1

2012

‘’IMPLICATIILE FIZIOPATOLOGICE ALE DEGRADARII ECHILIBRULUI REDOX IN CANCER, DIABET ZAHARAT SI BOLI INFLAMATORII’’

Stresul oxidativ este termenul folosit pentru afecţiunile produse de moleculele de oxigen

distrugătoare numite radicali liberi. Stresul oxidativ se defineşte ca dezechilibrul dintre oxidanţi

şi antioxidanţi, în favoarea oxidanţilor, având potenţial distructiv şi patogenetic. In functie de

intensitatea lor, stresurile oxidative se pot desfasura in interiorul sau exteriorul celulei. Stresul

intracelular poate conduce la necroza celulara sau la o dezorganizare mai mult sau mai putin

marcata a celulei, putand fi catastrofala in cazul unei celule care nu se poate reproduce. De

asemenea, stresul oxidativ extracelular este citotoxic.

Radicalii liberi sunt substanţe care derivă din compuşi oxidaţi incomplet, care au trecut

prin arderi parţiale, având în structura lor grupări de oxigen capabile să iniţieze la suprafaţa

membranelor celulare sau chiar în interiorul celulelor reacţii agresive de oxidare. Radicalii liberi

provin din procesele ce se petrec în organism (fagocitoza, catabolismul incomplet, producerea de

energie, detoxifiera hepatică), cât şi din mediul exterior (fum de ţigară, aer poluat, anumite

alimente şi medicamente, apa de fântână sau de robinet).

Radicalii liberi cei mai activi sunt ionii : superoxid (O22-), peroxid (O2

-), hidroxid (OH¯),

oxid nitric (NO¯). Peroxizii şi superoxizii, anionii care exercită o acţiune oxidantă energică

provin din apa oxigenata (H2O2) precum şi din alte surse sau procese, aşa cum sunt cei rezultaţi

în urma râncezirii alimentelor bogate în lipide (peroxizii lipidici).

Radicalii liberi provin din 2 surse majore :

- Endogenă (radicalii liberi care se formează în organism pe parcursul fenomenelor

metabolice sau fiziologice). Dacă, cel puţin dintr-o anumită masură, impactul cu

radicalii liberi exogeni poate fi limitat prin abordarea unui mod de viaţă adecvat şi

echilibrat, nu se poate spune acelaşi lucru şi despre radicalii liberi endogeni.

- exogenă (radicalii liberi pătrund în organism din mediul extern).

2

Expunerea organismelor la substanţe chimice foarte variate sau la radiaţii poate antrena

oxidarea compuşilor biologici.

Xenobioticele non-medicamentoase (poluanţi atmosferici, tabagici, CCl4, etanolul)

determină o hiperproducţie de O2¯, dezorganizarea membranelor prin solubilizarea în lipidele

lor, favorizând pătrunderea intracelulară a calciului. Sistemul nervos este foarte sensibil la acest

proces deoarece este sărac în sisteme de apărare (slaba activitate a glutation peroxidazei).

Epiteliul alveolar este cel mai agresat şi cel mai vulnerabil la poluarea atmosferică. În

condiţii de viată normale, 300000 metri cubi de aer sunt inhalaţi aducând epiteliului alveolar

oxidant ozonul şi oxizii de azot (iniţiatorii lipoperoxidării).

Tabagismul este un factor important al poluării atmosferice. Fiecare fum de ţigară aduce în

aer aproximativ 10 radicali. Principalul antioxidant al surfactantului lichidian alveolar,

glutationul redus este normal prezent la concentraţii de 200 milimoli/l., care sunt superioare celor

întâlnite în plasmă. S-a observat că autopoluarea tabagică se traduce la nivel plasmatic printr-o

mărire de produse flourescente ale lipoperoxidării şi o scădere a ascorbemiei. Potenţialul oxidant

al aerosoluli tabagic inhibă α-1 tripsina care este principalul inhibitor al elastazei neutrofilelor

prezente în surfactantul alveolar. Această acţiune induce dezvoltarea emfizemului pulmonar.

Formele active de oxigen, sunt de asemenea, implicate în cancerogeneză.

Anumite antibiotice antitumorale (adriamicina) sunt biotransformate în radicali

semichinonici aflaţi la originea unor cantităţi importante de O2¯, indirect responsabili de

cardiotoxicitatea lor, adesea fatală. Rezistenţa celulelor tumorale la adriamicină s-ar datora

bogaţiei lor în glutation peroxidaza.

Toxicitatea etanolului poate să rezulte de asemenea din efectul său inhibitor faţă de SOD şi

glutation peroxidaza. Intoxicaţiile acute şi cronice notează o scădere a activităţii SOD şi a

concentraţiei cerebrale a glutationului redus.

Cei mai mulţi radicali liberi endogeni se produc la nivelul: mitocondriilor (în timpul

generării de molecule macroergice, ATP- acid adenozin trifosforic), care reprezintă principalele

surse de energie din organsim; peroxizomilor, citocromului P450 (este localizat la nivelul

plămânilor şi al ficatului, având rolul de a neutraliza substanţe cu potenţial toxic, care provin din

aerul poluat sau din alimente), fagocitelor.

Mitocondria reprezintă cea mai importantă sursă endogenă de radicali liberi prin

reacţiile care se desfăşoară la nivelul lanţului respirator mitocondrial. La nivelul mitocondriei în

3

urma reacţiei de reducere a oxigenului molecular de către citocromii respiratori celulari se

produce în jur de 2% din cantitatea totală de ioni superoxid, peroxid de hidrogen şi radical

hidroxil. Reacţia de oxidoreducere este parte componentă a unui proces complex de respiraţie

mitocondrială prin care O2 din aerul inspirat ajunge datorită circulaţiei sanguine la ţesuturi şi în

final, la nivelul mitocondriilor celulare.

Peroxizomii sunt corpusculi citoplasmatici prezenţi în mai multe tipuri de celule, în

special în ficat, iar denumirea lor vine de la faptul că aceste organite celulare sunt o sursă

importantă de producere a peroxidului. Aceştia conţin numeroase enzime care generează H2O

incluzând oxidaza glicolat, D-amino acid oxidaza, urat oxidaza. Oxidaza acţionează asupra

aminoacizilor şi hidroxiacizilor conform reacţiei:

D(L)aminoacizi → cetoacizi + H2O2

L–hidroxiacizi →cetoacizi+ H2O2

Fagocitele sunt activate şi recrutate în răspunsul inflamator. Polinuclearele sunt primele

care ajung la situsul inflamaţiei, urmate de macrofage. Fagocitele aderă la bacterii şi le ingeră.

Principalul mecanism bactericid, este un mecansim oxigeno-dependent care se însoţeşte de un

consum crescut de oxigen cu activarea NADPH –oxidazei

Citocromul p450 reprezintă un grup de enzime prezent în fiecare celulă a organismului

cu excepţia eritrocitelor şi celulelor musculare ale muşchilor scheletici.

Are importanţă în metabolizarea anumitor substanţe din organism, precum steroizi,

vitamine liposolubile, acizi graşi, prostaglandine şi alcaloizi. De asemenea, enzimele cuprinse în

acest grup detoxifică medicamentele şi un număr mare de agenţi poluanţi din mediu.

4

GENERAREA DE SPECII REACTIVE

’’Un paradox al vieţii terestre este că molecula esenţială pentru traiul aerob, oxigenul, nu

numai că stă la baza metabolismului energetic şi a repiraţiei, dar este implicată şi în multe

afecţiuni şi maladii degenerative ’’ (L. Marx 1985). În acestea intervin forme parţial reduse ale

oxigenului, denumite specii reactive de oxigen, care sunt molecule relativ mici, organice sau

anorganice : oxigenul singlet, anionul superoxid, peroxidul de hidrogen, radicalul hidroxil,

radicalii alcoxil si peroxil. Toate aceste molecule sunt înalt reactive datorită electronilor

nepereche şi joacă în condiţii fiziologice roluri importante în procesele metabolice normale

(mobilizarea sistemelor de transport ale ionilor, cicatrizarea leziunilor, homeostazia sanguină,

sistemele redox de semnalizare, procesele imune). În condiţii de mediu anormale (expunerea

excesivă la căldură, radiaţii ultraviolete, poluanţi), nivelul speciilor de oxigen creşte dramatic,

rezultând grave leziuni celulare.

Speciile reactive de oxigen sunt formate şi sub acţiunea radiaţiilor ionizante. Stresul

oxidativ îşi cumulează efectele cu stresul nitrozativ datorat formării speciilor reactive de azot.

Speciile reactive de azot sunt o familie de molecule antimicrobiene derivate din oxid

nitric şi superoxid, produse prin activitatea enzimelor NOS2 şi NADPH-oxidaza, rezultând

peroxinitritul. NOS2 se exprimă mai ales în macrofage, iar peroxinitritul este foarte reactiv şi

poate reacţiona cu diverse componente celulare.

Reacţiile speciilor reactive cu substraturile organice sunt complexe.Natura leziunilor

oxidative care pot determina moartea celulei nu este întotdeauna evidentă. Leziunile determinate

de stresul oxidativ pot fi clasificate în: leziuni ale ADN-ului, oxidări ale acizilor graşi

polinesaturaţi din lipide şi oxidări ale aminoacizilor din proteine.

Oxigenul singlet este un oxidant puternic, mai reactiv decat radicalul hidroxil,

reacţionând cu mulţi compuşi organici, cum sunt acizii graşi, polinesaturaţi.

5

SISTEME ENZIMATICE DE APĂRARE ÎMPOTRIVA RADICALILOR LIBERI

Celulele se pot apăra de atacul speciilor reactive prin numeroase mecanisme. În primul

rând există o serie de enzime antioxidante : superoxid dismutazele (tipurile 1,2 şi 3), catalazele,

lactoperoxidaza, glutation peroxidaza şi peroxiredoxina. Acestora li se adaugă prezenţa unui

numar mic de molecule antioxidante : acidul ascorbic (vitamina C), tocoferolul ( vitamina E),

acidul uric, bilirubina, glutationul. Dintre ele glutationul este extrem de activ şi important, fiind

regenerat de glutation reductaza şi NADPH. Poate fi regenerat şi de acidul lipoic în asociere cu

alţi oxidanţi.

Când reţelele endogene de antioxidanţi eşuează în restabilirea balanţei redox celulare,

nivelurile de glutation scad şi apare stresul oxidativ. Un antioxidant adesea trecut cu vederea este

acidul uric, a cărui formarea poate asigura chiar un mijloc semnificativ de apărare faţă de

reacţiile de nitrozare date de peroxinitrit în miocardul afectat de hipoxie. De aceea, se consideră

că nivelul de acid uric seric este un marker important de stres oxidativ.

Substanţele care neutralizează efectul potenţial negativ al radicalilor liberi sunt grupate în

general în sistemul de apărare antioxidantă. Acest sistem cuprinde un număr mare de elemente,

fiind la fel de divers cum sunt şi radicalii liberi, celulele conţinând o varietate de substanţe

capabile de scavenging pentru multiple specii radicalice tocmai pentru a putea asigura o protectie

maximă.

Deşi s-au realizat progrese considerabile în identificarea şi întelegerea modului de acţiune

al unor enzime şi al altor componenţi ai apărării antioxidante, varietatea şi complexitatea

antioxidanţilor intracelulari face încă imposibilă explicarea acestui proces de apărare.

Superoxid dismutaza (SOD)

Funcţia superoxid dismutazei a fost descrisă de către Mc Cord şi Fridovich în anul 1969.

SOD este un mijloc de apărare a organismului faţă de anionii superoxid.

6

Superoxid dismutaza accelerează viteza de dismutare a superoxidului în H2O2 de

aproximativ 1000 de ori. SOD împiedică aceasta specie reactivă de a crea radicalul HO¯. SOD se

găseşte în toate celulele aerobe precum şi în bacteriile facultativ aerobe. Iniţial ea a fost

interpretată ca formă de depozitare pentru cupru, iar mai târziu s-au descris trei tipuri de SOD,

bazate pe tipul de metal din centrul catalitic.

În funcţie de metalul localizat în situsul catalitic superoxid dismutaza se diferenţiază în :

Ø Fe 2+ –– SOD, caracteristică bacteriilor anaerobe.

Ø Mn 2+ –– SOD, evidenţiată în mitocondrii şi organismele în organismele inferioare.

Ø Cu 2+, Zn 2+ –– SOD, prezentă în citoplasma celuleloreucariote.

Cele două metale din structura enzimei au roluri diferite. Cuprul contribuie la actul catalitic,

iar zincul se ocupă de stabilitatea centrului catalitic.

Rolul superoxid dismutazei este de a cataliza reacţia de dismutare a anionului radical

superoxid conform ecuaţiei :

O2•¯ ¯ + O2•¯ ¯ + 2H+ O2 + H2O2

Enzima poate inhiba şi producerea de oxigen singlet şi indirect peroxidarea acizilor graşi

polinesaturaţi. Ea îşi poate adapta sinteza în funcţie de necesităţi, astfel biosinteza este

accelerată de concentraţii crescute de O2, în timp ce Fe are efect represiv.

În afară de rolul de marker al procesului oxidativ, SOD este testată ca potenţial agent

terapeutic în condiţii patologice în care stresul oxidativ are un rol binestabilit, precum

sindroamele de ischemie-reperfuzie, afecţiuni hepatice şi pulmonare, inflamaţii acute şi

cronice, cataracta, artrita reumatismală, diabet, neoplazii. Una din reacţiile catalizate de

enzimă duce la apariţia altui compus nociv – peroxidul de hidrogen, pentru care organismul

nu este dotat cu mijloace de distrugere.

Glutation peroxidaza (GPx)

GPx face parte dintr-o familie de enzime ce catalizează degradarea hidroxiperoxizilor

organici rezultaţi din procesele metabolice normale şi asigură protecţia proteinelor, lipidelor şi

acizilor nucleici faţa de acţiunea moleculelor oxidante, utilizând ca donator de electroni

glutationul sau, în anumite cazuri, tioredoxina sau glutaredoxina.

7

GPx este o enzimă selenium dependentă, ce se găseşte în citosol (70%) dar şi în

mitocondrii (30%). Este de neînlocuit în arsenalul antioxidant, în special în mitocondrii,

deoarece acestea nu conţin catalaza pentru metabolizarea peroxidului. GPx asigură de asemenea

protecţie faţă de hidroperoxizii organici şi ajută la regenerarea formei reduse a vitaminei C.

Dezechilibre în nivelul GPx au fost observate odată cu îmbătrânirea şi într-o varietate de

tulburări cum ar fi : cancerul, bolile cardiovasculare, diabetul zaharat.

Atomii de seleniu de la nivelul situsului activ participă direct la reducerea peroxidului,

fiind esenţiali în sistemul de protecţie împotriva antioxidanţilor.Un deficit de seleniu, chiar

neînsemnat, afectează activitatea enzimei şi determină peroxidarea membranelor şi creşterea

permeabilităţii acestora.

Glutation peroxidaza catalizează reacţii de tipul :

GPx

2GSH + H2O2 GSSS + 2H2O

sau

R-OOH + 2 GSH R-OH +GSSG + H2O

în care R-OOH pot fi H2O2 sau orice peroxid derivat din acizi nucleici, acizi graşi

polinesaturaţi, steroizi.

GPx are unele calităţi faţă de celelalte sisteme de protecţie :

detoxifică toate tipurile de peroxizi existenţi în mediile biologice;

descompune H2O2 mai eficient decât catalaza

combină capacităţile antioxidante ale tiolului şi seleniului.

foloseşte ca al doilea substrat glutationul redus, cel mai mobil compus tiolic, prezent în

toate tipurile de celule animale şi uşor de regenerat prin şuntul pentozo-fosforic.

Rolul GPx în condiţii fiziologice nu este uşor de stabilit dat fiind multiplele competiţii cu

alte enzime pentru substratul comun ; oricum ele protejează celulele de prejudiciile aduse de

radicalii liberi în mod indirect prin reducerea concentraţiei peroxizilor.

GPx este o enzimă care are un potenţial antioxidant mai mare decât SOD şi catalaza,

datorită specificităţii largi de substrat. Alte roluri pe care le are sunt : reglarea biosintezei de

prostaglandine prin inhibarea lipooxigenazei, iar în cooperare cu glutation reductaza contribuie la

refacerea glutationului redus. .[6]

8

CATALAZA

Catalaza este universal răspândită în natură, activitatea catalazică fiind prezentă în toate

microorganismele aerobe, în celulele plantelor şi animalelor. În celulă enzima este localizată

aproape exclusiv în peroxizomii majorităţii celulelor, reducând nivelul peroxidului de hidrogen.

Catalaza reduce nivelul peroxidului de hidrogen în peroxizomi, dar este absentă în cloroplaste.

Peroxidul de hidrogen este cea mai stabilă dintre toate speciile active ale oxigenului, fiind un

oxidant nucleofilic foarte puternic. Este răspunzător pentru inhibarea enzimelor din ciclul calvin.

Catalaza, alături de alte 2 enzime (fumaraza si aceticolinesteraza) este unul dintre cei mai

eficienţi catalizatori cunoscuţi, reacţiile pe care le catalizează fiind esenţiale pentru viaţă. Enzima

catalizează o reacţie de fiecare dată când întâlneşte o molecula de sulf. Viteza relativă şi

orientările moleculelor care interacţionează sunt foarte importante pentru reacţie.

Catalaza acţionează în conversia peroxidului de hidrogen care este un agent oxidant

puternic, cu caracter toxic pentru celule.De asemenea ea foloseste peroxidul de hidrogen pentru a

oxida toxine ca fenoli, acid formic, formaldehida şi alcooli.

Este un antioxidant primar major cu funcţie principală în cataliza descompunerii H2O2

în H2O., funcţie pe care o are şi GPx:

H2O2 + H2O → O2 +2 H2O

Catalaza ca şi SOD, are o răspândire largă în ţesuturi, nivelul activităţii variind nu numai

în funcţie de ţesut ci şi în cadrul celulei. Nivele mari ale catalazei se găsesc în ficat rinichi şi

hematii, la nivelul hepatocitului, peroxizomii au cea mai importantă activitate catalazică, iar

activităţi mai reduse se întâlnesc la microzomi şi citosol.

Având în vedere că toxicitatea H2O2 este crescută în prezenţa metalelor tranziţionale de

1000 de ori, este de înţeles de ce organismele aerobe şi implicit cel uman necesită două clase

majore de apărare cu rol complementar : catalaza şi enzimele asociate glutationului.

9

SISTEME NEENZIMATICE DE APĂRARE ÎMPOTRIVA RADICALILOR LIBERI

Glutationul (GSH)

Glutationul, numit “proteina vietii”, este o polipeptidă bioactivă cu funcţie de coenzimă,

prezentă în aproape toate celulele organismului uman. Este sintetizată în ficat din aminoacizii

cisteina, glutamina si glicina. Ficatul este cel mai mare depozit de glutation, dar în concentraţii

mari glutationul se găseşte şi în splină, rinichi, pancreas, cornee.

Nivelul celular al glutationului este stimulat de acidul alfa lipoic, glutamină, colostru,

seleniu şi vitaminele C, B6 şi B2. Eficienţa vitaminelor C, E şi a coenzimei Q10 depinde de

nivelul de glutation din organism. Glutationul redus este forma cea mai activă.

2GSH + H2O2 →GS−SG +2 H2O2

Are efect antitumoral deoarece reduce mutaţiile ADN-ului determinate de substanţele

cancerigene, prin susţinerea fazelor I şi II de detoxifiere enzimatică; inhibă absorbţia şi

favorizează eliminarea din organism a metalelor grele, fumului de tigară, pesticidelor,

fungicidelor, hormonilor în exces, coloranţilor alimentari, detergenţilor, supradozelor

medicamentoase.

Este unul dintre cei mai puternici şi importanţi antioxidanţi ai organismului; este numit

“antioxidantul miraculos”; stresul oxidativ produs prin deficit de glutation are un rol major în

patogenia cancerului, astmului, bronşitei cronice, emfizemului, fibrozei chistice, mucoviscidozei

pulmonare, autismului, deficitului de atenţie şi hiperactivitate, bolii Parkinson, maladiei

Alzheimer, sclerozei multiple, schizofreniei, protejează împotriva leziunilor si a emboliilor

cerebrale.

Vitamina C (acidul ascorbic)

10

Vitamina C a fost descoperită de către savantul maghiar Szent-Gyorgy Albert. El a fost

primul care a reuşit să extragă din ardei Vitamina C şi pentru aceasta descoperire a fost distins cu

premiul Nobel. Denumirea chimică conform nomenclaturii IUPAC este ( R)-3,4-dihidroxi-5-

((S)-1,2-dihidroxietil)furan-2(5)-ona.Vitamina C este sintetizată în plante, organisme

monocelulare şi o parte din animale. Deficitul de vitamina C provoacă boala numită scorbut.

Acţiunea antioxidantă a acidului ascorbic se bazează pe reacţia cu radicalii liberi de tip

hidroxi sau alţi radicali având un număr impar de electroni la un atom de oxigen, cu formare de

acid monodehidroascorbic şi apoi acid dehidroascorbic.Aceste forme oxidate sunt relativ stabile

şi nu sunt toxice pentru celule.

În contrast cu vitamina E, vitamina C este hidrofilică şi funcţionează mai bine decât

vitamina C în mediul apos. Ca agent reducător antioxidant reacţionează direct cu O2•¯ ¯

OH• ca şi cu diverşi hidroperoxizi lipidici. În plus poate restabili proprietăţile antioxidante ale

vitaminei. Distribuită larg în ţesuturi, are o concentraţie mai mare în glanda suprarenală şi

hipofiză, iar cantităţi mai mici în ficat, pancreas, splina şi creier.

În comparaţie cu ceilalţi antioxidanţi hidrosolubili, vitamina C oferă o protecţie mai mare

antioxidativă. Ea poate acţiona şi ca prooxidant în cantităţi excesive, în prezenţa metalelor

tranziţionale, generând cofactori ai activării radicalilor de oxigen în perioada de promovare a

peroxidării lipidice.

În afara reacţiilor de oxidare, vitamina C are şi rol de transportor de electroni participând

la reacţiile de hidroxilare: biosinteza glicogenului, biozinteza carnitinei, hidroxilarea dopaminei

şi norepinefrinei sub influenţa β-dopamin hidroxilazei.

Acidul ascorbic interacţionează cu Fe, favorizând absorbţia acestuia la nivel intestinal,

reduce methemoglobina la hemoglobina şi inhibă formarea de compuşi nitriţi la nivel digestiv.[7]

Tocoferolii (vitamina E)

Vitamina E are 4 tocoferoli care se găsesc în natură. Aceştia, au în moleculele lor, ca

structura de bază, tocolul. La rândul său, acesta conţine un nucleu cromanic substituit în poziţia 6

11

cu un hidroxil iar în poziţia 2 cu un metil şi un radical saturat conţinând 16 atomi de carbon. Din

tocol derivă, prin metilări în diverse poziţii (5, 7sau 8) cei patru tocoferoli naturali :

tocoferolul (5, 7, 8 trimetiltocol)

β tocoferolul (5,8 dimetiltocol)

γ tocoferolul (7, 8 dimetiltocol)

Δ tocoferol (8 metiltocol)

Acţiunea antioxidantă a tocoferolilor este eficientă la concentraţii ridicate ale oxigenului.

Datorită acestui lucru, tocoferolii au tendinţa să se concentreze în structurile lipidice care sunt

expuse la presiuni ridicate de oxigen (membrana eritrocitară, membranele arborelui respirator).

Acumularea vitaminei E în membranele celulare depinde de cantitatea ingerată, de cantitatea de

seleniu adusă prin alimentaţie, de cantitatea de aminoacizi tiolici, de raportul prooxidantilor şi

antioxidantilor din organism.

Vitamina A

Catenoizii sunt de mult timp consideraţi antioxidanţi datorită capacităţilor de scavengeri

de radicali liberi şi mai ales de oxigen single, protejând lipidele de peroxidare: β-carotenul, are o

activitate antioxidantă importantă prin inhibarea LPO indusă de sistemul xantinoxidaza.

Această funcţie de scavengeri de radicali liberi este sugerată şi de aranjamentul structural al β-

carotenilor, în lanţuri lungi cu duble legături conjugate ; modificarea culorii carotenoizilor în

timpul oxidării susţine de asemenea acest rol. β-carotenul poate funcţiona şi ca antioxidant dar şi

ca prooxidant, la presiuni parţial crescute ale oxigenului. .[6]

12

ROLUL STRESULUI OXIDATIV IN PATOLOGIE Echilibrul dintre actiunea oxidativa a radicalilor liberi si nivelul antioxidantilor dintr-un organism este esentialul vietii , caracterizeaza capacitatea de rezistenta a organismului . In multe stari patologice are loc o accelerare a formarii speciilor reactive de oxigen (SRO) , avand ca rezultat dezechilibrul dintre factorii oxidanti si sisteme antioxidante protectoare. Astfel , se explica implicarea radicalilor liberi in foarte multe boli , constituind un factor de agregare nespecific . Alaturi de implicarile stresului oxidativ in boli respiratorii , de la nivelul aparatului renal , a asocierii in cadrul complicatiilor diabetului zaharat este necesar de mentionat importanta in cadrul afectinunilor de tip : ischemie-reperfuzie , HTA , boala Parkinson , si cele prezente la nivel endotelial . De asemenea , se vor observa asocierile in cadrul evidentierii rolului hiperhomocisteinei . Homocisteina va putea induce leziuni vasculare datorita caracteristicilor chimice ale gruparii tiol ( R-SH ) . Sulful are electronegativitatea mai mica decat oxigenul . Energia necesara pentru a scinda legatura S-H din gruparea tiol este relativ mica , ceea ce face aceasta grupare foarte acida si extrem de reactiva . Ca rezultat , gruparile tiol , ( R-SH ) , sunt rapid oxidate la disulfura ( RS-SR ) cu resturi de cisteina prezente in proteine structural , hemoproteine , enzime , hormoni vasoactivi , cu proteine implicate in coagulare sau cu cele plasmatice sau celulare . In decursul acestei reactii sunt generate specii reactive ale oxigenului : anionul superoxid , peroxidul de hidrogen si anionul hidroxil , care ar putea provoca disfunctii endoteliale ce vor prezenta grave consecinte :

reglare vasomotorie alterata ; schimbarea fenotipului antitrombocitar ; activarea si agregarea plachetelor ; stimularea depunerii calciului in intima arteriala ; activarea elastazei ; peroxidarea lipidelor din lipoproteinele plasmatice , in special a LDL , cu formarea hidroxicolesterolului , compus aterogenic ; modificarea aldehidica a resturilor de lizina din Apo B100 , avand consecinte citotoxice si aterogenice .

In plus , procesul oxidativ cauzeaza inactivarea sintazei oxidului nitric si a glutation-peroxidazei . S-a sugerat ca oxidul nitric este capabil sa reduca efectele toxice ale aminoacidului prin formarea S-nitrozo-homocisteinei , care previne producerea de hidrogen peroxid si , de

13

asemenea , inhiba formarea homocistein-tionolactonei . Ca rezultat al acestei reactii este generat un stres oxidativ care produce leziunea endoteliului arterial .

STRESUL OXIDATIV SI ENDOTELIUL VASCULAR

Stresul oxidativ este considerat actualmente factorul initiator si promoter cel mai important al lezarii celulei endoteliale. Modificarile survenite au o importanta majora in oxidarea lipoproteinelor si in ateroscleroza. Radicalii liberi implicati in acest proces sunt anionul superoxid, hidroxi-anionul, radicalul hidroperoxil si peroxide. Sursele de radicali liberi sunt reprezentate de celule participante la aterogeneza : celule endoteliale , celule musculare netede si macrofagele . Endoteliul vascular este bogat in xantina (sursa importanta de anion superoxid generat prin metabolizarea xantinei sub actiunea xantin oxidazei). Alta sursa : activarea lantului metabolic al acidului arahidonic. NO, inhibat de anionul superoxid , contribuie la disfunctia endoteliului lezat . Factorii care agraveaza endoteliul sunt factorii de risc pentru ateroscleroza (hiperlipoproteinemia , hipertensiunea arteriala , fumatul , diabetul zaharat ) si sunt cei care favorizeaza constituirea unei zone de stres la nivelul endoteliului . Factorul de risc major este hipercolesterolemia . Daca la acest factor de risc se adauga hipertensiunea arteriala , efectele sunt aditive. Atat hiperlipemia cat si hipertensiunea arteriala agraveaza aterosleroza prin alterarea statusului REDOX din peretele vascular . Leziunea aterosclerotica este dependenta de interactiunea dintre celula endoteliala si lipoproteinele cu densitate joasa de circulatie . S-a observat ca LDL incubate cu celule endoteliale timp de 24-48 ore sunt recunoscute de receptorii de pe macrofage si sunt rapid capturate printr-un proces de endocitoza. Modificarea LDL de catre celulele endoteliale , macrofagele , neutrofilele si celulele muscular netede sunt capabile sa oxideze LDL prin eliberarea SRO cu inalta toxicitate. Produsii citotoxici rezultati prin peroxidarea lipidelor prezinta un ‘iritant’ constant pentru endoteliu si contribuie la dezvolatrea unei cascade de evenimente care determina lezarea endoteliului , agregarea trombocitelor la endoteliu , eliberarea factorilor de crestere stimulatori ai proliferarii celulelor muscular netede , acumularea celulelor inflamatorii si dezechilibrelor metabolismului eicosanoizilor. Oxidarea LDL este o reactie lipidica guvernata de radicalii liberi . Produsii finali ai peroxidarii lipidelor sunt aldehidele citotoxice , hidrocarburi gazoase si variate reziduuri chimice , malonilaldehida , cu rol in proprietatile citotoxice . Unele aldehide rezultate din peroxidare declanseaza eliberarea de IL-1. Produsii de degradare pot difuza de la locul de formare si pot determina edem celular , cresterea permeabilitatii vasculare , eliberarea de factori chemotactici pentru polimorfonucleare . Ei altereaza activitatea fosfolipazei A2 si formeaza favorizarea cascadei acidului arahidonic cu formarea consecutiva de prostaglandina si endoperoxizi . Se poate astfel concluziona ca stresul oxidativ declanseaza un raspuns inflamator implicat direct in patogenia ateroslerozei .

14

Concluzionam, afirmand ca implicarile rezultate in urma activitatii si corelarii prezentei hiperhomocisteinemiei asupra stresului oxidativ , precum si inflamatia , alterarea metabolismului lipidic se interactioneaza complex in aterogeneza. Hiperhomocisteinemia moderata este, de asemenea , considerata un factor de risc independent pentru aparitia leziunilor vasculare din AS . Multe studii au aratat corelatii stranse intre hiperhomocisteinemia si boala coronariana, cerebrovasculara si trombembolismul peroferic. Aproximativ 10 % risc de boala coronariana este atribuit cresterii concentratiei de homociteina . Cresterea homocisteinei cu pana la 5 micromol/ L creste riscul aproximativ de 41% , ca si cresterea colesterolului cu 0,52 micromol/L ( 20 mg/l ) . Fumatul si hipertensiunea au efecte multiple pe actiunea aterogenica a concentratiilor crescute ale homocisteinei . Asocierea dintre hiperhomocisteina si factorul V- Leiden (rezistenta la proteina C activata ) creste riscul de tromboza de 3-6 ori . Rolul stresului oxidativ in cancer Cancerul a suscitat o vie atentie in mediile medicale si biochimice in ultimii ani.S-au adus progrese reale in ceea ce priveste cunoasterea agentilor cancerigeni si a mecanismelor acestuia.O estimare bruta arata ca 75 % din cancerele umane sunt induse de mediu si factorii carcinogeni ai acestuia (aer, apa, alimente , etc ) si radiatii .Se fac eforturi imense pentru identificarea carcinogenilor din mediu si explicarea mecanismului de actiune al aestora, cei chimici prezentand structuri diverse dar in final intervenind prin :

modificari structurale permanente ale ADN, activarea cailor de transductie a semnalelor citoplasmatice , mitocondriale, si nucleare.

modularea proteinelor si genelor de stres care moduleaza genele efectoare implicate in cresterea, diferentierea si moartea celulara.

In cancer exista un stres oxidativ permanent.Stresul oxidativ si radicalii liberi sunt cunoscuti de mult ca agenti mutageni .Ei fiind mediatori ai unor modificari feno- si genotipice ce duc de la mutatie la neoplazie . Exista reactii metabolice relativ specifice ale unor carcinogeni chimici (hidrocaburi aromatice) ce actioneaza prin radicali liberi. Astfel ea se desfasoara in 3 stadii: initiere, promovare si conversie maligna. O mutatie in complexul care controleaza cresterea si diferentierea, e un exemplu al tipuluide modificare genica in stadiul de initiere. Varii carcinogeni, inclusiv SRO pot produce perturbari genetice fundamentale. Rolul stresului oxidativ in initierea cancerului Se detin numeroase dovezi PRO asupra interveniei SRO in initierea carcinogenezei in cel putin cinci arii care contin:1- Inducerea tumorilor prin radiatii ionizante 2- Inducerea tumorilor prin corpi straini 3- Inducerea mediata de metal 4- Inducerea prin substante chimice 5- inducerea tumorala produsi alimentari.

15

In cazul radiatiilor, este dificila stabilirea exacta a unui mecanism care sa explice carcinogeneza sub actiunea acestora fara implicarea predominanta a SRO. Activitatea izoenzimei superoxid dismutaza in plasma si tesutul tumoral in cancerul de san:

-S-a observat o crestere generala a activitatii SOD in plasma si tesutul tumoral ( p< 0,05).

-Mn-SOD scade semnificativ in tesutul tumoral (p<0.05) si scade nesemnificativ in plasma.

EC-SOD in plasma( in benignitate si in cancerul de san) este3,5%, respectiv 22,8%. -scaderi EC-SOD in tesutul tumoral -pentru TBRS( tiobarbituric reactive substance) s-a observant aceeasi tendinta.

Alcoolul influenteaza prin cresterea stresului oxidativ in toate tipurile de cancer iar efectul este si mai nociv in asociere cu fumatul. Un factor major de risc pentru dezvoltarea cancerului este scaderea GSH si a TAA( total antioxidant activity). Valorile produşilor finali ai peroxidării lipidice sunt la niveluri semnificativ crescute în serul pacienţilor cu cancere ale laringelui şi hipofaringelui comparativ cu martorii sănătoşi. Capacitatea antioxidantă totală este diminuată semnificativ în serul pacienţilor cu cancere ale laringelui şi hipofaringelui comparativ cu martorii sănătoşi EFECTELE STRESULUI OXIDATIV ÎN DIABETUL ZAHARAT

La pacienţii diabetici s-a constatat creşterea peroxidării lipidelor şi scăderea activităţii enzimelor antioxidante eritrocitare.

Principalele ţinte ale oxidării sunt proteinele, creşterea conţinutului în carbonil al acestora, prin formarea aldehidelor şi cetonelor este un indicator al stresului oxidativ.

Nivelul plasmatic al proteinelor glicozilate neenzimatic este semnificativ crescut la pacienţii diabetici comparativ cu persoanele nondiabetice. Acest fenomen se observă încă din stadiile precoce ale bolii ceea ce înseamnă că modificările structurale ale proteinelor plasmatice datorate radicalilor liberi apar devreme şi vor duce în timp la apariţia complicaţiilor în stadiile tardive ale bolii.

Interesul crescând faţă de stresul oxidativ şi de implicarea lui în patologie se justifică prin rolul esenţial pe care îl joacă acesta în aparitia unor leziuni specifice celulare, tisulare sau de organ denumite generic leziuni oxidative.

In prezent este cunoscut faptul că la pacienţii diabetici, ca urmare a starilor de hiperglicemie se produce o intensificare a agresiunii oxidative prin autooxidarea glucozei, formarea produşilor avansaţi de glicozilare. Speciile reactive ale oxigenului apărute ca urmare a acestor procese vor determina apariţia disfuncţiilor la nivelul endoteliului şi vor induce o intensificare a proliferării celulelor musculare netede.

Totuşi fenomenul este încă incomplet studiat în prezent. Acest neajuns porneşte de la faptul că speciile reactive au o durată scurtă de viaţă şi de aici derivă dificultăţile de dozare a acestori produsi şi dificultatea de a stabilii relaţia dintre acţiunea acestor produşi şi apariţia unor fenomene patologice .

16

Pacienţii diabetici prezintă hiperglicemie cronică, ceea ce va genera o agresiune oxidativă. Prin autooxidarea glucozei se vor forma produşi de glicozilare avansată. In urma acestor agresiuni oxidative se produc radicali liberi care vor iniţia mecanisme fiziopatologice ce vor genera disfuncţii endoteliale, modificări importante care sunt implicate în apariţia complicaţiilor microvasculare ale diabetului zaharat.

Mecanismele prin care stresul oxidativ intervine în apariţia leziunilor vasculare la pacienţii diabetici sunt: intensificare oxidării LDL, disfuncţia endotelială, inflamaţia vasculară, activarea proceselor de tromboză.

Reducerea activităţi sistemelor antioxidante este consecinta mai multor mecanisme: Scăderea concentraţiei de glutation, scăderea activităţii superoxiddismutazei (SOD), deficitul de detoxifiere a componentelor stresului carbonil, modificarea producerii de NO şi a acţiunii sale.

Capacitatea antioxidanta a organismului poate fi apreciata prin dozarea substantelor antioxidante de tipul: ceruloplasminei.

Actiunea agentilor oxidanti la nivel tisular şi celular va determina declansarea unor procese fiziopatologice care stau la baza aparitiei leziunilor microvasculare.

Metode de determinare a radicalilor liberi Determinarea radicalilor liberi este foarte dificilă datorită faptului că ei se găsesc în concentraţii

scazute şi au o durata scurtă de viaţă. Pentru determinare sunt folosite:

- metode indirectede dozare: urmăresc efectele radicalilor liberi asupra diferitelor structuri,

dozând produşii rezultaţi din degradarea acestor substante:

malondialdehida (MDA)

proteinele carbonilate

INFLUENTA STRESULUI OXIDATIV IN BOLI INFLAMATORII

Celulele epiteliale sunt componentele cele mai superficiale ale pielii si mucoaselor si sunt principalele generatoare de bariere fizico-chimice, inalt specializate care sunt organizate in tesuturi ce exista in primul rand pentru a defini si separa distinct compartimentele corpului cu rolul de a proteja gazda in intregime dar si de a prezerva functia homeostatica a organismului.

Aceste functii protective sunt evident maximale la nivelul pielii, conjunctivei si mucoasei respiratorii, din moment ce ele definesc circumferinta ce vine in contact direct cu mediul inconjurator. In mod normal microorganismele, toxinele si alergenii din mediu sunt blocati eficient de la intrare de sistemul de aparare organizat de straturile de celule epiteliale.

In portiunile viabile ale epidermei, membranele lipido-plasmatice si sistemele de transport cu specificitate inalta formeaza un obstacol formidabil impotriva pasajului transepitelial al celor mai nedorite molecule. In plus, conexiunile barierei jonctionale intercelulare creaza un

17

continuum cu citoscheletul celulelor epiteliale care este conservat chiar si cand celula epiteliala se divide sau intra in apoptoza.

Oricum o mare parte din functia de bariera fizico-chimica a epidermei umane, impotriva mediului inconjurator este asigurata de invelisul celulelor corneene (CE), un unic sistem format din doua compartimente inalt lipofilice al corneocitelor intregrat in matricea intercelulara bogata in lipide. De jos in sus, de la stratul cel mai profund al epidermei, keratinocitele progresiv diferentiate si eventual transformate in cellule corneene anucleate formeaza o plasa keratinoasa inchisa cu o matrice insolubila de proteine si inconjurata de un invelis lipidic bogat in ceramide. Ambele componente proteice si lipidice ale CE sunt esentiale pentru functionarea optima a barierei, find demonstrata de defectele genetice care stau la baza numeroase boli umane.

MECANISMUL  ECHILIBRULUI  REDOX  LA  NIVELUL  PIELII

In pielea sanatoasa, practic toate tipurile celulare ale pielii produc ROS si RNS.De exemplu, atat melanocitele cat si keratinocitele produc apa oxigenata (H202) si radical superoxid in reactia cu pheomelanil cu lumina UV. Toate celulele deasemenea produc cantitati mici de anion superoxid prin producerea transferului de electroni din lantul respirator mitocondrial. Prin reactionarea directa cu moleculele lipidice, sau afectand enzimele lipido-metabolice redox-sensibile (fosfolipaza, lipooxigenaza si ciclooxigenaza), ROS induc producerea de specii reactive lipidice (radicali lipidici, peroxizi, hidroxiperoxizi, aldehide).

Desi mutarea anionului peroxid conteaza probabil mult pentru H2O2 produsa de celule eucariote , deasemenea poate fi format si direct prin reducerea celor doi electroni ai oxigenului, mecanism impartit si de un numar de oxidaze flavoproteice.

NO si peroxinitritul sunt RNS majore in sistemul biologic. In piele, NO este produs de doua isoforme constitutive oxid-nitric sintetaze (cNOS), indentificate ca endoteliala (eNOS), neuronala (nNOS), si o isoforma inductibila (iNOS).

Atat fibroblastii cat si keratinocitele exprima constitutive NOS. NO reactioneaza usor cu speciile oxidative inclusiv ROS, metale tranzitionale si tioli care leaga numeroase RNS.In mod particular, automat reactioneaza cu anionul superoxid in apropierea ratelor de difuziune limitata, conducand catre producerea extrem de rapida a ionului peroxinitrit .Cand este generat la concentratii crescute, peroxinitratul poate difuza si poate suferii transformari in alti oxidanti puternici, incluzand radicalul hidroxil si alte RNS (No2) Este important sa subliniem ca nivelele scazute ale ROS si RNS inalt reactive sunt efectori indispensabili in caile homeostatice conducand la proliferare, difentiere, senescenta si moarte celulara si exista numeroase evidente ale organismului care confirma ca este adevarat deasemenea si pentru alte populatii celulare distincte ale pielii organismului .

Pe perioada contactului direct cu provocarile fizico-chimice ale mediului extern, pielea este deosebit de bogata in sisteme antioxidante efective. In straturile viabile ale epidermei, antioxidantii lipidici solubili, mai ales alfa-tocoferol si enzimele antioxidante precum catalaza (CAT), superoxid dismutaza (SOD), glutation peroxidaza (GPX) sunt exprimate din abundenta. Spatiile extracelulare ale epidermei si dermului contin un numar mare de antioxidanti hidrosolubili precum acidul ascorbic, acid uric si glutationul. In schimbul contracararii efective a insultelor ce vin din partea mediului inconjurator, CE ale pielii normale umane contin nivele ridicate de antioxidanti hidro- si liposolubili precum glutationul, thioredoxina, vitamina c , acid

18

uric, 2-tocoferol, scualen si coenzima Q10 , distribuite in raport cu concentratiile crescute din straturile profunde .

Psoriazisul este o boala inflamatorie cronica, afectiune proliferativa a pielii caracterizata prin leziuni patologice ale tegumentului cauzate de numerosi factori exogeni si endogeni. Este asociat cu dezechilibre biochimice si imunologice.

A fost sugerat faptul ca o crestere a speciilor reactive ale oxigenului si o functie antioxidanta compromisa sunt implicate in patogenia psoriazisului, reflectate de cresterea peroxidarii lipidelor si scaderea TAS (capacitatii antioxidante totale) precum si scaderea activitatii SOD si CAT. Cresterea produsilor finali ai NO la pacientii cu psoriasis poate fi urmare a unui mecanism immunologic si inflamator, informatie foarte importanta pentru etiopatogenia psoriazisului.

Mai mult, s-a constatat o agravare a statusului oxidativ comparativ cu progresia leziunilor psoriazice.

p

Psoriazis Reprezentare schematica a psoriazisului

Evidentierea stress-ului oxidativ in psoriazis

Exista multe semne sistemice si leziuni ale stress-ului oxidativ la pacientii cu

psoriazis activ. In plasma si in eritrocitele pacientilor cu psoriazis activ nivele crescute de malonildialdehida (MDA) au fost interpretate ca amprente a epuizarii sistemelor naturale de aparare antioxidante enzimatic si nonenzimatic. Intr-un alt studiu, eritrocitele pacientilor au prezentat o scadere semnificativa a SOD si GPx eritrocitare. In acest raport nivele crescute de MDA au fost masurate in tesuturile lezate dar nu si in serul pacientilor cu psoriazis. Alti autori au descris un potential antioxidant scazut in plasma impreuna cu o expresie SOD mai mare decat in mod normal precum si valori crescute ale MDA, dar nici o corelatie intre acesti parametri si severitatea bolii. Aceste rezultate sustin ideea ca un dezechilibru in sistemul oxidant – antioxidant poate fi observat la pacientii cu psoriazis. La nivelul leziunii infiltrarea masiva cu leucocite activate duce la eliberarea locala a unei serii de specii prooxidative, care la randul lor sunt implicate in activarea celulelor proinflamatorii restante ale pielii, in special a keratinocitelor si fibroblastilor. Numerosi mediatori proinflamatori in special TNFα, IFNγ si IL-8 stimuleaza leziunile psoriazice si sunt inductori puternici de exprimare a iNOS si NO eliberate din keratinocitele epidermice.

19

NO a fost recent considerat un jucator cheie in patogeneza psoriazisului acesta fiind un proinflamator in piele.

Investigatiile au descoperit ca aplicarea unui unguent cu eliberare de NO pe leziunile psoriazice active duce la regresia bolii si prin urmare la inhibarea celulelor T si a macrofagelor atrase in piele. S-au inregistrat cresteri semnificative in ser de malondialdehida, produsi de degradare ai

oxidului nitric cu o scadere a activitatii enzimei eritrocitare - superoxid dismutaza, activitatea catalazei si statusul antioxidant total la pacientii cu psoriasis sugerand agravarea bolii.

‘’Radicalii liberi sunt asadar dusmanii de temut ai tineretii si sanatatii, ei sunt

raufacatorii care ne imbatranesc pielea inainte de vreme, ne ameninta cu infact sau cu cancer. Adevaratii teroristi ai celulelor, creeaza o veritabila anarhie in organism, dezarmandu-l in fata bolii…’’