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STRESS OSSIDATIVO
Stress chimico indotto dalla presenza, in un organismo vivente,
di un eccesso di specie chimiche reattive, generalmente centrate
sull’ossigeno (reactive oxygen species, ROS), secondario ad
un’aumentata produzione delle stesse e/o a una ridotta
efficienza dei sistemi fisiologici di difesa antiossidanti.
Radicali liberiAntiossidantiProtezione
dalle malattieDanno cellulare
(invecchiamento e malattie)
Radicali liberiAntiossidanti Radicali liberiAntiossidantiProtezione
dalle malattieDanno cellulare
(invecchiamento e malattie)
Protezione dalle malattieProtezione
dalle malattieDanno cellulare
(invecchiamento e malattie)
Danno cellulare(invecchiamento
e malattie)
PRO-OSSIDANTI ANTIOSSIDANTI
STRESS OSSIDATIVO
Sbilanciamento dell’equilibrio tra pro-ossidanti e antiossidanti
nell’organismo a favore dei pro-ossidanti
Lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra processi pro-ossidanti e processi antiossidanti (Sies, 1991)
Specie reattive Difese antiossidanti
Radiazioni, farmaci, metalli pesantiFumo di sigaretta, alcool, inquinamentoEsercizio fisico inadeguato, sedentarietà
Infezioni ed altre malattie
Ridotta assunzione e/o diminuita sintesi
e/o ridotta capacità di utilizzazione e/o aumentato consumo di antiossidanti
Danno cellulare
Invecchiamento precoce
Malattie cardiovascolari
Altre malattie
Demenza, M. di Parkinson
Infiammazioni,tumori
Danno tissutale
Danno d’organo
Danno sistemico
Reazioni del metabolismo dell’ossigeno
L’ossigeno è una molecola biatomica solitamente rappresentata come
O::O
In realtà alla temperatura corporea l’ossigeno è un biradicale
.O : O.
con due elettroni spaiati, ciascuno localizzato su un orbitale diverso. A causa quindi della sua configurazione elettronica l’ossigeno va incontro a riduzione monovalente ( 1 e-)
Quando un ossigeno guadagna un elettrone, si trasforma in radicale anione superossido, O2
- . L’aggiunta di un secondo elettrone (insieme con due protoni) trasforma quest’ultimo in perossido di idrogeno, H2O2. Il perossido non è un radicale ma guadagna facilmente un altro elettrone dando spazio ad un radicale idrossilico, OH che è una particella chimica molto attiva che inizia facilmente reazioni a catena incontrollabili.
I principali ROS sono: O2
- (anione superossido),
O2H (radicale idroperossido); OH (radicale idrossilico);
NO (monossido d’azoto);
ONOO- (anione perossinitrito).
Esistono altre molecole, quali H2O2 (perossido d’idrogeno) e HOCl (acido ipocloroso) che pur non essendo radicali di per sé, producono facilmente il radicale idrossilico, altamente reattivo
Nei sistemi biologici, i radicali liberi dell’ossigeno o ROS (Reactive Oxygen Species) vengono generati ed eliminati continuamente.
Le specie chimiche reattive, radicaliche, agiscono come ossidanti
L’ossidazione, ovvero il trasferimento di uno o più elettroni, è la base chimica dello stress ossidativo
++
Radicale (ossidante)
A A
Nuova molecola (ridotta, stabile)
Molecola bersaglio (doppio legame C-C)
C C
Nuovo radicale(ossidante)
CC
Elettrone spaiatoOSSIDAZIONE
REAZIONI DI RADICALI LIBERI
INIZIO: formazione di radicali liberi
PROPAGAZIONE: i radicali liberi reagiscono con altre
molecole per produrre altri
radicali liberi
TERMINAZIONE: i radicali liberi reagiscono tra loro per
formare molecole
REAZIONI DI RADICALI LIBERI
CH4 + Cl2 CH3Cl + HCl
INIZIO
Cl Cl Cl Cl
• Richiesta luce UV per questo primo stadio
• Formazione di radicali liberi
PROPAGAZIONE
• Non è richiesta luce
• Ogni reazione produce radicali liberi
La propagazione è caratterizzata da reazioni in ciascuna delle quali si consuma un radicale libero e se ne forma un altro
Molecole H
Cl + H C H
H
Radicali liberi
H
Cl H + C H
H
H
H C + Cl Cl
H
H
H C Cl + Cl
H
TERMINAZIONE
La terminazione è caratterizzata dalle reazioni dei radicali liberi per produrre molecole
Cl + Cl
H H
C H C H H H
H
Cl + C H
H
H
Cl C H
H
Cl Cl
H H
H C C H
H H
Diverse specie chimiche reattive sono implicate nella patogenesi dello STRESS OSSIDATIVO
Non radicale
HOClOAcido ipocloroso
Radicale-STiile
Non radicale
ROONO(Alchil)perossinitrito
Non radicale
NO2+Catione nitronio
Non radicale
ONOOHAcido perossinitroso
Non radicale
ONOO-Perossinitrito
Non radicale
N2O3Triossido nitrico
Non radicale
N2O4Tetrossido nitrico
Non radicale
HNO2Acido nitroso
RadicaleNOOssido nitricoNon
radicaleO3Ozono
RadicaleE-OFenossile (dalla vitamina E)
RadicaleQSemichinone (dal Coenz. Q)
Non radicale
ROOH(Alchil)idroperossido
RadicaleROO(Alchill-)perossil radicale
RadicaleRRadicale alchilico
RadicaleHORadicale ossidrile
Non radicale
H2O2Perossido di idrogeno
Radicale (?)1O2*Ossigeno singoletto
RadicaleO2Anione superossido
ClasseFormulaSpecie chimica ClasseFormulaSpecie chimica
I ROS vengono prodotti sia attraverso una serie di reazioni
catalizzate da enzimi che attraverso reazioni di natura non
enzimatica.
I ROS possono essere prodotti anche in seguito ad esposizione
a radiazioni ionizzanti, xenobiotici, agenti chemioterapici.
reazione di Fenton: H2O2 + Fe2+ (Cu+ ) Fe3+ (Cu2+) + HO + OH-
reazione di Haber-Weiss: H2O2 + O2
- HO + OH- + O2 Il perossido di idrogeno in presenza di ioni Fe2 + o Cu2+ reagisce con l’anione superossido prendendo parte alla:
I mitocondri vengono considerati la fonte principale di ROS cellulari poiché i radicali del superossido vengono generati costantemente durante la fosforilazione ossidativa e possono essere convertiti in H2O2 ed altre specie reattive dell’ossigeno
Durante i processi di fosforilazione ossidativa, il 4-5% dell’ossigeno non viene completamente ridotto ad H2O, ma forma prodotti intermedi dell’O2 altamente reattivi
Nella cellula, i ROS oltre che nei mitocondri, vengono generati anche in altri compartimenti e da molti enzimi.
Numerose attività metaboliche sono in grado di generare ROS
Citocromo P450
Citocromo b5
NADH deidrogenasiCitocromo ossidasi
NADPH ossidasiLipoossigenasi
Xantina ossidasi Aldeide ossidasi
Stress ossidativoda modificazioni reattivedella superficie cellulare
Stress ossidativo da induzione
farmacometabolica
Stress ossidativo da variazioni
intracellulari della pO2
Stress ossidativoda ridotta efficienza del-la respirazione cellulare
Citocromo P450
Citocromo b5
Xantina ossidasi Aldeide ossidasi
NADPH ossidasiLipoossigenasi
NADH deidrogenasiCitocromo ossidasi
Produzione di ROS dal catabolismo purinico
Xantina Xantina ossidasiossidasi
ipoxantinaipoxantina xantinaxantina xantinaxantina Acido uricoAcido urico
HH22O + OO + O22 HH22OO22 OO22 OO22..
Meccanismo d’azione della NADPH ossidasi
Biosintesi dell’NO
Agisce come importante
messaggero intra ed inter
cellulare regolando molte
funzioni: pressione arteriosa,
respirazione, coagulazione
del sangue ed alcune attività
cerebrali.
Ha un ruolo determinante
nella difesa dalle infezioni
batteriche e nella
prevenzione dei tumori
MECCANISMI DI PRODUZIONE DI ROS
Negli organismi viventi i ROS sono generati nel corso della normale attività metabolica cellulare
A concentrazioni elevate i ROS sono dannosi per l’organismo in
quanto attaccano i maggiori costituenti della cellula (proteine, acidi
nucleici, lipidi) partecipando così a processi complessi quali
l’invecchiamento e le patologie ad esso correlate.
A concentrazioni moderate i ROS partecipano attivamente ad una
varietà di processi biologici complessi, implicati nella normale
crescita cellulare quali la trasduzione del segnale, il controllo
dell’espressione genica, la senescenza cellulare, l’apoptosi
Effetto dei ROS sulle macromolecole
I ROS causano danni ossidativi, chimici alle biomolecole Il radicale idrossilico OH reagisce con le biomolecole tramite reazioni di sottrazione o addizione di H. Uno dei siti più sensibili al danno causato dai ROS è la membrana plasmatica, in particolare il bersaglio è a livello degli acidi grassi poliinsaturi
Il radicale idrossilico OH reagisce con vari amminoacidi per formare derivati idrossilati
Il radicale idrossilico OH reagisce con le basi azotate I ROS reagiscono anche con i carboidrati per formare composti dicarbonilici
La matrice cellulare rappresenta uno dei principali target
delle specie reattive dell’ossigeno
Il danno della matrice extracellulare gioca un ruolo determinante nella patogenesi dello stress ossidativo
Gli effetti dello stress ossidativo sulla struttura e sulle funzioni cellulari
Cellula normale(senza lesioni)
Cellula dopo l’attacco dei ROS
Perossidazione di lipidi
Modificazioni enzimatiche
Modificazioni del DNA
Denaturazionedi proteine
Perossidazione ammi-noacidi e proteine
(Per)ossidazione di carboidrati
Alterazioni dellaomeostasi ionica
Effetto dei ROS sulle macromolecole
Uno dei siti più sensibili al danno causato dai ROS è la membrana plasmatica, in particolare il bersaglio è a livello degli acidi grassi poliinsaturi.
Il radicale idrossilico OH sottrae un atomo di idrogeno ad un acido grasso poliinsaturo, iniziando così una catena di reazioni di perossidazione lipidica.
I perossidi lipidici formati in questa reazione vengono degradati per formare dei prodotti caratteristici quali la malonildialdeide (MDA) o l’idrossinonenale (HNE)
Questi composti reagiscono con le proteine formando legami crociati e addotti chimici con esse (prodotti finali di lipoossidazione avanzata)
DANNO INDOTTO DALLA LIPOPEROSSIDAZIONE ALLE MEMBRANE BIOLOGICHE
RADICALI LIBERI
ridotta fluidita’ di membrana
perossidazione dei PUFA
(acidi grassi polinsaturi)
compromessa attività cellulare
NEOPLASIE
MALATTIE
CARDIOVASCOLARI
INVECCHIAMENTO
Effetto dei ROS sulle macromolecole
Il radicale idrossilico OH reagisce con vari amminoacidi per formare derivati idrossilati
H2O2 e HOCl e ONOO- reagiscono con la metionina e la tirosina per formare nitro-e-clorotirosina e metionina solfossido
Effetto dei ROS sulle macromolecole
Il radicale idrossilico OH reagisce con le basi azotate. I maggiori prodotti dell’ossidazione sono la 8-ossiguanosina (il principale indicatore di danno al DNA), timinaglicole, 5-idrossimetiluracile
RADICALI LIBERI E ACIDI NUCLEICI
EFFETTI DEI RADICALI LIBERI NEI
SISTEMI BIOLOGICI
Difese antiossidanti Per evitare i danni ossidativi, la cellula ha sviluppato un sofisticato sistema di difesa
nei confronti dei ROS di natura enzimatica e non (attività “scavenger”). Tali meccanismi di difesa sono fondamentali per l’omeostasi redox cellulare che dipende dal bilancio tra generazione dei ROS e sistemi antiossidanti. Quando l’equilibrio si sposta a favore dei primi oppure la cellula si trova in uno stato di carenza di difese antiossidanti si crea la condizione di stress ossidativo.
I principali enzimi responsabili dell’omeostasi redox cellulare sono: la superossido dismutasi (SOD) la catalasi la glutatione perossidasi la tioredossina la perossiredossina
Questi enzimi funzionano come “scavengers” dei ROS, ma non possono intervenire direttamente sulle macromolecole biologiche a rimuovere un danno già avvenuto.
Il sistema antiossidante è regolarmente distribuito nella cellula
ANTIOSSIDANTI
ENDOGENI
Enzimi: SOD, catalasi, glutatione perossidasi
Proteine: proteine-SH, leganti metalli (Fe, Cu)
Altre molecole: acido urico, bilirubina ...
Vitaminici:
• Vitamina C
• Vitamina E
• Carotenoidi (-carotene)
Non vitaminici:
• Carotenoidi
• Polifenoli
ESOGENI
Meccanismo d’azione degli antiossidanti
Antiossidanti preventivi
Bloccano la formazione dei
radicali
Antiossidanti
scavenger
Bloccano la reazione di inizio
Bloccano la reazione di propagazione
Riparano il danno e ricostituiscono le membrane
Antiossidanti di riparo e de novo
Inquinanti, fumo, radiazioni, metalli pesanti,farmaci, alcool, ischemia-riperfusione, …
Specie Chimiche Reattive
Attacco di biomolecole(glicidi, lipidi, proteine,
ecc)
Reazioni radicaliche a catena
Danno ossidativo
Invecchiamento, malattie
ANTIOSSIDANTI PREVENTIVI
Prevengono la formazione dei radicali liberi
Classe Esempi Meccanismo d’azione Transferrina, lattoferrina, ferritina Sequestro di ferro Aptoglobina Sequestro di emoglobina Emopessina Stabilizzazione dell’eme
Sequestratori di metalli
Ceruloplasmina, albumina Sequestro di rame Carotenoidi Quenching dell’ossigeno singoletto “Quencher”
di ROS Superossido dismutasi 2O2• + 2H+ H2O2 + O2
Catalasi
2 H2O2 2 H2O + O2
Perossidasi H2O2 + AH2 2 H2O + A LOOH + AH2 LOH + H2O + A
Glutatione perossidasi (plasmatica)
PLOOH+2GSH PLOH+H2O+GSSG
Glutatione perossidasi (dei perossidi fosfolipidici)
H2O2 + 2 GSH 2 H2O + GS–SG PLOOH+2GSH PLOH+H2O+GSSG
Glutatione perossidasi (intracellulare)
H2O2 + 2 GSH 2 H2O + GS–SG LOOH+2GSH LOH+H2O+GS–SG
Inattivatori di perossidi
Glutatione–S–trasferasi
Scissione dei perossidi lipidici
ANTIOSSIDANTI SCAVENGER
Riducono la concentrazione di radicali liberi rimuovendoli dal mezzo in cui si trovano
Natura idrofila: albumina, acido urico, vitamina C
Natura lipofila: carotenoidi, vitamina E, coenzima Q
AGENTI DI RIPARO
Enzimi che intervengono dopo il danno effettuato dai radicali liberi
Idrolasi, transferasi, polimerasi
AGENTI DI ADATTAMENTO
Sostanze o tecniche attraverso le quali è possibile potenziare il sistema antiossidante fisiologico di un organismo
esercizio fisico, regime alimentare corretto ed equilibrato
ANTIOSSIDANTI SOLUBILITA’ RDA M/F DOVE
VitaminaA
Vitamina C
Vitamina E
Licopene
Bioflavonoidi
GTE (green tea extract)
Sali di Mg,Zn
Se, Cr
Grassi poliinsaturi
Acidi grassi (Omega 6)
Acidi grassi (Omega 3)
liposolubile
idrosolubile
liposolubile
liposolubile
Idrosolubile
1000/800
60/60mg
10/8 mg
1.7/1.3 mg
5 gr
5-6 gr
Frutta gialla, arancione o verde scura
Frutta, ortaggi a gemma
Fegato, uova
Pomodoro
Cereali, carne, latte
Te’ verde
Olio d’oliva
Semi vegetali
Pesce
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
ENZIMATICI, CELLULARI
SUPEROSSIDO DISMUTASI
(SOD)
Principale antiossidante cellulare, mantiene bassa la concentrazione di anione superossido (O2
-• )
Converte l’anione superossido in perossido d’idrogeno
Agisce in collaborazione con la catalasi e la glutatione perossidasi
La superossido dismutasi (SOD)
La SOD catalizza la reazione di dismutazione dell’anione superossido:
2 O2- + 2H+ H2O2 + O2
Se ne conoscono varie forme isoenzimatiche.Nei mitocondri l’isoenzima utilizza come cofattore il manganese (MnSOD). Altri isoenzimi, di cui alcuni anche a localizzazione nucleare hanno come cofattori rame o zinco (Cu/ZnSOD). Esiste anche un isoenzima Cu/ZnSOD extracellulare secreto (EC-SOD)
La catalasi (appartiene alla classe delle ossido-reduttasi), localizzata nei perossisomi, inattiva l’H2O2 catalizzando la reazione:
2H2O2 O2 + 2H2Ocontiene un gruppo eme
CATALASI (CAT)
2 H2O2 2 H2O + O2
Eme-proteina presente nei perossisomi e nel citosol degli RBC
Agisce con la SOD per la rapida detossificazione dell’anione superossido (O2
-•)
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
ENZIMATICI, CELLULARI
PEROSSIDASI (Px)
Diverse forme, diverse localizzazioni, diversi substrati
Difesa cellulare primaria contro i perossidi (R-OOH, H2O2)
Convertono i perossidi in H2O in presenza di riducenti
R-OOH + AH2 R-OH + A + H2O
La glutatione perossidasi
GLUTATIONE PEROSSIDASI (GSH-Px)
2 H2O2 2 H2O + O2
2 GSH GSSG
ROOH ROH + H2O
GLUTATIONE REDUTTASI
NADPH2NADP+
ANTIOSSIDANTI ENDOGENIENZIMATICI, CELLULARI
Richiede selenio (cofattore) e glutatione (riducente)
Tripeptide (Glu-Cys-Gly) endogeno idrofilo a basso PM Cofattore della glutatione-perossidasi (GPx) Consente alla GPx di svolgere il suo ruolo antiossidante
GLUTATIONE (GSH)
GLUTATIONE (GSH)
Azione disintossicante
Attività immunitaria
Attività protettiva nei riguardi del SNC
E’ presente in alimenti quali: cocomero, avocado, asparagi,
pompelmo, patate, fragole, pomodori, arance, spinaci.
Ciclo del glutatione
2 NADP+
2 NADPH + H+
2 GSH
GS – SG 2 H2O
H2O2
GS – SG TRASLOCASI
ESCREZIONE
Pr – SH Pr – SG + GSH
H2O + ½ O2
O2•
GSH–R GPx
SOD
CAT
Agenti esogeni/metabolismo
SOD: superossidodismutasiCAT: catalasiGPx: glutatione perossidasiGSH-R: glutatione reduttasi
La vitamina C e la vitamina E agiscono in maniera coordinata e sinergica: la vitamina C rigenera l’-tocoferolo trasformandosi in radicale ascorbile, e viene riconvertita ad acido ascorbico da una reduttasi NADPH-dipendente.
L’-tocoferolo protegge le membrane dal danno ossidativo in quanto blocca le reazioni a catena caratteristiche del processo di perossidazione lipidica delle membrane biologiche.
Le principali molecole non enzimatiche che contribuiscono all’equilibrio redox cellulare sono:
la vitamina C (o acido ascorbico),
la vitamina E (o -tocoferolo),
vitamina A (o -carotene),
l’urato, il piruvato, e infine il GSH
ANTIOSSIDANTI ENDOGENINON ENZIMATICI
PROTEINE -SH:
• Agiscono come antiossidanti plasmatici.
• Acquistano un e- generando un radicale sulfidrilico (-S•) più stabile.
PROTEINE LEGANTI Cu-Fe:
• Proteine di trasposto: transferrina (2Fe+++) e ceruloplasmina (Cu++)
• Proteine di deposito: ferritina (FeOOH)
ANTIOSSIDANTI ENDOGENI
NON ENZIMATICI
BILIRUBINA:
• Prodotto di degradazione dell’eme
• Blocca i radicali perossilici a livello plasmatico
ACIDO URICO:
• Prodotto finale del catabolismo delle purine (adenina e guanina)
• Chela i metalli e riduce l’ozono (antiossidante del tratto respiratorio)
ACIDO URICO
Sostanza a basso peso molecolare, idrofila Potente scavenger contro vari ossidanti (HO•,O2*, O3, HClO)
Chelante nei confronti di metalli di transizione (Fe, Cu) Previene l’ossidazione Fe-dipendente dell’ascorbato
N
N
H
N
N
OH
HO
OH
N
N
H
N
N
OH
HO
OH
ANTIOSSIDANTI ESOGENIVITAMINICI
ACIDO ASCORBICO (Vitamina C)
Principale antiossidante extracellulare idrosolubile
Può bloccare O2-•, HO•, H2O2,
1 O2
Riducendo il radicale tocoferile rigenera la vitamina E
Il radicale ascorbile è rigenerato dalla NADPH deidroascorbato reduttasi, mentre il deidroascorbico dall’ascorbico reduttasi-GSH.
Vitamina C
VITAMINA E
ANTIOSSIDANTI ESOGENI
VITAMINICI
Attività antiossidante vitamina E
VITAMINA E
• Sostanza liposolubile.
• Principale radical-scavenger delle membrane e delle
lipoproteine.
• Agisce bloccando i radicali perossilici formatisi durante la
perossidazione lipidica.
• Può essere rigenerata dall’acido ascorbico e dal GSH.
ANTIOSSIDANTI ESOGENIVITAMINICI
ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
Molecola liposolubile associata alle membrane biologiche e alle lipoproteineprotegge i grassi poliinsaturi dalla perossidazione
ATTIVITA’ NON ANTIOSSIDANTE
A carico di RRR- tocoferil succinatopotente agente antitumorale
VITAMINA E
INIBISCE LA PROLIFERAZIONE
DI CELLULE MALIGNE
CAUSA APOPTOSI
È ANTI-ANGIOGENICA
INIBISCE VEGF(fattore di crescita vascolare)
Vit. E
VITAMINA E e neoplasieVITAMINA E e neoplasie
CAROTENOIDI
• Gruppo di pigmenti rossi, arancio e giallo presenti soprattutto nella frutta e vegetali.
• Sostanze liposolubili.
• Alcuni hanno attività vitaminica (-carotene).
• Presenti nelle membrane cellulari e veicolati dalle lipoproteine.
• Interrompono le reazioni a catena dei radicali perossili (R-OO•)
• Bloccano i radicali tra cui anche l’1O2 (ossigeno singoletto) tramite due meccanismi:
• trasferimento del e-
• addizione del radicale alla molecola
ANTIOSSIDANTI ESOGENIVITAMINICI
• Antiossidante naturale della famiglia dei carotenoidi,
presente in elevate concentrazioni nel pomodoro maturo e in
misura minore nel cocomero, albicocca, uva e papaia
• Chimicamente costituito da carbonio e idrogeno ed in natura
è rinvenibile nella struttura “trans”
• Tempo di emivita 2-3 giorni, maggior metabolita 5,6-
diidrossi-5,6diidrolicopene
LICOPENE
LICOPENE
Sembra avere un ruolo importante nella prevenzione di
alcune malattie degenerative quali il cancro e le malattie
vascolari, che sembrano in parte dipendere da fenomeni
ossidativi
Il meccanismo di azione alla base dell’attività antitumorale del
licopene è ancora sconosciuto
LICOPENE
In pazienti con tumore della prostata la supplementazione con
licopene per sole 3 settimane ha determinato una riduzione dei
valori sierici di PSA (un marker usato comunemente per
monitorare l’andamento della malattia), suggerendo un effetto
antiproliferativo specifico sulle cellule neoplastiche prostatiche
POLIFENOLI
Ampia classe di composti derivati dal metabolismo secondario
delle piante
Chimicamente sono derivati ciclici del benzene sostituiti con
gruppi idrossilici
Comprendono molecole sia semplici come gli acidi fenolici
oppure altamente polimerizzate come i tannini
Scavenger nei confronti dei radicali HO• e O2•
ANTIOSSIDANTI ESOGENI
NON VITAMINICI
• bloccare i radicali liberi
• legare i metalli di transizione
• inibire l’ossidazione delle LDL
• rigenerare il radicale tocoferile
O
A
B
C
1'2
3
45
6
7
8
2'
3'
4'
5'
6'
Struttura dei flavonoidi
O
OH
R1R2
R3
R4
R1R2
R3
R4
O
OH
Struttura degli acidi fenolici
Sostanza a basso peso molecolare, relativamente idrofila Scavenger di vari ossidanti (HO•, O2*, HClO)
Chelante nei confronti dei metalli di transizione (Fe, Cu) Consente la rigenerazione delle vitamine C ed E Prodotto nell’organismo, è coinvolto nel complesso della piruvato deidrogenasi, funzionando da accettore di elettroni, grazie al suo ponte disolfuro, reattivo
SH
COOH
SHSH
COOH
SH S
COOH
SS
COOH
S
Forma ridotta (attiva) Forma ossidata
ACIDO LIPOICO
Ac. LIPOICO
(25-100µM) induce
ATTIVITA’ antiossidanti:Catalasi (+55%)Superossido dismutasi Glutatione reduttasiGlutatione perossidasiGlutatione transferasiEffetto dose
dipendente
Ac. LIPOICO(25-100µM) riduce
ACCUMULO ROS(-55%)
DIMOSTRAZIONE IN VITRO DELL’ EFFETTO PROTETTIVO
DELL’AC.LIPOICO IN Saccaromycetes cerevisiae
Perossido di Idrogeno (H2O2)
4-5mM
Ossidante (H2O2) + Acido
Lipoico 0.01-0.1mM
Riduce le possibilità di
sopravvivenza della
cellula (Saccaromycetes
cerevisiae)
Riduce il n delle
generazioni
successive
Aumenta il n
delle generazioni
successive
Aumenta la possibilità
di sopravvivenza della
cellula
Coenzima Q10
Sostanza lipofila a basso peso molecolare Scavenger nei confronti dei radicali perossilici (ROO•) Consente la rigenerazione dei tocoferoli
OH3CO
H3COO
CH3
(CH2 – CH = C – CH2)10H
CH3
OH3CO
H3COO
CH3
(CH2 – CH = C – CH2)10H
CH3
Ruolo del Coenzima Q e della vitamina E nell’inibizione della perossidazione lipidica
INIZIO
Fe3+ O2
Fe3+ H2O2 UQ•
UQH2
UQ•
L – H
L•
O2
LOO•
LOOH
E – OH
E – O AH- UQH2
A• UQ•
UQH2
L – H
L•
PROPAGAZIONE
INIZIO
Fe3+ O2
Fe3+ H2O2 UQ•
UQH2
UQ•
L – H
L•
O2
LOO•
LOOH
E – OH
E – O AH- UQH2
A• UQ•
UQH2
L – H
L•
PROPAGAZIONE
ZINCO
Componente essenziale di numerosi enzimi, in cui svolge un
ruolo strutturale, di regolazione e catalitico: l’amminoacil-
RNA-sintetasi, la DNA e l’RNA polimerasi, la fosfatasi
alcalina, la lattico deidrogenasi, la superossido dismutasi
e le carbossipeptidasi A e B
Attività antiossidante, prevenendo la perossidazione
lipidica e riducendo la formazione dei radicali liberi
MANGANESE
E’ un cofattore dell’attività di numerosi enzimi (arginasi, piruvato carbossilasi, superossido dismutasi)
SELENIO
Componente dell’enzima glutatione perossidasi, che
impedisce l’ossidazione dell’emoglobina e quindi l’emolisi
degli eritrociti. Agisce in sinergismo con la vitamina E
Azione antiforfora e antimicotica
In laboratorio, per valutare lo stato redox, è possibile dosare:
Alcuni enzimi antiossidanti (SOD, GPx, glutatione reduttasi,
catalasi)
Vitamine
Potere antiossidante totale del siero
Prodotti di lipoperossidazione (malonildialideide MDA,
sostanze reattive all’acido tiobarbiturico TBARS)
Metaboliti reattivi dell’ossigeno (ROM’s)
Valutazione dello stress ossidativo ed idroperossidi
Gli idroperossidi sono marker ed amplificatoridelle lesioni da STRESS OSSIDATIVO
Aumentata produzione
di ROS (O2., HO., H2O2,…)
Compromissione della barriera antiossidante (vit. C, vit. E,…)
Perossidazione di biomolecole con produzione di idroperossidi
R-OOH(una classe di ROM)
IDROPEROSSIDI (MARKER ED AMPLIFICATORI DEL DANNO)NEI LIQUIDI EXTRACELLULARI
INVECCHIAMENTO E PATOLOGIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO (ictus, infarto, diabete, demenza, m. di Parkinson, cancro, …)
STRESS OSSIDATIVO: valutare per riequilibrare
VALUTAZIONE GLOBALE DELLO STRESS OSSIDATIVO
Valutare l’“attacco”Status pro-ossidante
Valutare la “difesa”Status antiossidante
PREVENZIONE E MONITORAGGIODELLE MALATTIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO
d-ROMs test, MDAOXY-Adsorbent test, BAP test, -SHp test…
Valutazione dello stress ossidativo
TEST DI LABORATORIO PER LA VALUTAZIONE
DELLO STATUS PRO-OSSIDANTE
d-ROMs test
- Test spettrofotometrico che consente di determinare, in un
campione biologico, la concentrazione degli idroperossidi
(ROOH) su diversi substrati biochimici
- Gli analiti misurati nel test sono metaboliti reattivi
dell’ossigeno (reactive oxygen metabolites, ROM)
Gli idroperossidi presenti in un campione biologico, dopo
aver reagito con un apposito cromogeno sviluppano un
derivato colorato (dal rosa al rosso) rilevabile e
quantificabile per via spettrofotometrica.
La concentrazione degli idroperossidi, direttamente
proporzionale all’intensità del colore rilevato, viene espressa
in unità di U CARR (Carratelli)
1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL
Reazione di Fenton: un metallo di transizione in forma ionica (Fe o Cu) catalizza la scissione di un idroperossido (ROOH), generando nuove specie radicaliche (idroperossili (ROO*) o alcossili (RO*), a seconda che lo ione catalizzante si ossidi (Fe2+ Fe3+ o Cu+ Cu2+) o si riduca.
Nel test gli idroperossidi, nelle condizioni previste dalla reazione di Fenton, generano in vitro radicali idroperossilici ed alcossilici.
1a) R-OOH + Fe2+ R-O* + Fe3++ OH-
1b) R-O* + A-NH2 R-O- + [A-NH2*]+
2a) R-OOH + Fe3+ R-OO* + Fe2+ (Cu+) + H+
2b) R-OO* + A-NH2 R-OO- + [A-NH2*]+
Principio del d-ROMs test
Procedura sperimentale:
Un’aliquota di siero viene diluita in una soluzione tampone (acetato)
pH 4.8; il ferro ionico legato alle sieroproteine, si rende disponibile in
forma libera catalizzando la scissione degli idroperossidi in radicali
idroperossilici ed alcossilici.
Alla soluzione viene aggiunto un cromogeno (N,N-dietil-
parafenilendiammina) che ha la proprietà di cambiare colore (dal
rosa al rosso) quando viene ossidato.
E’ necessario preparare lo standard (o calibratore), fornito
all'interno di un kit commerciale sottoforma di siero liofilo a titolo
noto (U CARR).
Procedura cinetica standard: si preparano 3 soluzioni (bianco,
campione (preferibilmente siero fresco) e calibratore)
incubazione delle soluzioni per 1 min a 37°C;
lettura fotometrica (abs a 505 o 546 nm) a 0, 1, 2 e 3 min.
Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il calibratore si
sottrae, quindi, il valore di assorbanza del bianco.
Procedura endpoint: si preparano 3 soluzioni (bianco, campione
(siero o plasma eparinato) e calibratore).
incubazione delle soluzioni a 37°C per 75 min;
lettura fotometrica (abs a 505 o 546 nm).
Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il
calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza del bianco.
Valori di riferimento nell’uomo:
250-300 U CARRcioè 20.08-24.00 mg/dL di H2O2
Un aumento delle U CARR indica una gravità crescente di stress ossidativo
Unico test disponibile per la valutazione complessiva della
componente lesiva, pro-ossidante, dello stress ossidativo che unisce a
questa specificità una standardizzazione utile nella pratica clinica
routinaria e la possibilità di integrarsi con altri test sullo stress
ossidativo.
· preciso e affidabile;
· richiede una strumentazione relativamente semplice (un
fotometro termostatato ed una centrifuga);
· possiede tutti i vantaggi di un mono test (rilevazione fotometrica
diretta di un’unica miscela di reazione, contenente il campione e il
reattivo cromogeno);
· richiede una minima manualità, con notevole riduzione delle
possibilità di errore.
• nella perossidazione lipidica si formano prodotti di degradazione;
• essi sono utilizzati per misurare il grado di perossidazione; si misura la formazione della malonildialdeide (dialdeide malonica, MDA)
MDA (malonilaldeide o malonildialdeide, CHO-CH2-
CHO): prodotto finale delle reazioni a catena innescate
nelle membrane cellulari dall’attacco ossidativo, da parte
di alcuni ROS (radicale idrossile), degli acidi grassi
poliinsaturi (acido arachidonico, costituente dei fosfolipidi
di membrana).
MDA test
MDA: indicatore piuttosto tardivo di stress ossidativo.
Svantaggi: non è sempre in grado di poter svelare
precocemente uno stato ossidativo alterato.
La MDA è scarsamente specifica; è un prodotto di
decomposizione ossidativa di amminoacidi, di
carboidrati e di prostaglandine;
E’ un prodotto di ossidazione dell’acido ascorbico,
risulta inutilizzabile il suo dosaggio ai fini di un
eventuale monitoraggio terapeutico in corso di
trattamenti antiossidanti.
TOTAL ANTIOXIDANT STATUS
Valutazione dell’efficacia della barriera ossidante, che si oppone all’azione lesiva dei radicali
PRINCIPIO DEL METODO
Rilevazione della capacità del siero in esame di opporsi ed inibire la cascata di reazioni che portano alla formazionedei radicali liberi
Nel plasma è identificabile una “barriera antiossidante”, alla cui costituzione contribuiscono sostanze esogene ed endogene.
Questi componenti, “donando” elettroni, bloccano la potenziale lesività dei radicali liberi.
Qualsiasi “insulto” a carico di tale barriera consente ai radicali liberi di attaccare e danneggiare le strutture cellulari.
Rappresentazione schematica della barriera antiossidante plasmatica
L’efficienza della barriera antiossidante plasmatica può essere
valutata saggiandone la capacità di ridurre un determinato
substrato, ossia di donare elettroni ad un agente ossidante
(avido di elettroni), che funge da “sensore”.
Il potere antiossidante è, in termini rigorosamente chimici,
un’attività riducente, cioè elettron-donatrice.
BAP-TEST
BAP test (biological antioxidant potential, determinazione
del potenziale biologico antiossidante): test fotometrico.
Si basa sulla capacità che ha una soluzione di ioni ferrici (Fe3+)
complessati ad un cromogeno di colorarsi, quando gli ioni Fe3+
sono ridotti a ioni ferrosi (Fe2+), come accade se si aggiunge ad
essa un adeguato sistema riducente, ossia antiossidante, quale il
plasma.
Il campione di plasma (ottenuto dal sangue intero mediante
centrifugazione) viene aggiunto ad una soluzione colorata
(FeCl3, cloruro ferrico + cromogeno, un tiocianato).
Dopo un’incubazione (5 min) la soluzione si decolorerà e la
decolorazione sarà tanto più marcata quanto più i componenti
del plasma ridurranno gli ioni ferrici presenti, responsabili
della formazione del complesso cromatico.
Valutando per via fotometrica l’entità della decolorazione, sarà
possibile risalire alla quantità di ioni ferrici ridotti e alla
capacità riducente, ossia al potere antiossidante del plasma
testato.
I risultati del BAP test sono espressi in moli di ferro ridotto per L di plasma esaminato.
Test affidabile, preciso, ripetibile, con un coefficiente di variazione (CV) inter-serie ed intra-serie assolutamente accettabile, anche con metodica manuale (<5%).
Interferenza segnalata è legata alla concentrazione lipidica: un
plasma iperlipemico può indurre una sottostima dei valori.
Il test va obbligatoriamente eseguito a digiuno o dopo un congruo
intervallo di tempo rispetto ad un pasto copioso o all’assunzione
massiva di antiossidanti per os.
Il BAP Test viene eseguito su siero o plasma eparinato
fresco, con lettura fotometrica a 505 nm a 37°C.
Data l’esigua quantità di campione necessaria (10 µl per
l’analisi manuale) il prelievo può essere venoso o
capillare.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Il range stimato del BAP test negli individui normali è 2200-4000 moli/L.
Una riduzione dei valori del test al di sotto dell’intervallo indicato è direttamente correlato con una ridotta efficienza della barriera antiossidante plasmatica.
Test fotometrico che valuta la capacità del plasma di opporsi all’azione ossidante di una soluzione di acido ipocloroso, HClO (ossidante). Il campione di plasma viene sottoposto all’azione di HClO a titolo noto, in evidente eccesso rispetto alle capacità di essere “adsorbito” dalla barriera antiossidante da valutare.
Dopo un intervallo di tempo stabilito, l’HClO residuo reagisce con la N,N-dietilparafenilendiammina che, ossidandosi a spese dell’acido, si trasforma in un derivato colorato in rosa.
OXY-Adsorbent test
La concentrazione del complesso colorato sarà
direttamente proporzionale alla concentrazione di HClO
rimasta in eccesso ed inversamente proporzionale alla
capacità antiossidante del plasma analizzato;
più bassa è la concentrazione residua dell’acido e più
elevata è la capacità antiossidante del campione di plasma
esaminato, e viceversa.
Il valore di riferimento del test è al di sopra di 350 moli/mL di HClO. In condizioni normali, 1 mL di plasma umano è in grado di “adsorbire” e, quindi, neutralizzare, almeno 350 moli di HClO.
Valori inferiori a questa soglia indicano una riduzione dello “spessore” della barriera antiossidante e correlano direttamente con la gravità del danno da questa subito.
Il test viene eseguito su siero o plasma eparinato fresco con lettura fotometrica a 505 o 546 nm a TA.
Il prelievo può essere venoso o capillare.
Test affidabile, preciso, ripetibile, con un coefficiente di variazione (CV) inter-serie ed intra-serie assolutamente accettabile, anche con metodica manuale (<5%).
Il test va eseguito a digiuno o dopo un congruo intervallo di tempo rispetto ad un pasto copioso o all’assunzione massiva di antiossidanti per os.
I tioli rappresentano una componente qualitativamente significativa della barriera antiossidante plasmatica
Si basa sulla capacità dei gruppi -SH di sviluppare un complesso colorato determinabile fotometricamente (405 nm) quando reagiscono con l’acido 5,5ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB).
Il “titolo” di tioli è direttamente proporzionale all’intensità del colore rilevato.
Grado accettabile di imprecisione analitica. Infatti, il CV intra-serie su 20 aliquote di siero fresco è stato pari a 1.7%, quello inter-serie su 20 aliquote di siero congelato 3.3%.
SHp test
Il range negli individui normali è 450-650 moli/L.
Una riduzione dei valori del test al di sotto di questo
intervallo si correla direttamente con una ridotta
efficienza della barriera antiossidante tiolica.
Sistema analitico integrato che consente di eseguire qualsiasi tipo di analisi chimica basata sul principio della fotometria
Sistema FREE (Diacron)
Predisposto per l’esecuzione di test per la valutazione globale dello stress ossidativo (d-ROMs test, l’OXY-adsorbent test, il BAP test e l’-SHp test).
Sistema analitico integrato costituito da un fotometro con
centrifuga incorporata progettato per consentire
l’esecuzione del d-ROMs test su sangue intero, ottenuto
mediante prelievo di sangue capillare. Viene fornito
insieme al kit del d-ROMS test che ne costituisce parte
integrante.
SISTEMA FRAS (Diacron)
Una goccia di sangue, prelevata per digitopuntura, è raccolta in un piccolo capillare e, insieme a questo tubicino, immersa in una provetta contenente una soluzione tampone lievemente acida.
Il campione, dopo una delicata agitazione, è trasferito in cuvetta, ove viene aggiunta una goccia di reattivo cromogeno. La soluzione è sottoposta a centrifugazione e alla lettura fotometrica.
Il fotometro trasformerà l’intensità del colore (proporzionale alla quantità di radicali e, quindi, di idroperossidi presenti nel campione) in unità di concentrazione (U CARR), a cui possono corrispondere determinati livelli di stress ossidativo.
dROM test: errori da evitare
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