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Structure cristallographique d’une jonction de Holliday, intermédiaire principal de la recombinaisonStructure cristallographique d’une jonction de Holliday, intermédiaire principal de la recombinaison
Jérémie Pitona, Odile Lecompteb, Olivier Mauffretc, Olivier Pochb, Claudine Mayera aCRC Pôle 4 Equipe 12 - Site Pitié-Salpêtrière, UMRS 872 INSERM, 91 bd de l'Hôpital, 75013 Paris.
bIGBMC, Département de Biologie et Génomique Structurales, IGBMC, 1 rue Laurent Fries, 67404 Illkirch.cLBPA, UMR 8113 CNRS, Institut Gustave Roussy, 39 rue Camille Desmoulins, 94805 Villejuif Cedex.
E-mail: [email protected]
Remerciements : Nous remercions l’équipe de cristallographie du laboratoire UMRS 872 INSERM et en particulier Vanessa Delfosse et Stephanie Petrella, ainsi que Michel Pirrochi de la ligne FIP-BM30A pour son aide lors des collectes de données.
Forme B, Forme HJ ?Forme Modèle
B
HJ
1ZFC
1ZF3 OK Forme Jonction de Holliday
Remplacement Moléculaire
La recombinaison homologue est impliquée dans de nombreux processus cellulaires. Décrite à l’origine comme responsable de la diversité génétique en créant de nouvelles combinaisons de gènes, la recombinaison possède des rôles très importants dans la ségrégation des chromosomes, l’intégration virale, la stabilité et le maintien du génome… L’étape principale de la recombinaison homologue est la formation d’un complexe formé de quatre brins d’ADN appelé jonction de Holliday qui conduit à deux doubles hélices d’ADN recombinées. Il est donc nécessaire de caractériser cette structure quaternaire d’ADN pour comprendre les causes de leurs formations ainsi que le mode de reconnaissance avec les protéines impliquées dans la recombinaison, telles que les recombinases ou les résolvases. Dans le cadre d’études de relations structure-fonction d'une famille d'ATPases atypiques d'archaea [1] (dénommées A5+) possédant un domaine résolvase et jouant ainsi un rôle potentiel dans la recombinaison, nous avons résolu la structure d’un oligonucléotide amphimorphique, c'est-à-dire qui cristallise sous plusieurs formes (forme A, forme B ou jonction de Holliday).
Des travaux antérieurs montrent que le passage d’une forme à une autre est dépendant de la séquence et de la concentration en ions. L’oligonucléotide CCGATATCGG cristallise en forme B dans le groupe d’espace P212121 en présence de 5 mM CaCl2, et en forme jonction de Holliday dans le groupe d’espace C2 avec 100 mM CaCl2 [2]. Des cristaux de cet oligonucléotide ont ici été obtenus en présence de 30 mM MgCl2, conditions jamais décrites dans la littérature. L’oligonucléotide cristallise dans le groupe d’espace C2 avec les paramètres de maille a = 64,26 Å, b = 24,37 Å, c = 37,97 Å, β = 111,39°. Nous présentons ici la structure résolue à 2.3 Å en forme jonction de Holliday ainsi qu'un modèle d'interaction avec les protéines A5+.
Résumé
Domaine Domaine d’hydrolyse d’hydrolyse
de l’ATPde l’ATP
Domaine Domaine de liaison de liaison à l’ADNà l’ADN
Domaine résolvase de Domaine résolvase de jonction de Hollidayjonction de Holliday
Jonction de Jonction de HollidayHolliday
ADN ADN
forme Bforme B
Proposition d’un modèle d’interaction
AXE 2
En cours d’affinement…
Affinement : CNSAffinement : CNS
Unité biologiqueUnité biologique
R = 0,22 Rfree = 0,32
Unité asymétriqueUnité asymétrique Symétrique généré par Symétrique généré par l’axe 2 cristallographiquel’axe 2 cristallographique
Unité biologique
=
Influence des conditions de Influence des conditions de cristallisationcristallisation
Modifications structurales par rapport à 1ZF3
Effets des ions Mg2+ ?
Affinement et structure de HJ_Mg
1ZF3HJ_Mg
Oligonucléotide amphimorphique : cristallise sous plusieurs formes
forme A, forme B, jonction de Holiday
Influence de la séquence... … et de la nature des ions
CCGATATCGG
?Forme Forme
HJHJ
1ZF31ZF3
Forme HJ
1ZF4
Forme Forme BB
1ZFC1ZFC
50 mM cacodylate de sodium, 1 mM spermine, 30 mM MgCl2 et 30 % MPD
Conditions de cristallisation
+ Mg2+
+ Ca2+
(100mM)+ Ca2+
(5mM)
Problématique
+ Na+
La recombinaison homologueIntermédiaire de la recombinaison : Jonction de Holliday, structure quaternaire d’ADN
Protéines moteurs : permet à la jonction de glisserProtéines résolvases : hydrolyse la jonction de Holliday libérant les 2 hélices recombinées
Intermédiaire de la recombinaison, jonction de Holliday
Forme « open X »
2 Formes en solution
Jonction de Holliday
Interactions protéines - ADN :- Protéines tetramériques reconnaissent la forme « open X »Ex : RuvAB, intégrase, etc…
- Protéines dimériques reconnaissent la forme « stacked X »Ex : Résolvase, endonucléase, etc…
Domaine Domaine d’hydrolyse de d’hydrolyse de l’ATP l’ATP (280 aa)
Domaine AAA+Domaine AAA+
Domaine de liaison à l’ADN Domaine de liaison à l’ADN Winged Helix Winged Helix (100 aa)
Domaine WHDomaine WH C
Domaine Domaine Résolvase de Résolvase de jonction de jonction de HollidayHolliday (120 aa)
Domaine Domaine RésolvaseRésolvaseN
Organisation en domaines des protéines de la famille A5+
Interaction avec jonction de Holliday en forme « stacked X », rôle dans la recombinaison
Études structurales d’une jonction de HollidayDans le cadre d’études des relations structure – fonction des protéines de la famille A5+, nous avons résolu la structure d’un oligonucléotide en forme Jonction de Holliday.
Forme Open X ou Stacked X ?
Seule forme cristallisable sans protéine
Références bibliographiques :[1] Lecompte O., Ripp R., Puzos-Barbe V., Duprat S., Heilig R., Dietrich J., Thierry J.-C., Poch O., Genome Res., 2001, 11, 981-993.[2] Hays F.A., Vargason J.M., Ho, P.S. Biochemistry, 2003, 42, 9546-9597.
Statistiques de la collecte
27,4 (29,8)
2845 (428)
50-2.2 (2.3-2.2)Résolution (Å)0.974Longueur d’onde (Å)
a = 64.36, b =24.37, c = 37.97 = 111.39
Paramètres de maille (Å,°)
C2Groupe d’espaceBM30A (ESRF)Source des rayons X
No. Mol. dans U.A.
Rsym† (%)
I/(I)Redondance
Complétude (%)
No. reflexions unique
No. d’observations
11,91 (7,4) 4.1 (4.1)96,9 (93,4)
11723 (1760)
Forme « stacked X »
1 monomère
CCGATATCGGCCGCTAGCGGCCGGTACCGGTCGGTACCGACCGGCGCCGGCCAGTACUGGCCGGGCCCGGCCGGGACCGG
23 structures de type jonction de Holliday dans la NDB
8 séquences non redondantes
Pu : Base purine Py : base pyrimidine