Structure et polymorphisme des lipides: Étude par diffraction des rayons X du système formé de lipides de mitochondries de coeur de boeuf et d'Eau

$Page 1: Structure et polymorphisme des lipides: Étude par diffraction des rayons X du système formé de lipides de mitochondries de coeur de boeuf et d'Eau$
J. Mol. Biol. (1967) 27, 303322

Structure et Polymorphisme des Lipides : fitude par Diffraction des Rayons X du Systkme form& de Lipides de

Mitochondries de Coeur de Boeuf et d’Eau

T. Gum-Ibmmcm, E. RIVAS ET VITTORIO LUZZATI

Labordoire de G&nktique Physiologique, C.N.R.S. 91-Gif-sur- Yvette, France

(Received 20 Februury 1967)

A lipid preparation from beef heart mitochondria, carefully extracted and analysed, has been used for the X-ray d.i&action study of the structure of the phases present in the lipid-water system.

At high temperature, under conditions in which the conformation of the paraffin chains is “liquid”, two phases are observed. One, found at very low water content, is formed by a two-dimensional hexagonal array of narrow water channels, embedded in a paraffin matrix; this type of hexagonal structure is common in lipid-water systems involving phospholipids of biological origin. The other phase is lamellar, formed by equidistant lipid layers of constant thickness, separated by water layers the thickness of which varies from 8 to over 250 A, according to the water content of the system. The distribution of the electron density in the lipid lamellae has been analysed quantitatively, making use of the fact that, for this type of structure, the amplitudes of the reflections are at all concentrations proportional to the Fourier transform of an isolated lamella. As the temperature is lowered gradual organization of the paraffin chains takes place, without change in the thickness of the lipid lamellae. This phenomenon is interpreted by assuming that the centre of the pan-&n leaflet is occupied by au ordered layer, involving a fraction of the parathn chains, which are organized over part of their length: the conformation of the rest of the chains is assumed to remain “liquid”.

At still lower temperatures, two other lamellar phases are observed. One is formed of identical lipid leaflets, each containing a double parffi layer, in which the chains are stiff (but randomly oriented around thin long axes) and organized in a two-dimensional hexagonal lattice. The other phase consists of an alternate sequence of two types of lipid leaflet: one is the low-temperature form just described, the other is the high-temperature lamellar form, with part of the chains disordered. The agreement of the observed and calculated structure factors provides strong confkmation of the two models.

The phase transitions observed in this system certainly involve a segregation of the different lipid molecules. This phenomenon is discussed with reference to the known chemical heterogeneity of the lipids of this system.

1. Introduction Les lipides sont l’un des composants principaux d’une famille d’organites cellulaires (membranes, chloroplastes, mitochondries, recepteurs sensoriels, etc.) dont la fonction biologique est Btroitement li&e & une organisation physique particuli&ement ordonnee. Bien que le role des lipides dans la formation de ces structures ne soit guere contest& leur fonction precise est encore l’objet de conjectures: certains pensent que lea lipides

303

304 T. GULIK-KRZYWICKI, E. RIVAS ET V. LUZZATI

constituent essentiellement des barrieres passives de diffusion, d’autres leur attribucnt des for&ions biologiques plus aetives.

Nous avons et& amen& a nous interesser a ce probleme a la suite de l’etudc, par diffraction des rayons X, de systemes lipide-eau. Les resultats, obtenus d’nbord avec les savons et les detergents (Luzzati, Mustacchi, Skoulios & Husson, 1960; Husson, Mustacchi & Luzzati, 1960) et Btendus ensuite a des systemes dun inter&t biologique plus direct (extraits de cerveau, Luzzati & Husson, 1962: membranes d’erythrocytes, Husson & Luzzati, 1963; lecithine, phosphatidyl ethanolamine, sphingolipides, Reiss-Husson, 1967) nous ont conduits a formuler quelques hypotheses sur le role physiologique que pourraient jouer des transitions polymorphiques des lipides au sem des membranes (Luzzati & Husson, 1962; Luzzati, Reiss-Husson, Rivas & Gulik-Krzywicki, 1966; Reiss-Husson & Luzzati, 1966; Luzzati, 1967).

Confront& ainsi avec le probleme de la structure des membranes, nous l’avons aborde par l’etude cristallographique de systemes modele. Les plus simples, parmi ces modeles, sont form& de lipides et d’eau; cc sont en outre les lipides les plus simples que nous avons Btudies jusqu’ici. Avant d’aborder des systemes plus complexes, nous nous sommes poses la question de savoir dans quelle mesure les proprietes des differentes phases des systemes lipide-eau dependent de la composition chimique. Dans ce but il nous a paru opportun d’etudier quelques systkmes de composition voisine de cede qu’on rencontre in situ, en maintenant les parametres chimiques sous un contr6le plus rigoureux que nous ne l’avions fait preckdemment. Nous decrivons dans ce memoire les resultats obtenus avec un extrait lipidique de mitochondries de coeur de boeuf, dont la composition chimique est d&rite en Appendice.

2. Analyse des Structures

s = 2 sirqh

h, k, 1 dv M

C

- - 017 vo

+ = p+e, (1-c)/B, cl-1 x

a

s = (2/&a (h2+k2-hk)1’2

d 0, = l/d

(a) Notation et formules

espacement reciproque (A-l); 28 est l’angle de diffraction, h est la longueur d’onde indices des reflexions nombre d’Avogadro masse molaire des lipides; dans un melange M est la moyenne en poids concentration pond&ale (lipide/lipide + eau) volumes specifiques partiels des lipides et de l’eau (cm3g-l) concentration volumetrique surface moyenne dont dispose chaque groupe polaire b l’interface eau-lipide (A2).

Phase hexagonale parametre de la maille hexagonale (A) espacement des raies de diffraction (A-l)

Phase lamellaire

periode de la maille a une dimension (A) espacement des raies de diffraction (A-l)

X-RAY DIFFRACTION IN LIPID-WATER SYSTEM 305

a, = a+ Bpaisseur de la couche lipidique fictive, qu’occupent les lipides d’une maille, sans eau (A)

a, = a-a, Bpaisseur de la couche d’eau (A)

N, = a,mo-24/m, nombre de moldcules de lipicle par unit& de surface d’une maille Bldmentaire (mol6cules par A’)

S = 2/N,

(b) Con&l&-ations &or&e G&&-al

Lorsqu’on abode l’&ude, par diffraction des rayons X, d’un syst&me B, plusieurs composants, il convient de reconnaitre, avant tout, les diff&entes phases, et de d&miter leurs domaines d’existence (ce qui Bquivaut formellement A construire le diagramme des phases), pour entreprendre ensuite la &termination des structures.

Plusieurs syst&mes lipide-eau ont 6th Btudi& au cows des clerdres an&es: le nombre et la vari& des phases sont remarquable. La structure de ces phases a BtB pas&e en revue dcemment (Luzzati, 1967); l’analyse des Aultats a permis de clegager quelques principes d’ordre g&n&al. Nous rappellerons brievement ci-dessous ceux de ces principes auxquels nous nous &f&rerons dans ce m&moire.

(c) Organisation ci courte Cchelle: conformation des ch&aes parafiniques Dans les syst&mes ddcrits ici les chaines paraffiniques adoptent cliff&rents types de

conformation. Les deux types extremes sont les suivants. La conformation chuotique, de type liquide, qui se caract&ise par la pdsence, clans

les diagrammes de diffraction des rayons X, d’une bade diffuse, autour de s = (4,5 A)-1, analogue A la bade des paraffines liquides. Le d&ode des chaines paraffiniques est confirmd par le fait que certaines dimensions des Bldments de structure diminuent lorsque la temperature s’&ve (Fig. 6), selon une loi dont l’interprdtation thborique a t%B don&e ailleurs (Luzzati et al., 1960; Luzzati & Husson, 1962; Luzzati, 1967).

La structure rigide, iL symdtrie hexagonale, caract&i&e par la prksence, clans la region comprise entre s = (3 A) - l et s = (5 A) -I, d’une seule raie fine, voisine de s = (4,2 A)-l. Cette raie a BtB attribde par Miiller (1932) aux paraffincs rigides et &ides, orientdes au hasard autour de leur axe, organides latdralement selon un rdseau hexagonal iL deux dimensions. Vincent & Skoulios (1966) ont mis en Qvidence ce type de structure clans les savons. Nous avons confirm4 ici la syndtrie hexagonale par l’observation des raies B s = &(4,2 8)-l et A s = 2(4,2 A)-l (phase L/3, Planche I(c)). Un param&re relatif B ce mode d’organisation, auquel nous now Gfirrerons dans la suite, est la surface dent dispose chaque chaine sur le plan perpendiculaire B son axe, c’est-&-dire la surface de la maille Blkmentaire L deux dimensions: ,T = (4,2)a 2/& = 20,4 A2.

(cl) Organisation i2. grade Lchelle: type et sym&trie des rbeaux Les phases d&rites dans ce mkmoire, dent la structure est hautement d&ordonde

B 1’6chelle atomique, presentent ri une Bchelle nettement plus grade une organisation strict’ement pdriodique B une ou deux dimensions.

Les phases d0nt l’organisation est p&iodique b une dimension sont dites lam& luires. Les mol&.des de lipide sont associees en lamelles, paraWes et dquidistantes, sans d’autres corrdations en position et orientation. Les lamelles sont remplies par les chaines paraffiniques, et sont couvertes par les groupes polaires.


Le seule phase de ce m&moire qui presente un ordre periodique a deux dimensions possede une symetrie hexagonale. Cette phase est form&e par des batonnets longs et rigides, paralleles et Bquidistants, sans correlations dans le sens de la longueur. La projection sur le plan perpendiculaire a l’axe des batonnets d&kit un reseau b deux dimensions, hexagonal (groupe de symetrie p6, International Tables, 1952).

(e) Taille et contenu des &ments de structure

Si on tient compte des propri&%s chimiques des systemes lipide-eau, on peut envisager d’autres criteres de classification des structures.

Lea structures sont simples ou complexes selon que les elements, form& d’aggregats de molecules lipidiques, ont une forme simple, ou bien sont des associations de plusieurs elements (voir l’exemple des phases Lp et h plus loin).

Lorsque la forme des elements de structure est telle qu’on peut distinguer le volume interieur du volume exterieur (c’est le cas, par exemple, de la phase hexagonale), deux types de structures sont possibles: le type I, si les chaines paraffiniques se trouvent b l’interieur et le milieu polaire a I’exterieur, type II dans le cas contraire. Pour faire le choix entre ces deux types de structures il faut Bvidemment s’appuyer sur d’autres dorm&es experimentales que celles fournies par la diffraction des rayons X (voir plus loin le cas de la phase hexagonale).

(f) DCtt?rminution des param&es de structure

Lea don&es experimentales relatives a chaque phase sont un ensemble de reflexions, obtenues en general saris orientation. On reconnait le type et la symetrie du reseau d’apres lea rapports des espacements (voir plus haut). Lorsque la symetrie est connue, on peut determiner les dimensions de la maille Blementaire.

Si on connait Bgalement la concentration et le poids moleculaire des lipides, ainsi que lea volumes specifiques partiels des lipides et de l’eau, on peut determiner le nombre N de molecules lipidiques contenues dans une maille Blkmentaire (voir plus haut) .

Pour avancer plus loin dans l’analyse des structures il est necessaire de faire quelques hypotheses. Une premiere, deja tacitement admise, est que les chaines paraffiniques se trouvent rassemblees dans des regions d’ou l’eau est exclue, et que l’interface eau-paraffine est couverte par les groupes hydrophiles des molecules lipidiques. Dans ce cas la surface S dont dispose en moyenne un groupe hydrophile a l’interface eau-paraffine est un parametre dt%ni sans ambigiiite. Une deuxieme hypothese est que la forme des elements de structure possede une symetrie Blevee, meme si celle-ci n’est pas exigee par la symetrie de la maille (Luzzati & Reiss-Husson, 1966); ainsi dans la phase hexagonale on admettra que les batonnets sont des cylindres A section circulaire. Ces hypotheses faites, il est possible de determiner plusieurs parametres dans chaque phase (voir plus haut).

(g) Distribution de la densite’ klectronique

L’etape suivante eat l’analyse de la distribution de la densite Blectronique. Nous avons effect& cette analyse pour les phases lamellaires, en cherchant dans chaque cas un modele qui rende compte de l’intensite des raies de diffraction. Nous decrirons plus loin le choix des mod&s et le calcul des intensites.


3. Partie Experimentale (a) Preparation des mitochondries

Le coeur du boeuf est mis dans la glace a l’abattoir, imm&liatement apres la mort de l’animal, pour etre transport6 au laboratoire. Toutes les operations suivantes sont effect&es It 2°C environ.

Le muscle cardiaque, debarasse de la graisse et coupe en morceaux, est passe au h&choir Blectrique. Le h&his obtenu est m&mge avec une solution de saccharose 0,25 M, contenant 0,2% de KaHP04, a raison de 100 g de viande par litre de solution. Le pH est ajuste 8. 7,2 par addition de quelques gouttes d’une solution KOH, 6 M. Le melange est ensuite soumis a un broyage puissant. Le pH est a nouveau ajuste 8, 7,2, et l’homogenat est filtre sur gaze.

Lea mitochondries sont &par&es par centrifugation differentielle, suivant une technique d&i&e de celle de Crane, Glenn & Green (1956). Le surnageant apres centrifugation a 700 g, est filtre sur de la gaze et recentrifuge a 7500 g. Le nouveau surnageant est d&ante, le culot, soigneusement lave 2 a 3 fois avec une solution de saccharose 0,25 M, est homo- geneise avec 5 vol. de cette m&me solution. L’homogenat est centrifuge & 8000 g, le surnageant est d&ante, et le culot est utilise pour l’extraction des lipides. La purete de la preparation de mitochondries est v&flee au microscope Blectronique (nous devons 8. l’obligeance du Dr Yotzuyanagi ces derniers contrales).

(b) Extraction des lipides

Apres quelques essais, nous avons Bte amen& a utiliser une technique qui derive de celle de Folch, Lees & Sloane-Stanley (1957).

Tous les solvents, de qualite “pour analyse”, sont fraichement distill&. Toutes les parties des appareils qui viennent en contact avec les solvants sont en verre.

Le culot de centrifugation qui contient les mitochondries est verse dans un melange chlorophorme-methanol (1 vol./2 vol.), a raison de 25 ml. de culot par litre de solvant. Le melange est agite Bnergiquement pendant 5 a 10 minutes, sous courant d’azote, puis filtre sur un papier prealablement degraisse. La solution est Bvaporee sous vide entre 16 et 25”C, dans un Bvaporateur rotatif, en condensant les vapeurs de solvant a -20°C. En fin d’evaporation la trompe 8. eau est remplacee par une pompe a palettes.

Le residu est extrait ensuite par un melange chlorophorme-methanol (2 vol./l vol.), a raison de 100 8. 150 ml. par 25 ml. de culot de centrifugation de depart. La solution de lipides contient a ce stade des quantites importantes de saccharose, de proteines et d’autres contaminants; on lee &mine par la technique de Folch et al. (1957).

Les lipides sets sont utiliies immediatement pour la preparation des Bchantillons ou sont conserves a -3O”C, sous azote.

(c) Controles analytiques

La teneur en proteines, determinee selon la technique de Lowry, Rosebrough, Farr & Randall (1951), reste inferieure a 1%.

Les phospholipides rendent oompte de 92% environ de l’extrait lipidique total, d’apres l’analyse chromatographique (colonne d’acide salicilique Mallinkrodt, 100 mesh, AR), et en bon accord avec la teneur en phosphore (35 + 2 pg P/mg lipide).

La separation analytique des phospholipides est effect&e par chromatographie sup couche mince, selon la technique de Stahl (1964). La determination quantitative se fait par l’analyse de phosphore (Chen, Toribara & Warner, 1956) sur chaque tache chromatographique. En tenant compte du poids moleculaire moyen et de la teneur en phosphore des different8 lipides, nous avons obtenu les resultats suivants:

lecithinet 34 rfi 5yo phosphatidyl Bthanolaminet 29 + 5% phosphatidyl inositol 10 zt 2% cardiolipines 20 zk 5% cholesterol 2 f 1% lipides neutres 5 f 2%

t Avec son plesmalog&ne. 21


L’accord avec d’autres dorm&s est excellent (Fleischer, Klouwen $ Brierley, 1961; Strickland t Benson, 1960).

La structure chimique et la composition en chaines parathniques des lipides sont don&es en Appendice.

(d) Expdriences de diffraction des rayons

Les lipides sont manipules dans des conditions at&riles, afln d’eviter toute contamination par des microorganismes.

Les Bchantillons pour l’etude cristallographique sont prepares dans de petits p&e-flltres, par pesee directe des composants (lipides et eau bidistillee), et sont conserves deux ou trois jours a temperature ambiante, jusqu’a ce que l’equilibre soit atteint. Ensuite chaque echantillon est transvase dans une cuve Btanche, 8. fen&res de mica transparentes aux rayons X; cette cuve est montee dans un support thermostat& pendant les experienoes de diffraction des rayons X. La teneur en eau est parfois verifiee par analyse (technique de Karl Fischer), sur l’echantillon recueilli apres l’experience de diffraction des rayons X.

Les chambres de diffraction sont du type Guinier, St monochromateur de quartz courbe, operant sous vide. Les espacements explores vont de (300 A) - la (2 A) - I. Le rayonnement utilisb est soit la raie CuKccl (h = 1,540 A), soit la raie WLC(~ (A = 1,476 A).

(e) VoZumes La composition Blementaire moyenne d’une molecule de phospholipide de mitochondries

de coeur de boeuf est C 42,4, H 76,6, 0 9,1, N 0,6, P, en tenant compte de la composition en especes lipidiques (voir plus haut) et en chaines paratiiques (Appendice). La masse molaire moyenne est 771 g; le nombre d’electrons moyen par molecule est 423.

Faute de don&es precises, nous adopterons pour le volume specifique partiel la valeur relative aux lecithines: 0,98 cm3 g- l, 8. 25°C (Reiss-Husson, 1967). Le volume specifique de l’eau, a la meme temperature, est 1,00 cm3 g-r (3,00 A3 par electron).

Le partage entre part& paraf%nique et partie polaire se fait entre 10 premier groupement CH, et le groupement carboxylique. Nous avons port6 dans le Tableau suivant le nombre moyen v de groupements CH, CHs et CH, par molecule, leur volume 2, (Reiss-Husson & Luzzati, 1964) et leur nombre d’electrons n:

CH CH, CH3

Y 8 24 2 n (electrons) 7 8 9 v (9, 25%) (A3) 20,5 27,0 64,O

On determine ainsi npar = 266 electrons et vpar = 919 An, et on en deduit npo, = 167 electrons et vpol = 336 As.

Le choix des volumes est plus d&cat a basse temperature, lorsque la conformation des chames parathniques cease d’5tre “liquide”. Pour effectuer les calculs relatifs aux experiences faites a -20°C nous avons adopt8 pour les volumes des parties paraffiniques et polaires les valeurs a 25°C multipliees par 0,919 (ce coefficient est tire du travail de Reiss-Husson, 1967).

Dans tous les calculs nous admettons que les volumes speoifiques partiels sont inde- pendants de la composition du systeme.

Nous discuterons plus loin les consequences des erreurs qui peuvent affecter les volumes specifiques.

4. Resultats (a) Diagramme des phases

Nous avons utilis8, an tours de ce travail, des lipides provenant d’une dizaine de preparations diffkrentes: les r&ult.ats sont toujours les mi?mes, dans la mesure oti les lipides sont de qualit satisfaisante, selon les critkres de la chromatographie sur couche mince.


Le disgramme des phases du systkme lipides-eau a et6 explore en fonction de la concentration et de la temperature (et zt pression atmospherique), & l’interieur des limites indiqu6es dans la Fig. 1. L’etude B des temperatures plus &levees a et& limit&e par une alteration des lipides.

I I I I I I,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0

-60

-40

-20 ;j z#

- o+’

--20

FIG 1. Diagramme dee phases. Les &mites de la region exploree sont indiqu6es par une ligne 21 traits. Les regions a une phase sont hbhurbes. Les regions de transition n’ont pas et6 etudiees avec soin: on indique les phases qu’on rencontre dans certaines regions a deux phases. Au dessus de la ligne a-a la conformation des chaines paraffiniques est chaotique.

Differentes phases ont &A caract&is6es par leur diagramme de diffraction des rayons X; lea domaines d’existence des phases pures sont portees sur la Fig. 1. Une des phases eat hexagonale (H,,), trois sont lamellaires (Lor, LjI, Ly), une autre est le glace (gl). Lea regions intermkliaires contiennent deux ou trois phases. Dana certaines regions iL deux phases, explorees A temperature constante, en fonction de la concentration (Fig. 2), on note que la composition des deux phases B l’equilibre vsrie s,vec la composition du systeme: l’h&&og6n&t6 des lipides rend compte de cette observation (voir plus loin).

c

FIG. 2. Dimensions des phases hexagonale et lamellaire a 25°C dans la region de demixtion (voir texte).

(0) Phase H,,, distance entre les axes des cylindres a; ( x ) phase La, pbriode de rbpetition d.

310 T. GULIK-KRZYWICKI, E. RIVrlS ET V. LUZZATI

A temperature suffisamment elevee, soit au dessus de la ligue a--a (Fig. l), la conformation des chaines paraffiniqucs est chaotique; en effct on n’observe, all

dela de s = (10 d)-l, qu’une bande diffuse, autour de s = (4,s A)-l (Planche I(a) et (b)). Dans les phases L/3 et Ly on observe les raies fines et intense, qui correspond L l’organisation hexagonale des chaines paraffiniques rigides (Planche I(c) et (d)). A l’int&ieur de la phase Lo: la transition entre les deux types de conformations dcs chaines paraffiniques est graduelle (voir plus loin).

(b) Phase hexugonab

Cette phase, dont le domaine d’existence est assez Btroit, est caract&isee par quelques raies de diffraction, centrales, dont les espacements se suivent selon la progression 1 : 1/3 : J4 : $7:. . . , et d’une bande diffuse autour de s = (4,5 A)-l (Planche I(a)). La structure consiste en un assemblage hexagonal bidimensionnel de cylindres paralleles de longueur ind&inie. Quelques donnees experimentales sont portees dans les Figs 2 et 4. La variation des dimensions de la maille en fonction de la temperature (Fig. 6), en plus de la bande autour de s = (45 A)-l, indiquent que la conformation des paraffines est chaotique.

En principe, deux types de structures seraient compatibles avec oes donnees (voir plus haut): type I, avec les cylindres remplis de paraffines, entour& par le milieu polaire; type II, avec les cylindres remplis par l’eau et les groupes polaires, entour& par les paraffines. En fait le type II est bien plus satisfaisant dans ce cas. D’une part, en effet, la quantite d’eau parait insuffisante pour remplir les interstices entre les cylindres paraffiniques, si la structure etait du type I; d’autre part il a BtB montre (Luzzati & Husson, 1962) que lorsque la concentration de la phase hexagonale est plus Blevee que celle de la phase lamellaire, la structure est du type II et du type I dans le cas contraire (voir dans Stoeckenius (1962) une confirmation par microscopic Blectronique) .

(c) Phase lamellaire Lu

Cette phase est caract&is~e par quelques raies de diffraction, centrales, fines et Bquidistantes. A tempdrature Blevee ou plus pr&isement au dessus de la ligne a-a de la Fig. 1, on observe autour de s = (4,5 A)-l la bande diffuse typique des paraffines “liquides”; aux temp&atures inferieures il apparait une raie fine, a s = (4,2 A)-l (Planche I(e) a (i)). Nous discuterons separ6ment la structure des formes a haute et & basse temperature.

(i) Forme 2t huute tempkrature

La structure, represent&e schematiquement dans la Fig. 3(a), est formhe par un empilement de feuillets lipidiques identiques et Bquidistants, s&par& par des couches d’eau. Lea chames paraffiniques “liquides” remplissent l’int&ieur des feuillets lipidiques; les groupements hydrophiles tapissent la surface.

On mesure, dans chaque expdrience, la pkriode de r&p&ition d, et on determine l’dpaisseur du feuillet lipidique et de la oouche d’eau, d, et d, (voir plus haut). Quelques donndes expkrimentales sont portees dans la Fig. 4.

On constate qu’a temperature constante l’dpaisseur du feuillet lipidique est in- dependante de la concentration, a une toute petite variation p&s. Si, comme le sugg&re cette observation, la struoture du feuillet est la mhme a toute concentration, on se trouve dans une situation particuli&ement favorable B une Etude pr&ise de la

(b)

(4

(h)

0)

,

I

PLANCHE 1. Quelques exemples de clichk de diffraction des rayons S, enregistrPs dans u~w chambre de type Guinier, it faisceau monochromatique focali&, optkant sous vidc, en position sym&trique (sauf pour (c), obtenu en position disym&rique). Kaponnement CuKa,, h = If,40 il. distance Cchantillon-film 125 mm.

(a) Phase hexagonale: c = (I,!%, 37-C, (! -= 47,s A. Les iudiccs des raies writ IO, 20, 31, 30 (vail notation); la raie 21 est, absent?. Soter la bande diffuse nutour cl? s (4,5;\)-1, caract6ristiqw de la conform&ion chaotique des chaines parafiniques.

(b) Phase lamrllaire La, forme B haute tempPraturr: c 0,X0, 25‘ C. l,w raies fines crlltralw sont les ordres successifs relatifs & l’espacemellt .%,.i A. Sot,er Pgalemwt la bantlc diffuse.

(c) Phase lamellaire 1~8: c m= 0,94, WC. 011 peut compter 10 ordres tlt~ l’esparcrnrnt tiO,ti A (voir Tableau 2) et la premi+re raie de la phase hexagonalr, B s (45.4 A) I. Noter la rai0 trPs intense B s 7 (4,2 A)-l, et les rairs plus faibles b s : (3,42 >\)-I et h s ($1 A-1 (crttcs dernikre est, b peine visible SW le rlichb), qui carart&srut l’organisatiorl twxagollalr dex chaillrs paraffiniques rigides. La raie k s = (4,2 A)- ’ est, dPformbr par la reprodrwt ion l’hotopraphiclur~: en fait elle est aussi fine quc clans le clichb (i).

(d) Phase lamellaire Ly: c 0,8X, -20°C (voir Tableau 2). (e) & (i) Phase lamellaire La, transition thelmiclur: c : 0.78. On Ilotcl d‘ullca part, qu’it toutI>

tempkature la position et l’intensit6 des raies wntrales soot, les m6mes. rt d’autw part qurt l’intensitb de la bande b s (4.5 A) ml tlirnillue et, tint’ wllr de la raio B s (4.2 A) ~’ wagrnwtc~, & mesure que la tjempbrat,urr baisse.

(e) 10°C; (f) .i’C; (g) WC; (h) --.‘,‘(I; (i) IO (‘. Sole. Certaillos tarhes parssites (par (~xen~l)lr b s ~7 0.23 A I, c+t6 gauchos, (lrs calktr6r ((x)

k (i)) sent, dues aux fen8trrs dc miva drs cuvt>s ~~o~t~~-bct~alltillorl.


(a) (b)

FIG. 3. Representation schematique de la structure des phases lamellaires, et distribution de. la densite Qlectronique. Les cercles representent les groupements polairas, les lignes sinueuses les paraffines “liquides” et les lignes paralleles les paraffines rigides et ordonnees.

(a) La, forme it haute temperature, au dessus de la ligne a-a (Fig. 1). Les chaines paraffiniques sont completement desordonnees.

(b) LB, Les chaines paral?lniques sont rigides, ordonnees selon un reseau hexagonal a deux dimensions. La presence d’une mince couche desordonnee, au centre du feuillet paraffinique, est due a l’h&Srogen&te de longueur des chdnes paraffiniques. Les fonctions delta sont reprosent&s par des traits verticaux Bpais.

(c) Ly, formee de feuillets La et L/3 alternes. Lcr est representee dans sa forme “basse temperature”, avec une partie des chaines rigides, et ordonnees sur une partie de leur longuour

40-

Fro. 4. Dimensions relatives a la phaseilamellaire Lx, en fonction de la concentration, 8. 25°C.

( x ) Pkiode de rep&ition d; (0) Bpaiaseur du feuillet lipidique d,; (8 ) surface moyenne 8; (0) distance entre lea axes des cylindres, phase H,,.

distribution de la den&t6 Blectronique, car les facteurs de structure sont dans ce cas une fonction de s, ind6pendante de la concentration;

F(s) = s

[p(z)-p(O)] cos 277 sz dz teumet

oh Oz est la direction perpendiculaire au plan du feuillet, p(z) la distribution de la densit Blectronique, p (0) la densit 6lectronique de l’eau, qu’on suppose constant (on admet que le feuillet pos&de un plan de symhie).


Nous avons represent6 dans la Fig. 5 la valeur relative des facteurs de structure observes a differentes concentrations. En bon accord avec le modele, la loi de variation eat la meme a toute concentration, et on observe en particulier des regions de s ou le facteur de structure s’annule, quelle que soit la concentration: ce sont les regions oh la transformee de Fourier change de signe. L’enveloppe des points de la Fig. 5 permet done de tracer une courbe continue, qui doit suivre de p&s la transform&e de Fourier d’un feuillet isole.

0,2 0 4 8x10-a

s(A - 1)

FIG. 5. V&ilication cristallographique de la phase Lcr. P(s) est la transform& de Fourier de la distribution de la den&6 6lectronique reprAsent6e dans la Fig. 3(a) (voir 6galement Tableau 1). Chaque ligne horizontale reprbsente un diagramme de diffraction des rayons X B temperature ambiante. La concentration est port& en ordon&e lee espaoements des r6flections en abscisse. La longueur des traits verticaux est proportionnelle 8. la valeur absolue dee facteum de structure expki- mentaux (les intensit6s sont eatim6es visuellement). L’attBnuation des intensit68 aveo 8 croissant s’accentue A mesure que la concentration bake, B cause du d6sordre croissant de l’organieation pbriodique.

On peut utiliser les intensit& observ&s pour analyser la distribution de la densite Qlectronique du feuillet. En principe on pourrait effectuer une transformation de Fourier de l’enveloppe des points experimentaux; en fait le pouvoir de r&solution est si limit4 dans ce cas qu’il s’est av&% p&f&able de verifier un modele, choisi a priori, par l’accord entre les facteurs de structure observes et calcul&.

Le modele eat form6 d’une couche paraffinique, entouree par deux couches polaires: la densite Blectronique est uniforme dans chaque couche (Fig. 3(a)). On determine l’epaisseur des couches et les valeurs de la densite Blectronique de la man&e suivante. On connait (voir ohapitre (e) sur volumes dans la Partie expkimentale) le nombre d’electrons et le volume d’une mol6cule lipidique (n et w), et des parties paraffiniques et polaires (spar, mpol, vUpar et v r0 ,) : 1’6paisseur et la densit Blectronique de la partie parafkique ont pour expression:

d Par = NI ~psr, (2)

Ppar = %sr IV p&r' (3)


La couche polaire contient les groupements hydrophiles des mol&cules lipidiques, accompagn& Bventuellement d’une petite quantitd d’eau. L’Bpaisseur minimale, c’est-&-dire en absence de solvatation, est:

c4m11 min. = N, fJpo1* (4) La valeur de la densit Blectronique pPOl est li&e B celle de 1’6paisseur par la relation suivante :

(/%01-P0)~p01 = ~lkbol--v,&l)* (5) Le seul param&tre variable du modrYe est done l’dpaisseur de la couche polaire. Apr&s quelques tktonnements nous avons abouti aux dimensions port&es dans le Tableau 1, pour lesquelles l’accord entre facteurs de structure observtk et calcuEs est excellent (voir Fig. 5).

TABLEAU 1

Phases lumellaires: distribution de la den&% Clectronique (Fig. 3)

La (dans Ly)

t Pa C

d (4

4 (A)

N, (mol6cuhs par A”) s (AZ) &a, (4 d,,, (4

p,,,~ou pi=) (61ectrons par A3) A,,, (81ectrons par Aa)

,+,ol(ou &,,) (6lectrons par A3) d,,, (61ectrons par A’)

+25 0,85 B 0,20

50 It 200

39,s

0,0317

63,l

29,l

15,0

0,289

0,428

-20

0,94

60,6

56,6

0,0491

40,7

41,4

19,2

0,333

-0,742

0,509

-0,742

-20 -20

0,88

113,7

100,l 44,0

0,0796 0,0382

52,4

73,2 32,2

20,Q

0,315

0,431

Lea dif%rents param8tres sont d&ermin& & l’aide des Equations (2) & (IO), et avec lea valeurs numbriques portbes au chapitre (e) volumes.

Les Bpaisseurs des diffbrentes couches indiquQs dans la Fig. 3 sont: AB=CD=7,5A; BC=29,1A; EF=GH=LM=NO=9,6A; FG=MN=41,4A; IJ = KL = lo,45 A; JK = 32,2A; 6, = 6,; 8s = &/2.

(ii) Forme ic ba-sse tempdrature

Si, & concentration constante, on abaisse la temptkature, les diagrammes de diffraction des rayons X restent sensiblement les memes, aussi longtemps qu’on se trouve au dessus de la ligne a-a (Fig. 1); seul l’espacement des raies centralea varie t&s 1Qgkrement (Fig. 6), car 1’8paisseur du feuillet lipidique augmente, selon une loi qui est caract&istique de la conformation chaotique des chaines paraffiniques (voir plus haut).

Au passage de la ligne a-a il apparait une raie suppldmentaire & s = (4,2 A) - l, dont l’intensitk augmente, par rapport b celle de la bande, 8, mesure que la tempdrature baisse; la finesse de cette raie semble &re indhpendante de la temperature (Planche


I (e) a (i)). Ce phdnomkne n’est accompagnd d’aucune modification de la region centrale: le nombre, la finesse et l’intensitt5 des reflections restent identiques des deux c&k de la ligne a-a, et aucune discontinuite ne se manifeste clans 1’6volution des espacements avec la tempdrature (Fig. 6).

1 -20 0 20 40

tw

FIG. 6. Variation des dimensions des phases Hn et La avec la. tempbrature, & concentration con&ante. La flbche indique l’apparition de la raie B, 8 = (4,2 Al-l. On note que Ia maille ee contracts lorsque la temperature augment0 (voir texte).

(0) HII, c = l,O, distance entre lee axes des cylindres a; (a) Lu, c = 0.78, p&iode de rbpbtition d; ( x ) La, c = 0,64, pbriode de rbpbtition d; (+) LX, c = 0,56, ptkiode de rbp&ition d.

11 eat peu probable, clans ces conditions, que le systkme contienne plus qu’une phase: on est done amend & supposer d’une part que la conformation des cha$nes paratiques est ht%&og&ne au sein d’une mdme phase lamellaire, avec des r&ions “liquided et des rdgions plus orclondes responsables respectivement de la bade autour de s = (4,5 8)-l et de la raie L 8 = (4,2 I$)-I, et Q. admettre d’autre part que l’gpaisseur des feuillets est in&pendante de la conformation des chaines. L’analyse des difftkentes man&es d’associer lea deux types de r&ions clans une mhme phase conduit 8. envisager les deux types de structure suivants.

Le premier est form& de rdgions oh toutes les ohaPnea paratiques sont odor&es sur toute leur longueur, et de r&ions oh toutes les chaines sont entihrement “liquided’. Si l’hpaisseur des feuillets est constante et homogkne, la surface par chaine, mesuree sur le plan du feuillet, est S/2 = 29 AZ; par ailleurs la section transversale d’une chafne est Z = 20,4 Ba. I1 est clair, clans ces conditions, que les rdgions ordonndes sont formdes par une double couche de chafnes rigides, inclin~es par rapport B la normale au plan du feuillet; en effet on aurait S = 4.Z si les chaines appartenant aux deux c&t% du feuillet se recouvraient, et S = 2.Z si dans la double couche les chaines Btaient per- pencliculaires au plan du feuillet. En outre dans ce cas les groupements CH, terminaux se trouvent tous looalisf% au centre au feuillet.

Dans le deuxi&me type de structure les h&&og&dit& de conformation sont situees a l’intdrieur de chaque moldcules lipidique, et m&me le long de chaque chaine par- a0inique. Les r@ions ordonnkes, clans ce cas, occupent une couche & l’intdrieur des feuillets parafkiques (Fig. 3(c)); clans ces couches les chaines des moldcules appartenant aux deux c&t&t au feuillet se recouvrent, et s’organisent selon un r&eau

X-RAY DIFFRACTION IN LIPID-WATER SYSTEM 31.5

hexagonal, avec leur axe vraisemblablement perpendiculaire au plan du feuillet (ceci pour des raisons de symkie). Cette couche organis& eat entourde par deux couches & structure d&ordonnke, qui contiennent h la fois un segment de chacune des chaines engagdes dans la region ordonn&e, et quelques chaines entikres. Le nombre de chaines dont un segment est ordorm ne peut atteindre, au maximum, que la fraction 22/S du nombre total. L’ordre peut se d&elopper soit par augmentation de 1’8paisseur, soit par l’extension lattkale des domaines B structure ordonnde.

C’est en fait le deuxikme type de structure qui parait le plus satisfaisant, et ceci pour deux raisons. D’une part, en effet, nous avons nott5 que lea intensit& des r& flexions ne varient pas, des deux c6tBs de la ligne a-a, meme lorsque lea regions paraffiniques il structure ordonnt5e deviennent prddominantes (voir Planche I (e) B (i) ): or les perturbations des facteurs de structure dues a la localisation prkcise des groupements CH,, qui eat inhdrente au premier type de structure, sont bien plus krieuses (voir phase L/3 ci-dessous) que celles que peuvent produire les fluctuations de densite Blectronique dues, dans le deuxi&me type de structure, & la distribution des regions ordonnt5es et “liquides” au sein des feuillets paraffiniques. D’autre part la majorit& des moltkules lipidiques (voir Appendice) comportent une chaine paraffinique entierement saturde, et une chaine non satur8e; dans le deuxihme type de structure lea chaines satu&es, qui sont susceptibles de “cristalliser” plus aist5ment que les chaines non saturdes, peuvent se concentrer dans lea r&ions ordonndes, & mesure que la temperature baisse. Au contraire dans le premier type de structure lea regions ordonndes doivent contenir, d&s leur formation, des chaines satur&es et non satur6e8 en nombres a peu p&s Bgaux.

On peut noter, pour terminer avec la phase LX, que la loi de variation des espacements avec la temperature eat sensiblement la mGme des deux c&&s de la ligne a-a (Fig. 6). Ceci est en accord avec le mod&le thdorique, qui n’est pas perturb& par la “cristallisation” d’une partie des chaines parafliniques (voir Luzzati, 1967); on pourrait s’attendre peut-8tre t3 observer une cassure dans lea droites au passage de la ligne a-a, si toutefois la pr&ision des points expkrimentaux Btait suffisante.

(d) Lamelluire L/3

Lea diagrammes de diffraction de cette phase comportent une dizaine de r&lexions, dont lea positions correspondent aux o&es successifs d’un espacement de 60 d environ, et une raie fine et intense & s1 = (4,2 A) -I, accompagnt5e par deux raies

t&s faibles & s2 = Jis, et B sg = .%, (Planche I (c)). Le domaine d’existence est limit& it une petite region du diagramme des phases, vers lea faibles teneurs en eau et les basses tempkratures (Fig. 1); en fait nous n’avons jamais observ& cette phase tout-b-fait pure.

L’espacement et l’intensit8 des r&lexions varient avec la concentration: quelques donnbes sont port&es sur la Fig. 7. La phase n’6tant jamais parfaitement pure, on ne peut pas determiner sa concentration de man&e p&ise; toutefois, et cela saris grand risque d’erreur, nous admettrons qu’& c = 0,94 la concentration du syst&me cojincide avec celle de la phase, puisque & cette concentration la raie de diffraction due it la phase qui accompagne L/3 est faible. En connaissant c et d on peut determiner les dimensions des diff&ents Bldments de structure, si on suppose que les volumes sptkifiques sont comma dgalement (voir plus haut): on aboutit ainsi aux dimensions port&es dans le Tableau 1.

316 T. QULIK-KRZYWICKI, E. RIVAS ET V. LUZZATI

FIG. 7. Dimensions relatives aux phases L/l, Ly et H II, en fonction de la concentration, & -20°C.

(A) Lb, pbriode de rbpbition d; (0) Ly pbriode de rbpbtition d; (0) Hn, distrtnce entre lee axee des cylindres a.

On constate que la valeur de S/2 eat t&s voisine de celle de Z (S/2 = 20,4 Aa, Z = 20,4 Aa): ceci indique que les feuillets lipidiques sont form& par une double couche de chaines paraffiniques, organisees selon un reseau hexagonal bidimensionnel, et orientees avec leurs axes perpendiculaires au plan du feuillet (voir Fig. 3(b)). 11 nous a paru necessaire, B cause de la longueur inegale des chafnes paraffiniques, de postuler l’existenoe au centre du feuillet d’une mince couche a structure desordonnee.

Le nombre des reflections eat suffisamment Bleve dans cette phase, pour justifier une verification cristallographique fond&e sur l’accord des facteurs de structure cal- 0~16s et observes. Le modele de distribution de la densite Blectromque (Fig. 3(b)), comme celui de la phase La, est forme par deux regions de densite electronique constante; toutefois dans ce cas il convient de tenir compte de la localisation precise des extr&nit6s des molecules lipidiques.

En ce qui concerne la couche para0lnique, on connait son epaisseur (equation (2)); par ailleurs, puisque les extr&nit& CH, sont toutes situ&es au centre du feuillet, on soustrait de ppar la contribution des CH,, qu’on localise au milieu de la couche, sous forme de fonction delta. La densite klectronique modifiee et le contenu de la fonction delta ont pour expression:

%*r = bhr -%HJ b3r-%13) - l9 (6)

A pear = s

W)dz = 2x1 (~OH3--~OR3 fkw)- (7) feuillet

En ce qui concerne la couche polaire, on lui incorpore le peu d’eau que contient la phase, et on suppose qu’elle comporte, en son centre, une fonction delta negative, analogue & celle de la couche paraffinique, pour rendre compte de l’emplacement des extr&nit& polaires. Nous avons admis arbitrairement que le contenu des deux fonctions delta est le meme. On a ainsi (voir equation (5)):

Go, = d-dpsr, (8)

d,,, b;,r~o) = N, h,l - so1 d-A,m (9)

A,,, = A,,,. (10)


On calcule les facteurs de structure relatifs B ce modkle avec 1’6quation (1) : l’accord entre valeurs calcul&es et observdes est excellent (Tableau 2).

TABLEAU 2

Don&es cristallographiques relatives aux phases L/3 et Ly

h x 103(A)-l I,,, I oa,o signe

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11

0 16,5 33,0 49,6 66,l 82,6 99,2

115,7 132,2 148,7 165,2

- ttF

tf 0

tF m F 0

t:f tf

3,59 + 7,94 - 0,oo + 0,02 - 3,05 - 0,23 + 1,12 - 0,03 - 0,24 - 0,oo - 0,23 -

LB LY

0 - 11,32 + 898 f 0,17 -

17,6 ttF 19,37 - 26,4 ttf 0,51 - 35,2 ttf 0,59 + 44,0 0 0,Ol + 52,s 0 0,22 61,6 F 4,91 - 70,4 m 1,43 - 79,2 f 0,64 + 88,O 0 0,02 - 96,s f 1,17 -

I os,c = [P(s)12 exp (-90s2), oh F(s) est donnb par 1’6quation (l), et le distribution de la densit& Blectronique [p(z)-p(O)] est indiqube dans la Fig. 3 et dans le Tableau 1. Les valeurs exp&imentales (I,,& sont obtenues par estimation visuelle: ttF: extriknement forte; tF: t&s forte; F: forte; m: moyenne; f: foible; tf: t&a foible; ttf: extrGmement foible.

Notons que la contribution des extr&nit& des molkules est appkiable, ainsi que nous l’avions remarqu6 ci-dessus, 8, propos de la phase La.

11 convient de faire deux remarques sur la port&e des calculs d&elopp& ci-dessus. D’une part il est admis implicitement que la sQgr&gation des difftkentes espkces lipidiques entre les deux phases ne perturbe pas sensiblement la composition en lipides de la phase Lp, par rapport g la composition globale de la prdparation; cette hypoth&se est en fait justifide, du moins autour de c = 0,95, car & cette concentration la phase qui accompagne L/3 eat pr6sente en faible proportion. D’autre part les incertitudes sur le choix des volumes spkifiques (voir plus haut), qui perturbent les valeurs de pbp, et de pbol, n’ont que des effets secondaires sur les calculs des facteurs de structure; il est clair, en effet, que puisque le modkle comporte deux regions de densit Qlectronique constante et deux for&ions delta (Fig. 3(b)), les facteurs de structure ne dependent que du rapport entre le contenu des fonctions delta et le contraste [pLOl - pLBp]. En outre les valeurs de d,,, et de d,,, ne sont pas t&s sensiblea au choix du coe&ient de dilatation thermique, dans la mesure toutefois oh les changements des dimensions des parties parafkique et polaire sont homoth&iques, et la teneur en eau faible.

(e) Lumell.aire Ly, complexe

Cette phase se pr&ente pure, & basse tempdrature, entre c = 0,8 et c = 0,9 environ (Figs 1 et 7). Les diagrammes de diffraction des rayons X contiennent une dizaine de raies fines, correspondant S une structure lamellaire de p&iode voisine de 115 A,


et une raie fme et intense B s = (4,2 A)-l (PI anche I (d)). L’Bpaisseur de la couche lipidique est 100 A (Tableau I).

Une Bpaisseur aussi &levee indique que la structure est complexe, c’est-&-dire qu’elle contient des feuillets lipidiques d’au moins deux types difkents. En effet 1’6paisseur d’un feuillet lipidique ne peut pas dQpasser 57 d, valeur correspondant A une double rangee de moltkules compl&ement &i&es, telle qu’on I’observe dans la phase Lfl (Fig. 3(b)). Parmi lea diff&entes combinaisons que nous avons envisagdes, une s’est a&&e particuli&rement satisfaisante. 11 s’agit (Fig. 3(c)) de l’empilement alter& de feuillets de type La et L/l, s&par& par une mince couche d’eau: en effet 1’6paisseur de la couche lipidique de Ly est t&s voisine de la somme des Qpaisseurs de La et de L/3 (Tableau 1).

Pour calculer les facteurs de structure nous avons adopt6 une distribution de la densite Blectronique qui derive de celle des phases La et L/3 (Fig. 3(c)). Le feuillet L/3 est celui de la phase du m6me nom (Tableau 1). Les dimensions du feuillet La sont d&ermindea en extrapolant A -20°C lea observations effect&es entre 35 et -15°C (Fig. 6). L’Bpaisseur de la couche paraffinique est d&ermintSe iL l’aide de 1’6quation (2); en ce qui concerne la couche polaire, on admet qu’elle occupe le reste de la maille (Fig. 3(c)), et on en d&ermine la densite Blectronique par 1’8quation (5).

L’accord entre les facteurs de structure calcul& et observtk est excellent (Tableau 2), ce qui fournit une v&ification du modale. L’absence de bande & s = (4,5 .&)-I ne doit pas surprendre, car dans la phase La, A, t&s basse tempdrature, cette bande est B peine visible (Planche I (i)), A, cause de la proximit& de la raie A s = (4,2 A)-l, d’intensit6 Qcrasante.

11 faut noter qu’il est admis implicitement que la s&grdgation des lipides entre les deux types de feuillets n’entraine pas de perturbations skieuses des dimensions et des densit& des lamelles La et Lj?. En ce qui concerne les consequences des erreurs qui peuvent affecter le choix des volumes spdcifiques, on peut appliquer B. cette phase les m&mes remarques faites ci-dessus & propos de la phase L/?.

5. Discussions et Conclusions Nous avons &A particukkement attentifs, au tours de ce travail, aux problAmes

chimiques que pose l’&ude d’un melange lipidique complexe et ddlicat; pour obtenir dea r&ultats chimiques et cristallographiques tout-&fait reproductibles nous avons dfi mettre au point d’abord un ensemble de techniques d’extraction, de manipulation et d’analyse. L’expBrience a montrd que la prdsence de lipides alt&& (le plus souvent par hydrolyse et oxydation) peut perturber profonddment le nombre des phases et leurs domaines d’existence; toutefois, meme dans ce cas, les phases qu’on rencontre sont encore lamellaires et hexagonales, ce qui rend d.ifEcile de d&eler la presence de lipides aMrr8s par l’inspection d’un diagramme de diffraction des rayons X, en l’absence d’une &ude syst&natique A concentration variable.

Lea rkmltats obtenus A haute temptkature, ou plus exactement dans des conditions oh la conformation des para%nes est “liquide”, sont semblables A ceux d’autres syst&mes. Notons, une fois de plus, le fait fort remarquable qu’est l’exiatence d’un ordre bien d&elopp6 A grande Bchelle, dans un systkme oh la conformation A 1’6chelle atomique eat chaotique. Nous avons mis en relief, lors de la discussion de la phase La, le fait que des feuillets lipidiques d’bpaisseur pratiquement con&ante, engages dans une structure lamellaire ordonn6e, sont &par& par une couche d’eau dont


l’epaisseur va de moins que 8 A a plus que 250 A. La situation est toute differente en ce qui concerne des lipides plus homogenes, tels la lecithine, la phosphatidyl Bthanolamine, les sphingolipides (Reiss-Husson, 1967): dans ce cas, en effet, la phase lamellaire est saturee par une quantite d’eau relativement petite, et l’eau en exces reste &par&e des lipides. A cet Bgard les proprietes de l’extrait lipidique de cerveau (Luzzati & Husson, 1962), qui est egalement de composition “naturelle”, rappellent celles des lipides de mitochondries. Une telle cor&lation entre composition des lipides et propriMs des phases lamellaires est frappante: l’etude d’autres lipides permettra peut-&re d’en pr&iser la portbe.

Les r&ultats les plus originaux de ce travail, par rapport a ceux d’autres etudes de systemes analogues, sont ceux qui portent sur les phases dans lesquelles la conformation des paraffines est relativement ordonnee. L’organisation hexagonale des chaPnes paraffiniques rigides avait Btt3 mise en evidence, jusqu’ici, surtout dans des syst&mes contenant des parafEnes entierement saturees; Vincent & Skoulios (1966) ont montre que le changement de conformation a lieu entre phases distinctes, par des transitions discontinues. On aurait pu s’attendre, lors de la “cristallisation” des chaines dans un melange heterogene de paraffines, a la formation d’etats metastables et a une segregation complexe des diff&ents types de lipides. On constate en fait que le diagramme des phases n’est guere plus complique a basse qu’it haute temperature: les phases L/l et h sont stables, et toutes les transitions (entre H,,, La, L/3, b) sont reversibles. 11 est evident, dans ces conditions, que des chaines paraffiniques de degres de saturation et de longueur differentes peuvent adopter une conformation rigide et se mirlanger dans des r&gions a structure partiellement ordonnee. 11 faut noter, toutefois, qu’une fraction des chaines parafliniques reste toujours en dehors des regions ordonnees: la phase Lu, en effet, contient une couche desordonnee, et la phase L,G est toujours accompagn&e par une autre phase, ou la conformation d’au moins une partie des chaines est chaotique.

La phase Ly fournit un exemple interessant de structure complexe, avec une periode nettement plus grande que ne peut l’expliquer la longueur des moMcules lipidiques et la teneur en eau.

On peut essayer de degager des r&ultats expos& plus haut, ceux qui sont directement lies a l’htWrogtMit6 chimique, qui, dans le cas des lipides de mitochondries, Porte a la fois sur la nature des groupes polaires et sur la longueur et le degrd de saturation des chaines paraffiniques (voir Appendice). A temperature Blevee, lorsque la conformation des parafhnes est chaotique, les differentes molecules lipidiques peuvent se melanger parfaitement: c’est ce qu’on observe a l’int&ieur des domaines a une phase. A la transition entre phases lamellaire et hexagonale, l’h&&og6n&t6 des lipides fait que la composition des deux phases a l’equilibre varie, a temperature con&ante, avec la composition globale du systeme (il est clair que si dans ces conditions les lipides se comportaient comme un seul composant, au sens de la regle des phases, la composition de chaque phase serait constante). L’organisation graduelle des chaines paraffiniques et le fait que seulement une fraction des chafnes est suscep tible d’adopter une conformation ordonnee, tient Bgalement a l’h&&ogtMit6 des paraffines: il est clair, en effet, que les chaines s’organisent d’autant plus aisdment,, done a une temperature d’autant plus Blevee, que leur degre de saturation est plus haut. De meme la structure de la phase Ly s’explique, de toute evidence, par un fractionnement des diff&entes esp&ces de mol&ules lipidiques entre les deux types de feuillets. Notons, par ailleurs, que la distribution des differents types de chaines

320 T. GULIK-KRZYWICKI, E. RIVAS ET V. LUZZSTI

paraffiniques entre les diverses esp$ces lipidiques est fort complexe (voir Appendice) ; il parait difficile de trouver une explication chimique simple des ph&om&nes de &g&gation observ& dans ce syst&me.

Un param&tre particulikrement important, dans les systkmes lipide-eau, est la surface S dont dispose en moyenne chaque groupe polaire B l’interface eau-lipide. Dans les phases lamellaires du systeme dkcrit ici, S prend l’une de deux valeurs bien distinctes: 60 A2 environ dans La (A une petite variation thermique p&s), 41 A2 dans L/3. Nous avons mis en relation ces deux valeurs de S avec la conformation des chaPnes paraffiniques; il est Bvident, bien que nos donnt5es exp6rimentales ne touch- ent pas directement A ce problAme, que l’organisation des groupes polaires est diff&ente dans les deux cas.

Nous avons d&cut& en d’autres circonstances (Luzzati & Husson, 1962; Luzzati et al., 1966), la port&e biologique Bventuelle de ph&nom$nes analogues A ceux d&its dans ce memoire: il serait redondant de reprendre ici des consid&ations de ce genre.

Nous devons & Mme F. Reiss-Husson et au Dr R. P. Rand de nombreuses discussions et suggestions. Mme D. Laugier nous a fourni une collaboration technique particulierement compkente. Ce travail a btMfic% de l’aide de la DBMgation G&&ale A la Recherche ScientZque et Technique, Comitd de Biologie MolBculaire, et de la Direction des Recherches et Moyens d’Essais de MinistAre des ArmBes.

REFERENCES

Brockerhoff, H. (1961). Arch. Biochem. Biophys. 93, 641. Chen, P. S., Toribara, T. Y. & Warner, H. (1956). Andyt. Chem. 28, 1756. Crane, F. L., Glenn, J. L. & Green, D. E. (1956). Biochim. biophys. Acta, 22, 475. van Deenen, L. L. M. (1965). Progress in the Chemietry of Fats and other Lipids, vol. 8,

part I. London: Pergamon Press. Fleischer, S., Klouwen, H. & Brierley, G. (1961). J. BioE. Chem. 236, 2936. Folch, J., Lees, M. & Sloane-Stanley, G. H. (1957). J. Biol. Chem. 226, 497. Gray, G. M. (1960). Biochem. J. 77, 82. Gray, G. M. & Macfarlane, M. G. (1958). Biochem. J. 70, 409. Holman, R. T. & Widmer, C. (1959). J. Biol. Chem. 234, 2269. Husson, F. & Luzzati, V. (1963). Nature, 197, 822. Husson, F., Mustacchi, H. & Luzzati, V. (1960). Acta Cry&. 13, 668. International Tables for X-ray Crystallography, 1952, vol. 1. Birmingham: The Kynoch

Press. Lowry, 0. H., Rosebrough, H. J., Farr, A. L. &Randall, R. J. (1951). J. BioZ. Chem. 193,265. Luzzati, V. (1967). In Biological Membranes, ed. by D. Chapman. London: Academic

Press, in the press. Luzzati, V. & Husson, F. (1962). J. Cell BioZ. 12, 207. Luzzati, V., Mustacchi, H., Skoulios, A. E. & Husson, F. (1960). Acta Cryst. 13, 660. Luzzati, V. & Reiss-Husson, F. (1966). Nature, 210, 1351. Luzzati, V., Reiss-Husson, F., Rivas, E. & Gulik-Krzywicki, T. (1966). Ann. N.Y. Acad.

Sci. 137, Art. 2, 409. MUer, A. (1932). Proc. Roy. Sot. A, 127, 417. Reiss-Husson, F. (1967). J. Mol. BioZ. 25, 363. Reiss-Husson, F. & Luzzati, V. (1964). J. Phya. Chem. 68, 3504. Reiss-Husson, F. & Luzzati, V. (1966). Advances in Biological and Medical Physic-$ vol. 2.

London: Academic Press. Richardson, T., Tappel, H. L. & Gruger, E. H. (1961). Arch. Biochem. Biophya. 94, 1. Stahl, E. (1964). In Thidayer chromatography, ed. by G. B. Ma&i-Bettolo. London:

Elsevier Publishing Co. Stoeckenius, W. (1962). J. CeZZ BioZ. 12, 221. Strickland, E. H. & Benson, A. A. (1960). Arch. Biochem. Biophye. 88, 344. Vincent, J. M. & Skoulios, A. E. (1966). Acta Cryst. 20, 432 and 441.


APPENDICE

Structure Chimique et Composition en Chaines Parafiiniques des Lipides de Mitochondries de Coeur de Boeuf

Les lipides de mitochondries de coeur de boeuf contiennent surtout des phospholipides; la teneur en cholesterol et en lipides neutre est respectivement de 2% et de 6% environ.

Les phospholipides appartiennent aux types suivants: (a) Phosphatidyl choline (lecithine), phosphatidyl Bthanolamine, phosphatidyl inositol:

R,. CO. OCH,

R,.CO.OhH 0

AH,-O&O. X I OH

i

choline

X ethanolamine

my0 inositol

(b) Plasmalogenes (de choline et d’6thanolamine) :

R, . CH =CH . OCH,

R,.CO.OdH 0

AH,-O&O . X

OH

(c) Cardiolipines :

0

R, . CO. OCH, CH,---- O&O-CH,

R,.CO.ObH 0 JH.~H OH JH.CO.O.R,

J~H,--O~O--&H, A H,.CO.O.R, I OH

Les chaines paraffiniques (indiquees par R dans les formules ci-dessus) sont assez heterogknes en longueur et en degre de saturation. La distribution approximative des divers types de chaines entre les differents lipides est port&e dans le tableau suivant. Les chiffres representent le nombre de chaines, sur un total de 1000. La somme totale n’atteint pas 1000 du fait que des chaines presentes a 1’6tat de traces (indiqu6e par le signe + dans le Tableau) n’ont pas et6 prises en consid6ration.


(4 (4 lb) (b) (b) (b)

RI+% +

Ra+R, Rs+R, Rc+R, R, R, %+R, R, RZ

14 : 0 + + + + 2 + + 2 4

15 : 0 9 4 13

16 : 0 3 + 68 6 65 4 6 25 177

17 : 0 6 6 12

18 : 0 50 2 16 2 7 94 9 32 212

Total satds 53 2 84 8 89 98 15 69 418

16 : 1

18 : 1

18 : 2

18 : 3

20 : 4 20

22 > - Total non satturk

1 11 8 2 2 + + 24

23 24 55 33 16 12 5 168

9 153 26 40 20 31 279

4 17 + + + + 21

12 2 + + 18 32

6 2 + + +

>

11 18

54 209 89 75 2 54 54 5 542

Total global 107 211 173 174 152 143 960

(a) Gray & Macfarlane, 1958. (b) Gray, 1960.

En outre, ces resultats sont en bon accord avec les donnees de Richardson, Tappel & Kruger (1961) et de Holman & Widmer (1959) relatives a la composition globale des lipides de mitochondries.

En ce qui concerne la distribution des chaines paraffiniques entre les positions GC et ,O, on constate que dans les plaswuzlogbnes les chaines saturees se trouvent presque toutes en position u, les chaines non saturees en position /?. Pour le lkithine et la phosphatidyl kthanolumine la distribution des chaines ne semble pas avoir Bte deter- mince dans le cas des mitochondries; toutefois, par analogie avec ce qui a et& observe dans ces memes lipides d’autres animaux et d’autres organes (voir revue dans van Deenen, 1965), il y a lieu de penser que la position j3 est occupee de preference par des ohames non sat&es. Cette correlation entre position et de@ d’insaturation ne semble pas exister dans le phosphutidyl inositol (Brockerhoff, 1961).

Documents

Structure et polymorphisme des lipides: Étude par diffraction des rayons X du système formé de lipides de mitochondries de coeur de boeuf et d'Eau