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Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik II-Großhadern
der Ludwig-Maximilians-Universität München
Direktor: Prof. Dr. med. B. Göke
Stressreaktion des Pankreas
Hat die Hämoxygenase-1 (HSP32) eine protektive Wirkung auf die akute
experimentelle Pankreatitis?
Dissertation
zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin
an der Medizinischen Fakultät der
Ludwig-Maximilians-Universität zu München
vorgelegt von
Tobias Gebhardt
aus
Wiesbaden
München 2007
Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät
der Universität München
Berichterstatter: Prof. Dr. A. Wagner
Mitberichterstatter: Prof. Dr. T. Hoffmann Prof. Dr. R. Gärtner
Mitbetreuung durch den promovierten Mitarbeiter: PD Dr. med. C. Schäfer
Dekan: Prof. Dr. med. D. Reinhardt
Tag der mündlichen Prüfung: 19.04.2007
Meinen Eltern Gisela und Dieter,
welche mir gemeinsam mein Studium ermöglicht haben,
in Liebe und Dankbarkeit gewidmet.
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI
1. Gegenstand und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 1 2. Einleitung und Grundlagen 4
2.1. Anatomie und Physiologie des Pankreas..................................................... 4 2.1.1. Allgemeine Anatomie ........................................................................ 4 2.1.2. Allgemeine Physiologie..................................................................... 5 2.1.3. Exokrines Pankreas und dessen funktionelle Anatomie ................... 5 2.1.4. Physiologie des exokrinen Pankreas ................................................ 6
2.2. Ätiologie und Pathogenese der akuten Pankreatitis .................................... 9 2.2.1. Ätiologie ............................................................................................ 9 2.2.2. Pathophysiologische Modelle und Pathogenese der Pankreatitis .. 10 2.2.3. Pathophysiologische Vorgänge in der Frühphase .......................... 12
2.2.3.1. Sekretorische Blockade ..................................................... 13 2.2.3.2. Frühzeitige intrazelluläre Trypsinaktivierung...................... 13 2.2.3.3. Immunologische Reaktion im Rahmen der akuten
Pankreatitis ........................................................................ 17 2.3. Oxidativer Stress und zellulärer Schutz ..................................................... 18 2.4. Hitzeschockproteine................................................................................... 19
2.4.1. Expression und Aufgabe von Hitzeschockproteinen....................... 19 2.4.2. Hitzeschockproteingruppen............................................................. 20 2.4.3. Genetische Regulation der HSP-Synthese..................................... 22 2.4.4. Induktion von Hitzeschockproteinen im Pankreas .......................... 22
2.5. Hämoxygenase-1 (HO-1/HSP32)............................................................... 23 2.5.1. Charakterisierung der Hämoxygenase............................................ 23 2.5.2. Formen und Funktionen der Hämoxygenase.................................. 24 2.5.3. Struktur der Porphyrine und Einfluß von synthetischen
Metalloporphyrinen wie Kobalt-Protoporphyrin (CoPP) .................. 26 2.5.4. Die Hämoxygenase als ein protektives Protein............................... 28
3. Ergebnisse 31 3.1. Proteinexpression und Regulation von Hitzeschock-Proteinen im
Pankreas......................................................................................... 31 3.1.1. Nachweis verschiedener HSPs im Pankreashomogenat nativ und
nach Hyperthermie-Präkonditionierung........................................... 31 3.1.2. CoPP induziert die HSP32-Expression im Pankreas ...................... 35 3.1.3. Auswirkungen von Caerulein und Caerulein-induzierter
Pankreatitis auf die HSP-Expression .............................................. 41
Inhaltsverzeichnis
II
3.2. Biochemische Messungen und statistische Analysen................................ 45 3.2.1. Einfluss der Präkonditionierung auf die Trypsinaktivität in
Pankreashomogenaten................................................................... 47 3.2.1.1. Validierung der Trypsinbestimmung................................... 47 3.2.1.2. Bestimmung von Trypsin in Pankreashomogenaten.......... 49
3.2.2. Einfluss der Präkonditionierung auf die Sekretion von Lipase und Amylase .......................................................................................... 50
3.2.3. Ödembildung und relativer Wassergehalt ....................................... 53 3.3. Histologische und makroskopische Morphologie ....................................... 54
4. Diskussion 61 5. Zusammenfassung 71 6. Methoden 72
6.1. Präkonditionierungen ................................................................................. 72 6.1.1. Präkonditionierung durch Hyperthermie.......................................... 72 6.1.2. Präkonditionierung durch CoPP...................................................... 72
6.2. Organentnahme des Pankreas zur Analyse der Proteinexpression .......... 73 6.3. Induktion einer akuten experimentellen Pankreatitis.................................. 74 6.4. Pankreasödem ........................................................................................... 75 6.5. Enzymaktivitätsmessungen........................................................................ 75
6.5.1. Enzymaktivitätsmessung von Amylase........................................... 75 6.5.2. Enzymaktivitätsmessung von Lipase .............................................. 76 6.5.3. Bestimmung von Trypsin in Pankreashomogenaten....................... 78
6.6. Western-Blotting zum Proteinnachweis ..................................................... 80 6.6.1. Erstellung von Zellproben ............................................................... 80 6.6.2. Quantitative Proteinbestimmung..................................................... 81 6.6.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese........................................... 81 6.6.4. Transfer der Proteine auf Nitrozellulose.......................................... 82 6.6.5. Immunchemischer Nachweis von Proteinen................................... 83 6.6.6. Immunchemischer Nachweis von unterschiedlichen Proteinen
auf gleicher Nitrozellulosemembran (Stripping) .............................. 83 6.7. Histologische Untersuchungen .................................................................. 84
6.7.1. Hämatoxylin/Eosin-Färbung............................................................ 84 6.8. Statistische Auswertungen......................................................................... 84
7. Materialien 86 7.1. Chemikalien und Reagenzien .................................................................... 86
7.1.1. Narkose (Hyperthermie).................................................................. 86 7.1.2. Caeruleinpankreatitis ...................................................................... 86 7.1.3. Protein-Bestimmung ....................................................................... 86 7.1.4. Hämatoxylin/Eosin-Färbung (Histologie)......................................... 86
Inhaltsverzeichnis
III
7.1.5. Amylase-Bestimmung ..................................................................... 87 7.1.6. Lipase-Bestimmung ........................................................................ 87 7.1.7. Trypsin-Bestimmung ....................................................................... 87 7.1.8. SDS-Probenaufbereitung................................................................ 88 7.1.9. Western-Blotting ............................................................................. 91
7.2. Technische Geräte und Materialien ........................................................... 94 7.2.1. Technische Geräte.......................................................................... 94 7.2.2. Materialien ...................................................................................... 95
7.3. Versuchstiere ............................................................................................. 95 8. Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 96 9. Literaturverzeichnis 99 10. Danksagung 121 11. Lebenslauf 122
Abbildungsverzeichnis
IV
Abbildungsverzeichnis Abb. 1 Anatomische Verhältnisse des Pankreas ............................................. 4 Abb. 2 Azinuszelle mit Schaltstücken und Ausführungsgang .......................... 6 Abb. 3 Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Azinuszelle ...................... 7 Abb. 4 Pathophysiologische Phänomene in der Frühphase der akuten
Pankreatitis ......................................................................................... 13 Abb. 5 a/b Physiologische Schutzmechanismen vor Selbstverdauung und
Störungen bei hereditärer Pankreatitis ............................................... 14 Abb. 6 Immunantwort im Rahmen einer akuten Pankreatitis ......................... 17 Abb. 7 Katalytische Reaktion der Hämoxygenase ......................................... 24 Abb. 8 Nomenklatur der Porphyrine ............................................................... 27 Abb. 9 Cobalt (III) Protoporphyrin IX chloride [C34H32CoN4O4Cl] ................... 28 Abb. 10 Darstellung der Spezifität der Antikörper und der Einfluss von
Hyperthermie auf die Expression von HSP32 und HSP70 im Pankreas und der Leber ..................................................................... 32
Abb. 11 Einfluss von Hyperthermie auf die Expression von HSP25/27 im Pankreas und der Leber ..................................................................... 34
Abb. 12 Einfluss der Präkonditionierung mit CoPP auf die Induktion von HSP32 im Vergleich mit HSP70 ......................................................... 35
Abb. 13 Dosisabhängige Induktion von HSP32 durch CoPP- Präkonditionierung (Dose response) .................................................. 37
Abb. 14 a/b Einfluss von Hyperthermie und CoPP im Vergleich auf HSP25/27 und 32 im Pankreas............................................................................ 38
Abb. 15 Die Induktion von HSP25 nach CoPP-Präkonditionierung mit steigender Dosis ................................................................................. 40
Abb. 16 Auswirkung von Caerulein, Hyperthermie und CoPP auf das Expressionsmuster von HSP32 und HSP70 im Vergleich .................. 42
Abb. 17 Western Analyse mit Anti-HSP32 und die Auswirkungen von Trägerlösungen auf die HSP32-Expression ....................................... 44
Abb. 18 Messung der Zunahme der Fluoreszenz bei definierten Standard-Trypsinkonzentrationen ...................................................................... 48
Abb. 19 Kalibriergerade aus den ermittelten Steigungen der Standardkonzentrationen.................................................................... 48
Abb. 20 Trypsinaktivität im Pankreasgewebe .................................................. 49 Abb. 21 Aktivität der Lipase im Serum der Versuchstiere ................................ 51 Abb. 22 Aktivität der Amylase im Serum der Versuchstiere............................. 52 Abb. 23 Relativer Wassergehalt des Pankreas (Feuchtgewicht) ..................... 53 Abb. 24 Darstellung des OP-Situs eines Tieres ohne CoPP-Präkonditionierung
nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis ............................. 55 Abb. 25 Darstellung des OP-Situs eines Tieres ohne CoPP-Präkonditionierung
nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis ............................. 56
Abbildungsverzeichnis
V
Abb. 26 Darstellung des OP-Situs eines durch CoPP-Präkonditionierung vorbehandelten Tieres nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis ......................................................................................... 57
Abb. 27 Darstellung des OP-Situs eines durch CoPP-Präkonditionierung vorbehandelten Tieres nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis ......................................................................................... 58
Abb. 28 Darstellung von nativem Pankreasgewebe eines Versuchstieres ...... 59 Abb. 29 Darstellung von Pankreasgewebe eines Versuchstieres 6h nach
Caerulein-induzierter Pankreatitis....................................................... 59 Abb. 30 Darstellung von Pankreasgewebe eines Versuchstieres 6h nach
Caerulein-induzierter Pankreatitis und 24h nach CoPP-Präkonditionierung.............................................................................. 60
Abb. 31 Reaktion des Lipase-Farbtests ........................................................... 77 Abb. 32 Berechnung der Lipaseaktivität .......................................................... 77 Abb. 33 Fluorimetrische Umsetzung des Substrats durch Trypsin .................. 79
Tabellenverzeichnis
VI
Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Häufigste Faktoren und Ursachen als Auslöser einer Pankreatitis....... 9 Tabelle 2 Die bekanntesten und wichtigsten Gruppen der Hitzeschock-
Proteine .............................................................................................. 21 Tabelle 3 Übersicht über die Isoformen der Hämoxygenase ............................. 26 Tabelle 4 Verdünnungen der verwendeten Antikörper zum
immunochemischen Nachweis der HSPs ........................................... 31 Tabelle 5 Vorbehandlungen der Versuchstiere in einzelnen
Versuchsgruppen................................................................................ 45 Tabelle 6 Verwendete Reagenzien in einzelnen Versuchsgruppen ................... 73 Tabelle 7 Reagenzien des enzymatischen Farbtests (nach Roche) .................. 76 Tabelle 8 Darstellung der eingesetzten Standardtrypsinkonzentrationen .......... 80 Tabelle 9 Darstellung der Zusammensetzung der Sammel- und Trenngele ...... 82
Kapitel 1 Gegenstand und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
1
1. Gegenstand und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
Die akute Pankreatitis ist in den Industrieländern eine relativ häufig vorkommende
Erkrankung des Pankreas mit einer Inzidenz von 20 bis 100 Fällen pro 100.000
Menschen jährlich.
Das Ursachenspektrum ist breit gefächert (s. Abschnitt 2.2.1.) und der
Krankheitsverlauf in mehr als ¾ der Fälle mild und selbstlimitierend. In etwa 20 bis
30% der Fälle kommt es zu einem schweren Verlauf mit systemischen
Komplikationen, die nicht selten zu einem letalen Ausgang führen [Nam und Murthy
2003]. Das Verständnis der Pathophysiologie der Pankreatitis hat durch neuere
Forschungsergebnisse der letzten Jahre bedeutend zugenommen. Es wurden zwar
in den letzten Jahren Konzepte etabliert, wie z.B. die sekretorische Blockade, die
frühzeitige intrazelluläre Trypsinaktivierung oder andere pathologische Vorgänge (s.
Abschnitt 2.2.3.), dennoch gibt es bislang keine Möglichkeit, den Verlauf einer
Pankreatitis vorherzusagen und es steht auch keine kausale Therapie zur
Verfügung. Im Vordergrund der Therapie stehen daher rein symptomatische
Ansätze wie Schmerz- und Volumentherapie, sowie die Therapie von
Komplikationen.
Die Arbeitsgruppe Pankreas der Medizinischen Klinik II des Klinikums Großhadern
erforscht die Stressreaktion des Pankreas, mit dem Ziel, durch die
Charakterisierung der Stressreaktion des Pankreas weiterführende Erkenntnisse
zum Verständnis der Pathophysiologie der Pankreatitis und damit Ansatzpunkte für
eine adäquate Therapie zu erarbeiten.
Es können offensichtlich mehrere Hitzeschockproteine (HSPs) im Pankreas durch
Präkonditionierung mit verschiedenen Methoden induziert werden, so dass sich die
Frage nach der Bedeutung individueller HSPs in diesem Organ stellt. Es finden sich
in der Literatur zumindest zahlreiche Hinweise dafür, dass verschiedene
Hitzeschockproteine in anderen Systemen protektive Wirkung zeigen, wobei der
genaue Mechanismus immer noch nicht gut verstanden ist.
Durch die eingehende Untersuchung der Stressreaktion konnte bereits gezeigt
werden, dass Hitzeschockproteine, wie z.B. HSP27 oder HSP70, im Tiermodell
gegenüber einer akuten Pankreatitis protektiv wirken [Kubisch et al. 2004, Schäfer
Kapitel 1 Gegenstand und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
2
et al. 2005] und dass verschiedene Präkonditionierungen, wie zum Beispiel die
Hyperthermie-Präkonditionierung und auch die akute Pankreatitis selbst (s.
Abschnitt 2.4.4.), zur Expression von Hitzeschockproteinen, wie zum Beispiel
HSP70, im Pankreas führen [Wagner et al. 1996].
Die Expression wird durch Stress in großen Mengen induziert und die
Überexpression führt zu erhöhter Widerstandsfähigkeit gegenüber Hitze oder
anderen Stressfaktoren in einer Reihe von Zellinien [Kubisch et al. 2004]. HSP27 ist
offensichtlich an der Regulation des Zytoskeletts, insbesondere des Aktins, beteiligt,
indem die Überexpression zu einer Stabilisierung der Aktin-Mikrofilamente führt
[Schäfer et al. 1999, Kubisch et al. 2004].
Neben der Untersuchung von HSP27 und HSP70, die nicht Bestandteil der
vorliegenden Arbeit sind, steht besonders HSP32 (Hämoxygenase-1) [Ewing und
Maines 1991] und dessen Bedeutung im Rahmen der akuten Pankreatitis im
Vordergrund. Dies gilt nicht zuletzt deshalb, weil dieses Hitzeschockprotein relativ
gut definierte und biochemisch beeinflussbare Funktionen hat, so dass die selektive
Hemmung und Aktivierung dieses HSPs Aussagen bezüglich seiner Bedeutung für
die Stressreaktion bei der Pankreatitis zulassen. Auch ist der Einfluss auf die akute
Pankreatitis anhand spezifischer Parameter, wie Enzymaktivitäten (Amylase,
Lipase, Trypsin) oder morphologische Veränderungen (Histologie, Ödembildung),
gut im Verlauf zu dokumentieren und soll in dieser Arbeit untersucht werden.
Im Pankreas wird HSP32/HO-1 in der Spätphase durch Caerulein induziert [Fu et al.
1997, Sato et al. 1997]. Es existieren allerdings keine Daten zur Induktion in der
Frühphase der akuten Pankreatitis oder zur Induktion durch Hyperthermie. Durch
zuletzt genannte Methode lassen sich Vergleiche zu anderen HSPs, wie z.B. HSP27
oder HSP70, welche in unserer Arbeitsgruppe eingehender Untersucht wurden,
ziehen [Kubisch et al. 2004, Ploessl et al. 2005, Schäfer et al. 2005].
Untersuchungen über mögliche protektive Effekte der HO-1 im Pankreas liegen
ebenfalls nicht vor. Da die HO-1 zur Anhäufung antioxidativ wirkender Metabolite
wie Biliverdin und Bilirubin führt [Elbirt und Bonkovsky 1999], erscheint eine wichtige
Rolle der HO-1 für die Stressreaktion bei der akuten Pankreatitis zumindest
aufgrund theoretischer Erwägungen durchaus plausibel, da oxidativer Stress bei der
Entstehung der akuten Pankreatitis sehr wahrscheinlich eine wichtige Rolle spielt
[Schulz et al. 1999]. Sauerstoffradikale können mit einer Vielzahl von zellulären
Kapitel 1 Gegenstand und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
3
Molekülen wie Lipiden und Proteinen interagieren und zu Funktionsbeeinträchtigung
führen. Nachdem oxidativer Stress sehr wahrscheinlich einen wichtigen
Pathomechanismus bei der Entstehung der akuten Pankreatitis, zumindest im
Tiermodell darstellt, ist die Funktion der HO-1, Zellen vor oxidativem Stress zu
schützen, folglich sehr interessant (s. Abschnitt 2.3.).
Darüber hinaus lässt sich die HO-1, im Unterschied zu anderen
Hitzeschockproteinen, biochemisch mit verschiedenen Porphyrinen entweder
hemmen (Zink-Protoporphyrin, Zinn-Protoporphyrin) oder aktivieren (Kobalt-
Protoporphyrin) (s. Abschnitt 2.5.3.) und ist dadurch gut regulierbar [Amersi et al.
1999]. Diese Induktionsmöglichkeit stellt sich im Gegenzug bei anderen HSPs (z.B.
HSP70) nicht dar, so dass sich hier eine sehr spezifische Darstellung der
Auswirkungen und der Effekte auf die akute Pankreatitis, sowie der
pharmakologischen Induktionsmöglichkeit bietet, welche im Weiteren dargestellt
werden soll.
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
4
2. Einleitung und Grundlagen 2.1. Anatomie und Physiologie des Pankreas
2.1.1. Allgemeine Anatomie
Die Bauchspeicheldrüse (Pankreas) als zentrales Organ für die Verdauung und die
Regulation des Blutzuckers ist eine exokrine und endokrine Drüse und liegt
retroperitoneal in Höhe des zweiten Lendenwirbels hinter dem Magen. Sie gliedert
sich in Kopf (Caput), Körper (Korpus) und Schwanz (Cauda). Der Kopf liegt im
oberen Anteil des Duodenum, dem duodenalen C, das dünnere Ende mit dem
Pankreasschwanz im Bereich des Milzhilus. Ihr Gewicht ist etwa 70 g bis 90 g, sie
ist knapp 15 bis 20 cm lang, aber nur etwa 3 cm dick.
Abb. 1 Anatomische Verhältnisse des Pankreas
In der Bauchspeicheldrüse befinden sich kleine Drüsenläppchen, die das
Pankreassekret produzieren. Die Drüsenläppchen geben das Sekret in feine Gänge
ab, die sich zur Mitte der Bauchspeicheldrüse hin in einen großen
Hauptausführungsgang, den Ductus pancreaticus, vereinen. Dieser Pankreasgang
mündet zu 80% mit dem Ausführungsgang der Gallenblase in die Papilla vateri
(Papilla duodeni major) des Duodenums und ist von einer zarten Kapsel aus
kollagenem Bindegewebe umgeben. Die Blutversorgung erfolgt durch zahlreiche
kleinere Äste der Arteria mesenterica superior und des Truncus Coeliacus
(A. splenica, A. gastroduodenalis).
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
5
2.1.2. Allgemeine Physiologie
Das Pankreas ist ein zentrales Organ für die Verdauung und die Regulation des
Blutzuckers und lässt sich funktional in zwei Einheiten unterteilen: den exokrinen
Teil, dessen funktionelle Untereinheit die Azinuszellen sind und den endokrinen Teil,
der inselartig in den exokrinen Teil eingelagert ist und deshalb auch als Inselorgan
bezeichnet wird. Der endokrine Teil ist essentiell an der Regulation des Blutzuckers
beteiligt. In verschiedenen Zelltypen werden dafür Hormone gebildet und in die
Blutbahn abgegeben. A-Zellen produzieren Glucagon, das bei niedriger
Blutzuckerkonzentration ausgeschüttet wird und einen Abbau von Glycogen zu
Glucose in der Leber und damit eine Erhöhung des Blutzuckers bewirkt. Der
Gegenspieler dazu ist das Insulin, das bei hohen Blutzuckerkonzentrationen
ausgeschüttet wird und eine Aufnahme von Glucose aus dem Blut in die Zellen
bewirkt. Dabei ist für die vorliegende Arbeit der endokrine Anteil des Pankreas nicht
von Bedeutung.
Das exokrine Pankreas ist zuständig für die Synthese von Verdauungsenzymen und
für die Sekretion des Verdauungssaftes in das Duodenum. Dieser Saft setzt sich
aus einer Vielzahl an Eiweiß, Kohlenhydrat und Lipid abbauenden Enzymen sowie
Bicarbonat, das für die Neutralisation des sauren Magensafts zuständig ist,
zusammen.
2.1.3. Exokrines Pankreas und dessen funktionelle Anatomie
Das exokrine Pankreas des Menschen ist eine seröse, lobulär gegliederte Drüse.
Diese Lappen wiederum sind aus kleineren Lobuli zusammengesetzt, die mehrere
Gangverzweigungen enthalten, an deren Enden sich beerenförmige
Drüsenendstücke, die so genannten Azinuszellen, angliedern. Diese stellen die
morphologische und funktionelle Grundeinheit dar (s. Abb. 2).
Die pyramidenförmige Azinuszelle ist ungefähr 12-15 µm hoch und begrenzt mit
ihrer durch Mikrovilli besetzten apikalen Membran das Azinuslumen. Die
hauptsächlich apikal körnige Struktur ist bedingt durch die azidophilen
Zymogengranula. Deren Menge ist vom Funktionszustand der Zelle abhängig.
Die Azini sind dicht nebeneinander gepackt, das azinäre Lumen variiert im
Durchmesser in Abhängigkeit der Sekretionsphase. Im Interstitium der
benachbarten Azini befinden sich Fibrozyten, zwischen denen eingebettet die
Aufzweigungen der Blutgefäße und der Nerven verlaufen. Diese enden mit ihren
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
6
Synapsen an der basalen Plasmamembran der azinären Zelle, wobei sie von deren
Basallamina umhüllt werden. Jeder Azinus ist über das Schaltstück mit den
intralobulären und den in Bindegewebssepten verlaufenden interlobulären Gängen
verbunden. Die Schaltstücke sind relativ lang und münden direkt in die
Ausführungsgänge (s. Abb. 2).
Abb. 2 Azinuszelle mit Schaltstücken und Ausführungsgang
Die Ausführungsgänge bestehen aus einem allmählich an Höhe zunehmenden
prismatischen Epithel. Sie beginnen bereits intralobulär, die großen interlobulären
Gänge besitzen in der breiten bindegewebigen Hülle kleine, in die
Ausführungsgänge mündende, mukoide Drüsen. Die multiplen Ausführungsgänge
führen schließlich in den Hauptausführungsgang, den Ductus pancreaticus, der in
der Pars descendens des Duodenums auf der Papilla duodeni major mündet. Ein
sehr variabler akzessorischer Ductus pancreaticus accessorius mündet in den
Hauptgang oder selbständig in das Duodenum [Bockman et al. 1983, Ingbar 1993].
2.1.4. Physiologie des exokrinen Pankreas
Die Hauptfunktion des exokrinen Pankreas und der pankreatischen Azinuszellen ist
die Synthese, Speicherung und Sekretion von Verdauungs- und anderen Enzymen.
Das Pankreas des Menschen bildet täglich ca. 1,0 l bis 1,5 l blutisotones Sekret.
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
7
Das Sekret hat einen pH von 8,0 bis 8,4 und enthält Wasser, Elektrolyte wie Natrium
und Kalium, Anionen (Hydrogencarbonat, bis zu 125 mmol/l) und Enzyme, wie
Peptidasen (Trypsin (Trypsinogen), Chymotrypsin (Chymotrypsinogen), Carboxy-
peptidase), Lipasen (Lipase, Phospholipasen, Cholinesterase), Ribonukleasen und
α-Amylase.
Die Verdauungs- bzw. Proenzyme werden im Endoplasmatischen Retikulum
synthetisiert und von dort zum Golgi-Apparat transportiert. Die intrazelluläre
Speicherung der Enzyme erfolgt in so genannten Zymogengranula, die
membranumgebene Speicherorganellen darstellen. Hormone wie Cholezystokinin
oder Sekretin und der Neurotransmitter Acetylcholin bewirken eine Fusion der
Zymogengranulamembran mit der apikalen Plasmamembran der Azinuszelle,
wodurch es schließlich zur Exozytose der Enzyme in die Lumina der Azini kommt,
gleichzeitig findet eine intensive Neusynthese statt [Williams 1995, Williams et al.
1997].
Abb. 3 Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Azinuszelle
Aufnahme einer Azinuszelle mit deutlich erkennbaren fusionierten Granula
Die Sekretion der Verdauungsenzyme erfolgt nach Stimulation von spezifischen
Rezeptoren, die an der basolateralen Membran der Azinuszelle lokalisiert sind und
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
8
durch Hormone wie z.B. Acetylcholin oder CCK stimuliert werden. Für die Induktion
der experimentellen Pankreatitis bei Tieren wird häufig das CCK-Analogon
Caerulein verwendet. Beim Menschen werden die CCK-Effekte überwiegend über
neuronale Einflüsse vermittelt. Es gibt Hinweise darauf, dass beim Menschen ein
erheblicher Anteil der CCK-Rezeptoren nicht auf Azinuszellen, sondern auf
präsynaptischen cholinergen Neuronen lokalisiert ist [Adler et al. 1991, Niederau et
al. 1994].
Üblicherweise unterteilt man die exokrine Pankreassekretion in eine interdigestive
(basale) und in eine digestive (prandiale bzw. postprandiale) Phase. Die
interdigestive Sekretion findet man bei Nahrungskarenz bzw. dann, wenn die
aufgenommene Nahrung bereits vom Magen verdaut und von Jejunum und Ileum
resorbiert worden ist. Sie ist charakterisiert durch zyklische Aktivitätsschwankungen,
assoziiert mit dem Rhythmus der interdigestiven Motilität des oberen
Gastrointestinaltraktes. Die digestive Phase setzt schon vor der eigentlichen
Nahrungsaufnahme ein, nämlich bereits bei Vorstellung, Geruch und Anblick von
Speisen. Bei unmittelbarem Kontakt des Magens und des Dünndarms mit der
Nahrung bzw. mit dem Chymus wird sie verstärkt. Sie ist gekennzeichnet durch die
Ausschüttung großer Mengen an Wasser, Hydrogencarbonat und
Pankreasenzymen [Singer 1983].
Die Kontrolle über die Sekretion des exokrinen Pankreas unterliegt also neuralen,
hormonalen und auch parakrinen Mediatoren [Solomon 1987]. Unter
physiologischen Bedingungen existiert folglich im Gesamtorganismus eine Vielzahl
an stimulatorischen und inhibitorischen Regulationsmechanismen der
Pankreasfunktion. Diese bestimmen im Zusammenspiel die sekretorische Leistung
des exokrinen Pankreas insgesamt [Singer 1983]. Das normale exokrine Pankreas
zeigt folglich nicht eine konstitutive, sondern eine regulierte Sekretion, bei der die
Sekretionsprodukte in Abhängigkeit von extrazellulären Einflüssen synthetisiert und
nach Modifikation innerhalb der intrazellulären Kompartimente in die
Zymogengranula verpackt und exozytotisch freigesetzt werden [Palade 1975]. Über
transmembranöse und intrazelluläre Signalvermittlung erfolgt so eine Adaptation der
exokrinen Pankreasfunktion an die kurzfristigen, aber auch langfristigen
Veränderungen der Umweltbedingungen, wie beispielsweise die Zusammensetzung
der Nahrung [Morisset und Webster 1972, Webster et al. 1972, Kotler und Levine
1979].
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
9
2.2. Ätiologie und Pathogenese der akuten Pankreatitis
2.2.1. Ätiologie
Der Begriff „akute Pankreatitis“ beschreibt eine Vielzahl unterschiedlicher
Entzündungsformen des exokrinen Pankreas, die sich hinsichtlich Klinik,
Morphologie und Ätiologie unterscheiden, wobei viele pathogenetische Faktoren, die
den Verlauf dieser Erkrankung beeinflussen, zum größten Teil noch unbekannt sind.
Tabelle 1 Häufigste Faktoren und Ursachen als Auslöser einer Pankreatitis
Metabolisch Alkohol
Medikamente (z.B. Thiazide, Diuretika)
Hypertriglizidämie / Hyperlipoproteinämie
Hyperkalzämie
Genetische Ursachen
Mechanisch Gallensteine
Iatrogen (z.B. ERCP)
Trauma
Pankreastumor / Papillentumor
Kongenitale Anomalien
Sphinkter oddi Dysfunktion
Vaskulär Schock
Embolien
Polyarteriitis nodosa
Infektiös Mumps
Coxackie virus
M. Pneumoniae
Parasiten
Gifte
Hereditäre Formen (sind meistens häufiger Ursache einer chronischen Pankreatitis)
Trypsinogen-Gen
SPINK 1
CFTR
Wie andere Organe auch, reagiert das Pankreas dabei recht einförmig auf eine
ganze Reihe unterschiedlicher schädlicher Einflüsse und Noxen. Das klinische Bild
der akuten Pankreatitis variiert von einer milden Verlaufsform mit interstitiellen
Ödemen und „restitutio ad integrum“, bis hin zur schweren Verlaufsform mit
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
10
Multiorganversagen und Sepsis, was sich besonders in der schweren
nekrotisierenden oder hämorrhagischen Form der Erkrankung manifestiert.
Die akute Pankreatitis weist keine einheitliche Ätiologie auf, sondern kann durch
unterschiedliche Noxen ausgelöst werden (s. Tab. 1). Häufigste Ursachen der
akuten Pankreatitis sind Gallengangssteine (obstruktive Störungen) und
Alkoholabusus. Seltenere Ursachen sind unter anderem Medikamente, Toxine,
ERCP (iatrogene Ursache) und Tumore. Bei der chronischen Pankreatitis ist
Alkoholabusus die häufigste Ursache. Zusätzlich gibt es auch genetische Ursachen,
die die Präsdisposition für eine chronische Pankreatitis erhöhen können [Nam und
Murthy 2003].
2.2.2. Pathophysiologische Modelle und Pathogenese der Pankreatitis
In experimentellen Modellen der Erkrankung gibt es zahlreiche Faktoren, welche
eine Pankreatitis auslösen können, einbegriffen biliäre Obstruktion, die direkte
toxische Schädigung durch Ethanol und andere Toxine (wie z.B. Pharmaka), die
ischämische Schädigung, die Schädigung durch freie Radikale, Hypertrigliceridämie,
Hypercalcämie, eine Permeabilitätszunahme des Pankreasganges und
Hyperstimulation der Drüse sowie genetische Ursachen.
Die klassische Hypothese besagt, dass die biliäre Pankreatitis durch die Passage
eines Gallensteins durch das terminale bilio-pankreatische Gangsystem verursacht
werden kann, wobei gelegentlich eine Inkarzeration im ampullären Bereich auftritt.
Dieses Konzept basiert auf Opie's „Obstruktionstheorie“ von 1901 [Opie 1901].
Diese Theorie basierte auf dem bei zwei an Pankreatitis verstorbenen Patienten
erhobenen, autoptischen Nachweis von Gallensteinen, welche die Papilla major
verschlossen. Allerdings findet sich ein gemeinsamer Ausführungsgang von
Pankreas- und Gallenwegen, welcher lang genug wäre, einen Gallereflux im Falle
einer steinbedingten Okklusion der Papille zu erlauben, nur bei weniger als 20% der
Bevölkerung.
Weitere obstruktive Ursachen sind z.B. Trauma oder Tumor, welche mit einer
intraduktalen Druckerhöhung und einem duktalen Permeabilitätsanstieg
einhergehen können. Durch die Abflussbehinderung des Pankreassekretes im
Ductus pankreaticus ist die Ausschleusung der Pankreasproenzyme aus der
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
11
Azinuszelle gestört. Die Folge ist eine intrapankreatische Aktivierung dieser Enzyme
und somit Autodigestion des Organs [Steer 1997].
Hauptvertreter der direkten toxischen Schädigung, ist die akute Alkoholpankreatitis
[Apte und Wilson 2003]. Ursprung der alkoholinduzierten Pankreatitis ist die
Azinuszelle. Schon lange ist bekannt, dass Alkohol in Pankreasazinuszellen ganz
ähnlich wie in Hepatozyten metabolisiert werden kann [Clemente et al. 1977]. Es
gibt Hinweise, dass Alkoholmetabolite, zum Beispiel durch oxidativen Stress, zur
Schädigung von Azinuszellen bis zu Nekrosen führen können. Dies wiederum führt
zur Freisetzung von Chemokinen (z.B. Mob-1) und Zytokinen (z.B. TNF-α) durch die
Azinuszellen [Grady et al. 1997, Gukovskaya et al. 1997, Brady et al. 1999, Han et
al. 2000] (s. Abschnitt 2.2.3.3.). Oxidativem Stress sind auch unterschiedliche
Effekte auf die Pankreassekretion, die Pankreasgangpermeabilität und den Druck
im Pankreasgang zugeschrieben worden. Die Daten hierzu sind allerdings
widersprüchlich.
Aufgrund des aktuellen Kenntnisstandes scheint also ein direkter toxischer Effekt
von Alkohol und seinen Metaboliten bei entsprechend (genetisch oder durch
Cofaktoren) disponierten Patienten eine pathologische Sequenz auszulösen. Diese
beginnt mit der Azinuszellschädigung bis zur Nekrose und mündet in der
Freisetzung entzündlicher Mediatoren mit Stimulation des Immunsystems und
Rekrutierung von Makrophagen und Lymphozyten, in akuten rezidivierenden
Entzündungen sowie der Aktivierung von pankreatischen Sternzellen und
konsekutiver Fibrose. Neben genetischen Faktoren spielt zum Beispiel Rauchen
eine Rolle und scheint das Risiko für die Entstehung alkoholischer Pankreatitiden
und für die Fibrose sowie Verkalkungen des Pankreas zu erhöhen [Hartwig et al.
2000].
Offensichtlich müssen zum Alkohol noch weitere, entweder äußere oder auch
interne (genetische) Faktoren hinzukommen, da nur ein kleiner Teil der Alkoholiker
Pankreatitiden entwickelt [Dreiling und Koller 1985, Steinberg und Tenner 1994]. Die
bislang bekannten genetischen Ursachen der chronischen Pankreatitiden scheinen
bei Alkoholikern nicht wesentlich häufiger aufzutreten, so dass wesentliche
Polymorphismen möglicherweise noch nicht gefunden wurden.
Mehrere genetische Ursachen für die Entstehung einer chronischen Pankreatitis
wurden in den letzten Jahren beschrieben. Whitcomb et al. zeigten, dass
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
12
Mutationen im kationischen Trypsinogengen (PRSS1) für die hereditäre Pankreatitis
(s. Abschnitt 2.2.3.2.) verantwortlich sein können [Whitcomb et al. 1996 und 1999].
Mutationen im pankreatischen sekretorischen Trypsin Inhibitor (SPINK1) [Witt et al.
2000] oder dem „cystic fibrosis transmembrane conductance regulator“ (CFTR)
[Cohn et al. 1998] können offensichtlich die Prädisposition für die Entstehung einer
chronischen Pankreatitis erhöhen.
2.2.3. Pathophysiologische Vorgänge in der Frühphase
Abhängig vom auslösenden Faktor entwickelt sich die pathogenetische Sequenz der
akuten Pankreatitis entweder aus der direkten Azinuszellschädigung, wie dies vor
allem bei metabolischen Ursachen zu erwarten ist oder über vorzeitige Aktivierung
von Enzymen und deren Übertritt in den interstitiellen Bereich des
Pankreasgewebes. Über eine dieser beiden Sequenzen mündet das
Krankheitsgeschehen in die gemeinsame Endstrecke der pathomorphologischen
Schädigung. Möglicherweise kommt es bei verschiedenen Faktoren sogar von
Anfang an zu einer Überlagerung der intraduktalen Gangpermeabilitätsstörung und
direkten Azinuszellschädigung.
Um die pathophysiologischen Vorgänge genauer zu beschreiben, wurden in den
letzten Jahren konkrete praxisrelevante Konzepte entwickelt und es hat sich ein
Konzept der Pathophysiologie etabliert, welches erlaubt, für die Frühphase der
akuten Pankreatitis drei entscheidende Phänomene (s. Abb. 4) zu definieren [Steer
1997, Grendell 1997]. Es wurde publiziert, dass es zu Beginn einer akuten
Pankreatitis zur sekretorischen Blockade [Saluja et al. 1999] (s. Abschnitt 2.2.3.1.),
zur frühzeitigen intrazellulären Trypsinaktivierung [Saluja et al. 1997, Hofbauer et al.
1998, Saluja et al. 1999] (s. Abschnitt 2.2.3.2.) und letztlich durch die Bildung
proinflammatorischer Mediatoren zu einer immunologischen Antwort auf die
pathopysiologischen Vorgänge kommt [Grady et al. 1997, Brady et al. 1999] (s.
Abschnitt 2.2.3.3.).
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
13
Abb. 4 Pathophysiologische Phänomene in der Frühphase der akuten Pankreatitis
2.2.3.1. Sekretorische Blockade
Die sekretorische Blockade zu Beginn der Entstehung einer akuten Pankreatitis ist
ein bereits seit längerem bekanntes Phänomen. Man versteht darunter, dass die
Sekretionsantwort nach Stimulation mit bestimmten Sekretagoga, wie
Cholezystokinin (CCK), biphasisch verläuft. Nach Erreichen der maximal
sekretorisch wirksamen Dosis kommt es bei Hyperstimulation zu einer Hemmung
der Sekretion von Verdauungsenzymen. Die Synthese der Verdauungsenzyme in
der Azinuszelle erfolgt aber weiterhin, so dass die neu synthetisierten Enzyme in der
Drüse akkumulieren [Steer 1997]. Als Ursache für die sekretorische Blockade wird
diskutiert, dass es infolge der Pankreatitis zu einer Zerstörung des Aktinzytoskeletts
an der basolateralen Zellmembran der Azinuszelle kommt und damit der Transport
der Verdauungsenzyme aus der Zelle heraus unterbrochen ist [Schäfer und
Williams 2000, Kubisch et al 2004].
2.2.3.2. Frühzeitige intrazelluläre Trypsinaktivierung
Ein weiteres wichtiges Ereignis ist die frühzeitige, intrazelluläre (intraazinäre)
Aktivierung von Verdauungsenzymen, insbesondere von Trypsinogen zum
proteolytischen Enzym Trypsin. Dieses Konzept wird schon lange diskutiert, da es
bei der Pankreatitis zu einem Selbstverdau des Pankreas kommen kann.
Physiologischerweise erfolgt die Aktivierung der Verdauungsenzyme überwiegend
nach Erreichen des Duodenums. Trypsinogen wird von der Enterokinase des
Dünndarmepithels durch Abspaltung eines Peptides zu Trypsin aktiviert. Trypsin
aktiviert dann die übrigen Proenzyme (proteolytische Kaskade).
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
14
Das Pankreas besitzt normalerweise ausreichende Schutzmechanismen gegen eine
mögliche Selbstverdauung durch Verdauungsenzyme. Zum einen werden die
meisten Enzyme in Form von inaktiven Pro-Enzymen (Zymogene) synthetisiert und
in Zymogengranula gespeichert und zum anderen wird die Selbstverdauung des
Pankreas durch kleinere Mengen intraazinär aktivierten Trypsins
physiologischerweise durch verschiedene protektive Mechanismen verhindert (s.
Abb. 5 a/b).
Abb. 5 a/b Physiologische Schutzmechanismen vor Selbstverdauung und Störungen bei hereditärer Pankreatitis
a) Modell der intrazellulären Mechanismen gegen frühzeitige Trypsinaktivierung. Dazu gehören neben einem sauren pH-Wert in den Zymogengranula, der Serinproteaseninhibitor Typ KAZAL I (SPINK1), der reversibel bis zu 20% des Trypsins blockieren kann, welches durch vorzeitige Aktivierung von Trypsinogen anfällt und die Autolyse durch Trypsin verhindert. Des Weiteren gibt es trypsinaktivierte trypsinähnliche Enzyme, wie Mesotrypsin, die Trypsinogen degradieren, sowie unspezifische Antiproteasen im Pankreasparenchym wie α-1-Antitrypsin oder α-2-Makroglobulin [Lerch und Gorelick 2000].
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
15
b) Mutationen im Trypsinogengen bewirken einen verminderten Abbau durch Mesotrypsin bzw. Mutationen im SPINK-Gen können die trypsinhemmende Aktivität reduzieren.
Durch die Klonierung des Gendefektes der hereditären Pankreatitis konnte gezeigt
werden, dass eine vermehrte Aktivierbarkeit des Trypsinogens (frühzeitige
Trypsinaktivierung) offensichtlich rezidivierende Schübe akuter Pankreatitiden
verursachen kann [Whitcomb et al. 1996, Teich et al. 1998]. Die hereditäre
Pankreatitis ist eine seltene Erkrankung mit autosomal dominantem Erbgang. Bei
betroffenen Patienten kommt es bereits im Kindesalter zu rezidivierenden
Pankreatitisschüben mit Entwicklung einer chronischen Pankreatitis. Mindestens
zwei Mutationen im Gen des kationischen Trypsinogens sind inzwischen bei
Familien mit hereditärer Pankreatitis beschrieben. Man vermutet, dass eine Mutation
(Arg117His) zum Verlust einer putativen Schnittstelle im Trypsin führt, so dass
frühzeitig intrazellulär aktiviertes Trypsin nicht mehr durch Proteasen abgebaut
werden kann und somit die Aktivierung weiterer Verdauungsenzyme bereits
intrazellulär möglich wird [Whitcomb et al. 1996, Grendell 1997]. Die zweite Mutation
(Asp21Iso) führt dagegen möglicherweise zu einer verstärkten Aktivität des Trypsins
in saurem Milieu, was eine gesteigerte Aktivität in den Zymogengranula ebenfalls
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
16
erklären könnte [Teich et al. 1998, Keim et al. 1999]. Diese Arbeiten zeigen, dass
Trypsinmutationen ausreichend für die Entstehung einer chronischen Pankreatitis
sein können. Auch wurde eine Mutation (N34S) im Gen des Trypsinhemmers
SPINK1 (Serin Protease Inhibitor Typ KAZAL I) bei familiär gehäuften
Pankreatitisfällen und bei Kindern mit idiopathischer chronischer Pankreatitis
gefunden, aber auch in 2% der Kontrollpersonen, so dass gefolgert wird, dass diese
Mutation eher krankheitsmodifizierend als -verursachend ist [Witt et al. 2000 und
2002, Threadgold et al. 2002, Keim 2002, Whitcomb 2002].
Weitere Arbeiten an isolierten Azinuszellen und im in vivo Modell der akuten
Pankreatitis haben gezeigt, dass der zellpermeable Cathepsin B Hemmstoff E-
64d/CA-074Me die durch Caerulein induzierte Aktivierung von Trypsin komplett
hemmen kann [Saluja et al. 1997, Teich et al. 1998, Keim et al. 1999]. Inzwischen
gibt es auch Daten von Experimenten mit Cathepsin B -/- knock-out Mäusen, welche
zeigen, dass die Caerulein-induzierte, intrazelluläre Trypsinaktivierung bei diesen
Mäusen um bis zu 90% reduziert ist. Allerdings wird die Pankreatitis nur lokal
abgeschwächt, aber nicht verhindert. Die systemischen Auswirkungen z.B. auf die
Lunge sind dagegen nicht verändert [Halangk et al. 2000].
Wie es allerdings zur intrazellulären Trypsinaktivierung kommt, ist noch unklar. Eine
Hypothese besagt, dass es, möglicherweise im Zusammenhang mit der Störung der
Sekretion, zu einer Fusion von Lysosomen und Zymogengranula kommt
(„Kolokalisationshypothese“). Die lysosomale Protease Cathepsin B soll
Trypsinogen durch proteolytische Spaltung zum Trypsin aktivieren und so die
gesamte proteolytische Kaskade in Gang setzen [Steer et al. 1987, Niederau und
Grendell 1988]. Die „Kolokalisationshypothese“ ist allerdings nicht uniform
akzeptiert. So konnte elektronenmikroskopisch mittels Immunogold-Markierung
gezeigt werden, dass Cathepsin B und Verdauungsenzyme auch in gesundem
Pankreasgewebe bereits teilweise in den gleichen Organellen vorkommen [Willemer
et al. 1990]. Kolokalisation lysosomaler und sekretorischer Verdauungsenzyme
wurde außerdem nach Stimulation mit Bombesin, welches keine Pankreatitis
auslöst, beschrieben [Grady et al. 1996]. Bombesin führt auch zu einer
Trypsinaktivierung in einem zu Caerulein vergleichbaren Ausmaß. Des Weiteren
haben Trypsin- bzw. Proteasehemmstoffe den klinischen Verlauf der akuten
Pankreatitis nicht günstig beeinflussen können [Buchler et al. 1993].
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
17
2.2.3.3. Immunologische Reaktion im Rahmen der akuten Pankreatitis
Neben der lokalen Schädigung des Pankreas mit sekretorischer Blockade und
wahrscheinlich frühzeitiger intrazellulärer Aktivierung von Verdauungsenzymen, ist
inzwischen auch klar, dass der Schweregrad der akuten Pankreatitis ganz
entscheidend von einer, im Rahmen der Pankreatitis ablaufenden, immunologischen
Reaktion abhängt.
Abb. 6 Immunantwort im Rahmen einer akuten Pankreatitis
So ist schon länger bekannt, dass es im Verlauf der akuten Pankreatitis zur
systemischen Aktivierung von Makrophagen und Lymphozyten kommt, welche nicht
nur im Pankreas sondern auch in anderen Organen, wie zum Beispiel der Lunge,
eine entzündliche Reaktion in Gang setzen [Norman et al. 1995]. Entsprechend sind
auch die Serumspiegel diverser entzündlich aktiver Zytokine, wie TNF-α [Hughes et
al. 1996], weiterer Zytokine [Brady et al. 1999] und auch von Chemokinen [Grady et
al. 1997], Interleukin 1β (IL-1β) [Fink und Norman 1997], IL-6 [Gross et al. 1993]
oder Platelet activating factor (PAF) [Zhou et al. 1993] bei der akuten Pankreatitis
erhöht, die die Schädigung abhängig von den ihnen entgegengesetzten
Abwehrstrategien des Pankreasgewebes in unterschiedlicher Ausprägung ablaufen
lassen.
Zunächst galt die Herkunft dieser Zytokine von Makrophagen als gesichert, bis klar
geworden ist, dass die Azinuszellen der Bauchspeicheldrüse nicht nur selbst auf
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
18
Zytokine reagieren, sondern diese im Rahmen der Stressantwort bei der
Pankreatitis auch selbst synthetisieren kann [Gukovskaya et al. 1997].
Azinuszellen können aber nicht nur Zytokine synthetisieren und freisetzen, sondern
auch chemotaktisch wirksame Chemokine als Stressantwort produzieren [Luster
1998]. Somit ist die Bauchspeicheldrüse aktiv an der entzündlichen Reaktion im
Rahmen der Pankreatitis durch Chemokin vermittelte Anreicherung des
Pankreasgewebes mit weißen Blutzellen, sowie deren Aktivierung durch Zytokine
beteiligt.
2.3. Oxidativer Stress und zellulärer Schutz In normalen biologischen Prozessen werden in Zellen mit ihren Kompartimenten
laufend freie Radikale gebildet. Unter oxidativem Stress, worunter man die
Imbalance zwischen dem ansteigendem Gehalt an Pro-Oxidantien (z.B. reaktive
Sauerstoff-Zwischenstufen; reactive oxygen intermediates; ROI) und dem folglich
abnehmenden Gehalt an antioxidativen Schutzfaktoren (Proteinen) versteht, wird
die Formation dieser Radikale enorm gesteigert. Ein Absinken des Gehaltes an
Antioxidantien wie z.B. Glutathion, Ascorbinsäure oder a-Tocopherol (Vitamin E) hat
die vermehrte Bildung reaktiver Sauerstoffzwischenstufen [Halliwell und Gutteridge
1990] zur Folge.
Diese Sauerstoff-Intermediate können sich wegen ihrer hohen Reagibilität potentiell
toxisch verhalten. Die Imbalance durch zu hohe O• Produktion und abnehmenden
Schutzfaktoren erzeugt als Folge einen unkontrollierten oxidativen Stress mit
zellschädigenden Effekten wie z.B. Lipidperoxidation [Rice-Evans und Burdon 1993]
und dadurch Membranbeschädigungen [Ferrali et al. 1992], DNA-Strangbrüche
[Ames 1989] sowie Proteinveränderungen [Neuzil et al. 1993] und spielt bei der
Entstehung der akuten Pankreatitis sehr wahrscheinlich eine wichtige Rolle [Rau et
al. 2000]. Sauerstoffradikale können mit einer Vielzahl von zellulären Molekülen wie
Lipiden und Proteinen interagieren und zu Funktionsbeeinträchtigung führen
[Nonaka et al. 1990]. Freie Sauerstoffradikale können außerdem durch Hemmung
des Energiestoffwechsels zur ATP-Depletion bei akuter experimenteller Pankreatitis
führen [Luthen et al. 1995].
Um dem oxidativen Stress entgegenzusteuern, haben Zellen und Gewebe eine
Vielzahl von antioxidativ wirkenden Mechanismen entwickelt, die bei eventueller
Anreicherung von reaktiven Sauerstoffzwischenstufen, oder bei zellulären
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
19
Reperaturvorgängen aktiviert werden. Dazu zählen intrazelluläre Antioxidantien wie
die Katalase, welche Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff konvertiert, die
Superoxid-Dismutase (SOD), welche Superoxidanionen zu Wasserstoffperoxid
konvertiert, a-Tocopherol (Vitamin E), Ascorbinsäure und Glutathion (GSH). Auch
HSP32/HO-1 hat vermutlich antioxidative Eigenschaften.
Rau et al. konnten in experimentellen Modellen zeigen, dass die Antioxidantien wie
Glutathion und antioxidativ wirkende Enzyme wie Katalase und Superoxid-
Dismutase (SOD) einen positiven Effekt auf den Schweregrad der Pankreatitis
haben können [Rau et al. 2000]. Allerdings genügt oxidativer Stress allein nicht, um
eine akute Pankreatitis auszulösen [Fu et al. 1997, Rau et al. 2000].
2.4. Hitzeschockproteine
2.4.1. Expression und Aufgabe von Hitzeschockproteinen
Hitzschock-Gene (heat shock protein, HSP) ist die Bezeichnung für eine Klasse von
entsprechenden Genen und ihrer Proteine welche in allen bisher untersuchten
Spezies sehr stark konserviert sind. Die bedeutende Klasse von Stressproteinen
wurde zuerst 1962 von Ritossa in der Speicheldrüse der Fruchtfliegenlarve
Drosophila Melanogaster entdeckt [Ritossa 1962]. Es wurde festgestellt, dass die
Erhöhung der Zelltemperatur von 25°C auf 30°C eine Anhäufung von Formationen
an speziellen Regionen auf polytenen (übergroßen) Chromosomen der Larve
induziert. Diese Formationen reflektieren Transkriptionsaktivitäten von speziellen
Genen, welche eine Gruppe von Proteinen codieren, die Aufgrund ihrer gesteigerten
Genexpression nach Hitzeeinwirkung als Hitzeschockproteine (HSP) bezeichnet
wurden [Tissieres et al. 1974, Lindquist und Craig 1988].
Obwohl die HSPs ursprünglich anhand der Induktion durch gesteigerte
Temperaturen benannt wurden und die ausgeprägte Thermotoleranz der Zellen die
wichtigste und bekannteste Auswirkung der Hitzeschock-Proteine darstellt [Landry
et al. 1989], kann die Expression dieser Proteine aber auch durch nahezu jede
andere Art von Stress induziert werden, wie beispielsweise mechanischer Stress,
oxidativer Stress, toxisch-metabolischer Stress etc. [Morimoto et al. 1992]. Diese
Proteine werden deshalb auch als Stressproteine bezeichnet.
Zusätzlich zu ihrer Funktion als Teil der akuten, zellulären Antwort auf Stress, führt
die gesteigerte Expression von HSPs auch zu einer gesteigerten Toleranz
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
20
gegenüber nachfolgenden Stressereignissen. Es wurde später auch demonstriert,
dass thermischer Stress, welcher die Synthese von HSP induzieren kann, Schutz
vor nachfolgendem nichtthermischem Stress verleiht [Currie 1987, Bellmann et al.
1995].
HSPs sind aber nicht nur für die (pathophysiologische) Stressreaktion wichtig,
sondern erfüllen auch in normalem Zellstoffwechsel zahlreiche physiologische
Funktionen [Morimoto et al. 1992, Pockley 2001]. Eine häufig beobachtete Funktion
von Hitzeschockproteinen ist ihre Wechselwirkung mit anderen Proteinen. HSPs
können diese Proteine in eine korrekte Konformation (Ordnung der Proteinfaltung)
überführen. Zum Beispiel wirken HSP60 und HSP70 zusammen, um entstehenden
Peptiden bei der Translation die Einnahme ihrer korrekten Tertiärstruktur zu
ermöglichen. Wegen dieser Begleitfunktion, die auch unter physiologischen
Bedingungen wahrgenommen werden [Minowada und Welch 1995], sind sie auch
als Begleitproteine (chaperone proteins) oder „Chaperone“ bezeichnet worden.
2.4.2. Hitzeschockproteingruppen
Hitzeschockproteine umfassen eine ganze Reihe verschiedener Familien (s. Tab.
2), welche strukturell nicht miteinander verwandt sind. Die Bezeichnung und
Klassifizierung rührt vom apparenten Molekulargewicht der jeweiligen Proteine her,
(z.B. HSP32 ist ein 32 kDa Protein), also unter anderem HSP90, HSP70, HSP60,
HSP32 oder HSP25/27 [Hartl et al. 1996, Rakonczay et al. 2003].
Die Familienmitglieder besitzen funktionelle Homologien in verschiedenen
Kompartimenten der Zelle. Während es eine große Ähnlichkeit zwischen gleichen
HSP in verschiedenen Organismen gibt, z.B. teilen sich Escherichia coli DnaJ und
das humane HSP70 ungefähr 50% Sequenzgleichheit [Caplan et al. 1993], gibt es
offensichtlich keine Sequenzhomologie zwischen verschiedenen Familien (z.B.
zwischen HSP60 und HSP70).
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
21
Tabelle 2 Die bekanntesten und wichtigsten Gruppen der Hitzeschock-Proteine
Familie Proteine Lokalisation in der Zelle
Funktionen
kleine HSPs
Ubiquitin Zytosol / Nukleus
Beteiligt am nicht-lysosomalen Proteinabbau
HSP10 Mitochondrien Co-Chaperon von HSP60
αB-Crystallin
Zytosol Verbunden mit zytoskelettalen Elementen (Stabilisierung)
HSP27 Zytosol / Nukleus
Stabilisierung der Microfilamente, Regulation des Actin-Zytoskeletts
HSP32 Zytosol Hämoxygenase-1, Hämkatabolismus, Antioxidative Eigenschaften
HSP40 HSP40 Zytosol / Nukleus
Co-Chaperon von HSP70
HSP60 HSP60 Mitochondrien Gebunden an teilweise gefaltete Polypeptide (assistiert korrekte Faltung), in pankreatischen Zymogen Granula
HSP70 HSP72 (HSP70)
Zytosol / Nukleus
Durch starken Stress (Hyperthermie) induzierbar
HSP73 (HSC70)
Zytosol / Nukleus
Konstitutiv exprimiert
GRP75 Mitochondrien Beteiligt an der Translokation von Vorläuferproteinen durch die mitochondriale Membran
GRP78 Endoplasmati-sches Retikulum
Spielt eine Rolle bei der Zusammensetzung sekretorischer Proteine
HSP90 HSP90α Zytosol Wichtige Rolle in der Steroid-Rezeptor Funktion
HSP90β Zytosol Wichtige Rolle in der Steroid-Rezeptor Funktion
GRP94 Endoplasmati-sches Retikulum
Calcium-bindendes Chaperon
HSP100 HSP100 Zytosol / Nukleus
Beteiligt an der Auflösung von Aggregaten und der Erleichterung der Proteolyse, Thermotoleranz
Das GRP (Glucose regulated protein) ist nicht speziell durch Hitzeschock induziert, sondern durch Glucosemangel.
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
22
2.4.3. Genetische Regulation der HSP-Synthese
Die Regulation der Expression der Hitzeschock-Gene erfolgt größtenteils auf
Transkriptionsebene durch Bindung eines Hitzeschock-Transskriptionsfaktors (heat
shock factor; HSF) an eine DNA-Sequenz im Promoterbereich (heat shock response
element; HSRE) [Leppä und Sistonen 1997, Cotto und Morimoto 1999].
Nach wie vor ist die Signaltransduktion, welche der Induktion von HSP zugrunde
liegt, nur teilweise erforscht. Der HSF, welcher die Transkription reguliert und
konstitutiv exprimiert wird, liegt in ungestressten Zellen in monomerer und inaktiver
Form vorliegt und muss zu seiner Aktivierung phosphoryliert werden. Drei
Mononomere müssen sich zu einem Trimer zusammenfügen und es muss eine
Translokation aus dem Zytosol in den Zellkern erfolgen [Baler et al. 1993].
Sehr wahrscheinlich besteht eine negative Feedback-Regulation zwischen HSP und
dem HSF. HSP bindet HSF, stabilisiert somit seine monomere Form und hemmt so
seine transkriptionelle Aktivität. Wenn durch Stress die Akkumulation denaturierter
Proteine steigt, bindet das HSP mit höherer Affinität an diese Proteine, um ihre
Aggregation zu verhindern und die Rückfaltung in den nativen Zustand zu
unterstützen. Somit steht weniger HSP zur Hemmung der HSF-Aktivität zur
Verfügung, was zu einer Derepression der HSP-Transkription führt [Nieto-Sotelo et
al. 1990].
2.4.4. Induktion von Hitzeschockproteinen im Pankreas
Die HSP der großen zytoprotektiven Familien werden im Pankreas konstitutiv
exprimiert oder induziert [Schäfer und Williams 2000].
Es wurde bereits vor einigen Jahren mittels metabolischer Markierung azinärer
Proteine mit 35S-Methionin gezeigt, dass auch Azini auf eine Erhöhung der
Umgebungstemperatur (Hyperthermie) mit der Expression ganz bestimmter
Proteine reagieren [Wagner et al. 1996, Strowski et al. 1997]. Insbesondere fand
sich eine starke Hochregulation von HSP70 Isoformen (HSP72). Die Quantität von
HSP72 war nach 3-6h signifikant angestiegen und blieb 12-24h erhöht. Daneben
wurden aber auch Proteine von 92, 59, 58 und 30 kDa gefunden, welche ebenfalls
verstärkt nach Hyperthermie exprimiert wurden. Auch wurde in vorausgehenden
Versuchen HSP60 schwach induziert. Dieses Phänomen ließ sich in gleicher Weise
nach Ganzkörperhyperthermie (die Körperkerntemperatur der Versuchstiere wurde
auf 42°C für 20 min erhöht) im Pankreas in vivo zeigen [Tashiro et al. 2002].
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
23
Ferner konnte gezeigt werden, dass die Präkonditionierung durch Hyperthermie zu
einer Protektion bei einer experimentellen Pankreatitis und damit zur Abschwächung
des Schweregrades derselben führt, was nicht nur für das Modell der
Caeruleinpankreatitis gilt [Frossard 1999, Grise et al. 2000, Weber H et al. 2000].
Als möglicher Mechanismus der Protektion durch HSP wird eine Reduzierung der
frühzeitigen intrazellulären Trypsinaktivierung (s. Abschnitt 2.2.3.2.) nach Caerulein
Hyperstimulation diskutiert [Frossard et al. 2002, Bhagat et al. 2002].
HSPs werden auch bei Pankreatitis ohne Präkonditionierung im Pankreas
hochreguliert [Weber CK et al. 1995, Bhagat et al. 2002]. So wurde die Expression
von HSP32 nach Induktion einer akuten Pankreatitis durch Caerulein beschrieben.
Es wurde gezeigt, dass die Caerulein induzierte akute Pankreatitis mit einem
signifikanten Ansteigen der Expression von HSP32/HO-1 im Pankreasgewebe,
beginnend etwa 12-24h nach den ersten Zeichen eines intestinalem
Pankreasödems. Es konnte zwar nicht ausgeschlossen werden, dass infiltrierende
Phagozyten in das Pankreasgewebe zur ansteigenden Expression beigetragen
haben, aber es ist wahrscheinlicher, dass das ansteigende HO-1 in vivo den
Pankreaszellen zuzuordnen ist [Sato et al. 1997]. Für die Frühphase der akuten
Pankreatitis ließen sich in der aktuellen Literatur bisher keine Daten finden.
Der zeitliche Ablauf dieser selektiven Induktion im Pankreasgewebe in vivo könnte
die Antwort auf und Anpassung an die Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen (s.
Abschnitt 2.3.) in den frühen Stadien der akuten Pankreatitis widerspiegeln
[Schoenberg et al. 1995].
2.5. Hämoxygenase-1 (HO-1/HSP32)
2.5.1. Charakterisierung der Hämoxygenase
Die Hämoxygenase (HO) gehört zu den Monooxygenasen. Sie katalysiert den
ersten Schritt des Abbaus von Häm zu Gallepigmenten. Das bekannteste Beispiel
dafür ist der Hämoglobinabbau aus Erythrozyten, der hauptsächlich in Milz und der
Leber stattfindet. Die biochemischen Grundlagen dieser Abbauvorgänge wurden in
den vergangenen 20 Jahren weitgehend geklärt [Maines 1988 und 1992].
Von großer Bedeutung in der Regulation biologischer Systeme ist dabei die
Degradation des Häm zu Biliverdin (s. Abb. 7) unter Freisetzung von Eisen und der
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
24
Bildung von Kohlenmonoxid [CO]. Das Biliverdin wird anschließend durch die
Biliverdin-Reduktase (ein zytosolisches Enzym) zu Bilirubin konvertiert.
Abb. 7 Katalytische Reaktion der Hämoxygenase
Schematische Darstellung des Abbaus der Hämgruppe: Das Enzym katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt beim oxidativen Abbau des Häm zu Biliverdin und äquimolaren Mengen an Kohlenstoffmonoxid (CO) und Eisen. Diese Reaktion spielt eine wichtige Rolle bei der Wiedergewinnung des Eisens aus dem Hämoglobin alternder Erythrozyten und beim Abbau anderer Hämproteine. Das lineare Tetrapyrrol Biliverdin wird im Folgenden sofort durch die Biliverdin-Reduktase zu Bilirubin reduziert [Choi und Alam 1996].
Dem Bilirubin wird eine Bedeutung als physiologisch wirksame antioxidative
Substanz zugeschrieben [Stocker et al. 1987 und 1990]. Sowohl durch die
Mediatorfunktion von CO als auch durch das antioxidative Potential von Bilirubin
könnte Hämoxygenase im Pankreas daher unter physiologischen und
pathophysiologischen Bedingungen eine Rolle spielen. Daten aus der Literatur
zeigen, dass die HO-1 durch Exposition mit verschiedenen Formen von oxidativem
Stress induziert wird und dass dieses Enzym zellulären Schaden verhindern, sowie
gegen oxidativen Stress schützen kann [Stocker 1990] (s. Abschnitt 2.5.4.).
2.5.2. Formen und Funktionen der Hämoxygenase
Die Hämoxygenase Typ1 (HO-1) ist die induzierbare, ubiquitär im Organismus
vorkommende Isoform und hat ein Molekulargewicht von 32 kDa [Maines et al.
1986], während das später entdeckte Isoenzym mit Hauptvorkommen in Gehirn und
Hoden als Hämoxygenase Typ2 (HO-2) mit 36 kDa bezeichnet wurde. Nach
Klonierung und Sequenzierung dieser beiden Isoformen wurde durch Homologie-
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
25
Screening eine dritte Enzymvariante (HO-3) mit 33 kDa entdeckt, deren
biochemische Charakterisierung bislang noch aussteht [McCoubrey et al. 1997].
Die Gene für HO-1 [Shibahara et al. 1989] und HO-2 [McCoubrey und Maines 1994,
McCoubrey et al. 1995] sind auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert, dennoch
weisen sie grundsätzlich eine ähnliche Struktur und Homologie in der
Aminosäurensequenz von 40% auf. Durch ein sehr langes Intron sind jedoch die
HO-2 Gene nahezu doppelt so groß wie das HO-1 Gen.
HO-1 ist durch eine Vielzahl von strukturell nicht verwandten, pharmakologischen
und chemischen Agenzien, sowie durch Variation des Zellzustandes, wie z.B.
Hitzeschock und anderen Formen von zellulärem Stress (Stickstoffmonoxid) in
zahlreichen Zelltypen induzierbar. In vielen Geweben und Zellkulturen steigt die HO-
1 mRNA Expression durch die Behandlung mit dem natürlichen Substrat Häm sowie
mit verschiedenen Metallen und Xenobiotika (Fremdstoffen), endokrinen Faktoren
und synthetischen Metalloporphyrinen und Metallprotoporphyrinen [Alam et al.
1994]. Darunter sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS oder reactive oxygen
intermediates, ROI), Endotoxine, Cytokine wie TNF-α, UV-Licht, Natriumarsenit,
Hyperoxie und Glutathionmangel von besonderer Bedeutung [Keyse und Tyrrell
1989]. Die Induzierbarkeit des HO-1/HSP32-Gens dient höchstwahrscheinlich als
Schutz der Zellen gegen Stress, insbesondere oxidativen Stress wie z.B. Hitzschock
und Entzündungen [Choi und Alam 1996, Otterbein und Choi 2000].
HO-2 ist hauptsächlich im zentralen Nervensystem (Gehirn), Leber, Milz,
Gefäßsystem und Reproduktionsorganen (z.B. Hoden) exprimiert und scheint nicht
induzierbar zu sein [McCoubrey und Maines 1994, McCoubrey et al. 1997]. Studien
an HO-2 knock-out Mäusen weisen darauf hin, dass CO, durch HO-2 produziert, als
Signalmolekül wirken und somit eine Aufgabe in der Signaltransduktion haben kann
[Zakhary et al. 1997].
Die HO-3 wird ebenfalls konstitutiv exprimiert, wobei die katalytische Aktivität sehr
niedrig ist. HO-3 wirkt möglicherweise hauptsächlich als Häm-bindendes Protein
[McCoubrey et al. 1997, Elbirt und Bonkovski 1999].
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
26
Tabelle 3 Übersicht über die Isoformen der Hämoxygenase
HO-1 (HSP32)
HO-2 HO-3
Chromosom 22q12 16p13.3 ?
Gen Ratte: 6830 bp Mensch: ~ 14.000 bp 5 Exons, 4 Introns Heat shock elements Bindungsstellen für Transskriptionsfaktoren
Ratte: 12563 bp 5 Exons, 4 Introns Glucocortikoid-response element (GRE)
?
Protein Ratte: 289 AS, MW 33.005 Mensch: 288 AS, MW 32.818
Ratte: 315 AS, MW 35.762 Mensch: 315 AS, MW 36.033 ca. 40% Homologie mit HO-1
Ratte: MW ~ 33.000 ca. 90% Homologie mit HO-2
Vorkommen Induzierbar Leber, Milz, Pankreas
Konstitutiv ZNS (Gehirn), Hoden, Leber, Milz
Konstitutiv Gehirn, Hoden, Leber, Milz, Thymus, Niere, Prostata, Herz
Regulation Aktivierung durch: Häm, Hitze Neurotoxische Metalle (Cadmium) Viren, Bakterientoxine Stress: physiologisch und pathologisch Normales Vorkommen: Zellwachstum und Entwicklung
Keine Stimuli oder Regulatoren bekannt (Glukokortikoide nur während der Entwicklung)
Regulation nicht bekannt Nur schwache Hämkatalyse
2.5.3. Struktur der Porphyrine und Einfluß von synthetischen Metalloporphyrinen wie Kobalt-Protoporphyrin (CoPP)
Metallporphyrine, in welchen das zentrale Eisenatom z.B. gegen Zinn2+- (Sn),
Zink2+- (Zn), Chrom2+- oder Mangan2+- Ionen ausgetauscht wurde, wirken als
potente kompetetive Inhibitoren der Hämoxygenase [Rosenberg et al. 1989].
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
27
Im Gegensatz dazu induziert Kobalt-Protoporphyrin (CoPP) in vivo die
Hämoxygenase. Es ist also prinzipiell von der Beschaffenheit des zentralen
Metallatoms abhängig, ob ein Metalloporphyrin hemmende oder induzierende
Eigenschaften in vivo besitzt [Kappas und Drummond 1986].
Die HO-1 Aktivität lässt sich also mit Metalloporphyrinen positiv (CoPP) und negativ
(SnPP, ZnPP) regulieren.
Abb. 8 Nomenklatur der Porphyrine
Die vier Pyrrolringe werden mit A, B, C und D bezeichnet. Die Nummerierung und Zu-ordnung der Positionen der Porphyrinsubstituenten folgt den Richtlinien der „International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry“ (IUPAC/IUB). Wie rechts in der Abbildung ersichtlich, werden die Ringatome des Tetrapyrrolsystems, die C- und N-Atome, von 1 bis 24 durchnummeriert. Synthetisiert wird die Hämgruppe aus den Grundstoffen Succinyl-CoA (einem Zwischen-produkt des Citratzyklus) und Glycin. Der die Geschwindigkeit bestimmende Schritt dieser Synthese (das „Schrittmacherenzym“) bildet die δ-Aminolävulinat-Synthetase (ALAS).
Während anorganisches Zinn (Sn) und Sn-Protoporphyrin Vertreter metallischer
Sorten repräsentieren, deren Effekte auf die Häm-Degradation eher supprimierend
waren, bildet anorganisches Kobalt (Co) oder Co-Protoporphyrin (CoPP) (s. Abb. 9)
ein Musterbeispiel der Elemente, dessen biologische Aktivitäten, im Gegensatz
dazu, sehr gute Protoporphyrin-Chelatbildner sind. Anorganisches Kobalt in einer
Einzeldosis induziert die Hämoxygenase in der Leber, üblicherweise mit einem Peak
nach 16h und einem Absinken nach 48-72h. Dies ist mit einem gleichzeitigem
Sinken und transienter Verminderung des Cytochrom P-450 Levels assoziiert,
gefolgt von einem überschießendem „rebound“ Anstieg der δ-ALS-Synthaseaktivität
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
28
über hochnormale Werte, bevor sich die gesamte Reaktion wieder normalisiert
[Maines und Kappas 1974, 1975].
Abb. 9 Cobalt (III) Protoporphyrin IX chloride [C34H32CoN4O4Cl]
Dagegen verursacht eine einzelne äquimolare Dosis von Co-Protoporphyrin eine im
Maß wesentlich größere Induktion der Hämoxygenase in der Leber. Diese „Antwort“
persistiert auch für eine längere Zeitspanne, nämlich etwa für 3-5 Wochen, in den
behandelten Tieren. Co-Protoporphyrine sind hierbei ein starker und lang wirkender
Induktor der Hämoxygenase. Ein ausgeprägtes Absinken der δ-ALS-
Synthaseaktivität begleitet diese Reaktion. Als Konsequenz dieser anhaltenden
dualen Aktionen auf Hämsynthese und Degradation, erfolgt eine tiefe Abnahme des
Cytochrome P-450 Levels [Drummond und Kappas 1982].
2.5.4. Die Hämoxygenase als ein protektives Protein
Die HO-1/HSP32 ist ein Hitzeschock-Protein und damit ein Stressprotein, dass unter
anderem durch oxidative Schädigungen der Zelle induziert wird [Keyse und Tyrrell
1989, Nascimento et al. 1993, Schulz et al. 1999]. Von physiologischer Relevanz
sind das Biliverdin und das Bilirubin, die in vitro in der Lage sind, mit hoher Effizienz
Peroxyl-Radikale einzufangen [Stocker et al. 1987, Dennery et al. 1995]. Durch die
Bildung von Biliverdin entsteht ein starkes Antioxidans, welches freie
Sauerstoffradikale einfangen kann, wobei das Bilirubin Superoxid-Anionen
neutralisieren kann und somit viele Substrate vor Peroxidation bei der Anwesenheit
von Wasserstoffperoxid oder organischen Hydroperoxiden schützt. Dies ist
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
29
wahrscheinlich für die protektive Wirkung der HO-1 wichtig. Die antioxidativen
Eigenschaften des Bilirubins wurden durch verschiedene Studien belegt. So konnte
an isolierten Rattenherzen ein kardioprotektiver Effekt, sowohl durch Stimulation der
HO-1, als auch durch exogenes Bilirubin im Ischämie-Reperfusions-Modell gezeigt
werden [Clark et al. 2000]. Dennery stellte im Tiermodell einen protektiven Effekt
erhöhter Plasmaspiegel an unkonjugiertem Bilirubin gegen Hyperoxie vermittelte
oxidative Schädigung fest [Dennery et al. 1995]. In HO-1 defizienten knock-out
Mäusen zeigte sich entsprechend, dass die Anfälligkeit von Hepatozyten und
Fibroblasten gegenüber oxidativem Stress deutlich erhöht war. Kultivierte
Fibroblasten dieser Mäuse produzierten hohe Spiegel an freien Sauerstoffradikalen
und zeigten starke Cytotoxizität durch Prooxidanzien. Die Gabe von Endotoxin
verursachte in den knock-out Mäusen im Vergleich zu den Kontrolltieren vermehrte
Leberzellnekrose durch oxidative Schädigung und eine höhere Mortalität durch
endotoxischen Schock. Darüber hinaus entwickelten die Mäuse eine Eisenmangel-
Anämie mit Eisenablagerung in Leber und Niere, die zur chronischen Entzündung
der Organe führte [Vile et al. 1994, Poss und Tonegawa 1997].
Die HO-1 Expression lässt sich durch Veränderungen des intrazellulären Gehaltes
des Antioxidanten Gluthation beeinflussen. Ein Zusammenhang zwischen dem
antioxidativen Glutathion-Gehalt (GSH) und der Hämoxygenase-Induktion konnte in
kultivierten Fibroblasten von Ratten [Ketterer et al. 1988] festgestellt werden. Bei
einer Zellexposition durch Streßagentien wie z.B. Häm oder Wasserstoffperoxid
erfolgt eine Verminderung des zellulären GSH-Gehaltes. Diese Verminderung des
Antioxidanten wird durch eine Inhibierung der HO-1-Aktivität noch erhöht. Lautier
zeigte unter Verwendung des Glutathion-Inhibitorstoffes D,L-Buthionin-S,R-sulfoxin
ein komplettes Aufbrauchen des intrazellulären GSH-Gehaltes und einen daraus
resultierenden Anstieg der HO-1 [Lautier et al. 1992]. In Tieren, welche mit hohen
Konzentrationen von Caerulein behandelt wurden, fiel der gesamte pankreatische
Gluthation-Gehalt während der Frühphase der akuten ödematösen Pankreatitis ab
[Luthen et al. 1994]. Daraus kann man schließen, dass ein Abfall des intrazellulären
GSH, verursacht durch reaktive oxygene Radikale, einen Weg repräsentiert, die
Expression von HO-1 im Rahmen einer akuten Pankreatitis zu steigern.
Unter hypoxischen Bedingungen wird die HO-1 ebenfalls induziert, wobei der
molekulare Mechanismus dieser Induktion noch nicht bekannt ist. Als Grundlage
des Regulationsweges wird die Zellschädigung durch den Mangel an Sauerstoff
Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen
30
angenommen und die dadurch verbundene Ausschüttung von freien Radikalen. Die
durch die Radikale erzeugte Veränderung des Zellzustandes bewirkt eine
Anschaltung des zellulären Schutzsystemes und damit die Anschaltung der HO-1.
Kapitel 3 Ergebnisse
31
3. Ergebnisse 3.1. Proteinexpression und Regulation von Hitzeschock-
Proteinen im Pankreas Es konnte durch vorangegangene eingehende Untersuchungen der Stressreaktion
bereits aufgezeigt werden, dass Hitzeschockproteine im Tiermodell gegen eine
Pankreatitis protektiv wirken (s. Abschnitt 2.4.). Während HSP25/27 und HSP70 von
der Arbeitsgruppe Pankreas der Medizinischen Klinik II im Klinikum Großhadern
bereits eingehend untersucht wurden, stand für diese Arbeit besonders die
Expression von HSP32 im Pankreas, sowie dessen Bedeutung für die akute
Pankreatitis im Vordergrund.
3.1.1. Nachweis verschiedener HSPs im Pankreashomogenat nativ und nach Hyperthermie-Präkonditionierung
Zur genauen Beschreibung und Analyse des Expressionsmusters pankreatischer
Hitzeschockproteine im Pankreasgewebe, wie auch zum Nachweis der Spezifität
der verwendeten Antikörper wurden die SDS-Gel Elektrophorese und die Western
Analyse, wie in Methoden 6.6. beschrieben, durchgeführt. Zum immunochemischen
Nachweis der verschieden Hitzeschockproteine wurden spezifische primäre
Antikörper verwendet.
Tabelle 4 Verdünnungen der verwendeten Antikörper zum immunochemischen Nachweis der HSPs
Antikörper Verdünnung
Anti-HSP25 1:2000
Anti-HSP32 1:5000
Anti-HSP60 1:6000
Anti-HSP70 1:1000
Sekundäre Antikörper 1:10000
Die primären Antikörper wurden analog den in der Tabelle 4 angegebenen
Verdünnungen eingesetzt und nach dem Waschvorgang mit den jeweils
dazugehörigen sekundären, mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelten,
Kapitel 3 Ergebnisse
32
Immunglobulin G Antikörpern inkubiert. Diese Bindung wurde mit dem ECL-System
(s. Materialien 7.1.9.) erfasst und auf Film dargestellt.
Zunächst wurden die Expression und die Regulation der Expression von
Hitzeschockproteinen in verschiedenen Organen, wie Pankreas, Leber und Herz
untersucht und vergleichend dargestellt. Zur Regulation wurde zum einen die
Hyperthermie-Präkonditionierung (s. Abschnitt 2.4.4. und Methoden 6.1.1.) und zum
anderen die Präkonditionierung mit CoPP (s. Abschnitt 2.5.3. und Methoden 6.1.2.)
eingesetzt. Es wird in den Abbildungen jeweils als interner Standard und zur
Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper rekombinantes Protein der
jeweiligen Hitzeschockproteine mit aufgetragen (weiße Pfeile). In einigen
Abbildungen wird auch ein Protein-Standard-Marker für die jeweiligen
Molekulargewichte als Referenzmarkierung mit definierten Molekulargewichten auf
der linken Seite der Abbildung angegeben (schwarze Pfeile).
Abb. 10 Darstellung der Spezifität der Antikörper und der Einfluss von Hyperthermie auf die Expression von HSP32 und HSP70 im Pankreas und der Leber
Jeweils 20 µg Protein aus Herz (Bahn 4), Pankreas (Bahn 5 und 6, 8 und 9) und Leber (Bahn 3 und 7) von unbehandelten Kontrolltieren (NK) (Bahn 3 und 4), von Kontrolltieren (NK Pankreas), welche mit den Trägersubstanzen des CoPP bzw. Caerulein, [NaOH] (Bahn 8) und [NaCl] (Bahn 9) behandelt wurden, oder Tieren die mit Hyperthermie (HT) vorbe-handelt wurden (Bahn 5 bis 7), wurden pro Bahn aufgetragen. Die Proteine wurden per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulose-membran übertragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurden rekombinantes HSP32 (Pos. Kontr. HSP32, Bahn 1, 25 ng) oder
Kapitel 3 Ergebnisse
33
Pankreasgewebe mit Hyperthermie präkonditionierter Tiere (Pos. Kontr. HSP70, Bahn 2, 25 ng) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Die Membran wurde zunächst mit einem spez. Anti-HSP32 Antikörper (oberes Panel) in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000. Anschließend wurden die Antikörper durch Stripping (Herunterwaschen) entfernt und die Membran dann mit einem spez. HSP70 Antikörper in einer Konzentration von 1.1000 markiert (unteres Panel), die Konzentration des sekundären Ak war auch hier wieder 1:10000 (Erläuterungen siehe Text).
In Abbildung 10 ist gezeigt, dass die Hyperthermie-Vorbehandlung keinen Einfluss
auf die Expression von HSP32 im Pankreas hat.
Im oberen Panel der Western-Analyse mit Anti-HSP32 von Leber und Pankreas der
Ratte zeigt sich weder nativ (Negativkontrolle), noch nach Präkonditionierung durch
Hyperthermie, eine HSP32-Expression im Pankreas. Im Unterschied dazu kann in
der Leber eine geringe vorhandene konstitutive Expression, mit geringfügiger
zusätzlicher Induktion durch Hyperthermie-Präkonditionierung nicht ausgeschlossen
werden (vgl. Bahn 3 mit Bahn 7 im oberen Panel, sowie mit Abb. 12).
Im unteren Panel wurde nach „Strippen“ (s. Methoden 6.6.6.) dieselbe Membran mit
einem spezifischen Anti-HSP70 Antikörper markiert. Hierbei zeigt sich eine
Induktion der Expression von HSP70 durch Hyperthermie-Vorbehandlung. Die mit
rekombinantem HSP32 beladene Positivkontrolle ergibt dagegen kein Signal, so
dass durch diese Abbildung auch die Spezifität und Sensitivität der Antikörper
nachgewiesen werden kann.
In der im Folgenden gezeigten Abbildung 11 konnte, ergänzend zur zuvor gezeigten
Abbildung 10, mittels eines Anti-HSP25/27 Antikörpers die Expression von
HSP25/27 im Pankreas charakterisiert werden. Bei sehr schwacher konstitutiver
Expression konnte eine Hochregulation im Pankreas durch die Hyperthermie-
Präkonditionierung beobachtet und damit Ergebnisse der Literatur nachvollzogen
werden [Schäfer et al. 1999, Tashiro et al. 2002].
Kapitel 3 Ergebnisse
34
Abb. 11 Einfluss von Hyperthermie auf die Expression von HSP25/27 im Pankreas und der Leber
Jeweils 20 µg Protein von Tieren die mit Hyperthermie vorbehandelt wurden, wurden pro Bahn aufgetragen (Pankreas Bahn 3 bis 6; Leber Bahn 7 und 8), die Proteine per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran über-tragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurden rekombinantes HSP25 (Pos. Kontr. HSP25, Bahn 1). Als Negativkontrolle (NK) dienten Pankreas-Proben unbehandelter Kontrolltiere (Bahn 2). Gezeigt ist eine Auswahl aus 5 voneinander unabhängigen Experimenten. Die Membran wurde mit einem spezifischen Anti-HSP25 Antikörper in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären Antikörpers 1:10000 (Erläuterungen siehe Text).
HSP60 gehört zu den Hitzeschockproteinen, das schon in größerem Ausmaß
konstitutiv im Pankreas vorliegt [Wagner et al. 1996]. Deshalb wurde in weiteren
Versuchen auch der Einfluss von Hyperthermie-Präkonditionierung auf die
Proteinexpression von HSP60 untersucht. Es zeigte sich, dass HSP60 eher in der
Leber verstärkt exprimiert wird, wogegen durch eine Hyperthermie sich die
Expression von HSP60 im Pankreas nicht mehr sichtbar steigern lässt. Die
Präkonditionierung durch Hyperthermie scheint im Pankreas also nur eine geringe
Rolle bei der Induktion von HSP60 zu spielen (Daten nicht gezeigt).
HSP90 ist ein Hitzeschockprotein welches in vielen Geweben konstitutiv vorliegt
[Tashiro et al. 2002]. Im Pankreas dagegen ließ sich in unseren Versuchen keine
genuine Expression feststellen. Durch thermalen Stress war in unserem Versuch
Kapitel 3 Ergebnisse
35
nur eine schwache Expression im Pankreasgewebe feststellbar (Daten nicht
gezeigt).
3.1.2. CoPP induziert die HSP32-Expression im Pankreas
Als nächster Schritt wurden Metalloporphyrine als Werkzeuge eingesetzt (s.
Abschnitt 2.5.3.) und Versuchstiere mit CoPP in verschiedenen Konzentrationen (s.
Tab. 5 unter 3.2.) behandelt. Der Versuchsaufbau erfolgte in Anlehnung an die
Arbeiten von Amersi et al., in denen die Metalloporphyrine, zur Hochregulierung von
HO-1 zur Protektion der Rattenleber bei Ischämie und Reperfusionsschädigung,
verwendet wurden [Amersi et al. 1999].
Abb. 12 Einfluss der Präkonditionierung mit CoPP auf die Induktion von HSP32 im Vergleich mit HSP70
Jeweils 20 µg Protein aus Herz, Pankreas (Pankr.) und Leber (Bahn 3 bis 5) von unbe-handelten Kontrolltieren (NK) oder Tieren die mit 5 mg CoPP i.p. vorbehandelt wurden (CoPP, Bahn 6 bis 8), wurden pro Bahn aufgetragen. Die Proteine wurden per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran über-tragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurden rekombinantes HSP32 (Pos. Kontr. HSP32, Bahn 1) oder Pankreasgewebe mit Hyperthermie präkonditionierter Tiere (Pos. Kontr. HSP70, Bahn 2) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Zusätzlich wurde noch eine Negativkontrolle (NK NaOH Pankr., Bahn 9) verwendet. Die Membran wurde zunächst mit einem spez. Anti-HSP32 Antikörper (oberes Panel) in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000. Anschließend wurden die Antikörper durch Stripping (Herunterwaschen) entfernt und die
Kapitel 3 Ergebnisse
36
Membran dann mit einem spez. HSP70 Antikörper markiert (unteres Panel) (Erläuterungen siehe Text).
In Abbildung 12 ist der Effekt der CoPP-Präkonditionierung auf die HSP32-
Expression dargestellt. Im oberen Panel der Western Analyse mit spezifischen Anti-
HSP32/HO-1 Antikörpern zeigt sich, dass HO-1 im nativen Pankreas (NK Pankr.)
und im nativen Herz (NK Herz) konstitutiv nicht nachweisbar exprimiert wird,
wogegen in der Leber (NK Leber), wie schon in Abbildung 10 gezeigt, eine geringe
Expression nachweisbar scheint.
24 Stunden nach intraperitonealer Applikation von 5 mg CoPP/kg Körpergewicht
zeigt sich eine deutliche Expression von HSP32 in Herz, Pankreas und der Leber,
wobei die stärkste Induktion im Pankreas zu finden ist (Bahn 7). Dass der Träger
bzw. das Lösungsmittel [NaOH], in welchem CoPP zur Applikation gelöst wird,
keinen Einfluss auf die HSP32 Expression hat, lässt sich in Bahn 9 nachvollziehen.
Hier wurden die Versuchstiere nur mit einer dem CoPP-Träger aquivalenten Menge
an [NaOH] vorbehandelt. Es lässt sich dabei keine Induktion durch den Trägerstoff
nachweisen (vgl. auch Abb.17).
Im unteren Panel zeigt sich nach dem Strippen und Markierung derselben Membran
(s. Methoden 6.6.6.) mit einem spezifischen Anti-HSP70 Antikörper vergleichend
keine konstitutive Expression von HSP70 und keine Induktion der Expression nach
Präkonditionierung mit CoPP. Auch hier nimmt wiederum das Lösungsmittel von
CoPP, [NaOH], keinen Einfluss auf die Proteinexpression (Bahn 9).
Kapitel 3 Ergebnisse
37
Abb. 13 Dosisabhängige Induktion von HSP32 durch CoPP-Präkonditionierung (Dose response)
Jeweils 20 µg Protein aus Pankreashomogenat von Tieren, welche mit CoPP 5 mg (Bahn 3), 10 mg (Bahn 4 und 5) und 20 mg (Bahn 6 und 7) i.p. vorbehandelt wurden, wurden pro Bahn aufgetragen. Die Proteine wurden per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurde rekombinantes HSP32 (Pos. Kontr. HSP32, Bahn 1, 25 ng) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Die Membranen wurde zunächst mit einem spezifischen Anti-HSP32 Antikörper in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000 (Erläuterungen siehe Text).
In der oben gezeigten Abbildung 13 ist die dosisabhängige Induktion der
Proteinexpression (Dose response) von HSP32 nach CoPP-Präkonditionierung
dargestellt. In der Western Analyse mit spezifischen Anti-HSP32/HO-1 Antikörper
24h nach i.p. Applikation von 5, 10 oder 20 mg CoPP ist eine dosisabhängig
zunehmende Expression von HSP32 im Pankreas demonstriert.
Im Weiteren soll ergänzend noch der vergleichende Einfluss von CoPP auf
HSP25/27 untersucht werden. Hierbei auch im direkten Vergleich zwischen beiden
vorbeschriebenen Präkonditionierungen. Für die Bestimmung eines Expressions-
musters wurden die Versuchstiere einer Hyperthermie- bzw. CoPP-
Präkonditionierung unterzogen und 24h später die HSP-Expression in Pankreas-
homogenaten untersucht.
Kapitel 3 Ergebnisse
38
Abb. 14 a/b Einfluss von Hyperthermie und CoPP im Vergleich auf HSP25/27 und 32 im Pankreas
Jeweils 20 µg Protein von Tieren, die mit 5 mg CoPP i.p. vorbehandelt wurden (CoPP, Bahn 3 bis 6), wurden pro Bahn aufgetragen, die Proteine per SDS/Page aufgetrennt und an-schließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurden rekombinantes HSP25 (Pos. Kontr. HSP25, Bahn 2, 20 ng) oder Pankreasgewebe mit Hyperthermie prä-konditionierter Tiere (Bahn 7 und 8, 25 ng) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Zusätzlich wurde noch eine Negativkontrolle (NK Pankr., Bahn 9) verwendet. Die Membran wurde zunächst mit einem spezifischen Anti-HSP25 Antikörper (Abb. 14 a) in
Kapitel 3 Ergebnisse
39
einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000. Anschließend wurden die Antikörper durch Stripping (Herunterwaschen) entfernt und die Membran dann mit einem spezifischen HSP32 Antikörper markiert (Abb. 14 b). Das schwache Signal in Bahn 6 scheint durch die Auftragung weniger Protein bedingt zu sein und ist wohl hier eher als Auftragungsfehler zu werten bzw. resultiert aus einer stärkeren Verdünnung. Auf der jeweils linken Seite der Abbildungen wurden die Molekulargewichte durch einen Protein-Standard-Marker (schwarze Pfeile), die mitgelaufenen Positivkontrollen jeweils mit weißen Pfeilen auf der rechten Seite markiert. Als Positivkontrollen (die beiden linken Bahnen) diente rekombinantes Protein, als Negativkontrolle (äußerst rechte Bahn) diente unbehandeltes natives Pankreasgewebe.
In Abbildung 14 a sieht man das Expressionsmuster von HSP25/27 in den
Pankreasproben, sowohl 24h nach CoPP-Präkonditionierung, als auch 24h nach
Hyperthermiebehandlung (vgl. Abbildung 11). Im Unterschied zur Induktion durch
Hyperthermie, lässt sich kein eindeutiger Nachweis einer CoPP induzierten HSP25-
Expression erbringen. Die Expression bei den mit CoPP behandelten Tieren dürfte
vielmehr der konstitutiven HSP25-Expression im Pankreas entsprechen [Schäfer et
al. 1999]. Dies gilt analog auch für Abbildung 15, in der eine Expression von HSP25
durch CoPP-Präkonditionierung auch mit steigenden CoPP-Dosen nicht belegt
werden kann.
In Abbildung 14 b zeigt sich nach dem erneuten Waschen, Entfernen des
spezifischen HSP25 Antikörpers (Strippen) und erneuter Markierung derselben
Membran mit einem spezifischen Anti-HSP32 Antikörper, wiederum keine
Expression bzw. Hochregulierung von HSP32/HO-1 nach Hyperthermiebehandlung,
aber erneut eine Expression nach CoPP-Vorbehandlung. Dabei stellt sich in Bahn 6
ein schwächeres Expressionssignal dar. Wegen des geringen Expressionssignals
im Western auch von HSP25 in Abbildung 14 a in dieser Probe, muss hier von einer
geringeren Proteinmenge vorab ausgegangen werden.
Kapitel 3 Ergebnisse
40
Abb. 15 Die Induktion von HSP25 nach CoPP-Präkonditionierung mit steigender Dosis
Jeweils 20 µg Protein aus Pankreashomogenat von Tieren, die mit 5 mg (Bahn 1 bis 3), 10 mg (Bahn 4 bis 6) und 20 mg (Bahn 7 und 8) CoPP i.p. vorbehandelt wurden (CoPP, Bahn 1 bis 3), wurden pro Bahn aufgetragen, die Proteine per SDS/Page aufgetrennt und an-schließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membran wurde zunächst mit einem spezifischen Anti-HSP25 Antikörper in einer Kon-zentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000. das schwächere Signal ist am ehesten durch eine geringere aufgetragene Proteinmenge zu begründen.
Da in Abbildung 14 a eine HSP25 Expression in allen Bahnen zu sehen ist, ist in
Abbildung 15 noch einmal das Expressionsmuster mit unterschiedlichen Mengen
CoPP (Dose response) mit spezifischen Anti-HSP25 Antikörper nach Applikation
von CoPP i.p. in einer Auswahl aus 10 voneinander unabhängigen Experimenten
gezeigt. Nach Gabe von 5, 10 oder 20 mg CoPP stellt sich hier keine signifikante
Hochregulierung von HSP25 im Pankreas dar, die unterschiedlichen Intensitäten in
Bahn 3, 6 und 7 sind wohl eher auf verschiedene Experimente und Schwankungen
in den aufgetragenen Proteinmengen zurückzuführen. Dies zeigt, dass HSP25
genuin im Pankreas vorkommt, aber nicht auf die CoPP-Präkonditionierung
anspricht, also pharmakologisch durch CoPP nicht beeinflussbar ist.
Da sich zeigen lässt, dass sich HSP70 durch CoPP-Präkonditionierung nicht
beeinflussen lässt, wurde nun auch das in Verbindung mit HSP70 oft auftretende
HSP60 untersucht. Es wurde die HSP60-Expression auf unterschiedliche CoPP-
Mengen (5, 10 und 20 mg/kg KG) 24h nach i.p. Applikation beurteilt und auch hier
Kapitel 3 Ergebnisse
41
konnte keine spezifische Reaktion bzw. dosisabhängige Expression
(Hochregulierung) 24h nach CoPP-Präkonditionierung nachweisbar gezeigt werden
(Daten nicht gezeigt).
3.1.3. Auswirkungen von Caerulein und Caerulein-induzierter Pankreatitis auf die HSP-Expression
Die Induktion einer experimentellen akuten Pankreatitis erfolgte in Anlehnung an die
Vorarbeiten von Sato und Fu [Sato et al. 1997, Fu et al. 1997] und analog der
Arbeiten aus unserer Arbeitsgruppe [Kubisch et al. 2004, Schäfer et al. 2005]
standardmäßig durch Verwendung von Caerulein (pGlu-Gln-Asp-Tyr(SO3H)-Thr-
Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2) (s. Methoden 6.3.). Dabei handelt es sich um ein
Decapeptid und Cholezystokinin (CCK) Analogon, das sich von diesem nur durch
zwei zusätzliche Aminosäuren unterscheidet, die sich im Anschluss an das für die
biologische Aktivität zwingend notwendige Heptapeptid befinden. Die Wirkungen
von Caerulein und CCK auf das Pankreas sind annähernd identisch [Lampel und
Kern 1977].
Nachdem in den vorangegangenen Western-Analysen der Nachweis der
spezifischen pharmakologischen Induktion von HSP32 durch CoPP und HSP70
durch Hyperthermie vergleichend dargestellt und erbracht wurde, soll nun der
Einfluss von Caerulein bzw. der akuten Pankreatitis auf verschiedene
Expressionsmuster gezeigt werden. Interessant ist dabei, dass vorhergehende
Studien nach 12h bzw. 24h eine Induktion von HO-1 durch Caerulein beschreiben
[Fu et al. 1997, Sato et al. 1997]. In dieser Arbeit wird dagegen die Frühphase nach
6h untersucht und dargestellt.
Kapitel 3 Ergebnisse
42
Abb. 16 Auswirkung von Caerulein, Hyperthermie und CoPP auf das Expressionsmuster von HSP32 und HSP70 im Vergleich
Jeweils 20 µg Protein aus Pankreashomogenat von unbehandelten Kontrolltieren (Bahn 2 und 3) als Negativkontrolle (NK), von Tieren, welche mit Caerulein 50 µg/kg KG (Bahn 4 und 5), Hyperthermie (Bahn 6 und 7) oder Tieren die mit CoPP 5 mg (Bahn 8) und 10 mg (Bahn 9) i.p. vorbehandelt wurden, pro Bahn aufgetragen. Die Proteine wurden per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran über-tragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurde rekombinantes HSP32 (Pos. Kontr. HSP32, Bahn 1) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Die Membran wurde zunächst mit einem spez. Anti-HSP32 Antikörper (oben) in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000. Anschließend wurden die Antikörper durch Stripping (Herunterwaschen) entfernt und die Membran dann mit einem spez. HSP70 Antikörper in der Konzentration 1:1000 markiert (unten) (Erläuterungen siehe Text).
In Abbildung 16 wird zuerst die Wirkung von Caerulein auf die HSP32- und HSP70-
Expression im Pankreas ohne Präkonditionierung, wie noch einmal vergleichend,
der Einfluss der verschiedenen Vorbehandlungen mit Hyperthermie und CoPP,
dargestellt. Es sind zum einen Kontrolltiere ohne Vorbehandlung abgebildet (Bahn 2
und 3), wie auch Tiere nach Induktion einer akuten experimentellen Pankreatitis
durch 5-malige stündliche Applikation von Caerulein ohne Vorbehandlung (Bahn 4
und 5), sowie entweder jeweils 24h nach der Präkonditionierung mit Hyperthermie
bzw. mit CoPP (Bahnen 6 bis 9).
Kapitel 3 Ergebnisse
43
Das Expressionsmuster in der Western Analyse in Abbildung 16 im oberen Panel
mit Anti-HSP32 zeigt für Caerulein in der Frühphase nach 6h keinen messbaren
Einfluss auf die Expression von HSP32 im Pankreas. Weder im unbehandelten
Pankreasgewebe (NK), noch 6h nach induzierter Pankreatitis durch Caerulein (Cae)
oder 24h nach Präkonditionierung durch Hyperthermie (HT), zeigt sich eine HSP32-
Expression im Pankreas. CoPP-Präkonditionierung führt dagegen nach 24h
dosisabhängig zu einer starken HSP32-Induktion, dieses auch wie zuvor schon
beschrieben mit einer Dose response. Die Banden in der NK Bahn entsprechen
nicht dem Molekulargewicht der Positivkontrolle bzw. resultieren aus der
Überbelichtung und sind somit als unspezifisch anzusehen.
Der Einfluss von Hyperthermie ist, dargestellt im unteren Panel, wie schon vorher
gezeigt und so erwartet, nur auf HSP70 gegeben. Die unterschiedliche Ausprägung
der HSP70 Induktion bei den beiden Proben ist durch Schwankungen im Ausmaß
der durch Hyperthermie vermittelten Induktion der HSP70-Proteinexpression
einerseits und durch Schwankungen der aufgetragenen Proteinmenge zu erklären.
Eine Induktion von HO-1 durch Caerulein, wie in vorhergehenden Studien nach 12h
bzw. 24h beschrieben, lässt sich hierbei nach 6h also nicht nachweisen und scheint
wohl in der Frühphase der akuten Pankreatitis durch Caerulein noch nicht messbar,
was den Daten in der Literatur entspricht [Fu et al. 1997, Sato et al. 1997].
Abbildung 17 zeigt abschießend zwei repräsentative Western Analysen von Tieren,
jeweils während einer akuten, durch Caerulein induzierten Pankreatitis und nach
Präkonditionierung mit CoPP bzw. den Trägerlösungen [NaOH] und [NaCl].
Kapitel 3 Ergebnisse
44
Abb. 17 Western Analyse mit Anti-HSP32 und die Auswirkungen von Trägerlösungen auf die HSP32-Expression
Jeweils 20 µg Protein aus Pankreashomogenat von Tieren, welche mit Caerulein 50 µg/kg KG und mit CoPP 5 mg i.p. vorbehandelt wurden (Bahnen 3 bis 6 oben und Bahn 6 und 7 unten), von Tieren, welche mit Caerulein 50 µg/kg KG und mit [NaCl] (Bahn 7 und 8 oben und Bahn 3 unten), sowie [NaOH] (Bahn 4 und 5 unten), jeweils in äquimolarer Konzen-tration zu den Trägersubstanzen, pro Bahn aufgetragen. Die Proteine wurden per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurde rekombinantes HSP32 (Pos. Kontr. HSP32, Bahn 1, 25 ng) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Gezeigt ist eine Auswahl aus 10 voneinander unabhängigen Experimenten. Die Membranen wurde zunächst mit einem spezifischen Anti-HSP32 Antikörper in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären Antikörpers war 1:10000 (Erläuterungen siehe Text).
In den beiden Panels wird gezeigt, dass eine experimentelle akute Pankreatitis,
durch supramaximale Gabe von Caerulein ausgelöst, nach 6h noch keine
nachweisbare Hochregulierung der HSP32-Expression bedingt, wogegen die 24h
zuvor mit CoPP vorbehandelten (präkonditionierten) Tiere eine deutliche HSP32-
Expression zeigen. Es ist dargestellt, dass die Trägerlösungen [NaOH] oder [NaCl],
welche zur Lösung von CoPP oder Caerulein benötigt werden, sowie der Vorgang
der Injektion als „mechanischer Stress“ hierbei die HSP32-Induktion allein nicht
beeinflussen. Nun soll im folgenden Abschnitt die Qualität der Induktion und die
Kapitel 3 Ergebnisse
45
Auswirkung auf spezifische Parameter des Pankreas und der Pankreatitis evaluiert
werden.
3.2. Biochemische Messungen und statistische Analysen Nachdem gezeigt werden konnte, dass eine gezielte pharmakologische Induktion
von HSP32/HO-1 mit CoPP möglich ist und dass die Präkonditionierung mit
Metalloprotoporphyrinen im Besonderen die Expression von HSP32, aber nicht die
anderer HSPs beeinflusst, wurde nun der pharmakologische Einfluss der
HSP32/HO-1 auf die spezifischen biochemischen Parameter des Pankreas, sowie
die Auswirkungen auf den Verlauf der durch Caerulein induzierten Pankreatitis
untersucht und im folgenden Abschnitt dargestellt.
Um die Wirkung einer Präkonditionierung mit CoPP auf die akute Pankreatitis und
den Effekt der Überexpression von HSP32/HO-1 auf die Schwere der akuten
Pankreatitis vergleichend zu untersuchen und genauer zu charakterisieren, wurden
verschiedene pankreasspezifische biochemische Parameter, wie die
Konzentrationen der Enzyme Amylase und Lipase im Blutserum der Versuchstiere,
sowie Trypsin im Pankreasgewebe und der relative Flüssigkeitsgehalt im Pankreas
selbst im Verlauf des Versuches erhoben und in den folgenden Abbildungen
vergleichend dargestellt. Die Versuchstiere wurden, wie in Tabelle 5 beschrieben,
unterschiedlich vorbehandelt.
Tabelle 5 Vorbehandlungen der Versuchstiere in einzelnen Versuchsgruppen
Kontrollgruppe 1 0,9% NaCl Ø Ø
Kontrollgruppe 2 0,9% NaCl 5 mg/kg CoPP Ø
Versuchsgruppe 1 Ø 5 mg/kg CoPP 50 µg/kg Caerulein
Versuchsgruppe 2 Ø 10 mg/kg CoPP 50 µg/kg Caerulein
Versuchsgruppe 3 Ø 20 mg/kg CoPP 50 µg/kg Caerulein
Versuchsgruppe 4 0,9% NaCl Ø 50 µg/kg Caerulein
Die Kontrollgruppen erhielten 24h vor der Parameterbestimmung eine
Vorbehandlung entweder mit 0,9% [NaCl] oder mit CoPP, bzw. beidem, da [NaCl]
hier als Verdünnungsmedium von [CoPP/NaOH] verwendet wurde, bzw. der
Injektionsvorgang im Sinne des mechanischen Stresses als Einflussmöglichkeit
ausgeschlossen werden musste. Eine akute experimentelle Pankreatitis durch
Kapitel 3 Ergebnisse
46
Caerulein wurde in diesen Gruppen nicht induziert, um für die Auswertung
Nativdaten zu erhalten.
Die Tiere der Versuchsgruppen wurden dementsprechend jeweils 24h vor
Versuchsbeginn mit 5, 10 oder 20 mg/kg KG CoPP i.p. oder ebenfalls einer
äquivalenten Menge an 0,9% [NaCl] i.p. präkonditioniert bzw. behandelt (s.
Methoden 6.1.2.). Die Versuchsgruppen bekamen im Unterschied zur
Kontrollgruppe jedoch am Versuchstag stündliche intraperitoneale Injektionen,
welche die supramaximale Konzentration an Caerulein von 50 μg/kg KG enthielten
(s. Methoden 6.3.), welche zu einer gesteigerten Trypsinaktivität, zu einer
steigenden Lipase- und Amylaseaktivität im Serum, sowie zu einem steigenden
Wassergehalt (Ödembildung) im Pankreasgewebe führten.
Da die Induktion einer Pankreatitis dosisabhängig ist, wurde durch unsere
Arbeitsgruppe zunächst die genaue Menge an Caerulein ermittelt, die nötig ist, um
eine experimentelle akute Pankreatitis zu induzieren und damit sowohl auf
biochemischer, wie auch auf histologischer Ebene charakteristische Veränderungen
hervorzuheben. Zuerst wurde eine Dosis von 10 µg/kg KG Caerulein verwandt, bei
welcher es aber lediglich zu einer geringfügigen Veränderung der biochemischen
Parameter kam, histologische Veränderungen konnten dabei kaum beobachtet
werden (nicht gezeigt). Deshalb wurde die Caeruleindosis auf 50 µg/kg KG oder 100
µg/kg KG erhöht. Hierbei zeigten sich die erwarteten biochemischen und
histologischen Veränderungen aller Parameter. Es stellte sich heraus, dass sich bei
der Dosis von 50 µg/kg KG die pankreasspezifischen Parameter (Trypsin, Lipase,
Amylase, relativer Wassergehalt (Ödembildung) und histologische Veränderungen)
signifikant verändern und die weitere Steigerung der Caeruleinmenge zwar zu etwas
stärkeren Veränderungen der pankreatitisspezifischen Parameter führte, aber kein
weiterer statistisch signifikanter Unterschied zu beobachten war (im Vgl. mit 50
µg/kg KG). Deshalb wurden alle weiteren Experimente mit der Gabe eines Bolus
von 50 µg/kg KG durchgeführt, um eine akute Pankreatitis auszulösen (s. Methoden
6.3.).
In den Abschnitten 3.2.1.2., 3.2.2. und 3.2.3. sind die unterschiedlichen
Auswirkungen auf die oben genannten biochemischen Parameter nach Induktion
einer akuten Pankreatitis in der Frühphase sowie die Beeinflussung durch eine
zuvor erfolgte CoPP-Präkonditionierung graphisch dargestellt (s. Methoden 6.8.).
Kapitel 3 Ergebnisse
47
3.2.1. Einfluss der Präkonditionierung auf die Trypsinaktivität in Pankreashomogenaten
Der intrazellulären Trypsinaktivierung in der Frühphase der akuten Pankreatitis
kommt eine zentrale Bedeutung zu. Dieses beschreibt die frühzeitige intrazelluläre
Aktivierung von Verdauungsenzymen, insbesondere die von Trypsinogen zu
Trypsin, das in der Lage ist, die proteolytische Kaskade in Gang zu setzen. Dieses
Phänomen scheint eine zentrale Rolle zu spielen für die Pathogenese der akuten
Pankreatitis (s. Abschnitt 2.2.3.2.).
Als Parameter zur Beurteilung der Pankreatitis ist daher die Messung intrazellulär
aktivierten Trypsins zwingend erforderlich, sowohl bei in vivo (experimentelle
Pankreatitis) als auch bei in vitro Modellen (Azini) des exokrinen Pankreas. Für den
Einfluss einer CoPP-Präkonditionierung und des dadurch gebildeten HSP32 auf die
frühzeitige intrazelluläre Trypsinaktivierung lagen bislang in vivo im Modell der
akuten experimentellen Caerulein-induzierten Pankreatitis keine Daten vor.
3.2.1.1. Validierung der Trypsinbestimmung
Die Methodik zur Trypsinbestimmung und die Messung der Aktivität wurden in
unserer Arbeitsgruppe in Anlehnung an die Methode von Kawabata et al. etabliert
[Kawabata et al. 1988]. Dabei handelte es sich um eine Fluoreszenzmessung, bei
der das Substrat Boc-Gln-Ala-Arg-AMC•HCl durch Trypsin, nicht aber durch
Trypsinogen gespalten wird, wodurch die fluoreszierende Verbindung 7-Amino-4-
methylcoumarin (AMC) entsteht. Die Durchführung der Fluoreszenzmessung
erfolgte analog der Beschreibung im Kapitel Methoden 6.5.3..
Vor jeder Messung von Pankreasproben wurden Standardkonzentrationen von
Trypsin vermessen, um eine Standardkurve (Steigung gegen Trypsinkonzentration)
zu erstellen, damit die Konzentration an Trypsin in den zu vermessenden Proben
berechnet werden konnte. Hierfür wurden Standards mit definierten, vorbestimmten
Trypsinkonzentrationen (z.B. 0,1 ng/ml; 0,3 ng/ml; 0,5 ng/ml; 0,75 ng/ml) hergestellt
und vermessen (s. Methoden 6.5.3.).
Aus den erhaltenen Geraden der vermessenen, verschieden konzentrierten
Standards, wurden die jeweiligen Steigungen ermittelt (s. Abb. 18).
Kapitel 3 Ergebnisse
48
Abb. 18 Messung der Zunahme der Fluoreszenz bei definierten Standard-Trypsinkonzentrationen
Beispiel einer Messung der Zunahme der Fluoreszenz über die Zeit, abhängig von unterschiedlichen Trypsinkonzentrationen.
Abb. 19 Kalibriergerade aus den ermittelten Steigungen der Standardkonzentrationen
Darstellung einer Kalibriergerade, die sich ergibt, wenn die Steigungen der einzelnen Intensitätsgeraden gegen die jeweils entsprechende Trypsinkonzentration aufgetragen werden (vgl. Abb.18).
Die berechneten Geradensteigungen wurden dann gegen die dazugehörigen
Trypsinkonzentrationen in ng/ml in einem Koordinatensystem aufgetragen
(s. Abb. 19). Zur Berechnung des Trypsingehaltes der Pankreasproben, wurden die
Kapitel 3 Ergebnisse
49
ermittelten Steigungen aus den vermessenen Proben jeweils in die
Geradengleichung der Kalibriergeraden y = mx eingesetzt, wobei m der Steigung
der Kalibriergeraden entspricht. Indem man für x die Geradensteigung der
jeweiligen Probe einsetzt, erhält man folglich als y die Konzentration an Trypsin in
der zu bestimmenden Probe. Bei Proben, die für die Vermessung verdünnt wurden,
musste anschließend der jeweilige Verdünnungsfaktor mit in das Ergebnis
eingerechnet werden, um die tatsächliche Trypsinkonzentration in der Probe zu
erhalten.
3.2.1.2. Bestimmung von Trypsin in Pankreashomogenaten
In Abbildung 20, ist graphisch die pankreatische Trypsinaktivität dargestellt. Sechs
Stunden nach Versuchsbeginn erkennt man einen deutlichen Anstieg der Aktivität
der Versuchsgruppen gegenüber den Kontrollgruppen (vgl. mittleren Balken mit
Balken 1 und 2 oben), was die Ausprägung der induzierten akuten Pankreatitis
beschreibt. Dabei besteht ein signifikanter Unterschied zwischen den
Versuchstieren mit und ohne Präkonditionierung (p < 0,01), wobei der größte Effekt
hier bei der Präkonditionierung mit 5 mg/kg CoPP zu sehen ist (vgl. hierzu mittleren
Balken mit den Balken 4 und 5 unten).
Abb. 20 Trypsinaktivität im Pankreasgewebe
Die Ergebnisse sind bei Mehrfachbestimmungen als Mittelwert mit Standardabweichung dargestellt; die Anzahl der Versuchstiere pro Gruppe ist unter (n) angegeben. Balkenbezeichnung 1-5 von oben nach unten.
Kapitel 3 Ergebnisse
50
Bei der Trypsinbestimmung (s. Abb. 20) nach Induktion einer Caeruleinpankreatitis
lässt sich für die nicht CoPP-präkonditionierten Versuchstiere (Anzahl n = 17,
Balken 3), ein Mittelwert von 845,65 fmol/mg Protein bei einer Standardabweichung
von 266,32 und einer SEM von 64,59 angeben.
Die Werte von mit CoPP vorbehandelten Versuchstieren ergaben nach Induktion
einer Caeruleinpankreatitis bei 5 mg/kg CoPP (Balken 4) einen Mittelwert von
234,40 fmol/mg mit einer Standardabweichung von 161,09 und einer SEM von
53,70 und für 10 mg/kg CoPP (Balken 5) einen Mittelwert von 328,18 fmol/mg mit
einer Standardabweichung von 150,60 und einer SEM von 50,20. In beiden
Versuchsgruppen betrug die Anzahl der Versuchstiere n = 9.
Die Caerulein-induzierte Trypsinaktivität in Pankreashomogenaten war in beiden
CoPP-Versuchsgruppen (Balken 4 oder 5) signifikant niedriger (p < 0,001) im
Vergleich mit der Gruppe, welche nur mit [NaCl] vorbehandelt wurde (Balken 3).
Vergleicht man dabei beide CoPP-Gruppen untereinander, zeigt sich kein
signifikanter Unterschied (p = 0,220).
3.2.2. Einfluss der Präkonditionierung auf die Sekretion von Lipase und Amylase
Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Präkonditionierung mit
Metalloprotoporphyrinen im besonderen die Expression von HSP32 und damit die
Trypsinaktivität im Pankreashomogenat beeinflusst, wurde untersucht, inwiefern
sich die Lipase- und Amylasesekretion, sowie die jeweilige Enzymaktiviät im
Blutserum nach Induktion einer akuten Pankreatitis in der Frühphase, durch eine
zuvor erfolgte CoPP-Präkonditionierung, beeinflussen lassen.
Kapitel 3 Ergebnisse
51
Abb. 21 Aktivität der Lipase im Serum der Versuchstiere
Die Ergebnisse sind bei Mehrfachbestimmungen als Mittelwert mit Standardabweichung dargestellt; die Anzahl der Versuchstiere pro Gruppe ist unter (n) angegeben. Balkenbezeichnung 1-5 von oben nach unten.
Bei der Lipasebestimmung (s. Abb. 21) nach Induktion einer Caeruleinpankreatitis
lässt sich für die nicht mit CoPP präkonditionierten Versuchstiere (Balken 3) ein
Mittelwert von 668,88 U/l bei einer Standardabweichung von 327,21 und einer SEM
von 79,36 angeben. Die Werte der mit CoPP vorbehandelten Versuchstieren
ergaben nach Induktion einer Caeruleinpankreatitis bei 5 mg/kg CoPP (Balken 4)
einen Mittelwert von 268,66 U/l mit einer Standardabweichung von 131,48 und einer
SEM von 43,83 und für 10 mg/kg CoPP (Balken 5) einen Mittelwert von 163,88 mit
einer Standardabweichung von 116,23 und einer SEM von 38,74. In beiden
Versuchsgruppen betrug die Anzahl der Versuchstiere n = 9.
Dabei ergibt sich für den Vergleich der nur mit [NaCl] vorbehandelten Tiere mit 5
mg/kg CoPP (Balken 3 mit 4) ein statistisch signifikanter Unterschied von p = 0,002.
Der Caerulein-induzierte Anstieg der Lipaseaktivität war in beiden CoPP
Versuchsgruppen signifikant geringer als im Vergleich mit der Versuchsgruppe mit
NaCl Vorbehandlung (p < 0,001). Der Vergleich der Gruppen 5 mit 10 mg/kg KG
CoPP (Balken 4 mit 5) zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied.
Kapitel 3 Ergebnisse
52
Abb. 22 Aktivität der Amylase im Serum der Versuchstiere
Die Ergebnisse sind bei Mehrfachbestimmungen als Mittelwert mit Standardabweichung dargestellt; die Anzahl der Versuchstiere pro Gruppe ist unter (n) angegeben. Balkenbezeichnung 1-5 von oben nach unten.
Bei der Amylasebestimmung (s. Abb. 22) nach Induktion einer Caeruleinpankreatitis
lässt sich für die nicht mit CoPP präkonditionierten Versuchstiere (Balken 3) ein
Mittelwert von 483,18 U/l bei einer Standardabweichung von 122,62 und einer SEM
von 29,74 angeben.
Die Werte der mit CoPP vorbehandelten Versuchstieren ergaben nach Induktion
einer Caeruleinpankreatitis bei 5 mg/kg CoPP (Balken 4) einen Mittelwert von
452,89 U/l mit einer Standardabweichung von 164,00 und einer SEM von 54,67 und
für 10 mg/kg CoPP (Balken 5) einen Mittelwert von 423,22 U/l mit einer
Standardabweichung von 151,44 und einer SEM von 50,48. In beiden
Versuchsgruppen betrug die Anzahl der Versuchstiere n = 9.
Im Unterschied zu den Effekten von Caerulein auf die Trypsinaktivierung und die
Serumlipase-Werte zeigte die CoPP-Vorbehandlung keinen Effekt auf die Caerulein-
induzierte Amylase-Erhöhung (p = 0,599 für 5 mg/kg und p = 0,285 für 10 mg/kg).
Auch der direkte Vergleich beider CoPP-präkonditionierten Gruppen untereinander
(Balken 4 mit 5) zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,695).
Die Aktivität von Lipase (s. Abb. 21) und Amylase (s. Abb. 22) im Serum ist im
Vergleich zu den Kontrollgruppen deutlich um ein vielfaches erhöht (vgl. jeweils
Kapitel 3 Ergebnisse
53
Balken 3 mit Balken 1 und 2), was in den durchgeführten Versuchen die Qualität der
Ausprägung der akuten Pankreatitis nach 6h sehr gut beschreibt. Die eigentliche
Verabreichung bzw. manuelle Injektion des Caerulein bzw. [NaCl / NaOH] scheint
als traumatische Ursache hierbei keinen Einfluss zu nehmen (siehe jeweilis Balken
1 und 2).
3.2.3. Ödembildung und relativer Wassergehalt
In Abbildung 23 (vgl. mittleren Balken mit Balken 1 und 2) kann man die deutliche
Zunahme des Feuchtgewichts 6 Stunden nach einer durch Caerulein induzierten
akuten Pankreatitis bei den Versuchsgruppen erkennen. Dieses entspricht der
Entstehung eines Pankreasödems im Rahmen der frühen Entzündungsreaktion. Es
wurde das Verhältnis von Feucht- zu Trockengewicht (nach 48h) dargestellt, der
Flüssigkeitsgehalt als prozentualer Anteil am Pankreasgewebe angegeben.
Auch hier fand sich ein signifikanter Unterschied zur CoPP-Vorbehandlung (vgl.
mittleren Balken mit Balken 4 und 5). Der größte Effekt zeigt sich, wie bei der
Trypsinaktivität (s. Abb. 20), wiederum bei 5 mg/kg KG CoPP (Balken 4), hier stellte
sich die geringste Ödembildung dar.
Abb. 23 Relativer Wassergehalt des Pankreas (Feuchtgewicht)
Die Ergebnisse sind als Mittelwert mit Standardabweichung dargestellt; die Anzahl der Versuchstiere pro Gruppe ist unter (n) angegeben. Balkenbezeichnung 1-5 von oben nach unten.
Kapitel 3 Ergebnisse
54
Diese Daten passen auch sehr gut zu den makroskopischen und mikroskopischen
Bildern in denen sich dieser Effekt sehr gut nachvollziehen lässt (s. Abschnitt 3.3.).
Bei der Bestimmung des relativen Wassergehaltes (RWC) nach Induktion einer
Caeruleinpankreatitis lässt sich für die nicht mit CoPP präkonditionierten
Versuchstiere (Anzahl n = 17, Balken 3) ein Mittelwert von 89,59% bei einer
Standardabweichung von 1,76% und einer SEM von 0,47 angeben.
Die Werte der mit CoPP vorbehandelten Versuchstiere ergaben nach Induktion
einer Caeruleinpankreatitis bei 5 mg/kg CoPP (Balken 4) einen Mittelwert von
77,00% mit einer Standardabweichung von 5,91% und einer SEM von 1,97 und für
10 mg/kg CoPP (Balken 5) einen Mittelwert von 86,23% mit einer
Standardabweichung von 2,41% und einer SEM von 0,8. In beiden
Versuchsgruppen betrug die Anzahl der Versuchstiere n = 9.
Im direkten Vergleich je einer CoPP-Versuchsgruppe (Balken 4 oder 5) mit der
Gruppe, welche nur mit [NaCl] vorbehandelt wurde (Balken 3), ließ sich jeweils ein
signifikanter Unterschied von p < 0,001 beobachten. Der Vergleich beider CoPP-
Gruppen untereinander (Balken 4 mit 5) zeigt in diesem Fall einen deutlichen
stärkeren Effekt nach Vorbehandlung mit 5 mg/kg Copp im Vergleich zu 10 mg
CoPP (p < 0,001).
Bei der Präkonditionierung der Gruppe der Versuchstiere mit 10 mg/kg CoPP fällt im
Vergleich mit der Gruppe, welche mit 5 mg/kg CoPP vorbehandelt wurden, eine
sehr starke Zunahme des Feuchtgewichtes auf. Somit scheint der protektive Effekt
der höheren CoPP-Dosierung geringer zu sein. Bei den biochemischen Messungen
ließ sich dies nicht so beobachten (s. Abbildungen 20 bis 22). Möglicherweise
werden die protektiven Effekte der CoPP-Präkonditionierung durch toxische Effekte
der höheren Dosierung zum Teil aufgehoben [Dennery 2000].
3.3. Histologische und makroskopische Morphologie In den morphologischen Analysen wurde die Auswirkung einer Caerulein-
induzierten Pankreatitis im Vergleich zur CoPP-Präkonditionierung in der Frühphase
dokumentiert. Hierbei konnte schon, wie in den oben genannten biochemischen
Messungen angedeutet, eine deutliche Reduktion der histologischen Parameter, wie
z.B. die Ödemgröße, im Vergleich zu Tieren die keine CoPP-Präkonditionierung
erhalten haben, beobachtet werden.
Kapitel 3 Ergebnisse
55
Die morphologischen und histologischen Veränderungen nach einer akuten
Pankreatitis wurden in Pankreasgewebe beschrieben, welches während Präparation
und Resektion, sowie im Rahmen von Autopsien gewonnen wurde (s. Methoden
6.2.). Es zeigten sich hierbei in den milden akuten Formen, dass größtenteils die
Veränderungen im Pankreasödem lagen, während schwere Pankreatitiden sich
durch Nekrose, Hämorrhagie, Abszeß und Flüssigkeitsansammlungen
auszeichneten. In dieser Arbeit wurde das Bild einer akuten Pankreatitis in der
Frühphase (6h) dargestellt.
Abb. 24 Darstellung des OP-Situs eines Tieres ohne CoPP-Präkonditionierung nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis
Dargestellt ist ein abdomineller Situs ohne CoPP-Präkonditionierung (24h nach [NaCl] i.p.) und 6h nach Caerulein-Gabe. Die weißen Pfeile bezeichnen das stark ödematös veränderte Pankreasgewebe.
Auf den Abbildungen 24 bis 27 ist jeweils ein geöffnetes Abdomen während eines
Versuches bei den Versuchstieren (Ratten) dargestellt. Die Organe sind zur
besseren Orientierung beschriftet, die weißen Pfeile bezeichnen in den jeweiligen
Bildern das Pankreasorgan.
Kapitel 3 Ergebnisse
56
Die Tiere auf den Abbildungen 24 und 25 wurden jeweils 24 Stunden vor Induktion
einer akuten experimentellen Pankreatitis mit einer dem CoPP äquivalenten Menge
an Trägerlösung [NaCl / NaOH], die Tiere auf den Abbildungen 26 und 27 mit 5
mg/kg KG CoPP (s. Methoden 6.1.2.) vorbehandelt. Zur Induktion der akuten
Pankreatitis bekamen die Versuchstiere am Versuchstag stündlich (insgesamt 5-
mal) eine intraperitoneale Injektion, welche die supramaximale Konzentration an
Caerulein von 50 μg/kg KG enthielt (s. Methoden 6.3.).
Abb. 25 Darstellung des OP-Situs eines Tieres ohne CoPP-Präkonditionierung nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis
Dargestellt ist ein abdomineller Situs ohne CoPP-Präkonditionierung (24h nach [NaCl] i.p.) und 6h nach Caerulein Gabe. Die weißen Pfeile bezeichnen das stark ödematös veränderte Pankreasgewebe.
Im direkten Vergleich der jeweiligen OP-Situs kann man makroskopisch deutlich die
verstärkte Ödembildung bei den Tieren ohne CoPP-Vorbehandlungen sehen (weiße
Pfeile auf Abb. 24 und 25). Es ist eine stärkere Flüssigkeitsansammlung im
Abdomen feststellbar und das Pankreas wirkt größer in seiner Substanz und
ödematös aufgequollen.
Kapitel 3 Ergebnisse
57
Im Gegensatz dazu erscheint die Ödembildung im Pankreas nach der CoPP-
Vorbehandlung in den Abbildungen 26 und 27, trotz gleicher Behandlung mit
Injektionen derselben Konzentration an Caerulein, makroskopisch nur sehr gering
ausgebildet bzw. nicht vorhanden. Es zeigt sich also hier, was das makroskopische
Bild betrifft, eine gewisse Protektion gegenüber einer durch Caerulein induzierten
Pankreatitis.
Abb. 26 Darstellung eines OP-Situs eines durch CoPP-Präkonditionierung vorbehandelten Tieres nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis
Dargestellt ist ein abdomineller Situs 24h nach intraperitonealer CoPP-Präkonditionierung mit 5 mg/kg CoPP und 6h nach Caerulein Gabe. Die weißen Pfeile bezeichnen hierbei, im Vergleich zu den nicht präkonditionierten Tieren (vgl. Abb. 24 und 25), gering verändertes Pankreasgewebe.
Kapitel 3 Ergebnisse
58
Abb. 27 Darstellung eines OP-Situs eines durch CoPP-Präkonditionierung vorbehandelten Tieres nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis
Dargestellt ist ein abdomineller Situs 24h nach intraperitonealer CoPP-Präkonditionierung mit 5 mg/kg CoPP und 6h nach Caerulein Gabe. Die weißen Pfeile bezeichnen hierbei, im Vergleich zu den nicht präkonditionierten Tieren (vgl. Abb. 24 und 25), nur gering verändertes Pankreasgewebe.
Das mikroskopische Bild in den Abbildungen 28 bis 30 bestätigt die makroskopische
Aussage. Auch hier kann man durch die Präkonditionierung eine Verminderung des
histologischen Schweregrades im Rahmen der Gewebsveränderungen in der
Frühphase der Caerulein-induzierten Pankreatitis erkennen. Im Vergleich des
nativen Pankreasgewebes mit den Pankreatitisbildern (vgl. Abb. 28 mit Abb. 29 und
30) stellt sich eine deutlichere Gewebsveränderung bei den Tieren ohne
Präkonditionierung dar. Die größten Unterschiede zeigen sich dabei am deutlichsten
in der Ausprägung des Gewebeödems. Größere Zellschäden lassen sich hierbei in
der Frühphase nur vereinzelt ausmachen.
Kapitel 3 Ergebnisse
59
Abb. 28 Darstellung von nativem Pankreasgewebe eines Versuchstieres
Abb. 29 Darstellung von Pankreasgewebe eines Versuchstieres 6h nach Caerulein-induzierter Pankreatitis
Kapitel 3 Ergebnisse
60
Abb. 30 Darstellung von Pankreasgewebe eines Versuchstieres 6h nach Caerulein-induzierter Pankreatitis und 24h nach CoPP-Präkonditionierung
Kapitel 4 Diskussion
61
4. Diskussion Die Untersuchung der Stressreaktion der Bauchspeicheldrüse bildet die Grundlage
der vorliegenden Arbeit, mit dem Ziel die Mechanismen, die zur Entstehung einer
akuten Pankreatitis führen, noch besser zu verstehen. Zu den typischen Ursachen,
die zu einer akuten Pankreatitis führen, wie z.B. Alkoholabusus, eingeklemmte
Gallensteine oder die Einnahme bestimmter Medikamente, kann eine Pankreatitis
auch iatrogen ausgelöst werden, wie z.B. nach einer ERCP oder nach
extrakorporalem Kreislauf in der Herzchirurgie. Dadurch, dass eine Pankreatitis
einen sehr schweren und mitunter lebensbedrohlichen Verlauf nehmen kann, wäre
demnach eine klinische anwendbare Form der Präkonditionierung und damit der
induzierbaren Protektion von größtem Nutzen. Präkonditionierung als Möglichkeit
einer Organschädigung vorzubeugen, sowie das Ausmaß der Schädigung zu
reduzieren, eignet sich dabei selten zur Protektion von spontan erworbenen bzw.
auftretenden Erkrankungen. Hingegen ist sie eine durchaus sinnvolle Methode, um
z.B. iatrogen verursachte Schädigungen, wie z.B. bei der durch die ERCP
induzierten Pankreatitis, zu minimieren [Raeburn et al. 2001, Cleveland et al. 2001].
In vorangegangen Studien konnte bereits belegt werden, dass eine
Präkonditionierung oder Prästimulation durch geeignete Stressoren, wie z.B. die
Hyperthermie, geeignet ist, eine akute Pankreatitis, zumindest im Tiermodell, zu
verhindern oder wenigstens deutlich abzuschwächen. Es wurde dabei von
verschiedenen Arbeitsgruppen der Beweis erbracht, dass diese Methode in
Verbindung mit der Induktion und Expression von Hitzschock- oder Stressproteinen
steht und im Pankreas Schutz vor einer akuten Pankreatitis bietet [Wagner et al.
1996, Bhagat et al. 2000 und 2002, Frossard et al. 2002]. Die Induktion von
Hitzeschockproteinen, besonders von HSP70 und HSP32, aber auch HSP27, ist an
vielen verschiedenen Organsystemen in unterschiedlichen Studien über die
Regulations- und Schutzmechanismen an in vivo sowie in vitro Modellen untersucht
worden und nach Präkonditionierung auch protektiv wirksam [Elbirt et al. 1999,
Immenschuh und Ramadori 2000, Otterbein und Choi 2000]. Im Pankreas sind
insbesondere HSP70 und HSP27 bezüglich Ihrer protektiven Wirkung untersucht
und beschrieben worden [Wagner et al. 1996, Bhagat et al. 2000 und 2002,
Frossard et al. 2002, Kubisch et al. 2004].
Die Induktion durch einen Stressreiz wie Ischämie oder Hyperthermie ist dabei einer
der wichtigen Mechanismen bei der Präkonditionierung [Redaelli et al. 2001,
Kapitel 4 Diskussion
62
Frossard et al. 2002, Jaeschke 2003]. Auch bei der Ischämie-Reperfusions-
Schädigung (IRS) am Herzen konnte eine Hyperthermie-Präkonditionierung die
Infarktgröße deutlich verringern [Donnelly et al. 1992, Plumier und Currie 1996] und
besaß im Rahmen von Ischämien im Bereich des ZNS ein protektives Potential
[Franklin et al. 2005]. Dieses Verfahren der Hyperthermie-Präkonditionierung ist
jedoch klinisch schlecht einsetzbar.
In dieser Arbeit wurde die Induktion und Regulation der HSP32/HO-1, einem
Vertreter der intrazellulären Stress- bzw. Hitzeschockproteine, unter experimentellen
Stressbedingungen, wie der durch Caerulein induzierten, akuten Pankreatitis,
untersucht. HO-1 ist, wie auch schon in Abschnitt 2.5. beschrieben, durch Häm, wie
auch eine Vielzahl anderer Substanzen, wie Schwermetalle, Endotoxine,
Hitzeschock, Zytokine oder Prostaglanine induzierbar [Choi und Alam 1996]. Neben
der Rolle der Hämdegradation, kann eine Überexpression von HO-1 eine defensive
Rolle gegen oxidativen Stress unter Entzündungs- oder Irritationsbedingungen
spielen [Nath et al. 1992, Vogt et al.1995 und 1996] und hat sich in verschiedenen
Zelltypen als protektiv gegen oxidativen Stress erwiesen [Wong und Wispe 1997].
Am Herzen ist dieser protektive Effekt bislang am besten beschrieben. So ist der
myokardiale Schaden nach IRS bei transgenen Mäusen, die menschliches HO-1-
Gen erhalten haben, verringert. Die Induktion des Enzyms durch exogenes Häm
reduziert die Infarktgröße [Yet et al. 2002].
Um einen begründeten Effekt nun einem einzelnen HSP, wie HSP32/HO-1
zuzuschreiben, kann man dieses entweder durch Überexpression, wie in dieser
Arbeit durchgeführt, oder durch Hemmung [Amersi et al. 1999] beeinflussen. Die
HO-1 lässt sich im Unterschied zu anderen Hitzeschockproteinen, biochemisch mit
verschiedenen Porphyrinen entweder hemmen (Zink-Protoporphyrin (ZnPP), Zinn-
Protoporphyrin (SnPP)) [Labbe et al. 1999], oder wie in Abschnitt 2.5.3. dargestellt,
durch Kobalt-Protoporphyrin (CoPP) aktivieren. So konnte zum Beispiel in
Vorarbeiten gezeigt werden, dass die IRS (Ischämie-Reperfusions-Schäden) von
transplantierten Lebern im Modell von übergewichtigen Zucker Ratten (genetically
fat Zucker rats) durch Induktion der HO-1 mit Kobalt-Protoporphyrin reduziert und
durch Hemmung der HO-1 mit Zink-Protoporphyrin verstärkt werden kann [Lee et al.
1996, Amersi et al. 1999]. In diesen Studien wurde dabei eine konstitutive HO-1
Expression in Leberzellen nachgewiesen. Im Gegensatz dazu konnte in unserem
Versuchsaufbau keine konstitutive HSP32-Expression im Pankreasgewebe
Kapitel 4 Diskussion
63
nachgewiesen werden (s. Abb. 12). Auch andere Studien zeigen keine bzw. nur
eine sehr geringe konstitutive Expression im Pankreasgewebe [Sato et al. 1997, Fu
et al. 1997]. Deshalb lag der Fokus der vorliegenden Arbeit entsprechend auf der
Induktion und Expression von HSP32/HO-1 mit CoPP und nicht auf der Suppression
mit SnPP oder ZnPP.
Es wurden dazu Möglichkeiten der pharmakologischen Induktion des HSP32/HO-1
untersucht und angewandt. Kobalt gehört, wie in der Literatur beschrieben, zu den
potenten Induktoren der HO-1 [Maines 1988]. In dieser Arbeit wurde untersucht,
inwiefern HSP32/HO-1 im Pankreas exprimiert wird und durch Kobalt-
Protoporphyrin (CoPP) induzierbar ist. CoPP induzierte dabei den Anstieg der HO-1
Proteinexpression im Pankreasgewebe analog anderer Studien, in denen bei in vivo
Experimenten mit Mäusen, durch CoPP-Injektion, ein Anstieg der HO-1
Proteinexpression nach 24h in der Milz, der Leber und der Niere nachgewiesen
werden konnte [Woo et al. 1998, Amersi et al. 1999]. Eine Therorie besagt, dass
CoPP über die Verschiebung des oxidativen Gleichgewichtes durch Reduktion der
intrazellulären GSH Konzentration mit konsekutivem Anstieg der freien
Peroxidkonzentration die HO-1 mRNA Expression induziert [Dennery 2000].
In den durchgeführten Versuchen zeigte sich 24 Stunden nach intraperitonealer
Gabe von 5 mg CoPP eine deutliche Proteinexpression unter anderem in Pankreas,
Leber und Herz (s. Abb. 12). Die Induktion und Expression konnte im weiteren
Verlauf dosisabhängig gesteigert werden, mit maximaler Expression bei ca. 20
mg/kg CoPP i.p. (s. Abb. 13), so dass man von einer Dosisabhängigkeit (Dose
Response) sprechen kann. Einen ähnlichen Effekt konnte auch Sato et al [Sato et
al. 1997] in Pankreas βTC3-Zellen nachweisen, indem er diese mit verschiedenen
Stressoren wie CdCl2, Diethylmaleat (DEM) oder H2O2, welches Sauerstoffradikale
freisetzt, in steigender Konzentration inkubierte und eine Zeit- sowie dosisabhängige
Steigerung der HO-1-Expression darstellte.
Die Auswirkungen auf die Parameter der experimentellen Pankreatitis zeigten in
dieser Arbeit allerdings eher eine biphasische Antwort mit maximalen Effekten bei 5
mg und geringerer Reduktion des Schweregrades bei höheren Dosierungen (vgl.
Abb. 20 bis 22 in Abschnitt 3.2.). Das Lösungsmittel von CoPP [NaOH], hatte dabei,
wie auch [NaCl] als Lösungsmittel von Caerulein, keinen Einfluss auf die HSP32-
Expression. Genauso wenig beeinflusste die mechanische Injektion als
traumatische Ursache die Proteinexpression.
Kapitel 4 Diskussion
64
Im Unterschied zur Hyperthermie-Präkonditionierung stellte sich heraus, dass die
Präkonditionierung mit CoPP spezifisch zur Induktion von HSP32/HO-1 führt und in
den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen (s. Abschnitt 3.1.2.) keinen Einfluss
auf die Expression von HSP70, HSP25/27 und HSP60 im Pankreasgewebe hat. Die
Präkonditionierung mit CoPP erlaubt also in dem in dieser Arbeit angewandten
Modell, isoliert die Effekte der Expression von HSP32 auf die Pankreatitis zu
beobachten, da eine spezifische pharmakologische Regulation möglich ist. Auch
zeigen die gewonnenen Daten, dass die in den Versuchen verwendeten Antikörper
sensitiv und spezifisch sind.
Vergleicht man dagegen die vorher beschriebene Methode der Hyperthermie-
Präkonditionierung als etablierte experimentelle Methode [Wagner et al 1996], mit
der Induktion und Expression von HSP32 im Pankreas, zeigt sich zwar ein
deutlicher Effekt auf die Expression anderer Hitzschockproteine wie HSP70, HSP60,
HSP 90 und HSP25/27 einzeln oder in Kombination, nicht jedoch auf HSP32 im
Pankreas. Es zeigte sich dagegen eine Hyperthermie-induzierte Induktion der
HSP32-Expression in der Leber (s. Abb. 10). Passend zu diesen Daten wurde eine
Hyperthermie-induzierte Expression von HSP32 in Leber und Niere auch von
anderen Arbeitsgruppen gefunden. In diesen Organen wird die Hämoxygenase-1
(HSP32) durch Hyperthermie in den Mechanismus der Präkonditionierung mit
einbezogen und induziert [Amersi et al. 1999, Redaelli et al. 2001 und 2002].
Es zeigt sich also, dass die Hyperthermie-Präkonditionierung mehrere HSPs
hochregulieren kann und die Untersuchung des Effektes einzelner HSPs
problematisch ist, da die Effekte der verschiedenen induzierten HSPs nicht oder nur
schwer getrennt werden können.
HSP32/HO-1 kann neben CoPP auch durch andere Agenzien, wie durch oxidativen
Stress [Applegate et al. 1991, Tyrrell und Basu-Modak 1994] sowie z.B. durch
Caerulein i.p. im Pankreasgewebe induziert werden [Fu et al. 1997]. Es wurde in
vorangegangenen Studien gezeigt, dass Caerulein auf mRNA Ebene die Expression
von HSP32/HO-1 mRNA im Pankreas rasch und koordiniert hochreguliert, dabei
konnte aber zuerst der Anstieg von TNF-α und die Infiltration von Makrophagen
nachgewiesen werden [Norman et al. 1995]. Das Ausmaß der Proteinbildung stieg
in in vivo Experimenten mit Mäusen in der Frühphase der akuten, Caerulein-
induzierten Pankreatitis (bis 6h) nur sehr gering an [Fu et al. 1997] und führte erst 7-
12h nach Caeruleininjektion auch auf Proteinebene zur deutlich nachweisbaren
Kapitel 4 Diskussion
65
Expression von HSP32 im Pankreas. Passend zu unseren Beobachtungen haben
Sato et al. ergänzend festgestellt, dass HSP32 nur in sehr niedrigen Basisspiegeln
im Pankreas in vivo und in Azinuszellen in vitro exprimiert wird [Sato et al. 1997].
Die Caerulein-induzierte akute Pankreatitis war hier mit einem signifikanten
Ansteigen der Expression von pankreatischem HSP32 erst 12-24 Stunden nach den
ersten Zeichen von intestinalem Ödem im Pankreas der Versuchstiere (Ratten)
verbunden. Der zeitliche Verlauf dieser selektiven Induktion von HO-1 im Pankreas
in vivo spiegelt wahrscheinlich eine anlagebedingte Reaktion (Antwort) auf die
Bildung von reaktiven oxidativen Radikalen in der Frühphase der akuten
Pankreatitis wider [Schoenberg et al. 1992 und 1995, Luthen et al. 1995].
In dieser Arbeit wurden auf dieser oben genannten Grundlage die Effekte von
Caerulein in einem experimentellen Versuchsaufbau auf die HSP32-Expression
untersucht. Hier zeigte sich, dass in diesem System Caerulein innerhalb von 6h
(Frühphase) nicht zu einer nachweisbaren Proteinexpression von HSP32/HO-1 im
Pankreas führt (s. Abb. 16 und 17). Somit ist das gewählte System der
pharmakologischen Präkonditionierung mit CoPP in dieser Arbeit gut geeignet, für
die individuelle Analyse der Effekte der Induktion von HSP32/HO-1 auf den Verlauf
der Caerulein induzierten Pankreatitis. Dies ist im Unterschied zur Hyperthermie-
Präkonditionierung von Vorteil, da durch diese mehrere Hitzeschockproteinklassen
(z.B. HSP70, HSP25/27 und HSP60) induziert werden können [Redaelli et al. 2001
und 2002, Jaeschke 2003]. Auch ist in der hier gewählten Methode durch die
Caeruleingabe alleine noch keine Expression von HSP32/HO-1 nachweisbar, da die
Tiere vor Beginn der ausschließlich durch Caerulein-induzierten Proteinexpression
getötet werden.
Wie in der Einleitung schon erläutert, stellt die intrazelluläre Aktivierung von Trypsin
ein zentrales Phänomen für die pathophysiologischen Vorgänge in der Frühphase
der akuten Pankreatitis dar. Verschiedene Studien der letzten Jahre konnten zeigen,
dass die Entstehung und Entwicklung einer akuten Pankreatitis ihren Anfang in der
Azinuszelle nimmt und die frühzeitige und intrazellulär stattfindende Aktivierung von
Verdauungsenzymen dabei eine entscheidende Rolle spielt [Saluja et al. 1999,
Whitcomb et al. 1999, Bhagat et al. 2000]. Die Unterbindung dieser schädlichen
Aktivierung von Trypsin in der Azinuszelle spielt vermutlich eine entscheidende
Rolle für die Abschwächung des Schweregrades des Verlaufs der akuten
experimentellen Pankreatitis und dürfte auch eine entscheidende Rolle für die
Kapitel 4 Diskussion
66
Protektion des Pankreas in diesem Zusammenhang spielen [Leach et al. 1991,
Saluja et al. 1999, Whitcomb et al. 1999]. Auf diesem Hintergrund wurde in dieser
Arbeit untersucht, ob der protektive Effekt auf die akute Pankreatitis durch eine
vorangegangene CoPP-Präkonditionierung und die damit verbundene Expression
von HSP32/HO-1 in einer Änderung dieser initial in der Zelle ablaufenden
schädlichen Trypsinogenaktivierung liegt [Witt et al. 2001]. Dafür wurde ein Modell
gewählt, mit dem es möglich war, die intrazelluläre Aktivität von Trypsin und die
Sekretion darzustellen und zu quantifizieren (s. Abschnitt 3.2.1. und Methoden
6.5.3).
Betrachtet man die Auswirkung der CoPP-Präkonditionierung auf die
Trypsinaktivierung in dieser Arbeit (s. Abb. 20), so zeigt sich eine direkte Inhibierung
der frühzeitigen und intrazellulären Aktivierung von Trypsin nach Gabe
supramaximaler Caerulein-Konzentrationen, mit ähnlichen Phänomenen, wie denen
der in der Literatur beschriebenen Versuchen mit HSP27 [Schäfer et al. 2000,
Kubisch et al 2004]. Auch Bhagat et al. konnten zeigen, dass eine Protektion in
Zusammenhang mit einer Reduktion der Trypsinogenaktivierung steht [Bhagat et al.
2000]. Im Prankreashomogenat, welches von präkonditionierten Tieren gewonnen
wurde, konnte eine schwächere Aktivierung des intrazellulären Trypsins beobachtet
werden, als dies bei den Zellen der Fall war, welche von Ratten isoliert wurden, die
nicht zuvor präkonditioniert waren. Zusammen mit der ebenfalls in dieser Arbeit
beobachteten starken Expression von HSP32 kann dies als Indiz dafür gewertet
werden, dass der Mechanismus der Protektion gegen die Entstehung einer
Pankreatitis in der verringerten Aktivierung des intrazellulären Trypsins zu sehen ist.
Der Mechanismus durch den HSP32 dabei in die Caerulein-induzierte intrazelluläre
Trypsinaktivierung eingreift, bleibt dabei allerdings weiter unklar. Viele
Arbeitsgruppen nehmen an, dass der Prozess der intrazellulären Trypsinaktivierung
durch eine Colokalisation von Trypsinogen und anderen Zymogenen mit
lysosomalen Hydrolasen insbesondere Cathepsin B in instabilen intrazellulären
Organellen hervorgerufen wird [Gorelick et al. 1992, Saluja et al. 1997].
Experimente an Cathepsin B -/- knock-out Mäusen zeigten, dass die Caerulein
induzierte, intrazelluläre Trypsinaktivierung bei diesen Mäusen um bis zu 90%
reduziert gegenüber Wildtypmäusen, aber nicht gänzlich verschwunden ist [Saluja
et al. 1997].
Kapitel 4 Diskussion
67
Im Folgenden wurden dann in weiteren experimentellen Gruppen die Entwicklung
typischer Pankreatitisparameter, wie die Amylase und Lipase im Serum untersucht.
Dabei wurden unbehandelte Kontrolltiere, mit Tieren, welche lediglich 5-malig
Caerulein i.p. erhielten und Tieren die 24h vor Caeruleingabe mit 5 oder 10 mg/kg
CoPP i.p. prästimuliert worden waren, verglichen. Hier zeigte sich bei den
spezifischen Pankreasenzymen nach Induktion einer Pankreatitis ein deutlicher
Anstieg der Enzymaktivität, wobei sich für die Präkonditionierung bezüglich der
biochemischen Parameter der Pankreatitis eine Verringerung des Schweregrades
der Caerulein-induzierten Pankreatitis dokumentieren lässt. Dies gilt insbesondere
für die Verringerung der intrapankreatischen Serum-Lipase. Auch Kubisch et al.
konnten mit einer Caerulein-induzierten Pankreatitis einen deutlichen Lipase- und
Amylaseanstieg nachweisen [Kubisch et al. 2004].
Die Aktivität von Lipase (s. Abb. 21) und Amylase (s. Abb. 22) im Serum ist im
Vergleich zu den Kontrollgruppen deutlich um ein vielfaches erhöht, was in den
durchgeführten Versuchen die Qualität der Ausprägung der akuten Pankreatitis in
der Frühphase sehr gut beschreibt. Auch lässt sich anhand der gemessenen
Parameter die Auswirkung einer Präkonditionierung der Versuchstiere darstellen.
Man kann hierbei den Einfluss und die teilweise deutliche Reduktion der
Pankreatitisparameter im Vergleich zu Tieren, die keine CoPP-Präkonditionierung
erhalten haben, beobachten. Damit zeigt sich, dass die Präkonditionierung mit
CoPP auch hier eine Milderung der akuten Pankreatitis bewirken kann. Im Vergleich
der für die Pankreatitis spezifischen Parameter zwischen der Kontrollgruppe und der
Versuchsgruppe zeigt sich eine deutliche Reduktion des Parameters Lipase (p <
0,01) mit dem Unterschied zur Amylase, deren Serumspiegel nach wie vor sehr
hoch waren und sich nicht signifikant veränderten (p > 0,05), wobei jeweils der
größere Effekt bei beiden Enzyme durch die Präkonditionierung mit 10 mg/kg CoPP
zu verzeichnen ist. Dabei stellt sich hier deutlich eine fehlende Korrelation zwischen
Schweregrad und Enzymwerten dar. Diese fehlende Korrelation zwischen der Höhe
der Serum-Amylase und -Lipase findet sich analog auch im klinischen Alltag bei
Patienten mit akuter Pankreatitis. Im Unterschied zur Präkonditionierung mit CoPP
zeigt sich nach Induktion von HSP27 eine deutliche Reduktion der Aktivität beider
Enzyme [Schäfer und Williams 2000, Kubisch et al. 2004].
Eine Steigerung der CoPP-Dosis führte zwar zu einer stärkeren HSP32-Expression
(Dose response), was aber im Falle der Enzymaktivität die Wirkung jedoch nur für
Kapitel 4 Diskussion
68
die Lipaseaktivität verstärken konnte. Die eigentliche Verabreichung bzw. manuelle
Injektion als traumatisches Ereignis, scheint auch hier, wie zuvor im Rahmen der
Proteinexpression schon beschrieben, keinen Einfluss auf die gemessen Parameter
zu haben.
Unter den etablierten experimentellen Bedingungen wurde ebenfalls untersucht,
inwiefern die Präkonditionierung mit CoPP zu einer morphologischen Beeinflussung
während einer Pankreatitis führt. Es zeigte sich im direkten Vergleich der jeweiligen
präparierten Situs makroskopisch und mikroskopisch deutlich bei den nicht
präkonditionierten Tieren eine verstärkte Gewebeödembildung im Pankreas (s. Abb.
24 bis 27), was für eine stärker ausgeprägte Pankreatitis in der Frühphase sprechen
könnte. Dieses lässt sich auch durch die graphische Darstellung des relativen
Wassergehaltes bekräftigen (s. Abb. 23). Die präkonditionierten Tiere zeigten
sowohl makroskopisch, als auch wiederum in der graphischen Darstellung einen
reduzierten Wassergehalt. Der stärkste Effekt zeigte sich hier bei 5 mg/kg CoPP,
ließ sich aber nicht durch steigende CoPP-Gabe verstärken. Es gibt also Anzeichen
einer der HO-1 zugerechneten Protektion (protektive Effekte), welche aber nicht mit
steigender Expression korreliert, d.h. es gibt hier wohl ein Induktionsoptimum, wobei
bei weiterer Steigerung höchstwahrscheinlich toxische Effekte von CoPP zum
Tragen kommen. Auch wurden von Dennery zelltoxische Effekte durch eine starke
Induktion mit CoPP beschrieben [Dennery 2000].
Der genaue Mechanismus der Protektion durch HSP32 im Pankreas ist bis jetzt
nicht eindeutig geklärt. HSP32 kann die Kernbindung von proinflammatorischen
Transkriptionsfaktoren reduzieren [Uchinami et al. 2002] und die antioxidative
Kapazität der Zellen steigern [Bauer und Bauer 2002]. Beide Effekte können
dadurch eine mildere inflammatorische Antwort bewirken [Arai et al. 2001].
Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Kohlenstoffmonoxid (CO), ein
Nebenprodukt der HO-1 Aktivität, die p38 MAP-Kinase als Schlüsselmechanismus
der CO-vermittelten Protektion gegen eine IRS aktiviert [Amersi et al. 2002, Katori et
al. 2002]. Auch antagonisiert HO-1 durch das als Radikalfänger wirksame Biliverdin
und Bilirubin sowohl den von freien Radikalen hervorgerufenen Zellschaden, als
auch die Leukozytenadhäsionen [Hayashi et al. 1999].
Noch ist nicht eindeutig geklärt, ob die durch Präkonditionierung hervorgerufene
Protektion wirklich durch HSPs vermittelt wird, da die Präkonditionierung auch noch
andere Effekte haben kann, an denen HSPs nicht beteiligt sind. Sie könnten mit der
Kapitel 4 Diskussion
69
Protektion assoziiert sein, ohne diese zu vermitteln [Bhagat et al. 2002]. Ebenso
kann Stress, welcher die HSP-Expression induziert, auch nicht-HSP-spezifische
Effekte haben, bzw. mehrere HSPs induzieren und somit eine Kombination von
diesen darstellen [Schäfer et al. 2005]. Aufgrund des jedoch engen zeitlichen
Verhältnisses zwischen der Induktion und beobachteter Protektion, ist anzunehmen,
dass die HSPs eine zentrale Rolle für die protektive Wirkung der Präkonditionierung
spielen. Es wurde von Kubisch et al. mit Hilfe der Generierung einer transgenen
Mauslinie, die HSP27 im Pankreas überexprimiert, gezeigt, dass eine einzelnes
HSP Schutz vor Caerulein-induzierter Pankreatitis bilden kann. Diese
Überexpression führt zu erhöhter Widerstandsfähigkeit gegenüber Hitze oder
anderen Stressfaktoren in einer Reihe von Zelllinien [Schäfer et al. 1999, Schäfer
und Williams 2000, Kubisch et al. 2004]. HSP27 stellt ein Phosphoprotein dar und
spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation und Stabilisierung des Zytoskeletts,
insbesondere des F-Aktins, wobei eine HSP27 Überexpression zu einer
Stabilisierung der Aktin-Mikrofilamente [Schäfer et al. 1999, Kubisch et al. 2004] und
zu einer Verbesserung der Proteinfaltung in der Zelle führt [Ethridge et al. 2000].
Damit wird eine vermehrte Toleranz des Zytoskeletts gegenüber Stress erreicht, da
hohe Dosierungen von CCK oder Caerulein zu negativen Veränderungen des
Aktinzytoskellets führen und damit zu einer Unterbindung der Exozytose von
Zymogengranula aus den Azinuszellen in die Pankreasgänge. Die Überexpression
von HSP27 bewirkt dabei eine Stabilisierung der Aktin-Mikrofilamente und inhibiert
damit die negativen Folgen von unphysiologisch hohen Konzentrationen von
Caerulein.
Weitere Studien haben bewiesen, dass eine Inhibition, bzw. Blockierung von HSPs
auch zum Auslöschen der Protektion führen kann und somit die Voraussetzung der
durch HSP vermittelten „Stresstoleranz“ eine verstärkte Aktivität oder Expression ist
[Bhagat et al. 2002, Frossard et al. 2002]. Bhagat et al. untersuchten den
protektiven Effekt von HSP70 bei der Caerulein-induzierten Pankreatitis mit Hilfe
von Antisense- und Sense-Oligonukleotiden. Dabei konnten sie einen
Zusammenhang zwischen HSP70 und der Reduktion des Schweregrades der
akuten experimentellen Pankreatitis aufzeigen. Es zeigten ihre Untersuchungen,
dass die Gabe von Antisense-Oligonukleotiden vor der Hyperthermiebehandlung die
Expression von HSP70 verhinderte. Die Folge der fehlenden HSP70-Expression
war, dass trotz Hyperthermiebehandlung kein protektiver Effekt auf die akute
experimentelle Pankreatitis zu sehen war [Bhagat et al. 2002].
Kapitel 4 Diskussion
70
Es gilt also, dass der verstärkte Einfluss der HSPs auf die Zelle zu einer
verbesserten Dissaggregation von stressbedingt denaturierten Proteinen und zu
einer vermehrten Stabilisierung, bzw. Reparatur von zellulären Strukturen, wie
Mikrofilamenten und Zentromeren, sowie von zellulären Prozessen, wie
Transkription, Splicing und Translation während eines zweiten Stresses führt [De
Maio 1999]. HSPs reduzieren außerdem die Bindung von proinflammatorischen
Transkriptionsfaktoren im Zellkern und erhöhen die antioxidative Kapazität der
Zellen [Jaeschke 2003].
Insgesamt ist die durchgeführte Prästimulation mit CoPP eine weitere Methode zur
Protektion durch Hitzschockproteine ähnlich der zuvor schon beschriebenen
Hyperthermiebehandlung [Wagner et al. 1996, Frossard et al. 1999 und 2002,
Bhagat et al. 2000 und 2002]. Nach einer Hyperthermiebehandlung konnten sowohl
im Pankreasgewebe, als auch in den Azinuszellen eine Reihe von HSPs
nachgewiesen werden, wobei im Gegensatz zu HSP32 der Effekt der Hyperthermie
auf die Expression von HSP70 besonders ausgeprägt ist. Da HSP70 unter normalen
Bedingungen nicht exprimiert wird und erst durch ein einwirkendes Stressereignis
gebildet wird, könnte man HSP70 den hauptsächlichen protektiven Effekt
zuzuschreiben, wobei HSP70, im Gegensatz z.B. zu HSP25/27, HSP32 oder
HSP60 im Pankreas das einzig nur unter Stressbedingungen exprimierte HSP zu
sein scheint [Wagner et al. 1996]. Das zytoprotektive Potential von HSP32 und
HSP70 wird durch die Hochregulation eines weiteren Hitzeschockproteins
(HSP25/27) unterstützt [Schäfer et al. 1999]. Ähnlich wie bei anderen
Hitzeschockproteinen, wird die Expression des schon genuin (konstitutiv)
vorliegenden HSP25/27 durch Stress und Hyperthermie reguliert und durch letztere
stark exprimiert. Somit könnte ein Synergismus von HSP70 und HSP27 für das
zytoprotektive Potential vorliegen [Schäfer et al. 1999, Schäfer und Williams 2000,
Kubisch et al. 2004] und somit scheint neben HSP32 und HSP70 auch HSP27 ein
protektives Potential gegenüber Stressereignissen im Rahmen der akuten
Pankreatitis aufzuweisen.
Kapitel 5 Zusammenfassung
71
5. Zusammenfassung Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass der Überexpression des
„Stressproteins“ und Antioxidans HSP32/HO-1 im Pankreasgewebe, während einer
akuten Pankreatitis, wohl eine Bedeutung als protektives Agens bei der
experimentellen akuten Pankreatitis zuzukommen scheint. Es wurde auf dem
Hintergrund der in der Einleitung beschrieben Mechanismen gezeigt, dass dieses
Enzymsystem eine protektive Rolle in Pankreaszellen durch eine pharmakologische
Prästimulation, d.h. Aktivierung vor Einsetzen der Schädigung, spielen kann. Das
Ausmaß der HO-1 Induktion durch oxidativen Stress und die weite Streuung des
Enzyms in verschiedenen Geweben, verbunden mit den biologischen Aktiviäten der
katalytischen Beiprodukte, CO, Eisen und Bilirubin, legen nahe, dass die HO-1
Induktion ein Teil der generellen Antwort auf oxidativen Stress ist und dass dieses
Enzym eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase
spielt.
Das antioxidative Potential von HO-1 mildert den Zellschaden und erhöht die
Widerstandsfähigkeit gegen oxidative Beschädigung. Es zeigt sich aus den
gewonnenen Beobachtungen, dass eine CoPP-Präkonditionierung ein potentes
Präkonditionierungsmodell, auch wegen der spezifisch pharmakologisch kontrollier-
baren Induktion, für die akute experimentelle Pankreatitis darstellt und dass es
durchaus einen Zusammenhang zwischen diesem und der dadurch hervor-
gerufenen verstärkten Expression von Hitzeschockproteinen und der Protektion des
Pankreas gibt.
Kapitel 6 Methoden
72
6. Methoden 6.1. Präkonditionierungen
6.1.1. Präkonditionierung durch Hyperthermie
Für die Hyperthermiebehandlung wurden die Versuchstiere narkotisiert. Für die
Einleitung der Anästhesie wurden die Sprague-Dawley Ratten in einem Glas-
Exsikkator mit 4% Isofluran (Forene®) in Sauerstoff über einen Isofluran Vaporisator
narkotisiert. Die eigentliche Narkose erfolgte unter Einsatz von Xylazin (Rompun®
2%) in einer Dosierung von 3 mg/kg Körpergewicht und Ketaminhydrochlorid
(Ketavet® 10%) in einer Dosierung von 40 mg/kg Körpergewicht. Die Verabreichung
des Narkotikums erfolgte intraperitoneal [Ploessl et al. 2004].
Die Tiere wurden anschließend in eine Heizdecke eingepackt und auf 42ºC
Körpertemperatur erwärmt. Die Kontrolle der Körpertemperatur erfolgte über ein
rektal appliziertes Digitalthermometer.
Im Abstand von etwa fünf Minuten erfolgte die intraperitoneale Verabreichung von 1
ml isotonischer Kochsalzsalzlösung über einen Butterfly, um das Dehydrieren der
Tiere zu vermeiden.
Die Ratten wurden nach erreichen der Körpertemperatur von 42ºC für 20 min
konstant bei dieser Körpertemperatur gehalten.
24 Stunden nach der Hyperthermiebehandlung erfolgte die Entnahme des Pankreas
wie nachfolgend unter Methoden 6.2. beschrieben [Wagner et al. 1996].
6.1.2. Präkonditionierung durch CoPP
Für die Anästhesie wurden die Ratten in einem Glasexsikkator mit 4% Isofluran in
Sauerstoff über einen Isofluran Vaporisator betäubt.
Die Metalloporphyrine wurden in Anlehnung an die Arbeiten von Amersi et al. und
Sato K et al. zur intraperitonealen Injektion gelöst und aliquotiert [Amersi et al. 1999,
Sato K et al. 2001].
Das in 0,2 M [NaOH] aliquotierte Metalloporphyrin (5 mg/ml) wurde lichtgeschützt
bei -80°C gelagert und zur intraperitonealen Gabe aufgetaut und mit 0,9% [NaCl]
auf 1 mg/ml bzw. 2,5 mg/ml verdünnt. Die intraperitoneale Gabe des
Cobaltprotoporphyrins beziehungsweise des Trägergemisches [NaOH/NaCl] in einer
Kapitel 6 Methoden
73
Kontrollgruppe, erfolgte 24 Stunden vor der Induktion einer akuten experimentiellen
Pankreatitis (s. Methoden 6.3.) und der darauf folgenden Pankreas- und
Serumentnahme (s. Methoden 6.2.). Die Bolusinjektion erfolgte mit verschiedenen
Mengenzusammensetzungen. Für die Kontrollgruppen bestand die
Injektionszusammensetzung nur aus der Verdünnung des CoPP [NaCl], bzw. dem
Trägergemisch [NaOH], um den jeweiligen Einfluss desselben zu dokumentieren.
CoPP selbst wurde in aufsteigenden Konzentrationen, alle im rechten oberen
Quadranten des Bauches, injiziert. Genauere Einzelheiten sind in Tabelle 6
zusammengefasst.
Tabelle 6 Verwendete Reagenzien in einzelnen Versuchsgruppen
Versuchstiere 0,9% NaCl NaOH CoPP
Kontrollgruppe 1 Ø Ø Ø
Kontrollgruppe 2 mg/kg KG Ø Ø
Kontrollgruppe 3 mg/kg KG 0,2 M Ø
Versuchsgruppe 1 mg/kg KG 0,2 M 5 mg/kg KG
Versuchsgruppe 2 mg/kg KG 0,2 M 10 mg/kg KG
Versuchsgruppe 3 mg/kg KG 0,2 M 20 mg/kg KG
6.2. Organentnahme des Pankreas zur Analyse der Proteinexpression
Für die Probengewinnung wurden männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem
Körpergewicht von 150-250 g verwendet und in einem Glas-Exsikkator mit Isofluran
für 1,5 min betäubt und anschließend durch Dekapitation getötet und ausgeblutet.
Das Blut wurde für die Enzymassay´s (s. Methoden 6.5.1. und 6.5.2.) aufgefangen
und gekühlt (4°C) bei 14000 rpm 15 min zentrifugiert. Das Blutserum wurde
abpipettiert und auf Eis gelagert, das Pelett verworfen. Anschließend erfolgte ein
Bauchschnitt, der Bauchraum wurde geöffnet und das Pankreas dargestellt. Es
folgte ein Foto des Organs in situ, die zügige Entnahme des Pankreas und das
Überführen in eine Schale mit gekühlter, physiologischer Kochsalzlösung 0,9%
[NaCl]. Nach erneutem Fotografieren erfolgten die Entfernung von Fettgewebe und
Lymphknoten, das Zerteilen in mehrere Stücke für verschiedene Proben, sowie die
Entnahme von anderen Organen (Leber, Niere, Herz).
Kapitel 6 Methoden
74
6.3. Induktion einer akuten experimentellen Pankreatitis Zur Induktion einer experimentellen akuten Pankreatitis wurden die Tiere über Nacht
nüchtern gelassen. Die Versuchstiere bekamen am Versuchstag stündlich eine
intraperitoneale Injektion, welche die supramaximale Konzentration an Caerulein
von 50 μg/kg KG enthielt. Caerulein, ein Decapeptid und Cholezystokinin Analogon,
verursacht bei supraphysiologischen Konzentrationen eine akute Pankreatitis in
Ratten [Lampel und Kern 1977]. Über einen Zeitraum von 5 Stunden wurde
stündlich ein Bolus nach Kurznarkose (4% Isofluran (Forene®) und Sauerstoff) in
das linke untere Abdomen injiziert, um eine sekretagog induzierte Pankreatitis
auszulösen.
Für die Herstellung einer Caerulein-Stock-Lösung von 1 mg/ml wurde lyophilisiertes
Caerulein in der entsprechenden Menge 0,9% [NaCl] gelöst, in Portionen aufgeteilt
und bei -20°C aufbewahrt. Für die Injektion wurde eine entsprechende Menge an
Caerulein mit einer Konzentration 50 µg/ml durch Verdünnung mit 0,9% [NaCl]
hergestellt.
In der Versuchsgruppe erfolgte die Gabe von Caerulein 24 Stunden nach der CoPP-
Präkonditionierung. In jeder Versuchsgruppe wurden bei Kontrolltieren als
Negativkontrolle eine vergleichbare isotonische Kochsalzlösung verwendet und i.p.
injiziert.
Eine Stunde nach der letzten erfolgten Caerulein- bzw. 0,9% [NaCl]-Injektion
wurden die Tiere durch Dekapitation getötet und dabei das Blut aufgefangen und bei
4°C und 14000 rpm für 15 min zentrifugiert. Das Serum wurde zur Bestimmung
pankreasspezifischer Enzyme verwendet.
Die Pankreata wurden entnommen (s. Methoden 6.2.) und es folgte eine
Gewichtbestimmung des Organs und die Bestimmung des Pankreasödems (s.
Methoden 6.4.).
Das Pankreas wurde in physiologischer Kochsalzlösung auf Eis in mehrere Stücke
geteilt, zum Teil sofort in flüssigem Stickstoff [N2] schockgefroren und bis zu ihrer
Weiterverwendung bei -80°C aufbewahrt oder sofort zur Probenerstellung
verwendet.
Es folgte eine Fixation in Formalin für histologische Schnitte, eine Aufnahme in 500
µl Homo-Puffer (s. Materialien 7.1.8.) für die SDS-Probenaufbereitung und eine
Kapitel 6 Methoden
75
Aufnahme von 0,05 g Gewebe in 1000 µl MOPS-Puffer (s. Materialien 7.1.7.) zur
Trypsinbestimmung.
6.4. Pankreasödem Für die Bestimmung des Pankreasödems wurde ein Stück Pankreasgewebe kurz
auf Filterpapier zum Abtrocknen gelegt, in ein zuvor ausgewogenes Reaktionsgefäß
gegeben, gewogen und anschließend bei 90˚C für 48h bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet. Danach erfolgt erneut die Bestimmung des Gewichts. Aus der
resultierenden Abnahme des Gewichts wurde der prozentuale Anteil des
Feuchtgewichts am Gesamtgewicht bestimmt.
6.5. Enzymaktivitätsmessungen
6.5.1. Enzymaktivitätsmessung von Amylase
Die α-Amylaseaktivität im Blutserum der Versuchstiere wurde mit dem Phadebas®
Amylase Test nach Herstellerangaben [Arbeitsanweisung, Phadebas Amylase Test,
1994, Pharmacia AB, Uppsala, Schweden] gemessen. Dieser ist ein Verfahren, das
sich zur schnellen und einfachen Aktivitätsbestimmung in einer Serumprobe eignet.
Er basiert auf der Verwendung von Stärke als Substrat, an die kovalent blaue
Farbstoffmoleküle gebunden sind. Das Substrat selbst ist aufgrund seiner
Quervernetzung in Wasser schwer löslich. Die Amylase spaltet das Substrat in
kleinere, in Wasser lösliche Fragmente. Die Konzentration an farbigen Fragmenten
und somit die Absorption der überstehenden Lösung, welche im Photometer durch
Extinktionsmessung bei 620 nm bestimmt wurde, steht in direktem Zusammenhang
mit der Amylaseaktivität, welche so, ausgehend von einer Kalibrierungsreihe,
abgeschätzt werden kann.
Zur Durchführung wurde eine Phadebas®-Tablette in 14 ml Amylase-Puffer unter
ständigem Rühren gelöst. Zu 10 µl einer Serumprobe der Versuchstiere bzw. 10 µl
Aqua dest. als Nullabgleichprobe, werden 1020 µl oben genannter Reagenz
gegeben, mit dem Vortex-Mixer gemischt und danach bei 37°C inkubiert.
Nach 10 min Inkubation wird die Reaktion durch die Zugabe von 300 µl Stopplösung
0,5 M [NaOH] (4°C) gestoppt. Jedes Tube wird mit 4 ml Aqua dest. verdünnt und
erneut im Vortex-Mixer gemischt.
Kapitel 6 Methoden
76
Nach der Zentrifugation für 5 min bei 4000 rpm werden 1000 µl des Überstands in
eine Küvette vorsichtig abpipettiert und die Absorption am UV-Spektrometer bei
einer Wellenlänge von 620 nm gegen den Nullabgleich (Blindwert) gemessen. Die
Aktivität bzw. die Aktivitätskonzentration kann aus der vorgegebenen Kalibrierkurve
abgelesen werden [Arbeitsanweisung, Phadebas Amylase Test, 1994].
6.5.2. Enzymaktivitätsmessung von Lipase
Die Messung der Lipasekonzentration (Aktivität) erfolgt mit dem Lipase-Kit (LIP) der
Firma Roche Diagnostics nach Herstellerangaben. Das Lipase Kit beruht auf einem
enzymatischen in vitro Test zur quantitativen Bestimmung von Lipase im Blutserum
der in vivo Versuche.
Lipasen sind Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von 47000 Dalton. Sie sind
definiert als Triglycerid-Hydrolasen, die die Spaltung von Triglyceriden zu
Diglyceriden mit nachfolgender Bildung von Monoglyceriden und Fettsäuren
katalysieren. Die Pankreaslipase gehört neben der α-Amylase seit langem zu den
differentialdiagnostisch wertvollsten klinisch-chemischen Parametern bei
Pankreaserkrankungen.
Tabelle 7 Reagenzien des enzymatischen Farbtests (nach Roche)
Reagenz 1 Puffer Colipase Cholat
Reagenz 2 Puffer Farbsubstrat Cholat
Lipasefarbsubstrat: 1,2-O-Dilauryl-rac-glycero-3-glutarsäure-(6-methylresorufin)-ester)
Die Methode nach Roche beruht auf der Spaltung eines mit Gallensäuren
emulgierten spezifischen Lipasefarbsubstrats, dem 1,2-O-Dilauryl-rac-glycero-3-
glutarsäure-(6-methyl-resorufin)-ester. Mit der eingesetzten Kombination aus
Gallensäuren und Colipase wird das Pankreasenzym spezifisch erfasst. Bei
Abwesenheit von Colipase wird praktisch keine Lipaseaktivität nachgewiesen. Die
Colipase aktiviert nur die Pankreaslipase, nicht andere im Serum vorkommende
lipolytische Enzyme. Durch den hohen Anteil an Cholaten ist sichergestellt, dass im
Serum vorkommende Esterasen aufgrund der hohen Grenzflächenladung nicht mit
dem Farbsubstrat reagieren können. Das Testprinzip beruht auf einem
enzymatischen Farbtest.
Kapitel 6 Methoden
77
Abb. 31 Reaktion des Lipase-Farbtests
Abb. 32 Berechnung der Lipaseaktivität
Kapitel 6 Methoden
78
Die Serumproben der Versuchstiere wurden nach Entnahme bei 14000 rpm bei 4°C
für 10 min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Zu 1 ml Reagenz 1 wird 10 µl
dieser Probe hinzugegeben und dann für 5 min bei 37°C gewärmt. Durch Zugabe
von 600 µl der Reagenz 2 wird die Reaktion gestartet und nach 1 min mit der
Messung begonnen.
Das Lipasefarbsubstrat wird unter katalytischer Einwirkung von Lipase in alkalischer
Lösung zu 1,2-O-Dilauryl-rac-glycerin und einem instabilen Zwischenprodukt, dem
Glutarsäure-(6-methylresorufin)-ester, gespalten. Dieser zerfällt in alkalischer
Lösung spontan in Glutarsäure und dem Farbstoff Methylresorufin (s. Abb. 31). Die
Farbintensität des gebildeten roten Farbstoffs, welcher sich direkt proportional der
Lipaseaktivität verhält, wird photometrisch bei einer Wellenlänge von 570 nm in
einem Zeitraum von 90 Sekunden gemessen.
6.5.3. Bestimmung von Trypsin in Pankreashomogenaten
Die Bestimmung der Trypsinaktivität erfolgte aus frischem Pankreasgewebe der
Versuchstiere, welches nach Entnahme homogenisiert wurde. Zur Bestimmung
wurde 0,05 g Pankreasgewebe in 1 ml eiskaltem (4°C) MOPS-Puffer aufgenommen
und mit einem Handhomogenisator mechanisch zerkleinert, um das Gewebe zu
schonen. Die Gewebetrümmer wurden bei 4°C mit 3000 rpm für 5 min
abzentrifugiert und der Überstand sofort für die Vermessung (Trypsin-Assay)
verwendet.
Die Messung der Aktivität erfolgte fluorimetrisch mit einem Luminesescenz
Spectrometer (Perkin Elmer) mit Hilfe des Substrates [Boc-Glu-Ala-Arg-MCA•HCl]
nach der Methode von Kawabata et al. [Kawabata et al. 1988, Hofbauer et al. 1998,
Saluja et al. 1999].
Kapitel 6 Methoden
79
Abb. 33 Fluorimetrische Umsetzung des Substrats durch Trypsin
Die Messung beruht auf einer Umsetzung des Substrates mit Trypsin, wobei das
oben genannte Substrat durch Trypsin, nicht aber durch Trypsinogen, gespalten
wird und wodurch eine fluoreszierende Verbindung entsteht. Die Messung erfolgte
bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm, die Lichtemission wurde bei einer
Emissionswellenlänge von 440 nm in Quarzküvetten, sowie der Anstieg der
Intensität der Fluoreszenz über die Zeit wurde alle 10 Sekunden nachfolgend über
einen Zeitraum von 300 s fluorimetrisch gemessen. Aus der Differenz der
Fluoreszenz zwischen zwei Messpunkten wurde dann die Steigung nach der
Geradengleichung ermittelt. Die Steigung entspricht dabei dem Quotienten aus dem
jeweiligen vertikalen (Zeitachse) und dem horizontalen Abstand (Delta F) zweier
beliebiger Punkte der Geraden und ist ein Maß für die Änderung entlang der
Regressionsgeraden. Die Gleichung, nach der die Steigung einer
Regressionsgeraden berechnet wird, lautet wie folgt:
Die Trypsinaktivität wurde aus der Steigung der Standardkurve errechnet (s.
Abschnitt 3.2.1.1., Abb. 18 und 19), welche vor der Vermessung der Proben mit
definierten Trypsinkonzentrationen (Standardkonzentrationen) erstellt wurde (s. Tab.
8).
Kapitel 6 Methoden
80
Tabelle 8 Darstellung der eingesetzten Standardtrypsinkonzentrationen
Kalibrierkonzentration 0,1 ng/ml 0,3 ng/ml 0,5 ng/ml 0,75 ng/ml
Menge der Verdünnung 10 µl 30 µl 50 µl 7,5 µl
Verdünnung 10 ng/ml 10 ng/ml 10 ng/ml 100 ng/ml
Trypsin wurde als Stockreagenz auf 10 mg/ml aliquotiert. Die Verdünnungen wurden mit TAB-Puffer (s. Materialien 7.1.7.) wie folgt erstellt:
1:100 Verdünnungen 100 μg/ml ► 1 μg/ml
1:10 Verdünnungen 100 ng/ml ►10 ng/ml
Das Substrat wurde in DMSO in einer Konzentration von 10 mM gelöst und die
Aliquots bei -20°C aufbewahrt. Für die Messung wurden 20 μM Substrat pro
Einzelmessung lichtgeschützt eingesetzt.
Zur Vermessung der Kalibriergeraden wurden 900 µl TAB mit 100 µl Substrat und
der entsprechenden Menge an Verdünnung angesetzt und vermessen.
Zur Vermessung der Proben wurden 700 µl TAB mit 100 µl Substrat und 200 µl
Probe angesetzt. Bei zu hoher Intensität der Probe wurde diese entsprechend mit
TAB für die Vermessung verdünnt und anschließend der Verdünnungsfaktor
hinterher mit in das Ergebnis eingerechnet, um die tatsächliche
Trypsinkonzentration in der Probe zu erhalten.
Der Proteingehalt wurde mit einem Protein-Assay (s. Materialien 7.1.3.) bestimmt
und die Trypsinaktivität in femtomol pro Milligramm Protein angegeben.
6.6. Western-Blotting zum Proteinnachweis
6.6.1. Erstellung von Zellproben
Zur Erstellung der Proben für das Western-Blotting wurde eine Gewebeprobe in 500
µl gekühltem Homopuffer mit pH 7,4 (s. Materialien 7.1.8.) und Proteaseinhibitor
aufgenommen und bei 4°C mit einem Polytron (Homogenisator) zerkleinert und
aufgeschlossen. Das Homogenisat wurde daraufhin mit einer Kühlzentrifuge bei
4°C, 14000 rpm für 10 min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Dieser
Schritt wurde zweimal wiederholt, wobei das Pellet jeweils verworfen wurde.
Anschließend erfolgte die Proteinquantifizierung aus dem klaren Überstand mit dem
Bradford Protein Assay.
Kapitel 6 Methoden
81
Die Proben für die Proteinelektrophorese wurden mit SDS-Puffer (Laemmli-Puffer)
angefärbt und mit Homogenisatpuffer auf eine Proteinendkonzentration von 2 mg/ml
aliquotiert.
6.6.2. Quantitative Proteinbestimmung
Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte photometrisch mit dem Bradford
Protein Assay [Bradford 1976, BioRad Protein Determination, Laboratory Manual
1979].
Sie beinhaltet die Zugabe von einem Dye-Reagenz zur Proteinlösung und
anschließender Messung bei 595 nm in einem Spektralphotometer. Die
Farbveränderungen entstehen als Antwort auf verschiedene Proteinkonzentrationen
und der Vergleich mit einer Standardkurve liefert eine relative Messung der
Proteinkonzentration.
Das Prinzip der Quantifizierung beruht auf einer bathochromen Verschiebung des
Absorptionsmaximums durch Bindung des Farbstoffs Coomassie Brillant Blau an
Proteine im sauren Milieu. Die Kalibriergerade wurde mit definierten BSA Standards
(0,2-0,8 mg/ml) angefertigt. Die Verdünnung des Reagenz und die Durchführung
erfolgten nach den Angaben des Herstellers.
Vor der Proteinelektrophorese wurden die Proteinproben denaturiert und negativ
geladen durch Zugabe von Laemmli-Puffer und anschließendem Kochen der
Proben für 5 Minuten (s. Methoden 6.6.3.).
6.6.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Proteinauftrennung erfolgte mittels denaturierter SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (s. Materialien 7.1.9.) nach der Methode von
Laemmli [Laemmli 1970]. Bei dieser Methode werden Proteine in Laemmli-Puffer
(SDS-Puffer) durch Erhitzen und Kochen für 5 min bei 95°C denaturiert und
anschließend in einem elektrischen Feld anhand ihres Molekulargewichtes
aufgetrennt. Das geschieht durch Anlagerung des negativ geladenen Detergens
SDS an die hydrophoben Regionen dieser Proteine. Dadurch erhalten die Proteine
eine stark negative Ladung, die ihre Eigenladung überlagert, so dass ihre
Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld nur von ihrem Molekulargewicht,
also der Größe, abhängig ist. Das Molekulargewicht lässt sich nach der Auftrennung
Kapitel 6 Methoden
82
mit einem Protein-Standard-Marker ermitteln (Prestained SDS-PAGE Standards,
Low Range, BioRad, München).
Die elektrophoretische Trennung erfolgte in 10%-SDS-Trenngelen, die mit
Sammelgelen überschichtet wurde (s. Tab. 9).
Das Trenngel wurde so in die Gelkammern eingefüllt, dass noch etwa 3 cm bis zur
oberen Glaskante frei blieben. Zur Ausbildung einer ebenen Oberfläche wurde die
Lösung sofort mit 0,1% SDS oder Methanol überschichtet. Nach Polymerisation
wurde das SDS vorsichtig abgeschüttet, das Trenngel mit dem Sammelgel bis zur
oberen Glaskante überschichtet und ein Gelkamm eingesetzt.
Tabelle 9 Darstellung der Zusammensetzung der Sammel- und Trenngele
Bestandteile Trenngel Sammelgel
Trenngelpuffer 4,0 ml (pH 8,8) Ø
Sammelgelpuffer Ø 2,5 ml (pH 6,8)
Aqua dest. 6,7 ml 5,9 ml
30% Polyacrylamid 5,3 ml 1,6 ml
10% APS 25,0 µl 60 µl
TEMED 12,5 µl 20 µl
Nach der Polymerisation des Sammelgels wurde der Gelkamm entfernt und die
Gelkammern sowie die Apparatur mit Laufpuffer (1x) aus SDS-Laufpuffer-
Stammlösung (10x) gefüllt. Danach wurden 10 µl (20 µg) der in Laemmli-Puffer
(SDS-Puffer) gelösten Proben sowie ein Protein-Standard-Marker in die
entsprechenden Taschen des Sammelgels pipettiert. Die Gele wurden in die
Elektrophoresekammer platziert und die Auftrennung der Proteine erfolgte für 75
min bei 150 V.
6.6.4. Transfer der Proteine auf Nitrozellulose
Anschließend wurden die im Gel befindlichen, nun immobilisierten Proteine mittels
Blotting-Technik in einer Blot-Kammer, welche Transferpuffer (1x) aus Transfer-
Puffer-Stammlösung (10x) (Blotting-Puffer) enthält, auf eine Nitrozellulosemembran
übertragen. Dabei wandern die negativ geladenen Proteine in einem elektrischen
Feld von der Kathode zur Anode und damit aus dem Gel auf die Membran. Die
Kapitel 6 Methoden
83
Temperatur während des Transfers wurde bei 4°C gehalten. Der Transfer erfolgte
bei 300 mA (80-130 V) für 60 min.
6.6.5. Immunchemischer Nachweis von Proteinen
Nach dem Transfer der Proteine wurde die Nitrozellulosemembran in Blocklösung
auf dem Kreisschüttler für 60 min und 30 U/min bei Raumtemperatur geblockt, um
unspezifische Bindungsstellen abzusättigen und anschließend mehrfach mit TBS-T
gewaschen. Anschließend wurde die Membran mit dem primären Antikörper in TBS-
T und 2% Top-Block bzw. Non-Fat Dry Milk inkubiert. Die Bindung des Antikörpers
an die Proteine erfolgte über Nacht bei 4°C auf einem Überkopfrotator. Am
nächsten Tag wurde die Membran zur Entfernung ungebundener Antikörper für 30
min bei Pufferwechsel in Waschlösung gewaschen. Anschließend erfolgte die
Inkubation mit dem gegen den Primärantikörper gerichteten und Meerrettich-
Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörper für 60 min bei Raumtemperatur. Es
schloss sich wiederum ein Waschschritt für jeweils 10 min in Waschlösung mit
dreifachem Pufferwechsel an. Danach erfolgte die ECL-Detektion (Amersham) nach
Angaben des Herstellers.
Das Prinzip der „verstärkten Chemilumineszenz Reaktion“ beruht auf einer
Lichtemission, welche anhand der Schwärzung von Röntgenfilmen semiquantitativ
ausgewertet werden kann. Zur ECL-Detektion wurden je 0,5 ml der Luminol
enthaltenen zwei ECL-Lösungen vermischt, auf die Proteinseite der Nitrozellulose
gegeben und für 1 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Membran wurde dann über verschiedene Zeiträume in einer Dunkelkammer auf
Röntgenfilme gelegt, welche anschließend entwickelt wurden.
Die korrekte Lage der erwarteten Signale auf den Röntgenfilmen wurde einerseits
durch Vergleich mit dem Protein-Standard-Marker auf der Membran und
andererseits durch das Mitlaufen einer Positivkontrolle, welche zur Überprüfung der
korrekten Höhe der Signale verwendet wurde, festgestellt.
6.6.6. Immunchemischer Nachweis von unterschiedlichen Proteinen auf gleicher Nitrozellulosemembran (Stripping)
Um auf einer Membran verschiedene HSPs bei gleichem Laufmuster mit
unterschiedlichen Antikörpern zum direkten Vergleich nachzuweisen, wurde das
„Membran-Stripping“ angewandt. Die jeweilige Membran wurde, nach der
Kapitel 6 Methoden
84
Übertragung der Signale des ersten primären Antikörpers auf Röntgenfilme, im auf
50°C erwärmten Stripping-Puffer (s. Materialien 7.1.9.) für 30 min bei leichter
Bewegung im Überkopfrotator gewaschen. So konnten die primären Antikörper
schonend entfernt werden, ohne die Proteine bzw. das Proteinverteilungsmuster
aus der Membran zu lösen. Danach erfolgte das zweimalige Waschen in TBST-
Puffer für jeweils 10 min und das erneute Blocken in Blocklösung auf dem
Kreisschüttler für 30 min und 30 U/min bei Raumtemperatur, um unspezifische
Bindungsstellen erneut abzusättigen und anschließend mehrfach mit TBS-T
gewaschen. Anschließend wurde die Membran mit dem neuen primären Antikörper
in TBS-T und 2% Top-Block bzw. Non-Fat Dry Milk inkubiert. Die weiteren Schritte
erfolgten dann wie oben beschrieben.
6.7. Histologische Untersuchungen
6.7.1. Hämatoxylin/Eosin-Färbung
Histologische Schnitte des Pankreas wurden am Institut für Pathologie des
Universitätsklinikums Großhadern in München unter Anleitung von Prof. Dr. med. J.
Diebold angefertigt und mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt. Die formalinfixierten
Gewebeproben wurden in einem Einbettautomaten über Nacht in Paraffin
eingebettet. Aus den Paraffinblöcken wurden 2 μm dicke Schnitte angefertigt und in
einem Färbeautomat mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt.
Die Schnitte wurden maschinell von einem Eindeckautomat mit Deckgläschen
versehen.
6.8. Statistische Auswertungen Die statistische Auswertung erfolgt mit Sigma Stat, Version 2.03 (SYSTAT Software
Inc., Chicago, IL), die graphischen Auswertungen und Abbildungen wurden mit
Sigma Plot, Version 7.0 durchgeführt.
Die Ergebnisse werden jeweils mit den Mittelwerten und den zugehörigen
Standardabweichungen standard error of means (SEM) dargestellt, sowie die Größe
der Versuchsgruppen jeweils auf der x-Achse neben den Graphen angegeben. Die
einzelnen Proben aus einem Experiment werden jeweils z.B. doppelt oder dreifach
gemessen und daraus ein Mittelwert (mean) gebildet. Bei mehreren Experimenten
werden dann die jeweils ermittelten Mittelwerte wiederum verwendet, um die
Standardabweichung zu ermitteln.
Kapitel 6 Methoden
85
Die Signifikanz der Ergebnisse wird mit dem one sample t-test oder dem student´s t-
test. Dabei wird p < 0,05 und p < 0,01 als statistisch signifikant betrachtet.
Kapitel 7 Materialien
86
7. Materialien 7.1. Chemikalien und Reagenzien
7.1.1. Narkose (Hyperthermie)
Isofluran, Forene® Abott, Wiesbaden
Ketaminhydrochlorid, Ketavet® (100 mg/ml)
Pharmacia & Upjohn, Erlangen
Xylazin, Rompun® 2% BayerVital, Leverkusen
7.1.2. Caeruleinpankreatitis
Caerulein (MW 1352.4) Sigma Aldrich, München
Cobalt(III)-Protoporphyrin IX Chlorid (MW 654.61)
Frontier Scientific, Lancashire, UK
Isotone Kochsalzlösung 0,9% [NaCl] Braun, Melsungen
Natriumhydroxid [NaOH] (MW 40.0) Sigma Aldrich, München
CoPP Lösung (Stock-Lösung)
CoPP gelöst in 0,2 M [NaOH] mit einer Konzentration von 5 mg/ml
pH-Titration auf pH 7,4
Zur Präkonditionierung: Verdünnt in isotoner Kochsalzlösung 0,9% [NaCl] auf 1 mg/ml
7.1.3. Protein-Bestimmung
Serum Albumin, bovines (BSA) Fluka, Biochemie, Buchs, Schweiz
Bradford Protein Assay (Dye Concentrate)
BioRad Laboratories, Hercules, CA
7.1.4. Hämatoxylin/Eosin-Färbung (Histologie)
Paraformaldehyd Merck Biosciences, Darmstadt
Kapitel 7 Materialien
87
PBS gepuffertes Formalin
Paraformaldehyd 4% in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (s. Materialien 7.1.8.)
ph-Titration auf pH 7,4
7.1.5. Amylase-Bestimmung
Natriumchlorid [NaCl] (MW 58.44) Sigma Aldrich, München
Natriumdihydrogenphosphat [NaH2PO4] (MW 119.98)
Fluka, Biochemie, Buchs, Schweiz
Natriumhydroxid [NaOH] (MW 40.0) Sigma Aldrich, München
Phadebas® Amylase Assay Phadebas Pharmacia, Uppsala, Schweden
Amylase Puffer
[NaCl] 0,05 M
[NaH2PO4] 0,02 M
mit Aqua dest. ad 500 ml
pH-Titration auf pH 7,4
Stopp-Lösung
[NaOH] 0,5 M
mit Aqua dest ad 250 ml
7.1.6. Lipase-Bestimmung
(LIP) Lipase Farb Assay Roche Diagnostics, Mannheim
7.1.7. Trypsin-Bestimmung
Calciumchlorid [CaCl2] (MW 110.98) Sigma Aldrich, München
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt
Kapitel 7 Materialien
88
Sucrose (MW 342.3) Sigma Aldrich, München
Magnesiumsulfat [MgSO4•7H2O] (MW 246.4)
Sigma Aldrich, München
MOPS [C7H15NO4S] (MW 209.3) Sigma Aldrich, München
Natriumchlorid [NaCl] (MW 58.44) Sigma Aldrich, München
Serum Albumin, bovines (BSA) Fluka Biochemie, Buchs, Schweiz
Substrat [Boc-Glu-Ala-Arg-MCA•HCl] Bachem, Heidelberg
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Trizma®-Base [C4H11NO3] (MW 121,1)
Sigma Aldrich, München
Trypsin (8.300 U/mg) Sigma Aldrich, München
MOPS-Homogenisatpuffer
Sucrose 250 mM
MOPS 5 mM
[MgSO4] 1 mM
mit Aqua dest. ad 100 ml
pH-Titration auf pH 6,5
Trypsin-Assay-Puffer (TAB-Puffer)
TrisBase 50 mM
[NaCl] 150 mM
[CaCl2] 1 mM
BSA 0,1 mg/ml
mit Aqua dest. ad 100 ml
pH-Titration auf pH 8,1
7.1.8. SDS-Probenaufbereitung
Benzamidin [C7H8N2•HCl] (MW 156.6) Sigma Aldrich, München
Kapitel 7 Materialien
89
β-Mercaptoethanol [C2H6OS] (MW 78.1) Sigma Aldrich, München
Brij 35, 30% Lösung Sigma Diagnostics, St.Louis, USA
Bromphenolblau Sigma Aldrich, München
DTT (D2-Dithiothreitol) (MW 154.2) Sigma Aldrich, München
EGTA [C14H24N2O10] (MW 380.2) Sigma Aldrich, München
Glycerol [C3H8O3] (MW 92.1) Sigma Aldrich, München
β-Glycerophosphat [C3H7PO6] (MW 172.1) Sigma Aldrich, München
Kaliumchlorid [KCl] (MW 74.6) Sigma Aldrich, München
Kaliumhydrogenphosphat [KH2PO4] (MW 136.1)
Sigma Aldrich, München
Natriumchlorid [NaCl] (MW 58.4) Sigma Aldrich, München
Natriumdodecylsulfat (SDS) BioRad Laboratories, Hercules, CA
Natriumhydrogenphosphat [Na2HPO4] (MW 142.0)
Sigma Aldrich, München
Natriumfluorid [NaF] (MW 42.0) Sigma Aldrich, München
Natriumorthovanadate [Na3VO4] (MW 183.9) Sigma Aldrich, München
Proteinase Inhibitor Cocktail Set Calbiochem, La Jolla, CA
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Trizma®-Base (MW 121.1) Trizma®-HCl (MW 157.6)
Sigma Aldrich, München
Proteinase Inhibitor Cocktail Set
AEBSF 4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonylfluorid
500 µM
Aprotinin 150 nM
E-64, Protease Inhibitor 1 µM
EDTA, Dinatrium 0,5 mM
Leupeptin, Hemisulfat 1 µM
Kapitel 7 Materialien
90
Homogenisatpuffer (Homo-Puffer)
Glycerophosphat 50 mM
Benzamidin 2 mM
Brij 35, 30% Lösung 0.03%
Glycerol 5%
EGTA 1 mM
[Na3VO4] 2 mM
[NaF] 1 mM
DTT 1 mM
β-Mercaptoethanol 0,1%
mit PBS pH 7,4 ad 50 ml
Vor Gebrauch: Proteinase Inhibitor Cocktail Set (100 µl / 10 ml) hinzugeben
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
[NaCl] 0,14 M
[KCl] 2,7 mM
[Na2HPO4•7H2O] 10 mM
[KH2PO4] 1,8 mM
mit Aqua dest. ad 1000 ml
pH-Titration auf pH 7,4
Laemmli-Puffer (SDS-Puffer)
TrisHCl 0,2 M (pH 6,8)
Glycerol 40%
SDS 8%
β-Mercaptoethanol 10%
Bromphenolblau 0,2%
Kapitel 7 Materialien
91
7.1.9. Western-Blotting
10% Ammoniumperoxidsulfat (APS) Sigma Aldrich, München
30% Acrylamid / Bisacrylamid Solution BioRad Laboratories, Hercules, CA
β-Mercaptoethanol [C2H6OS] (MW 78.1) Sigma Aldrich, München
Blotting grade Blocker (Non-Fat dry milk) Sigma Aldrich, München
Bromphenolblau Sigma Aldrich, München
DTT (D2-Dithiothreitol) (MW 154.3) Sigma Aldrich, München
ECL®-Western Blotting Detection System Amersham Biosciences, UK
Glycin [C2H5NO2] (MW 75.1) Sigma Aldrich, München
Glycerol [C3H8O3] (MW 92.1) Sigma Aldrich, München
Kaliumchlorid [KCl] (MW 74.56) Sigma Aldrich, München
Methanol [CH3OH] Merck Biosciences, Darmstadt
Natriumchlorid [NaCl] (MW 58.44) Sigma Aldrich, München
Prestained SDS-PAGE Standards BioMol, München
Protein-Standard-Marker BioRad Laboratories, Hercules, CA
Natriumdodecylsulfat (SDS) BioRad Laboratories, Hercules, CA
N,N,N´,N´–Tetramethylethylendiamin TEMED
BioRad Laboratories, Hercules, CA
Salzsäure [HCl] Merck Biosciences, Darmstadt
Top-Block Fluka Biochemie, Buchs, Schweiz
Trizma®-Base (MW 121.1) Trizma®-HCl (MW 157.6)
Sigma Aldrich, München
Polyoxyethylene-Sorbitan Monolaurate Tween® 20 (MW 216.6)
Sigma Aldrich, München
Trenngelpuffer
TrisBase 1,5 M
SDS 0,014 M
mit Aqua dest ad 250 ml
Kapitel 7 Materialien
92
pH-Titration auf pH 8,8
Sammelgelpuffer
TrisBase 0,5 M
SDS 0,014 M
mit Aqua dest. ad 250 ml
pH-Titration auf pH 6,8
SDS-Laufpuffer-Stammlösung
TrisBase 25 mM
Glycin 0,2 M
SDS 10 mM
mit Aqua dest. ad 1000 ml
Transfer-Puffer-Stammlösung (Blotting-Puffer)
TrisBase 25 mM
Glycin 0,2 M
SDS 30 mM
Methanol 5 M
mit Aqua dest. ad 1000 ml
Tris-gepufferte Kochsalzlösung (Tris buffered saline, TBS) + Tween (TBS-T)
TrisBase 25 mM
[NaCl] 150 mM
[KCl] 2,5 mM
Tween® 20 0,25%
mit Aqua dest. ad 1000 ml
pH-Titration auf pH 7,5
Kapitel 7 Materialien
93
Blocklösung
TBS-T
Non-Fat Dry Milk / Top Block 5%
Waschlösung
TBS-T
Non-Fat Dry Milk / Top Block 2%
Strippingpuffer
β-Mercaptoethanol 100 mM
SDS 20 mM
ad 100ml TrisHCl
62,5 mM
pH-Titration auf pH 6,8
Antikörper und Proteine
Anti-HSP25 [SPA-801]
monoklonaler Kaninchen IgG-Antikörper
StressGen Biotech, Victoria, CA
Anti-Hämoxygenase-1(Anti-HSP32) [OSA-150] polyklonaler Kaninchen IgG-Antikörper
StressGen Biotech, Victoria, CA
Anti-Hämoxygenase-1(Anti-HSP32) [OSA-111] monoklonaler Maus IgG-Antikörper
StressGen Biotech, Victoria, CA
Anti-HSP60 [SPA-806] monoklonaler Maus IgG-Antikörper
StressGen Biotech, Victoria, CA
Anti-HSP70 [SPA-810] monoklonaler Maus IgG-Antikörper
StressGen Biotech, Victoria, CA
Anti-Kaninchen (Meerrettich-Peroxidase gekoppelter Antikörper) monoklonaler Esel IgG-Antikörper
Amersham Biosciences,Freiburg
Anti-Maus (Meerrettich-Peroxidase gekoppelter Antikörper) monoklonaler Ziege IgG-Antikörper
Amersham Biosciences,Freiburg
Kapitel 7 Materialien
94
Recombinantes [von Ratten] [SPP-730] HSP32 (Hämoxygenase-1)
StressGen Biotech, Victoria, CA
7.2. Technische Geräte und Materialien
7.2.1. Technische Geräte
Analysenwaage (Sartorius research) Sartorius, Göttingen,
Reagenzwasser System (Aqua dest.) Millipore, Molsheim, Frankreich
Blot-Kammer Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA
Elektrophorese-Apparatur Amersham Biosciences, UK
Hamiltonspritze Hamilton Company, Rena, Nevada, USA
Homogenisator Schütt Labortechnik, Göttingen
Inkubator GFL 1083 GFL, Burgwedel
Isofluran Vaporator 19.3 Dräger, Lübeck
Kühlzentrifüge 541712 Eppendorf, Hamburg
Luminesescenz Spectrometer LS50B Perkin Elmer Instruments, Rodgau
Magnetrührer RTC basic IKA Werke, Staufen
MiniSpin-Zentrifuge Eppendorf, Hamburg,
Minigelapparatur Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA
ph-Meter InoLab pH Level 1 WTW, Weilheim
Pipetten Eppendorf, Hamburg
Polytron Homogenisator Kinematica AG, Littau/Luzern, Schweiz
Power Supply (Elektrophorese) Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK
Schüttelblock Heidolph, Kelheim
Spektralphotometer Ultrospec 3100 pro Amersham Pharmacia Biotech Buckinghamshire, UK
Überkopfrotator Rocky 3D Fröbel Labortechnik, Lindau
Vortex Mixer 2020 neo Lab
Zentrifuge EBA 12R Hettich Zentrifugen, Bern, Schweiz
Kapitel 7 Materialien
95
7.2.2. Materialien
Einmal-Küvetten, UV Sarstedt, Nümbrecht,
Eppendorf-Röhrchen Eppendorf, Hamburg
Film (Hyperfilm®) Amersham Pharmacia Biotech, UK
Gel-Blotting Papier Schleicher & Schuell Bioscience, Dassel
Halbmikro-Fluoreszenz-Küvetten Hellma, Mülheim
Nitrozellulosemembran Protran® Schleicher & Schuell Bioscience, Dassel
Petrischalen Becton Dickinson Labware, Le Pont De Claix, Frankreich
Quarzglas SUPRASIL® Hellma, Mülheim,
Tubes (Falcon®) Becton Dickinson Labware, Le Pont De Claix, Frankreich
7.3. Versuchstiere Für die Präparation des Pankreas, die Präkonditionierungen, sowie die
Hyperthermie- und Caeruleinversuche wurden männliche Sprague-Dawley Ratten
(Charles River Wiga, Sulzfeld, D) mit einem Körpergewicht von 150-250 g
verwendet.
Die Tiere wurden in vollklimatisierten Ställen mit einem konstanten 12h Licht-
Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Futter (Ssniff Soest, Deutschland)
und entsprechend den Bedingungen des Tierschutzgesetzes gehalten. Vor der
Durchführung von Experimenten wurden die Tiere über Nacht nüchtern gehalten mit
freiem Zugang zu Wasser.
Die Tierversuche waren von der zuständigen Behörde genehmigt (AZ: 211-2531-
34/2001).
Kapitel 8 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
96
8. Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Abb. Abbildung(en)
Ag Antigen
Ak Antikörper
APS Ammoniumperoxidsulfat
ARDS adult respiratory distress syndrome
bp Basenpaare
BPA Bradford Protein Assay
BSA Rinder Serum Albumin
°C Grad Celsius
CCK Cholezystokinin
CO Kohlenmonoxid
CoPP Kobalt (Co)-Protoporphyrin
d Tag(e)
DIC Disseminierte intravasale Gerinnung
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DTT Dithiothreitol
ECL Enhanced chemiluminescence
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz
ERCP Endoskopische retrograde Cholangiopankreatographie
f femto
g Gramm
h Stunde(n)
HO Hämoxygenase
HRP Horseradish Peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)
HSRE heat shock response element
HSF heat shock factor (Hitzeschockfaktor)
Kapitel 8 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
97
HSP Hitzeschockprotein; Synonym: Stressprotein
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
i.p. intraperitoneal
IRS Ischämie-Reperfusions-Schaden
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
KG Körpergewicht
µg Mikrogramm
µm Mikrometer
M Molar [mol/l]
min Minute
ml Mililiter
MOPS 3-(N-Morpholino) propansulfonic acid
MW Molekulargewicht
n Anzahl der verwendeten Versuchstiere/Versuchseinheit
NK Negativ Kontrolle
PAGE Polyacrylamid Gel Elektrophorese
PBS Phosphat gepufferte Kochsalzlösung
Pos.Kontr. Positiv Kontrolle (Western Blotting)
s Sekunde
s. siehe
SDS Natriumdodecylsulfat (Sodium dodecyl sulphate)
SEM standard error of means (Standardabweichung)
Sn Zinn
spez. spezifisch(en)
Tab. Tabelle
TAB Trypsin Assay Buffer
TBS Tris buffered saline
Kapitel 8 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
98
TEMED Tetramethylethylendiamin
TNF Tumor-Nekrose-Faktor
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
rpm rounds per minute
pH negativer dekadischer Logarithmus der Konzentration von Hydroniumionen [H3O+]
RT Raumtemperatur
U Unit, Enzymspezifische Angabe
U/min Umdrehungen pro Minute
UV Strahlung im ultravioletten Bereich
V Volt
Vgl. / vgl. Vergleich / vergleiche
Zn Zink
Kapitel 9 Literaturverzeichnis
99
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Kapitel 10 Danksagung
121
10. Danksagung Ich möchte Herrn Prof. Dr. med. Andreas Wagner herzlich danken für die
interessante und herausfordernde Aufgabenstellung, die jederzeit gewährte
freundliche Unterstützung und die hervorragenden Möglichkeiten des
selbstständigen wissenschaftlichen Arbeitens, sowie der sehr guten Betreuung der
Arbeit. Seine kritische Auseinandersetzung mit meiner Arbeit, wie auch die
motivierenden Diskussionen und Gespräche waren mir eine große Hilfe und haben
den Fortgang der Arbeit entscheidend beeinflusst.
Mein Dank gilt Herrn PD Dr. med. Claus Schäfer, der mich in meiner Arbeit sehr
unterstützt und immer ein offenes Ohr für Anliegen aller Art hatte. Seine zahlreichen
Anregungen und Tipps haben mir bei der Fertigstellung dieser Arbeit sehr geholfen.
Bei Frau Dr. Irmgard Plössl und Frau Dr. med. Constanze Kubisch möchte ich mich
für die Einarbeitung und die Einweisung in experimentelle Techniken im Labor, die
hervorragende Zusammenarbeit und die anregenden Diskussionen, die freundliche
und geduldige Unterstützung herzlich bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit
wesentlich mit beigetragen haben. Ein weiterer Dank gilt Frau Claudia Jäger für ihre
Hilfsbereitschaft beim experimentellen Arbeiten.
Mein Dank gilt allen Kollegen des Arbeitskreises für ihre Hilfsbereitschaft und für
das überaus angenehme Klima im Labor, Herrn Prof. Dr. med. Joachim Diebold für
die Hilfe bei der Anfertigung histologischer Präparate und der Deutschen
Forschungsgesellschaft für die finanzielle Unterstützung der Arbeit.
Des Weiteren möchte ich mich bei Sebastian Fiedler und Tobias Brandt für Ihre
Unterstützung bei technischen und graphischen Problemen, sowie all meinen
Freunden für ihre Hilfe, Aufmunterung und Unterstützung, nicht nur während der
Doktorarbeit, bedanken.
Danken möchte ich ganz besonders auch meiner Familie, vor allem meinen Eltern,
für die anhaltende Unterstützung, die mir das Medizinstudium und diese
Doktorarbeit erst ermöglicht haben und auf deren Rückhalt ich jederzeit bauen
konnte.
Kapitel 11 Lebenslauf
122
11. Lebenslauf Zur Person
Tobias Gebhardt
geboren am 09.08.1974 in Wiesbaden
ledig
Schulausbildung
1980-1984 Grundschule in Homburg/Saar
1984-1985 Gymnasium Vaterstetten bei München
1985-1992 Gymnasium Oberalster, Hamburg
1992-1994 Gymnasium Adolfinum, Bückeburg, Niedersachsen Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Wehrdienst
1994-1996 Wehrdienst im Gebirgsjägerbataillon 233 in Mittenwald, Bayern Ausbildung im Sanitätsdienst und in der Bergrettung
1996 Erfolgreicher Abschluss an der Offizierschule des Heeres in Hannover
Universitäre Ausbildung
1997-2004 Studium der Humanmedizin an der LMU, München
Aug. 2000 Ärztliche Vorprüfung an der LMU
Aug. 2001 Erstes Staatsexamen an der LMU
Sep. 2003 Zweites Staatsexamen an der LMU
Nov. 2004 Drittes Staatsexamen an der LMU
Ärztliche Prüfung (Gesamtnote 2,33) und Approbation als Arzt
Beruflicher Werdegang
seit Feb. 2005 Assistenzarzt in der Allgemein- und Viszeralchirurgie, Akademisches Lehrkrankenhaus der LMU, Klinikum München-Neuperlach