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Ziele und Fragenstellungen Zielsetzung
Die vorliegende Arbeit setzt sich zum Ziel, eine Methode zu finden, mit der
möglichst schnell und primär auch mit hoher Sensitivität sowie Spezifität
eine Penicillinase-Produktion bei S. aureus nachgewiesen werden kann..
Als Referenzmethode wird eine genotypische Methode, die blaZ-PCR
gewählt. Folgende Methoden werden dafür herangezogen:
1) Penicillin-Disk (10 Units) mit Interpretation gemäss CLSI (≥ 29 mm=S,
< 28 mm=R) und Beurteilung des Hemmhofrandcharakters
2) Penicillin-Disk (1 Unit) mit Interpretation gemäss EUCAST (≥ 26
mm=S, < 26 mm=R) und Beurteilung des Hemmhofrandcharakters
3) Nitrocefin-Test (Cefinase®)
4) Flüssig-Cefinase
5) Cloverleaf-Test
Desweiteren ist das Ziel die Gegenüberstellung der CLSI- und der
EUCAST-Richtlinien in Bezug auf das Vorgehen zur Detektion der
Penicillinase beim S. aureus.
Fragenstellung
1. Welcher dieser evaluierten Methoden ist für die Bestimmung der
Penicillinase die sensitivste, spezifischste und schnellste bezogen auf
die Referenzmethode PCR?
2. Welche der beiden obengenannten Richtlinien begünstigt die
Detektion der Penicillinase beim S. aureus?
Zusammenfassung Heute bilden in der Schweiz über 80% der Staphylococcus aureus-Stämme (S. aureus) eine Penicillinase. Diese ist verantwortlich für die Resistenz gegenüber Penicillin.
Das kodierende Gen für die Penicillinase heisst blaZ. Penicillin gilt als Mittel der Wahl gegen Penicillin-sensible S. aureus-Isolate ohne Penicillinase-Produktion. Eine sichere
Unterscheidung zwischen Penicillin-sensiblen und -resistenten S. aureus-Isolaten ist daher von grosser klinischer Bedeutung. Deshalb gilt es, eine zuverlässige
diagnostische Methode für die Detektion einer Penicillinase zu finden.
In dieser Arbeit wurden verschiedene phänotypische Methoden (Nitrocefin-Disk Test, Flüssig-Cefinase, Cloverleaf-Test und Agardiffusionstest inkl. Hofrandcharakter nach
CLSI- und nach EUCAST-Richtlinien) mit der Referenzmethode blaZ-PCR verglichen. Es handelt sich dabei um eine retrospektive Untersuchung mit 98 S. aureus-Isolate
aus der Stammsammlung des IFIK Bern, die Initial als "nicht Penicillinase-produzierend" berichtet wurden. Von diesen 98 Stämmen wiesen nur 4 das blaZ-Gen auf und
zwei der vier positiven Stämme wurden in keiner der ausgetesteten phänotyischen Methoden positiv.
Der Nitrocefin-Disk Test, die Flüssig-Cefinase und der Agardiffusionstest (nach CLSI) erzielten eine Sensitivität von 0%. Der Hofrandcharakter nach CLSI wies eine
Sensitivität von 25% auf. Über Nacht erzielte die Flüssig-Cefinase eine verbesserte Sensitivität von 50%. Der Agardiffusionstest inkl. Hofrandcharakter (nach EUCAST) und
der Cloverleaf-Test zeigten eine Sensitivität von 50%. Die Spezifität fiel bei allen Methoden zu 100% bzw. beim Hofrandcharakter (nach EUCAST) zu 98.88% aus.
Der Cloverleaf-Test und der Agardiffusionstest (nach EUCAST) könnten unter gewissen Umständen routinemässig eingesetzt werden.
Diskussion Verglichen mit der Referenzmethode blaZ-PCR stellen sich in dieser Arbeit der Agardiffusionstest nach EUCAST mit dem Penicillin-Disk von 1 Unit (inkl. Bewertung des
Hemmhofrandcharakters) und der Cloverleaf-Test als relativ sensitive und spezifische phänotypische Methoden heraus. Beide Methoden sind unkompliziert in der Durchführung
und können mit etwas Übung sicher abgelesen werden. Als einziger Nachteil ist die Bebrütungsdauer von ca. 16 Stunden zu bemängeln.
Der Nitrocefin-Disk Test und die Flüssig-Cefinase sind obschon der Schnelligkeit für die Routine weniger geeignet, da diese Methoden einige falsch negative Resultate
erzielten.Das Fazit welches bezüglich der CSLI- und der EUCAST-Richtlinien gemacht werden kann, befürwortet das Arbeiten mit den EUCAST-Richtlinien, weil dadurch die
Detektion der Penicilinase begünstigt wird. Die Bedeutsamkeit eine möglichst schnelle, sensitive und spezifische Methode zur Detektion einer Penicillinase in S. aureus zu
finden, konnte trotz der geringen Anzahl an blaZ-positiven S. aureus-Isolaten (N=4) gezeigt werden.
Das Resultat ist aufgrund der wenigen blaZ-positiven S. aureus Isolaten statistisch nicht relevant. Dennoch ist die Dringlichkeit der Thematik erkennbar und gewisse Tendenzen
können erkannt werden.
Material, Methodik, Vorgehen Die 98 S. aureus-Patientenisolate werden mit 4 verschieden Methoden auf
die Penicillinase geprüft. Das Prinzip des Nitrocefin-Disk Tests und der
Flüssig-Cefinase beruht auf einem Farbumschlag. Ist die Penicilinase
vorhanden wird eine Säure freigesetzt und es erscheint die Farbe Rot. Der
Cloverleaf-Test zeigt bei Vorhandensein der Penicillinase ein
Kleeblattmuster. Beim Agardiffusions-Test wird mit einem Penicillin-Disk 1
und 10 Units gearbeitet. Es wird der Hemmhofdurchmesser wie auch der
Hemmhofrandcharakter beurteilt. Die Auswertung erfolgt beim Penicillin-
Disk 10 Units nach CLSI und beim Penicillin-Disk nach EUCAST.
Für den Nachweis, ob das gesuchte Gen blaZ in den S. aureus-Stämmen
ist, wird das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) genutzt. Die
phänotypische Expression des Gens, kann jedoch nicht garantiert werden.
Einleitung
S. aureus ist ein gram-positives, fakultativ anaerobes, rundlich bis ovales
Bakterium. Das Bakterium kommt weltweit vor und kann sowohl Mensch
wie auch Tier besiedeln. Etwa 20-50% der humanen Bevölkerung sind
Träger des S. aureus. Die Übertragung des Keimes geschieht
hauptsächlich durch Schmierinfektionen. Vor allem in Spitälern kann sich
der Keim durch Pflegepersonal oder Ärzte unbemerkt auf Patienten
übertragen. Dies führt zu den sogenannten nosokomialen Infektionen. (Nagel, 2015.)
Beta-Laktam-Antibiotika zählen zu den wichtigsten Antibiotika-Klassen. Zu
den Beta-Laktam-Antibiotika zählt auch die Substanzklasse Penicilline. Es
wirkt bakterizid, indem es in die Zellwandbiosynthese eingreift und so eine
Quervernetzung der Transpeptidase verhindert. Die Bakterien haben
jedoch im Laufe der Zeit verschiedene Resistenzmechanismen entwickelt,
um sich gegen Antibiotika zu schützen. Dazu gehören auch die Enzyme β-
Laktamasen. Durch diese Enzyme verliert das Antibiotikum seine Wirkung.
Penicillinasen gehören einer Untergruppe der β-Laktamasen. Sie werden
durch die Abgabe der Penicilline in S. aureus hervorgerufen. Das Gen, auf
welchem die Penicillinase codiert heisst blaZ. Kann bei S. aureus eine
Penicillinasebildung ausgeschlossen werden, ist Penicillin die Therapie
der Wahl. Deshalb ist eine sichere Unterscheidung zwischen Penicillin-
sensiblen und –resistenten S. aureus-Isolaten von grosser Bedeutung. (Lenga S., 2010)
Es gibt zwei wichtige Richtlinien, nach welchem ein Mikrobiologielabor eine
Resistenzprüfung durchführen kann. Dies ist CLSI und EUCAST.
Ergebnisse/ Resultate Von den 98 untersuchten Stämmen zeigten vier ein Vorhandensein des
blaZ-Gens. Daraus folgt, dass von den total 98 S.aureus-Stämmen (100%),
vier (3.92) blaZ-Gen Träger sind. In der Tabelle sind die Sensitivität sowie
die Spezifität der phänotypischen Methoden, berechnet anhand der
Referenzmethode blaZ-PCR.
Phänotypische
Methode Sensitivität
Richtig
positive
N=4
Spezifität
Nitrocefin-Disk Test 0% 0 100%
Flüssig-Cefinase nach 1
Std. 0%
0 100%
Flüssig-Cefinase über
Nacht 50% 2 100%
Cloverleaf-Test 50% 2 100%
Hemmhofdurchmesser
mit
Penicillin-Disk 10Units
0% 0 100%
Hemmhofdurchmesser
mit
Penicillin-Disk 1Unit
50% 2 100%
Hofrandcharakter mit
Penicillin-Disk 10Units 25% 1 100%
Hofrandcharakter mit
Penicillin-Disk 1Unit 50% 2 98.88%
Nitrocefin-Disk Test Flüssig-Cefinase
Cloverleaf-Test Agardiffusions-
Test
Referenzmethode
PCR
(Eigene Abbildungen)
Natascha Wymann BMA 12-15, 11.09.2015 IFIK Bakteriologie Bern Quellen: Nagel, G. [Stand 22.03.2015] Staphylococcus aureus, http://www.onmeda.de/krankheitserreger/staphylococcus_aureus.html
Lenga S,. 2010,: S.10-12l Dissertation. http://www-brs.ub.ruhr-uni-bochum.de/netahtml/HSS/Diss/LengaSarahMagdalena/diss.pdf