asciutta

Stolbur del pomodoro in Emilia-RomagnaRisultati di uno studio triennale

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INDICE

- Presentazione del progetto ................................................ 5

Maria Grazia Tommasini

- Sintomi e diffusione dello Stolbur ...................................... 7

Valentino Testi, Chiara Delvago, Roberto Zambini, Bruno Chiusa,

Ruggero Colla, Stefano Saccò

- Identificazione del fitoplasma dello Stolbur ...................... 15

Federica Terlizzi, Rino Credi

- Gli insetti vettori dello Stolbur ........................................ 21

Emanuele Mazzoni, Rinaldo Nicoli Aldini, Michela Panini

- Come prevenire la malattia .............................................. 25

Valentino Testi, Stefano Saccò, Bruno Chiusa, Rino Credi,

Emanuele Mazzoni

- Conclusioni ...................................................................... 28

Anna Rosa Babini

- Bibliografia ...................................................................... 29

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PROGETTO “STUDI SULLA FITOPLASMOSI DELLO STOLBURSUL POMODORO DA INDUSTRIA IN EMILIA-ROMAGNA”

(Finanziato dalla Regione Emilia-Romagna - Legge 28/98)

COORDINAMENTO

CRPV: Maria Grazia Tommasini.

UNITÀ OPERATIVE E PERSONALE IMPEGNATO

CRPV: Stefano Saccò.

CONSORZIO FITOSANITARIO PROVINCIALE DI PARMA: ValentinoTesti, Chiara Delvago, Roberto Zambini.

CONSORZIO FITOSANITARIO PROVINCIALE DI PIACENZA: BrunoChiusa, Ruggero Colla.

DIPARTIMENTO DI SCIENZE E TECNOLOGIE AGROAMBIENTALI(DISTA), ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA:Federica Terlizzi, Rino Credi.

ISTITUTO DI ENTOMOLOGIA E PATOLOGIA VEGETALE – UNIVERSITÀCATTOLICA DEL SACRO CUORE - SEDE DI PIACENZA: EmanueleMazzoni, Rinaldo Nicoli Aldini, Michela Panini.

SERVIZIO FITOSANITARIO REGIONE EMILIA-ROMAGNA: Anna RosaBabini.

RINGRAZIAMENTI

Per la realizzazione del progetto “Studi sulla fitoplasmosi dello Stolbursul pomodoro da industria in Emilia-Romagna” si ringrazia la RegioneEmilia-Romagna per il contributo economico (L.R. 28/98), leOrganizzazioni dei produttori AINPO, ASIPO, ARP, COPADOR e CIO perla collaborazione fornita e tutti gli Enti, tecnici e aziende agricole che,a diverso titolo, vi hanno contribuito.

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PRESENTAZIONE DEL PROGETTO

Maria Grazia Tommasini

Premessa

Dal 2005 in diverse località emiliane, soprattutto nelle province diParma e Piacenza, si sono riscontrati preoccupanti danni alle coltiva-zioni di pomodoro causati da una malattia di origine fitoplasmaticanota in letteratura come Virescenza ipertrofica del pomodoro o“Stolbur”. I campioni di pomodoro sintomatici, analizzati nei primi annidal Laboratorio di Virologia del Servizio Fitosanitario della RegioneEmilia-Romagna e dall’Istituto di Entomologia e Patologia vegetaledell’Università Cattolica del Sacro Cuore, sede di Piacenza, conferma-vano che l’agente eziologico era il fitoplasma dello Stolbur (Testi et al.,2007).Fino ad allora nelle coltivazioni di pomodoro da industria dell’arealesettentrionale si trovavano, sporadicamente, singole piante con sinto-mi ascrivibili alla fitoplasmosi, mentre la malattia era più diffusa econosciuta negli areali meridionali. Negli anni successivi, data la suapotenziale pericolosità ed in considerazione del fatto che Stolbur èriportato nella lista di allerta (A2) degli organismi fitopatogeni da qua-rantena da parte dell’EPPO (European and Mediterranean PlantProtection Organization), i Consorzi Fitosanitari Provinciali di Parma ePiacenza hanno avviato monitoraggi e investigazioni per valutare ladistribuzione e l’intensità della malattia nei rispettivi territori, con pre-lievi di piante di pomodoro sintomatiche e di erbe infestanti per lacaratterizzazione molecolare del fitoplasma analizzate dal CRA-PAVCentro di Ricerca per la Patologia Vegetale di Roma (Mazzoni et al.,2008).

Progetto

A partire dal 1° settembre 2009 è iniziato il progetto “Studi sulla fito-plasmosi dello Stolbur sul pomodoro da industria in Emilia-Romagna”,finanziato dalla Regione Emilia-Romagna (L.R. 28/98) e coordinato dalCRPV, avente lo scopo di approfondire le conoscenze sulle particolari-tà eziologiche dell’avversità fitoplasmatica e sui vari fattori che contri-buiscono a delinearne l’epidemiologia.Il progetto aveva i seguenti obiettivi:1) studiare l’areale di diffusione e l’incidenza della malattia nel territo-rio regionale;2) identificare il fitoplasma dello Stolbur, attraverso la determinazione

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degli isolati e la loro caratterizzazione genetica;3) approfondire i rapporti tra fitoplasmi - infestanti – vettori;4) ricercare gli insetti vettori coinvolti nell’espansione della malattia ele piante in grado di fungere da serbatoio d’inoculo del patogeno, non-ché da ospiti dell’insetto vettore.Sono state infine provate strategie di intervento con insetticidi chimicie valutate possibili tecniche agronomiche in grado di prevenire o con-tenere la diffusione del patogeno, al fine di garantire produttività eredditività al settore pomodoricolo nell’ambito di un sistema ecocom-patibile di agricoltura integrata.

I risultati ottenuti, illustrati nelle pagine seguenti, sono stati presenta-ti nel convegno “Stolbur del pomodoro in Emilia-Romagna: risultati diuno studio triennale” nell’ambito della manifestazione Tomato World –Piacenza, 23 novembre 2012.

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PremessaL’agente eziologico dello Stolbur è un fitoplasma incluso nel gruppo16SrXII, sottogruppo A (Lee et al., 1998; Langer e Maixner, 2004).I fitoplasmi sono organismi procarioti, unicellulari, appartenenti alla

classe dei Mollicutes, simili ai batte-ri, ma più piccoli (dimensioni varia-bili tra i 100 e i 1.000 nanometri) eprivi di parete cellulare (pleomorfi).Essendo biotrofici, cioè incapaci divivere al di fuori di cellule vive,necessitano di un vettore per la tra-smissione e non sono coltivabili invitro. Sono patogeni obbligati evivono solo all’interno dei tessutifloematici dei vegetali. A differenzadei virus, però, possiedono unmetabolismo proprio, anche semolte sostanze sono acquisite diret-tamente dall’ospite.

Sintomi

Nelle malattie fitoplasmatiche granparte dei sintomi derivano da alte-razioni a carico del sistema floema-tico e da squilibri ormonali. Studirecenti hanno evidenziato che i sin-tomi sono da attribuire anche allasovraespressione o alla repressionedi geni della pianta ospite. Nel caso dello Stolbur le profondemodificazioni indotte dai fitoplasmiinteressano, principalmente, l’appa-rato vegetativo e quello riprodutti-

vo: le piante assumono aspetto cespuglioso con portamento eretto,fusti ingrossati, germogli con internodi corti, affastellamento dellavegetazione dovuto alla produzione di getti ascellari.Le foglie spesso sono piccole, accartocciate, con margini arrotolati

Foto 1 – Fitoplasmi al microscopio elet-tronico: tali microrganismi appaiono diforme diverse e circondati solamente dauna membrana citoplasmatica (Foto: R.Credi).

Foto 2 – Piante di pomodoro con porta-mento eretto (Foto V. Testi).

SINTOMI E DIFFUSIONE DELLO STOLBUR

Valentino Testi, Chiara Delvago, Roberto Zambini, Bruno Chiusa, Ruggero Colla, Stefano Saccò

verso l’alto, di colore giallo-verdo-gnolo (clorotiche). Meno frequente-mente si osservano foglie grandi dicolorazione violacea, oppure foglielaciniate o nematofille. Le piantecolpite da Stolbur si vedono bene incampo nella fase finale del ciclo col-turale per il loro portamento erettoe cespuglioso, a differenza di quellesane che si coricano sul terreno peril peso dei frutti.

I grappoli fiorali presentano ramifi-cazioni dicotomiche con fiori malfor-mati, totalmente o parzialmentesterili, eretti, con sepali giganti epetali caratterizzati dalla perdita dipigmenti naturali (virescenza), cali-ce ingrossato e indiviso a forma divescica, organi fiorali trasformati infoglie (fillodia).I frutti già formati, normalmentepresenti solo sui primi palchi, si

presentano piccoli e deformi, con polpa dura e asciutta e rimangonotenacemente attaccati alla pianta anche dopo il vaglio della macchinaraccoglitrice. Sulle parti basali dei fusti si osserva la proliferazione di radici avventi-zie aeree. In Emilia-Romagna la malattia è sempre stata osservata su varietà dipomodoro a ciclo tardivo, a partiredalla seconda metà del mese diluglio. Ciò può essere dovuto alciclo di sviluppo dell’insetto vettoreed al periodo in cui è in grado di tra-smettere i fitoplasmi, oppure alfatto che solo in estate l’ambientefloematico è adatto alla loro soprav-vivenza e moltiplicazione.La distribuzione spaziale delle pian-te sintomatiche in campo risulta

Foto 3 – Foglie di pomodoro clorotiche,con margine arrotolato verso l’alto (FotoV. Testi).

Foto 4 – Ramificazioni dicotomiche emassiccio aborto fiorale. (Foto R. Colla).

Foto 5 – Frutti piccoli e deformi (Foto V.Testi).

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pressoché casuale, senza alcun gra-diente specifico o aree particolar-mente colpite rispetto ad altre.

Danni

Negli impianti di pomodoro mag-giormente colpiti e nelle annatenelle quali la malattia è più aggres-siva, i danni produttivi sono rilevan-ti in quanto viene a mancare la for-mazione delle bacche degli ultimidue palchi. Da indagini svolte nel

Parmense nel 2007 (Testi et al., 2008) si è potuto appurare che, met-tendo a confronto la produzione commerciale di piante sane con quel-la di piante colpite da Stolbur, le piante ammalate producono dal51,4% all’86,55% in meno, con una media del 66,62%. Inoltre si èriscontrato un aumento della perdita produttiva con l’avvicinarsi del-l’epoca di raccolta a causa del peggioramento dei sintomi e dell’au-mento della marcescenza dei frutti. Infatti le bacche del primo palco dipiante infette hanno avuto un aumento, medio, di frutti marci del 78%rispetto a quelle di piante sane. Quindi le piante di pomodoro forte-mente colpite da Stolbur hanno una produzione commercializzabilepraticamente nulla perché le bacche ben formate tendono a marcire ele altre piccole e dure sono scartate dalla fabbrica di trasformazione.Nei diversi anni si è constatato che gli appezzamenti più infetti, conpresenza di piante di pomodoro sintomatiche fino all’80% e oltre,erano quelli che, nella rotazione colturale, seguivano un prato stabile. Per tale motivo, gli studi riguardanti il ruolo epidemiologico dei vetto-ri e delle piante infestanti che li ospitano sono stati condotti preferibil-mente su appezzamenti di pomodoro a ciclo tardivo realizzati in suc-cessione ad un prato stabile.

Diffusione della malattia in Emilia-Romagna

Nel triennio 2009-2011 è stato eseguito un approfondito monitoraggionel territorio regionale per verificare presenza e diffusione della malat-tia, intensità e gravità della stessa. In ciascuna annata sono statimonitorati 100 appezzamenti di pomodoro individuati, a campione,nelle province più importanti per la coltivazione della solanacea.Nell’ambito del monitoraggio sono stati, inoltre, raccolti e poi saggiaticampioni prelevati da piante di pomodoro sintomatiche ed asintomati-che e campioni delle infestanti più rappresentative dei diversi areali dicoltivazione.

Foto 6 – Proliferazione di radici avventi-zie aeree (Foto V. Testi).

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Gran parte degli appezzamenti visitati sono stati georeferenziati utiliz-zando un computer palmare Trimble Geo XM, che ha integrato unapparecchio GPS (Global Positioning System) per il posizionamentomediante satelliti, e l’applicativo FitoPad, realizzato dal ServizioFitosanitario della Regione Emilia-Romagna per i controlli ispettivi. Leinformazioni geografiche, agronomiche e biologiche, descrittive di ogniappezzamento, sono poi state trasferite su PC, creando una banca datiGIS (varietà, epoca di trapianto, erbe infestanti presenti e percentua-le di piante ammalate) ed elaborate con FitoMap. Nei territori più conosciuti gli appezzamenti sono stati georefenziatidirettamente nell’applicativo FitoMap con l’utilizzo di CTR (CarteTecniche Regionali) e foto aeree (Ortofoto) come riferimento. Mediante il software sono state quindi elaborate mappe regionali cheevidenziano i punti monitorati e, con diversi colori, l’intensità dellamalattia: rosso con intensità di infezione superiore al 5%, arancioneintensità di infezione nell’intervallo 1-5%, giallo presenza inferiore al1% e verde assenza di piante sintomatiche.

Monitoraggio 2009

Nel 2009 sono stati monitorati 48 appezzamenti in provincia di Parma,28 in provincia di Piacenza, 13 in provincia di Ferrara, 8 in provincia diReggio Emilia e 3 in provincia di Ravenna.

I campi di pomodoro maggiormente colpiti da Stolbur erano presentinella provincia di Parma: n. 4 appezzamenti con intensità di infezionesuperiore al 5% (15%,10%, 6%, 6% di piante sintomatiche) e n. 13

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con intensità di infezione nell’intervallo 1-5%, e nella provincia diPiacenza: n.1 appezzamento con intensità di infezione superiore al 5%(15% di piante sintomatiche) e n. 8 appezzamenti con intensità diinfezione nell’intervallo 1-5%.Nelle province di Ravenna, Ferrara, Reggio Emilia, e negli altri campiosservati nelle province di Parma e Piacenza, la presenza di piante sin-tomatiche è risultata inferiore all’1% o nulla.

Monitoraggio 2010

Nel 2010 sono stati monitorati 59 appezzamenti in provincia di Parma,25 in provincia di Piacenza, 9 in provincia di Reggio Emilia, 2 in pro-vincia di Modena, 4 in provincia di Bologna e 1 in provincia di Ferrara.I campi di pomodoro maggiormente colpiti da Stolbur sono ancora pre-

senti nella provincia di Parma: n. 4 appezzamenti con intensità di infe-zione superiore al 5% (50%, 10%, 10%, 9% di piante sintomatiche)e n. 11 appezzamenti con l’intensità di infezione nell’intervallo 1-5%,e nella provincia di Piacenza: n. 4 appezzamenti con intensità di infe-zione superiore al 5% (20%, 13%, 10%, 9% di piante sintomatiche)e n. 1 appezzamento con intensità di infezione nell’intervallo 1-5%. Inprovincia di Reggio Emilia solo un appezzamento è risultato con inten-sità di infezione superiore all’1% (1,5% di piante sintomatiche).Nelle province di Modena, Bologna, Ferrara, Ravenna, e negli altricampi osservati nelle province di Parma, Piacenza e Reggio Emilia, lapresenza di piante sintomatiche è risultata inferiore all’1% o nulla.

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Monitoraggio 2011

Nel 2011 sono stati monitorati 46 appezzamenti in provincia di Parma,40 in provincia di Piacenza, 11 in provincia di Reggio Emilia e 3 in pro-vincia di Modena.

Nel 2011 la malattia è risultata molto più grave in provincia diPiacenza: n. 9 appezzamenti con intensità di infezione superiore al 5%(80%, 25%, 12%, 10%, 10%, 10%, 9%, 7%, 7% di piante sintoma-tiche) e n. 14 appezzamenti con intensità di infezione nell’intervallo 1-5%, che in quella di Parma: n. 1 appezzamento con intensità di infe-zione superiore al 5% (8% di piante sintomatiche) e n. 20 appezza-menti con intensità di infezione nell’intervallo 1-5%.Nelle province di Reggio Emilia e Modena l’intensità di infezione èrisultata nell’intervallo 1-5% rispettivamente in n. 4 appezzamenti(tutti 1% di piante sintomatiche) e in n. 3 appezzamenti (5%, 4%, 1%di piante sintomatiche).Negli altri campi osservati nelle province di Parma, Piacenza e ReggioEmilia, la presenza di piante sintomatiche è risultata inferiore all’1% onulla.

Conclusioni

Il monitoraggio realizzato in Emilia-Romagna ha permesso di rilevarescarsi o nulli danni associati a Stolbur nelle province orientali dellaregione (Reggio Emilia, Modena, Bologna, Ferrara e Ravenna) dove la

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presenza di piante infette dalla fitoplasmosi si limita a poche unità,poste soprattutto ai bordi degli appezzamenti.Maggiore la diffusione e la dannosità della malattia nelle province diParma e Piacenza, anche se l’incidenza dei danni risulta molto variabi-le negli anni e nei diversi areali di coltivazione. Infatti nei primi dueanni Stolbur ha maggiormente danneggiato il pomodoro nel Parmense,mentre nel 2011 la diffusione e la dannosità della malattia è risultatamolto maggiore nella provincia di Piacenza.Per quanto riguarda la suscettibilità delle varietà di pomodoro coltiva-te con ciclo tardivo, non si sono evidenziate differenze tra le diversevarietà.

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IDENTIFICAZIONE DEL FITOPLASMA DELLO STOLBUR

Federica Terlizzi, Rino Credi

Premessa

La malattia del pomodoro in argomento non è una novità nell’ambitodella patologia vegetale. La sindrome è infatti conosciuta da molto tempoe per le sue peculiarità fu originariamente denominata “Virescenza iper-trofica” o “Stolbur”. In tempi più recenti si è poi scoperto che il suo agen-te è un fitoplasma classificato nel sottogruppo tassonomico 16SrXII-A(Lee et al., 1998). Oltre al pomodoro, il fitoplasma dello Stolbur può infet-tare anche altre solanacee coltivate; nell’ambito poi di altre specie di inte-resse agrario è purtroppo agente di gravi affezioni come, ad esempio, il“Legno nero” nella vite (Credi et al., 2004).

Riguardo la diffusione di questa malattia, è già stato riportato che lepiù alte incidenze ricorrono in Emilia ed in particolare nelle coltivazioni dipomodoro da industria a ciclo tardivo con danni talvolta rilevanti (Testi et

al., 2007). A seguito della sua comparsa furono attivate le prime indagi-ni di campo e di laboratorio (Mazzoni et al., 2008; Testi et al., 2008).Tuttavia, durante questi ultimi anni, gli studi sono continuati con l’obiet-tivo di esaminare in modo più approfondito il fenomeno fitopatologico. Lapresente nota sintetizza i risultati che sono stati acquisiti su alcuni aspet-ti riguardanti la diagnosi e la caratterizzazione molecolare del fitoplasma,nonché il suo ciclo epidemiologico.

Campionamenti

I sopralluoghi nelle varie aree prese in considerazione sono avvenutidurante il triennio 2009-2011 ed usualmente nel periodo estivo, il più ido-neo per la massima estrinsecazione sintomatologica. Svariati impianti dipomodoro da industria, rappresentativi delle varietà maggiormente colti-vate, sono stati ispezionati primariamente nelle province di Piacenza eParma; poi, anche in altre realtà produttive minori di Reggio Emilia,Modena, Bologna, Ferrara e Ravenna. Per le verifiche diagnostiche dilaboratorio, nelle occasioni si campionavano numerose piante di pomodo-ro ammalate e, come controlli, anche alcune apparentemente sane (asin-tomatiche). Nei medesimi siti è stata considerata anche la flora sponta-nea presente all’interno degli appezzamenti o nelle vicine zone periferi-che (capezzagne, fossi di scolo). Le specie più comuni e frequenti veni-vano classificate e da esemplari di queste prelevati gli opportuni campio-ni fogliari da sottoporre alle specifiche analisi. Con l’intento di verificareuna eventuale trasmissione del fitoplasma mediante il seme, sono statiinoltre saggiati vari semenzali di pomodoro opportunamente ottenuti dasemi estratti da bacche di piante sintomatiche.

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Analisi diagnostiche

L’effettiva presenza del fitoplasma dello Stolbur nei tessuti fogliari èstata accertata mediante specifiche metodologie biomolecolari. La primafase consisteva nell’estrazione del DNA totale adottando, con alcune leg-gere modifiche, il protocollo di Angelini et al. (2001). I singoli estrattierano poi sottoposti alla così detta reazione a catena della polimerasi(PCR). La procedura consisteva in una prima PCR utilizzando una coppiadi oligonucleotidi (primers) universali (P1/P7), seguita da una secondaamplificazione, detta “nested-PCR”, con una coppia di primers specificiper il fitoplasma in esame (f/r STOL). Infine, gli eventuali amplificati diDNA del fitoplasma si evidenziavano mediante corsa elettroforetica in geldi agarosio all’1% e colorazione con bromuro di etidio. Nei casi in cui siotteneva una risposta positiva si procedeva con ulteriori indagini al finedi caratterizzare sotto l’aspetto genetico-molecolare i vari isolati del fito-plasma in precedenza identificati. Tutto ciò in base alle originarie indica-zioni di Langer e Maixner (2004). Più in particolare, i corrispettivi estrat-ti di acido nucleico si facevano reagire prima con la coppia di primersf/rTuf1 e poi con quella denominata f/rTufAy. Queste amplificano una por-zione variabile del gene non ribosomico tuf che codifica il fattore di allun-gamento Tu (Schneider et al., 1997). I prodotti della nested-PCR, previadigestione con l’endonucleasi di restrizione HpaII (Promega), venivanoinfine analizzati mediante la tecnica RFLP (restriction fragment lengthpolymorphism) per verificare il polimorfismo dei frammenti di restrizione.

L’identificazione dell’eventuale infezione del fitoplasma è stata ancheeffettuata utilizzando un protocollo molto innovativo di “duplex real-timeRT-PCR” (Margaria et al., 2007; Terlizzi et al., 2011). Al proposito, è inte-ressante notare che il saggio si effettua su aliquote di succo grezzo,opportunamente estratto dai tessuti fogliari delle piante considerate,poste su membrane di nylon (Osman e Rowhani, 2006). La duplex real-time RT-PCR permette un’amplificazione in tempo reale grazie all’impie-go di marcatori fluorescenti. Nelle nostre prove sono state impiegatesonde TaqMan® marcate con fluorofori differenti, mettendo nello stessotubo di reazione la combinazione primers/sonda specifica per il fitoplasmae quella specifica per il 18S rDNA delle piante quale controllo endogeno(da qui il termine “duplex”, essendo appunto due le reazioni che si vannoa realizzare).

In modo analogo si è proceduto anche per la caratterizzazione gene-tica-molecolare degli isolati di Stolbur, utilizzando una metodologia di“multiplex real-time RT-PCR” che prevede l’impiego di due sonde ceppo-specifiche (qBN-VK1 e qBN-VK2) per il fitoplasma in esame (Berger et al.,2009) unitamente alla sonda-controllo del DNA delle piante sopra men-zionate.

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Risultati

Negli anni in cui si è operato sono stati complessivamente colleziona-ti, e poi sottoposti alle analisi diagnostiche, 98 campioni fogliari da pian-te di pomodoro che manifestavano i tipici sintomi della malattia. I semen-zali di pomodoro ottenuti da semi di bacche provenienti da piante infet-te, e poi saggiati, erano invece 33.

Come confronti erano considerati pure diversi campioni prelevati dapiante di pomodoro asintomatiche. I risultati dei saggi diagnostici effet-tuati mediante la classica nested-PCR si sono dimostrati in linea con lostatus sanitario stabilito in campo al momento dei prelievi. Infatti, tutti icampioni raccolti dai pomodori con manifestazioni evidenti di Stolbursono apparsi infetti dal fitoplasma omonimo; per contro, i campioni pre-levati dalle piante senza sintomi reagivano negativamente (Figura 1).

Il medesimo responso si otteneva anche dai test analitici effettuati suicampioni dei semenzali.

Oltre un centinaio di piante spontanee, rappresentative di 14 speciediverse, sono state campionate nelle varie località oggetto dell’indagine.A seguito delle verifiche analitiche intraprese, solo fra le popolazioni didue comunissime erbe infestanti si è dimostrata, però, la presenza delfitoplasma. Queste erano Calystegia sepium (Vilucchione), 10 pianteinfette su 35 saggiate, e Convolvulus arvensis (Vilucchio comune), 12piante infette su 35 saggiate (Figura 1).

Figura 1 – Diagnosi del fitoplasma dello Stolbur: corsa elettroforetica su gel di agaro-sio all’1% degli amplificati ottenuti mediante nested-PCR, usando prima una coppia diprimers universali (P1/P7), poi una coppia di primers specifici (fStol/rStol). M = DNAmarker (1 Kb, Invitrogen); 1 = pianta di pervinca riconosciuta infetta (controllo positi-vo); 2 e 4 = piante di pomodoro asintomatiche; 3, 5 e 6 = piante di pomodoro amma-late e risultate infette dal fitoplasma; 7 e 8 = piante di C. arvensis infetta e sana, rispet-tivamente.

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Risultati del tutto similari a quelli precedentemente sintetizzati veni-vano ottenuti allorché si utilizzava la tecnica duplex real-time RT-PCR(dati non riportati).

Tutti gli isolati dell’agente patogeno reperiti nei tre anni, 98 dapomodoro, 10 provenienti da C. sepium e 12 da C. arvensis, sono staticaratterizzati sotto il profilo genetico mediante le citate analisi dinested-PCR e RFLP. I profili dei frammenti di restrizione, ottenuti dopodigestione degli amplificati con l’enzima HpaII, sono apparsi tutti dellostesso tipo, cioè con solo due frammenti di 600 e 300 paia di basi (pb),e più precisamente riferibili al ceppo epidemiologico denominato tuf-b(Figura 2). Risultati analoghi si sono registrati anche con l’uso dellatecnica multiplex real-time PCR (dati non riportati).

Figura 2 – Caratterizzazione del fitoplasma dello Stolbur (RFLP): corsa elettroforeticasu gel di agarosio all’1% dei prodotti di nested-PCR, ottenuti utilizzando prima la coppiadi primers f/r Tuf1 e poi la coppia di primes f/r TufAy, dopo digestione con l’enzina direstrizione HpaII. 1, 2, 3 e 4 = isolati da pomodori sintomatici; 5 = isolato da C. sepium;6 = isolato da C. arvensis; tuf-b = ceppo di riferimento associabile alle due convolvul-cee; tuf-a = ceppo di riferimento associabile invece ad U. dioica; M =100 bp DNA Ladder(Promega).

Conclusioni

Come previsto, tutte le piante di pomodoro con le caratteristicheanomalie morfologiche sono risultate infette dal fitoplasma delloStolbur. Riguardo invece i controlli effettuati sui semenzali ottenuti dasemi di bacche di pomodori colpiti, il responso dei saggi è stato sem-pre negativo. Ciò a dimostrazione che l’agente patogeno non passa alseme o comunque non si trasmette alla progenie mediante questa via.Gli isolati del fitoplasma collezionati sono stati inoltre caratterizzati,risultando tutti appartenere al ceppo denominato tuf-b. Le acquisizio-ni della presente indagine confermano e ampliano quelle delle prece-denti osservazioni (Mazzoni et al., 2008; Panini et al., 2011). La carat-teristica di tale ceppo è di essere strettamente associato alle due con-volvulacee C. sepium e C. arvensis, piante spontanee che usualmenteinfestano i nostri ambienti agrari. Queste, infatti, in natura fungono siada sorgenti d’inoculo del fitoplasma che da ospiti per il principale inset-

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to vettore, il cixiide Hyalesthes obsoletus (Maixner, 1994; Langer eMaixner, 2004; Credi et al., 2004; Credi et al., 2009).

Altri due ceppi epidemiologici del fitoplasma dello Stolbur sono statiriportati in letteratura (Langer e Maixner, 2004). Fra questi si segnalail tuf-a che, in molte realtà ecologiche-ambientali, si ritrova invecestrettamente associato a Urtica dioica. Il profilo RFLP di tale ceppo èfacilmente distinguibile essendo caratterizzato da tre frammenti poli-morfici di 410, 300 e 170 paia di basi (Figura 2). Al proposito è inte-ressante riportare che delle 13 piante di ortica campionate in alcuniappezzamenti di pomodoro con alte incidenze della malattia, nessunaè risultata infetta. Quindi, questo dato indicherebbe che la pianta nonriveste un ruolo epidemiologico significativo nelle realtà agricole chesono state oggetto della presente indagine, contrariamente a quantoverificato, sempre in Emilia-Romagna, per il Legno nero della vite,dove U. dioica è risultata la specie più importante nel ciclo fitoplasma-vettore-ospite (Credi et al., 2004; Credi et al., 2009).

In conclusione, da quanto suc-cintamente esposto, si evince che ilfitoplasma dello Stolbur presentaun’epidemiologia molto complessa,in cui, oltre alle piante ospiti d’im-portanza agraria, sono pure coin-volte alcune piante spontanee qualiserbatoi d’inoculo del patogeno,nonché ospiti dell’insetto vettore.La pluriennale attività condotta nel-l’ambito del nostro programma diricerca ha evidenziato che, nei siticonsiderati, le due specie potenzial-mente importanti sotto l’aspettoepidemiologico sarebbero solo C.

sepium e C. arvensis (Foto 7).Quindi, al fine di limitare l’incidenzadi questa importante malattia delpomodoro nei nostri comprensori,ciò è indubbiamente da tenere inalta considerazione come baseconoscitiva per sviluppare potenziali modalità di intervento. Al riguar-do, si ritiene che tali modalità dovranno essere principalmente di tipoagronomico, come ad esempio il diserbo controllato, nei modi e neitempi più opportuni, delle suddette infestanti.

Foto 7 - C. arvensis con arrossamenti daprobabile infezione fitoplasmatica (FotoV. Testi).

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GLI INSETTI VETTORI DELLO STOLBUR

Emanuele Mazzoni, Rinaldo Nicoli Aldini, Michela Panini

Premessa

Allo stato attuale delle conoscenze si ritiene che solo insetti appar-tenenti all’ordine dei Rincoti siano responsabili della trasmissione dellavirescenza ipertrofica al pomodoro (Stolbur). Gli agenti causali di que-sta malattia sono fitoplasmi che si localizzano nel floema e quindi sologli insetti che si nutrono a carico di questo tessuto sono potenzialmen-te capaci di acquisire e successivamente trasmettere questi patogeni.Varie ricerche hanno consentito di identificare numerose specie,appartenenti a varie famiglie, in grado di trasmettere il fitoplasmaagente dello Stolbur (Weintraub e Beanland, 2006).

Gli insetti che si alimentano su piante infette possono acquisire pas-sivamente il fitoplasma in un periodo ditempo che generalmente dura almenoalcune ore. Segue un periodo di “laten-za” o “incubazione” che può durareanche varie settimane, durante il qualeil fitoplasma si moltiplica nel corpo del-l’insetto vettore e arriva a invaderne leghiandole salivari. Con le successivepunture di alimentazione l’insetto saràcosì in grado di infettare nuove piante(inoculazione).

Attualmente si ritiene che il vettoredel fitoplasma su pomodoro siaHyalesthes obsoletus, RincoteOmottero appartenente alla famigliaCixiidae (Foto 8). Questo insetto è giàda lunga data segnalato come vettoredello Stolbur delle solanacee e di altrecolture da reddito (Fos et al., 1992).

Hyalesthes obsoletus

H. obsoletus è una specie polifaga, diffusa in tutta Italia. Gli adultisono lunghi circa 4-5 mm (i maschi sono leggermente più piccoli dellefemmine). Il corpo è di colore nero lucente, mentre il capo è ornatocon linee bianco–avorio che circondano anche gli occhi rossastri (Foto8). Le forme giovanili (neanidi e ninfe) sono di colore bianco-crema e

Foto 8 – Adulto di H. obsoletus(Foto: Istituto di Entomologia ePatologia vegetale, UniversitàCattolica del Sacro Cuore).

presentano la parte terminale dell’addome provvisto di ciuffi di cerabiancastra (Foto 9 e 10).

Foto 9-10 – Stadi preimmaginali di H. obsoletus rinvenuti su radici di convolvulacee(Foto: Istituto di Entomologia e Patologia vegetale, Università Cattolica del SacroCuore).

Nell’areale europeo questa specie compie una sola generazione all’an-no. Le forme giovanili svernano a svariati centimetri di profondità sulleradici di piante spontanee, prevalentemente allo stadio di ninfa di terzaetà, caratterizzata da una spiccata resistenza nei confronti del freddo. Trale piante ospiti preferite ritroviamo l’ortica (Urtica dioica), il convolvolo(Convolvulus arvensis), il vilucchio (Calystegia sepium) e anche il ranun-colo (Ranunculus sp.). In Italia l’ortica, il convolvolo e la calistegia sonorisultati ospiti naturali del fitoplasma dello Stolbur. Lo sfarfallamento del-l’adulto si verifica nel terreno, ad una profondità compresa tra 1 e 5 cm.

La ricerca si è svolta su appezzamenti di pomodoro in provincia diParma e Piacenza. In tutti i campi sotto indagine, le catture degli adulti,con retino entomologico, sono iniziate a giugno, hanno mostrato un piccoin corrispondenza della prima decade di luglio e si sono poi azzerateentro la prima decade di agosto. Gli adulti della cicalina sono stati trova-ti comunemente su convolvolo; nel maggio 2011 alcune forme giovanilisono state trovate anche sulle radicidi questa pianta.

La specie è stata individuata pre-valentemente sui bordi degli appez-zamenti, dove nel corso dei tre annidi indagine sono stati catturati, conretino entomologico, oltre 400 indivi-dui di H. obsoletus. Le catture effet-tuate con sfalci diretti su pomodorosono state invece molto più rare.

Infine, le trappole cromotropiche(Foto 12) collocate negli appezza-

Foto 11 – Sfalci con retino entomologico(Foto V. Testi).

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menti non hanno di fatto catturatoesemplari di questa cicalina.

Per identificare l’infezione, i sin-goli individui sono stati trattati perestrarne il DNA, successivamentesottoposto ad analisi tramite PCR.Una prima amplificazione è statafatta utilizzando primers universali(P1/P7) situati sulla sequenza codi-ficante per la subunità ribosomale16S (Schneider et al., 1995; Deng eHiruki, 1991). I prodotti di amplifi-cazione sono poi stati diluiti e sotto-posti a una seconda PCR (nested-

PCR) utilizzando la coppia di primers R16(I)F1/R1, specifici per i fito-plasmi di gruppo I e XII (Lee et al., 1998).

Sui campioni positivi è stata effettuata un’ulteriore reazione di PCR,impiegando i primers fTufAY/rTufAY specifici per il fitoplasma in esame(Schneider et al., 1997) e i prodotti di amplificazione sono stati infinedigeriti con l’enzima di restrizione HpaII per caratterizzare i vari isola-ti (tipi “tuf”) secondo Langer e Maixner (2004).

Ogni anno, circa il 10-15% degli esemplari analizzati sono risultatipositivi alla presenza del patogeno. La caratterizzazione molecolare deisottogruppi tuf ha mostrato in tutti i casi una concordanza tra i fitopla-smi trovati negli insetti raccolti (tuf tipo “b”) e i fitoplasmi individuatinelle piante di pomodoro con sintomi di Stolbur e in quelle di convol-volo presenti negli stessi ambienti.

Altre specie

Mediante sfalci con retino entomologico sono state catturate nume-rose altre specie di Rincoti. Il loro elenco e il numero di esemplari cat-turati è mostrato in figura 3.

Svariati esemplari sono stati analizzati insieme a quelli di H. obso-

letus per ricercare la presenza di fitoplasmi, ed in particolare di quellidel sottogruppo dello Stolbur (16SrXII-A). Tuttavia nessun esemplareè mai risultato positivo all’analisi.

Conclusioni

In base ai dati raccolti nel corso del progetto, le analisi svolte sugliinsetti raccolti da appezzamenti di pomodoro nel Piacentino e nelParmense hanno confermato il probabile coinvolgimento di H. obsole-tus nella trasmissione del fitoplasma dello Stolbur.

Foto 12 – Trappola cromotropica (FotoIstituto di Entomologia e Patologia vege-tale, Università Cattolica del SacroCuore).

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Solo esemplari appartenenti a questa specie sono, infatti, risultatiportatori del patogeno. Le analisi hanno dimostrato l’appartenenza ditali fitoplasmi al sottogruppo tuf di tipo “b”, lo stesso che fino ad ora èsempre stato identificato sia nelle piante di pomodoro, con chiari sin-tomi della malattia, sia in quelle di convolvolo e calistegia presentinegli stessi ambienti (Mazzoni et al., 2008; Panini et al., 2011).

Infine, allo stato attuale delle conoscenze, non sarebbero coinvoltealtre specie di Rincoti nella trasmissione dello Stolbur dalle convolvu-lacee (C. arvensis e C. sepium) al pomodoro, non essendo stati trova-ti insetti diversi da H. obsoletus portatori del fitoplasma.

Figura 3 – Elenco dei Rincoti catturati nel corso del progetto (anni 2010-2012).

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COME PREVENIRE LA MALATTIA

Valentino Testi, Stefano Saccò, Bruno Chiusa,

Rino Credi, Emanuele Mazzoni

Premessa

Lo Stolbur del pomodoro, come gran parte delle malattie di originefitoplasmatica, è una patologia complessa la cui espressione epidemio-logica, ed il relativo quadro sintomatologico, dipendono da moltepliciinterazioni tra più soggetti (piante ospiti – fitoplasmi - piante serbato-io – vettori) a loro volta influenzate da altre variabili quali andamentometeorologico, tecniche colturali e agronomiche, composizione dellaflora infestante e dell’habitat circostante.

Questa complessità rende la fitopatia estremamente variabile, diffi-cile da prevedere e quindi difficile da studiare, soprattutto su una col-tivazione come il pomodoro che ha un ciclo relativamente breve e sirinnova di anno in anno su terreni e ambienti diversi.

Negli ultimi anni la malattia si è manifestata in misura maggiorenelle province di Parma e Piacenza, ma l’intensità e la localizzazionedelle infezioni è stata sempre diversa. Infatti, fino al 2010 la fitopatiaè risultata maggiormente dannosa in provincia di Parma, poi nel 2011si è avuta una inversione di tendenza e nel 2012 la fitoplasmosi si èmanifestata poco in entrambi i territori, risentendo, presumibilmente,delle eccezionali condizioni di caldo e siccità.

Prevenzione

Vista l’aleatorietà di questa avversità fitoplasmatica, il miglioresistema di contenimento rimane la prevenzione. Pertanto, negli arealipiù infetti dove la malattia si manifesta con maggiore frequenza, siraccomanda di non coltivare pomodoro a ciclo tardivo nei terreni insuccessione a prati stabili, nei quali la percentuale di piante infette puòarrivare fino all’80% del totale, ed in quelli posti nelle vicinanze di zoneincolte e canali.

Utile anche l’eliminazione delle piante di pomodoro alla comparsadei primi sintomi della malattia, al fine di abbassare la presenza difocolai infettivi.

Fondamentale è l’attenta gestione del territorio, attraverso il conte-nimento delle piante spontanee e delle malerbe, soprattuttoConvolvulus arvensis e Calystegia sepium, che fungono da serbatoiod’inoculo del patogeno e da ospiti degli stadi giovanili del vettore

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Hyalesthes obsoletus. Risulta particolarmente efficace il controllo dellesuddette convolvulacee nelle coltivazioni di cereali che rientrano nellarotazione aziendale.

Una lotta diretta contro i fitoplasmi non è possibile, per cui è impor-tante ricorrere ad una gestione integrata dell’agroecosistema. Il mate-riale di propagazione deve essere sano. A questo riguardo si ribadisceche l’analisi delle piantine, ottenute da seme prelevato da baccheinfette, evidenzia che il fitoplasma non si trasmette attraverso il seme.

Difesa

La lotta chimica ai vettori è efficace solo quando il vettore è infeu-dato alla coltura da difendere, come avviene per Scaphoideus titanus,vettore della Flavescenza dorata della vite.

H. obsoletus, invece, è notevolmente polifago e visita occasional-mente le coltivazioni di pomodoro prediligendo la flora erbacea spon-tanea all’interno ed attorno ai campi coltivati. Inoltre, la malattia simanifesta in modo improvviso e con situazioni epidemiologiche diffici-li da prevedere.

Ciò nonostante, si è voluto verificare con sperimentazioni di campo,in areali frequentemente infetti, se uno o due trattamenti insetticidipotessero influire sulla dinamica delle popolazioni dei vettori e sullatrasmissione della malattia. Gli interventi sono stati posizionati nelmese di giugno, mese che, nei vari monitoraggi effettuati, ha eviden-ziato il volo degli adulti di H. obsoletus.

Nel 2011 l’applicazione di uno o due trattamenti con insetticida neo-nicotinoide, eseguiti a metà e fine giugno, ha consentito di ridurresignificativamente l’incidenza della malattia nella tesi con il doppiotrattamento (1,5% di piante di pomodoro sintomatiche), mentre nellatesi con un solo trattamento le piante colpite erano inferiori rispetto altestimone non trattato (rispettivamente 2,6% e 3,9%), ma non inmodo statisticamente significativo.

Foto 13 e 14 – Campi di pomodoro in successione a prato stabile distrutti da Stolburnel 2010 a Parma e nel 2011 a Piacenza (Foto V. Testi).

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Nel 2012 alle tesi “1 o 2 interventi con neonicotinoide”, eseguitinelle stesse epoche dell’anno precedente, si sono aggiunte le tesi “1 o2 trattamenti con piretroide", ma la scarsa presenza della malattia nonha consentito di ottenere differenze significative tra le diverse tesi esolo il doppio intervento con neonicotinoide ha mostrato un’efficaceriduzione della malattia (1% di piante di pomodoro sintomatiche)rispetto al testimone (4%).

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CONCLUSIONI

Anna Rosa Babini

L’attività di sperimentazione, oggetto del presente lavoro, ha per-messo di approfondire le conoscenze sulla eziologia e sulla epidemio-logia dell’avversità fitoplasmatica Stolbur che danneggia le coltivazio-ni di pomodoro a ciclo tardivo nelle province di Parma e Piacenza. Letecniche di diagnosi a base molecolare, oggi disponibili, rendono pos-sibile l’accertamento dell’effettiva presenza del fitoplasma delloStolbur nelle piante con i caratteristici sintomi di nanismo, virescenza,clorosi e accartocciamento fogliare. Tale agente infettivo è stato ritro-vato e caratterizzato anche nelle infestanti convolvulacee Calystegia

sepium e Convolvulus arvensis che, in natura, fungono sia da sorgen-ti d’inoculo del fitoplasma che da ospiti per il principale insetto vetto-re, il cixiide Hyalesthes obsoletus. Le analisi molecolari hanno confer-mato la positività di questo insetto e, quindi, il suo probabile coinvol-gimento nella trasmissione del fitoplasma dello Stolbur, a differenza diesemplari di altre specie di Rincoti reperiti nelle stesse aree, ma risul-tati tutti negativi.

Il progetto finanziato dalla Regione Emilia Romagna (L.R. 28/98) haquindi consentito di individuare alcuni accorgimenti per prevenire ladiffusione della stessa: eliminazione delle convolvulacee infestanti;appropriate rotazioni colturali; scelta di varietà a maturazione precocee media, evitando di coltivare le varietà tardive in successione a pratistabili e/o nelle aree a maggior diffusione della patologia. Da appro-fondire ulteriormente l’utilità e l’eventuale efficacia degli interventiinsetticidi contro il vettore della malattia.

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Finito di stamparenel mese di novembre 2012Grafiche Lama - Piacenza