A

Sd

JD

i

HAD

MCBpMC

1

scldnrsvpdbàm

r

1d

Revue du rhumatisme 79 (2012) 156–161

rticle original

ur-expression de la protéine BNIP3 et adressage vers la mitochondrie au course l’apoptose des cellules du noyau pulpeux induite par carence nutritionnelle�

ie Liu1, Jian Wang1, Yue Zhou ∗

epartment of Orthopaedics, XinQiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400038, Chine

n f o a r t i c l e

istorique de l’article :ccepté le 19 avril 2011isponible sur Internet le 6 novembre 2011

ots clés :ellules du noyau pulpeuxcl-2/adenovirus E1B 19-kDa-interactingrotein 3itochondrie

arence nutritionnelle

r é s u m é

Objectif. – Cette étude a été menée pour détecter l’expression de la protéine BNIP3 (Bcl-2/adenovirusE1B19-kDa-interacting protein 3) au cours de l’apoptose des cellules du noyau pulpeux induite parcarence nutritionnelle, de manière à mieux comprendre le mécanisme de l’apoptose dans ces cellules.Méthodes. – Les cellules isolées de disque caudal de rat ont été cultivées pendant un maximum de troisjours sous deux conditions de culture différant, soit par le pourcentage en oxygène, soit par les concen-trations en glucose et en sérum. Les effets des deux conditions de culture ont été comparés lors d’untest de viabilité cellulaire, la mesure du potentiel membranaire mitochondrial (� m) et la détection del’apoptose. L’expression et la localisation de la protéine BNIP3 ont été évaluées par PCR en temps réel etpar marquage immunofluorescent.Résultat. – La viabilité cellulaire et le potentiel membranaire mitochondrial (� m) ont été réduits signi-ficativement en absence d’oxygène, de glucose et de sérum, tandis que le pourcentage de cellules en

Disponible en ligne sur

www.sciencedirect.com

apoptose était significativement augmenté, en comparaison avec les cellules cultivées en conditions nor-males d’oxygène, de glucose et de sérum. L’expression de BNIP3 a été augmentée significativement enabsence d’oxygène, de glucose et de sérum, notamment à 72 heures. De plus, la protéine a été retrouvéeadressée vers les mitochondries.Conclusion. – La surexpression de BNIP3 et son adressage vers la mitochondrie pourraient être impliqués

les duançai

dans l’apoptose des cellu© 2011 Société Fr

. Introduction

Les disques intervertébraux sont des structures cartilagineusesituées entre les corps vertébraux, assurant la flexibilité de laolonne vertébrale. Chaque disque est constitué de trois régions :’anneau fibreux (ou annulus fibrosus, AF) qui constitue l’extérieuru disque, il entoure le noyau pulpeux (ou nucleus pulposus, NP) deature gélatineuse et qui occupe une position centrale, la troisièmeégion est constituée par deux fines plaques de cartilage hyalin quiéparent le disque des corps vertébraux adjacents. Le disque inter-ertébral est l’organe avascularisé le plus grand du corps, il recoitratiquement tout son apport nutritionnel des capillaires situés

ans le corps vertébral. Ces capillaires, provenant du corps verté-ral, pénètrent la plaque sous-chondrale et se terminent en bouclesla limite de la plaque de croissance cartilagineuse [1,2]. Les nutri-ents doivent ensuite diffuser de ces capillaires à travers le plateau

� Ne pas utiliser, pour citation, la référence francaise de cet article, mais la réfé-ence anglaise de Joint Bone Spine (doi:10.1016/j.jbspin.2011.04.011).∗ Auteur correspondant.

Adresse e-mail : xqgukezhouyue@yahoo.cn (Y. Zhou).1 Les co-auteurs ont contribué de manière égale à ce travail.

169-8330/$ – see front matter © 2011 Société Française de Rhumatologie. Publié par Elsoi:10.1016/j.rhum.2011.09.004

noyau pulpeux induite par carence nutritionnelle.se de Rhumatologie. Publié par Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

et la matrice pour atteindre les cellules du disque. Le métabolismeénergétique du disque est dominé par la glycolyse anaérobie. Dansces conditions, les cellules du disque consomment du glucose pourgénérer de l’énergie, avec également une consommation d’oxygènefaible mais significative [3]. Il y a des gradients très importants denutriment qui se développent, avec les cellules situées au centre dudisque dans le NP qui survivent avec de faibles concentrations enoxygène et en glucose et à un pH très acide [4].

Avec l’âge ou la dégénérescence, les disques interverté-braux subissent de nombreux changements histomorphologiquescomme l’apoptose des cellules du NP, la désorganisation deslamelles de l’anneau fibreux, l’amincissement et la calcification desplaques de cartilage, et ainsi de suite [5–7]. Dans le même temps,l’apport nutritionnel en oxygène, en glucose et en sérum diminueégalement d’une manière significative et peut même s’arrêter, ren-dant le microenvironnement du NP plus anoxique et plus acide.L’accroissement de l’apoptose des cellules du NP durant la dégé-nérescence coïncide avec la baisse de l’apport nutritionnel vers le

disque [8], suggérant que cette baisse ou cette carence nutrition-nelle pourrait être l’un des facteurs impliqués dans la disparitiondes cellules du NP des disques intervertébraux chez l’homme.

La baisse de l’apport nutritionnel vers le disque a été impliquéedepuis longtemps dans la dégénérescence du disque. Les facteurs

evier Masson SAS. Tous droits réservés.

umati

qlvda[ldd

uupbeBlmtmc

nlddcNediftlên

2

2d

itNdd(omllds1

2

tA5dc

J. Liu et al. / Revue du rh

ui limitent l’apport sanguin vers le disque, comme fumer [9],’athérosclérose [10] et une baisse accrue de l’apport des nutrimentsers les cellules du disque, sont associés à la dégénérescence duisque. La calcification de la plaque de cartilage, comme observéu cours du vieillissement et dans certaines atteintes du disque11,12], conduit à une chute de la perméabilité des plaques ce quiimite le transport des nutriments dans le disque [13–17]. La pertee perméabilité des plaques de cartilage est aussi associée à laégénérescence du disque [18].

BNIP3 (Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa-interacting protein 3) estn membre de la famille des protéines mitochondriales Bcl-2 ayantn seul domaine (BH3) homologue à Bcl-2 ; BNIP3 est une protéinero-apoptotique [19]. Dans des conditions normales, BNIP3 est fai-lement exprimée dans une grande variété de cellules, où ellest surtout localisée dans le cytosol [19,20]. Mais en hypoxie,NIP3 est rapidement surexprimée, puis est adressé du cytosol vers

a mitochondrie avec son extrémité C-terminale insérée dans laembrane externe de la mitochondrie tandis que sa partie N-

erminale reste dans le cytosol [21]. Après son insertion dans laembrane, BNIP3 induit des dysfonctionnements mitochondriaux

onduisant à la mort de la cellule [22,23].Dans cette étude, nous faisons l’hypothèse que durant la dégé-

érescence du disque, des changements d’apport nutritionnel danse microenvironnement des cellules du NP augmentent l’expressione BNIP3, ce qui conduit à son insertion dans la membrane externee la mitochondrie et à la baisse du potentiel de membrane mito-hondrial (� m), et finalement induit l’apoptose des cellules duP. Pour tester cette hypothèse, nous avons recherché l’expressiont la localisation de BNIP3 dans les cellules du NP en culture, suite àes carences en oxygène, en glucose et en sérum. Nous démontrons

ci que BNIP3 est surexprimée, transloquée vers la mitochondrie etait baisser le potentiel de membrane mitochondrial (� m). Nosravaux montrent pour la première fois l’expression de BNIP3 danses cellules du NP durant la carence nutritionnelle. BNIP3 pourraittre impliquée dans l’apoptose des cellules du NP, mais la détermi-ation de son rôle exact nécessite encore de nouveaux travaux.

. Méthodes

.1. Isolement et culture des cellules du noyau pulpeux desisques caudaux

Les cellules de NP de rats Sprague–Dawley de150–200 g ont étésolées des disques caudaux. Le NP a été extrait des deux moi-iés de chaque disque à l’aide d’un forceps et mis en pool. LesP ont subit une digestion enzymatique pendant quatre heuresans une solution de D-HANKS contenant 1 % (volume/volume)’antibiotiques/antimycotiques (Gibco Life Technologies), 0,2 %poids/volume) de protéase (type II). Le tissu digéré et la solutionnt été filtrés avec un filtre Falcon de 40 �m pour éliminer les frag-ents non digérés (Fahrenheit, Milton Keynes, Royaume-Uni) et

avés trois fois par centrifugation (5 min à 1118 G). Typiquement,es cellules ont été maintenues en culture pendant trois jours soitans des conditions standard (21 % d’O2, 5 mM glucose, 10 % SVF),oit dans des conditions variables (DMEM sans glucose, sans SVF et% d’O2).

.2. Viabilité cellulaire et test d’apoptose

La mortalité cellulaire a été estimée par exclusion du bleu

rypan. L’apoptose a été estimée en utilisant le kit Annexine V-lexa Fluor® 488/cellules mortes (Invitrogen, États-Unis). Ajouter�L d’Annexine V-Alexa Fluor® 488 et 1 �L d’iodure de propi-ium (solution stock à 100 �g/mL) pour 100 �L de suspensionellulaire. Incuber les cellules à température ambiante pendant

sme 79 (2012) 156–161 157

15 minutes. Après la période d’incubation, ajouter 400 �L de tam-pon 1X de fixation de l’Annexine, mélanger doucement et maintenirles échantillons sur la glace. Analyser les cellules marquées parcytométrie en flux, aussi rapidement que possible, en mesurantl’émission de fluorescence à 530 nm et 575 nm (ou équivalent)après excitation à 488 nm.

2.3. Analyse cytofluorimétrique du potentiel mitochondrialtransmembranaire (� m)

� m a été mesuré en utilisant un colorant mitochon-drial : la sonde lipophilique cationique 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1 ; Invi-trogen, États-Unis). Les suspensions de cellules témoins et decellules traitées ont été incubées dans le noir, dans du milieucomplet contenant 10 �g/mL de JC-1 pendant dix minutes à 37 ◦C.Par la suite, les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS à4 ◦C et analysées par cytométrie en flux avec un FACScan (Bec-ton Dickinson, New York, États-Unis) équipé d’un seul laser argonémettant à 488 nm. La longueur d’onde d’excitation était de 488 nmet l’émission de fluorescence par JC-1 à été mesurée à 530 nm. Lesdonnées ont été acquises en mode liste et analysées avec le logicielCellQuest (Becton Dickinson, New York, États-Unis).

2.4. Analyse de l’expression des gènes par RT-PCR en temps réel

Les ARN totaux ont été isolés des cellules à l’aide du mini kitRNeasy (Qiagen, Valencia, CA) et ont été rétro-transcrits en ADNcomplémentaires. Les amorces sens et anti-sens des gènes ciblesont été obtenus chez Integrated DNA Technologies (Coralville, IA).Les amorces utilisées sont les suivantes : BNIP3 sens, 5′-CGC TCCCAG ACA CCA CAA GAT AC-3′, et BNIP3-2 anti-sens : 5′-CCG ACTTGA CCA ATC CCA TAT CC-3′ ; GAPDH sens, 5′-TCC TCC TGA GCG CAAGTA CTC T-3′, et anti-sens, 5′-GCT CAG TAA CAG TCC GCC TAG AA-3′. Le kit Absolute QPCR SYBR Green Mix (ABgene, Rochester, NY)a été utilisé pour les analyses par RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) en temps réel. L’amplification a étéeffectuée dans un appareil à PCR (PCR System 7500, Applied BiosyStems, États-Unis) avec comme conditions cinq minutes à 94 ◦C,suivies de 30 cycles de 30 secondes à 94 ◦C, 30 secondes à 52 ◦C et30 secondes à 72 ◦C.

2.5. Immunocytochimie

Les cellules du NP ont été cultivées sur des lamelles traitéespar de la poly-L-lysine et après traitement, les cellules ont étémarquées avec du Mitotracker 500 nM (Invitrogen, États-Unis) pen-dant 45 minutes à 37 ◦C. Après trois lavages en PBS, les cellules ontété fixées pendant dix minutes par du paraformaldehyde 4 %, puisperméabilisées avec du Triton X-100 0,2 % pendant 30 minutes àtempérature ambiante. Les cultures ont été ensuite lavées dansdu PBS et incubées dans une solution de blocage (PBS sérum dechèvre 5 %). Après lavages PBS, les cellules ont été incubées avec unanticorps de lapin anti-BNIP3 (dilution 1:200 en PBS, Abcam, États-Unis) à 37 ◦C pendant une heure. Les cellules ont été lavées deuxfois dans du PBS et incubées avec un anticorps secondaire de chèvreanti-lapin couplé à l’Alexa Fluor 488 (dilution 1:500 en PBS, Invi-trogen, États-Unis) pendant une heure à 37 ◦C. Ensuite, les cellules

ont été incubées avec du Hoechst 33258 (Beyotime, CHN) pendantdix minutes à température ambiante. Les lamelles ont ensuite étémontées sur des lames de verre et des images ont été acquises etanalysées à l’aide d’un microscope Leica Microsystems CMS (Leica,GER).

1 umatisme 79 (2012) 156–161

2

pva(IpélII

2

piptDrpppeU

2

ttc

3

3d

réalcmutt

3

dgnqdcc1

58 J. Liu et al. / Revue du rh

.6. Analyse par western blot

Les échantillons protéiques ont été séparés sur des gels deolyacrylamide 10 % et transférés sur des membranes de poly-inylidene difluoride (PVDF). Les anticorps primaires étaient :nti-BNIP3 polyclonal (1:500, Abcam, États-Unis), anti-GAPDH1:2000, Sigma, États-Unis). L’anticorps secondaire était un anti-gG de souris fait chez la chèvre et couplé à l’HRP (horseradisheroxidase ; 1:10 000, Abcam, États-Unis). L’immuno-empreinte até révélée par le substrat chémiluminescent ECL (Amersham) et’image a été captée à l’aide d’un FluorChem 8900 imager (Alphannotech). Les bandes ont été quantifiées en utilisant le logicielmageJ du NIH.

.7. Activité caspase-3

La génération de p-nitroaniline (pNA) à partir du substrat tetra-eptidique Ac-DEVD-pNA (Beyotime, CHN) a été utilisée comme

ndex de l’activité caspase-3. Brièvement, les cellules cultivées enlaque six puits ont été lavées dans du PBS et lysées avec 100 �L deampon de lyse (Beyotime, CHN) sur la glace pendant 15 minutes.ix microlitres de lysat cellulaire ont été ajoutés à un mélange

éactionnel contenant 80 �L de tampon de réaction (20 mM Hepes,H = 7,5, 50 mM NaCl, 2,5 mM dithiothreitol), et 10 �L de Ac-DEVD-NA, puis incubés pendant une heure à 37 ◦C. La densité optique duNA libre a été mesurée (longueur d’onde d’absorption : 405 nm)n utilisant un spectrophotomètre à microplaques (DYNEX, États-nis).

.8. Analyse statistique

Les différences entre échantillons ont été comparées en effec-uant une analyse de variance monoparamétrique (one-way Anovaest). Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme étant signifi-ative.

. Résultats

.1. Morphologie des cellules du noyau pulpeux de disque caudale rat

Les cellules du NP fraîchement isolées de disques caudaux deat ont été observées au microscope. La plupart des cellules du NPtaient rondes, pleines de petites vacuoles et extrêmement larges,pproximativement 100 nm de diamètre, ce qui est en accord aveca littérature. Les cellules du NP n’adhéraient pas au flacon deulture jusqu’aux jours 6 à 8, et leurs formes changeaient égale-ent vers une morphologie élargie et polygonale avec une large et

nique vacuole. Cependant, les cellules NP adhérentes proliféraientrès lentement, même après quatre semaines en culture, comme lesrois semaines précédentes (Fig. 1).

.2. Tests de viabilité cellulaire et de l’apoptose

Une baisse de la viabilité cellulaire dépendante du temps a étéétectée dans les cellules de NP cultivées dans du DMEM sanslucose ni SVF sous 1 % d’O2 en comparaison avec les conditionsormales de culture (Fig. 2A). L’apoptose était détectée par mar-

uage des cellules avec l’AnnexineV-Alexa Fluor® 488 et l’ioduree propidium. Le résultat montre une augmentation du pour-entage de cellules apoptotiques dépendante du temps dans lesellules de NP cultivées dans du DMEM sans glucose ni SVF sous% d’O2 comparées aux conditions normales (Fig. 2B).

Fig. 1. Morphologie des cellules du noyau pulpeux (NP). A. Cellules fraîchementisolées de disque caudal de rat (200×). B. Morphologie des cellules du NP après unesemaine de culture (200×).

3.3. Analyse par cytofluorimétrie du potentiel transmembranairemitochondrial (� m)

Nous avons étudié ensuite si l’apoptose cellulaire induite parcarence nutritionnelle impliquait un changement de� m, commeobservé dans les analyses par FACScan des cellules marquées avecle colorant mitochondrial JC-1 (Fig. 3). Dans les cellules témoins,environ 94 % des cellules montraient une double florescence verteet rouge, cependant, dans des conditions de carence nutrition-nelle, on observait une baisse du pourcentage de cellules présentantune double florescence verte et rouge dépendante du temps,approximativement 92 % en 24 heures, 87 % en 48 heures et 84 %en 72 heures, indiquant un changement apparent dans le potentieltransmembranaire mitochondrial (� m).

3.4. Évaluation de l’expression génique par RT-PCR en temps réel

Pour déterminer si la carence nutritionnelle augmentaitl’expression de bnip3, nous avons utilisé la RT-PCR en temps réel.L’expression relative du gène bnip3 entre les cellules témoins et lescellules soumises à une carence nutritionnelle est résumée sur laFig. 4. Comparées aux témoins, les cellules cultivées en condition

J. Liu et al. / Revue du rhumatisme 79 (2012) 156–161 159

Fig. 2. Mort cellulaire induite par carence nutritionnelle des cellules du noyau pul-peux. Les cellules ont été cultivées en condition de carence nutritionnelle pendant24 heures, 48 heures, 72 heures et la mort cellulaire a été quantifiée. A. Viabilitécellulaire déterminée par exclusion du bleu trypan. B. Pourcentage de cellules apop-trr

ddpdum

Fnlac

Fig. 4. Expression relative de gènes cibles dans les cellules cultivées en condition decarence nutritionnelle et témoins évaluées par RT-PCR quantitative. En comparaisonavec les cellules témoins, une augmentation significative (*) des taux d’ARNm debnip3 a été observée dans les cellules soumises à une carence nutritionnelle pendant48 heures (moyenne : 755 ± 188 %, p < 0,05) et 72 heures (moyenne : 1034 ± 358 %,p < 0,05). Il n’y a pas eu de changements significatifs par rapport aux témoins dans

blement exprimée et localisait dans le compartiment cytosolique

otiques déterminé par le test Annexin V-FITC – Iodure de Propidium. Les résultatseprésentent les moyennes ± SE de trois expériences. * : différence significative parapport au témoin (p < 0,05) ; CN : carence nutritionnelle.

e carence nutritionnelle montraient une augmentation des taux’ARNm de bnip3 de 1,45 fois (en moyenne 145 ± 52 %, p > 0,05)our 24 heures, une augmentation de 7,55 fois des taux d’ARNm

e bnip3 (en moyenne 755 ± 188 %, p < 0,05) pour 48 heures, etne augmentation de 10,34 fois des taux d’ARNm de bnip3 (enoyenne 1034 ± 358 %, p < 0,05) pour 72 heures.

ig. 3. Analyses par cytométrie en flux des cellules témoins et en carence nutrition-elle traitées par JC-1. Les cellules ont été incubées avec JC-1 comme décrit dans

a section Matériels et méthodes et analysé par cytométrie en flux. Les résultats,nalysés en dot plots, sont représentatifs de trois expériences indépendantes. CN :arence nutritionnelle.

les cellules soumises à une carence nutritionnelle pendant 24 heures (moyenne :145 ± 52 %, p = 0,795). CN : carence nutritionnelle.

3.5. Immunocytochimie

L’étape initiale dans l’induction de la mort cellulaire parBNIP3 est l’adressage de la protéine vers la membrane externede la mitochondrie. Pour déterminer si la carence nutrition-nelle augmentait l’expression de BNIP3 et son adressage vers lamitochondrie, des expériences de microscopie confocale ont étéconduites avec un anticorps anti-BNIP3 couplé à un fluorochrome,les mitochondries étant marquées en rouge profond avec le Mito-tracker et les noyaux avec du Hoechst 33258. Dans les cellulessoumises à une carence nutritionnelle, on a observé une aug-mentation d’expression de BNIP3 dépendante du temps et unelocalisation mitochondriale. Dans le même temps, ces mêmes cel-lules subissaient une fragmentation nucléaire, une pycnose et unecaryolyse, tandis que dans les cellules témoins, BNIP3 restait fai-

(Fig. 5).

Fig. 5. Adressage de BNIP3 vers la mitochondrie et intégration dans la membraneau cours de la carence nutritionnelle. Distribution subcellulaire de BNIP3 analyséepar marquage immunofluorescent. Après carence nutritionnelle pendant 24 heures,les cellules ont été marquées par un anticorps anti-BNIP3 couplé à un fluorochrome(vert), avec du Mitotracker (rouge profond) qui marque les mitochondries, et duHoechst 33258 qui marque les noyaux en bleu. DIC : contraste de phase (differential-interference-contrast) ; CN : carence nutritionnelle.

160 J. Liu et al. / Revue du rhumati

Fig. 6. Adressage de BNIP3 vers la mitochondrie au cours de la carence nutrition-nelle. A. Western blot représentatif montrant la quantité de BNIP3 dans les lysatsde cellules entières. B. Quantification de BNIP3 dans les lysats de cellules entières.C. Western blot représentatif montrant la quantité de BNIP3 dans les lysats de mito-cdt

3

m7éuttad

mmaaBli

3

dsS(clqc

TR

Cl

hondries. D. Quantification de BNIP3 dans les lysats de mitochondries. Les valeurses quantifications ont été représentées sous forme de facteur par rapport au groupémoin. * : différence significative par rapport au témoin (p < 0,05), n = 3.

.6. Analyse de l’expression de BNIP3 par western blot

Les cellules de NP de rat ont été soumises à des conditions nor-ales de culture ou en carence nutritionnelle pendant 24, 48 et

2 heures, respectivement. Les niveaux d’expression de BNIP3 ontté déterminés par western blot. La carence nutritionnelle a induitne augmentation d’expression de la protéine BNIP3 en fonction duemps (Fig. 6A et B), BNIP3 était exprimée à bas niveau en condi-ions normales, tandis que la carence nutritionnelle induisait uneugmentation rapide de son expression au cours des 72 heures’observation.

Pour déterminer comment fonctionne BNIP3, nous avons exa-iné la localisation subcellulaire de BNIP3, des fractions deitochondries ont été préparées et analysées par western blot

vec un anticorps anti-BNIP3. Des témoins utilisant des anticorpsnti-Cox IV ont été utilisés pour les fractions mitochondriales.NIP3, induite par carence nutritionnelle, localisait surtout dans

es fractions mitochondriales, confirmant les résultats obtenus parmmunocytochimie (Fig. 6C et D).

.7. Analyse de l’activité caspase-3

Pour déterminer si l’apoptose cellulaire était caspase-épendante, l’activité caspase-3 a été mesurée dans unpectrophotomètre à microplaques après carence nutritionnelle.elon les densités optiques obtenues avec les lysats cellulairesTableau 1), durant les 72 heures de la période d’observation, laarence nutritionnelle n’a pas induit de changement significatif de

’activité caspase-3 en comparaison avec le lysat témoin, suggérantue l’apoptose induite par carence nutritionnelle pourrait êtreaspase-indépendante.

ableau 1ésultats des valeurs de densité optique (valeur moyenne ± déviation standard).

Échantillon Témoin CN 24 h CN 48 h CN 72 h

DO 0,069 ± 0,004 0,068 ± 0,001a 0,071 ± 0,002a 0,069 ± 0,003a

N : carence nutritionnelle ; DO : densité optique. Les valeurs de DO qui reflètent’activité caspase-3 ont été mesurées avec un spectrophotomètre à microplaques.

a Pas de différence significative par rapport au témoin (p > 0,05).

sme 79 (2012) 156–161

4. Discussion

Les disques intervertébraux sont situés entre les corps verté-braux et les lient ensemble. Ils sont les principales articulations dela colonne vertébrale et occupant un tiers de sa taille. Leur rôleprincipal est mécanique, puisqu’ils transmettent constamment lescharges venant du poids du corps et de l’activité musculaire viala colonne vertébrale [24,25]. Les disques intervertébraux sont desstructures complexes constituées par un fin anneau externe de car-tilage fibreux appelé l’annulus fibrosus, qui entoure un cœur plusgélatineux appelé le nucleus pulposus ; le NP est pris en sandwichau-dessus et en dessous par des plateaux de cartilage hyalins. LeNP central est le plus grand tissu avascularisé du corps humain,contenant une faible densité (approximativement 5000/mm3) decellules notochordales géantes et de petites cellules proches deschondrocytes [26].

Avec la progression en âge et la dégénérescence, le microenvi-ronnement du NP central change, devenant de plus en plus acideavec une disponibilité plus faible en nutriments comme l’oxygène,le glucose et ainsi de suite. Des travaux ont montré que durantla dégénérescence du disque, la mort des cellules du NP pouvaitégalement survenir, incluant l’apparition de nécrose et d’apoptose[27,28]. L’apoptose des cellules du NP central apparaît comme étantle résultat du vieillissement et de la détérioration progressive dudisque, et à son tour, la mort cellulaire accélère le vieillissementdu disque et sa dégénérescence [28,29]. Cependant, le mécanismeexact de la mort des cellules du NP est toujours inconnu.

BNIP3 est un membre de la sous-famille des protéines Bcl-2 contenant seulement un domaine BH3 homologue. Bien qu’ilmanque les domaines BH1 et BH2 caractéristiques de la familleBcl-2, BNIP3 a en commun le domaine d’interaction BH3 [30].L’expression de BNIP3 est régulée au niveau de sa transcription et,une fois induite, les taux protéiques augmentent et la protéine vientse localiser dans la membrane externe des mitochondries [31]. Dif-férents travaux ont montré que la surexpression de BNIP3 induitla mort cellulaire à la fois dans les cellules de rongeur et les cel-lules humaines [32]. De plus, BNIP3 semble jouer un rôle importantdans la mort cellulaire induite par hypoxie dans les cardiomyocytes[33], et les cellules neuronales [34], suggérant son implication dansla pathogenèse de maladies liées à une carence en oxygène ou ennutriments.

Le mécanisme de mort cellulaire induite par BNIP3 n’est tou-jours pas clair. Suite à son insertion dans la membrane externe de lamitochondrie, BNIP3 forme un hétérodimère avec Bcl-2 et Bcl-X(L)ou un dimère avec une autre protéine BNIP3 pour initier la mortcellulaire [35]. Ce mode d’induction de la mort cellulaire peut êtrecaspase-dépendant ou indépendant et peut passer par le relargagede cytochrome c [36], d’AIF ou d’EndoG par la mitochondrie [37,38].De plus, BNIP3 peut rapidement conduire à des dysfonctionne-ments mitochondriaux par interaction directe avec les protéinesVDAC/porin et ANT conduisant à l’ouverture d’un complexe poly-protéique mitochondrial appelé pore de transition de perméabilité(PTP), dissipant ainsi le potentiel transmembranaire mitochondrial(� m) [39,40]. La perte rapide du� m peut conduire à un épui-sement en ATP, un désordre en ion calcium et la destruction del’intégrité de la membrane, initiant finalement la mort cellulaire.

Dans cette étude, nous avons cultivé des cellules du NP dansdes conditions de carence nutritionnelle qui sont similaires aumicroenvironnement lors de la dégénérescence du disque hypoxiesévère, concentration de glucose basse et faible apport en protéinessériques. En comparaison avec les cellules témoins cultivées avec

un apport en nutriments suffisant, nous avons trouvé que les cel-lules en carence nutritionnelle sur-exprimaient BNIP3, montrant àla fois une augmentation des taux d’expression du gène et de la pro-téine, particulièrement après plus de 48 heures de culture. De plus,la protéine était majoritairement transloquée dans la mitochondrie,

umati

cf3nmcbrddlcqdiqcl

dettlBnl

D

t

R

c

R

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

J. Liu et al. / Revue du rh

omme observé par immunocytochimie et par western blot sur desractions cellulaires. Dans le même temps, les activités caspase-des cellules cultivées en conditions normales et en carenceutritionnelle ont été mesurées, cependant, les résultats n’ont pasontré de changements significatifs entre les deux conditions de

ulture. De plus, nous avons mesuré aussi le potentiel transmem-ranaire mitochondrial (� m) et la viabilité cellulaire. Comme lesésultats l’ont montré, le potentiel transmembranaire mitochon-rial (� m) a chuté lorsque l’apoptose cellulaire a augmenté, leseux survenant simultanément avec l’expression de BNIP3, spécia-

ement après culture de plus de 48 heures. Pris dans leur ensemble,es résultats suggèrent que la protéine BNIP3 pourrait être impli-uée dans la mort cellulaire observée dans les régions centraleses NP déficients en nutriments. De plus, le type de mort cellulaire

nduite par BNIP3 semble être caspase-indépendant. Par consé-uence, le blocage de l’expression de bnip3 pourrait donner auxellules du NP un avantage de survie leur permettant d’échapper à’apoptose induite par carence nutritionnelle.

L’inconvénient de cette étude est que les cellules du NP poussentans une trame de collagène in vivo, mais ont été cultivéesn monocouche dans cette étude, ce qui pourrait changer cer-aines caractéristiques cellulaires. De plus, bien que nous ayonsrouvé une expression de BNIP3 lorsque survient l’apoptose cellu-aire, cela montre juste un phénomène et un possible lien entreNIP3 et l’apoptose cellulaire. Nous avons besoin de poursuivreos recherches pour élucider le mécanisme exact qui relie BNIP3 à

’apoptose des cellules du NP.

éclaration d’intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en rela-ion avec cet article.

emerciements

Subvention : National Natural Science Foundation of China ;ontract grant number: 30872601.

éférences

[1] Crock HV, Goldwasser M, Yoshizawa H. Vascular anatomy related to the inter-vertebral disc. In: Ghosh P, editor. The biology of the intervertebral disc. BocaRaton (FL): CRC Press; 1988. p. 109–33.

[2] Urban JP, Holm S, Maroudas A, et al. Nutrition of the intervertebral disk. Anin vivo study of solute transport. Clin Orthop 1977:101–14.

[3] Holm S, Maroudas A, Urban JP, et al. Nutrition of the intervertebral disc: solutetransport and metabolism. Connect Tissue Res 1981;8:101–19.

[4] Stairmand J, Holm S, Urban J. Factors influencing oxygen concentrationgradients in the intervertebral disc: a theoretical analysis. Spine 1991;16:444–9.

[5] Ishii T, Tsuji H, Sano A, et al. Histochemical and ultrastructural observations onbrown degeneration of human intervertebral disc. J Orthop Res 1991;9:78–90.

[6] Thompson JP, Pearce RH, Schechter MT, et al. Preliminary evaluation of ascheme for grading the gross morphology of the human intervertebral disc.Spine 1990;15:411–5.

[7] Yasuma T, Koh S, Okamura T, et al. Histological changes in aging lumbar inter-vertebral discs. Their role in protrusions and prolapses. J Bone Joint Surg Am1990;72:220–9.

[8] Taylor JR, Twomey LT. The role of the notochord and blood vessels in verte-bral column development and in the aetiology of Schmorl’s nodes. In: Grieve

J, editor. Modern manual therapy. Edinburgh: Churchill Livingstone; 1986. p.21–9.

[9] Battie MC, Videman T, Gill K, et al. Smoking and lumbar intervertebral discdegeneration: an MRI study of identical twins. Spine 1991;16:1015–21.

10] Kauppila LI, Penttila A, Karhunen PJ, et al. Lumbar disc degeneration and athe-rosclerosis of the abdominal aorta. Spine 1994;19:923–9.

[

sme 79 (2012) 156–161 161

11] McFadden KD, Taylor JR. Endplate lesions of the lumbar spine. Spine1989;14:867–9.

12] Roberts S, Menage J, Eisenstein SM. The cartilage end-plate and intervertebraldisc in scoliosis: calcification and other sequelae. J Orthop Res 1993;11:747–57.

13] Aoki J, Yamamoto I, Kitamura N, et al. End plate of the discovertebral joint:degenerative change in the elderly adult. Radiology 1987;164:411–4.

14] Brown MD, Tsaltas T. Studies on the permeability of the intervertebral discduring skeletal maturation. Spine 1976;1:240–4.

15] Hassler O. The human intervertebral disc. A micro-angiographical study of itsvascular supply at various ages. Acta Orthop Scand 1970;40:765–72.

16] Roberts S, Urban JPG, Evans H, et al. Transport properties of the human cartilageendplate in relation to its composition and calcification. Spine 1996;21:415–20.

17] Urban MR, Fairbank JC, Etherington PJ, et al. Electrochemical measurement oftransport into scoliotic intervertebral discs in vivo using nitrous oxide as atracer. Spine 2001;26:984–90.

18] Nachemson A, Lewin T, Maroudas A, et al. In vitro diffusion of dye through theend-plates and annulus fibrosus of human lumbar intervertebral discs. ActaOrthop Scand 1970;41:589–607.

19] Lee H, Paik SG. Regulation of BNIP3 in normal and cancer cells. Mol Cells2006;2:1–6.

20] Vande Velde C, Cizeau J, Dubik D, et al. BNIP3 and genetic control of necrosis-like cell death through the mitochondrial permeability transition pore. Mol CellBiol 2000;20:5454–68.

21] Ray R, Chen G, Vande Velde C, et al. BNIP3 heterodimerizes with Bcl-2/BclXLand induces cell death independent of a Bcl-2 homology3 (BH3) domain at bothmitochondrial and nonmitochondrial sites. J Biol Chem 2000;275:1439–48.

22] Chen GR, Ray R, Dubik D, et al. E1B 19K Bcl-2 binding protein Nip3 is a dimericmitochondrial protein that activates apoptosis. J Exp Med 1997;186:1975–83.

23] Yan J, Yun H, Yang Y, et al. Upregulation of BNIP3 promotes apoptosis oflung cancer cells that were induced by p53. Biochem Biophys Res Commun2006;346:501–7.

24] Twomey LT, Taylor JR. Age changes in lumbar vertebrae and intervertebral discs.Clin Orthop 1987;224:97–104.

25] Roberts S, Menage J, Urban JPG. Biochemical and structural properties ofthe cartilage end-plate and its relation to the intervertebral disc. Spine1989;14:166–74.

26] Maroudas A, Nachemson A, Stockwell R, et al. Some factors involved in thenutrition of the intervertebral disc. J Anat 1975;120:113–30.

27] Trout JJ, Buckwalter JA, Moore KC. Ultrastructure of the human intervertebraldisc: II. Cells of the nucleus pulposus. Anat Rec 1982;204:307–14.

28] Gruber HE, Hanley EN. Analysis of aging and degeneration of the human inter-vertebral disc—comparison of surgical specimens with normal controls. Spine1998;23:751–7.

29] Buckwalter JA. Aging and degeneration of the human intervertebral disc. Spine1995;20:1307–14.

30] Webster KA, Graham RM, Bishopric NH. BNIP3 and signal specific programmeddeath in the heart. J Mol Cell Cardiol 2005;38:35–45.

31] Kubasiak LA, Hernandez OM, Bishopric NH, et al. Hypoxia and acidosis activatecardiac myocyte death through the Bcl-2 family protein BNIP3. Proc Natl AcadSci U S A 2002;99:12825–30.

32] Yasuda M, Han JW, Dionne CA, et al. BNIP3alpha: a human homolog of mito-chondrial proapoptotic protein BNIP3. Cancer Res 1999;59:533–7.

33] Regula KM, Ens K, Kirshenbaum LA. Inducible expression of BNIP3 provokesmitochondrial defects and hypoxia-mediated cell death of ventricular myo-cytes. Circ Res 2002;91:226–31.

34] Zhengfeng Z, Xuefen Y, Surong Z, et al. BNIP3 upregulation and EndoGtranslocation in delayed neuronal death in stroke and in hypoxia. Stroke2007;38:1606–13.

35] Goping IS, Gross A, Lavoie JN, et al. Regulated targeting of BAX to mitochondria.J Cell Biol 1998;143:207–15.

36] Prabhakaran K, Li L, Zhang L, et al. Upregulation of BNIP3 and translocationto mitochondria mediates cyanide-induced apotosis in cortical cells. Neuros-cience 2007;150:159–67.

37] Comelli M, Genero N, Mavelli I. Caspase-independent apoptosis in Friend’serythroleukemia cells: role of mitochondrial ATP synthesis impairment in relo-cation of apoptosis-inducing factor and endonuclease G. J Bioenerg Biomembr2009;41:49–59.

38] Kook SH, Son YO, Chung SW, et al. Caspase-independent death of humanosteosarcoma cells by flavonoids is driven by p53-mediated mitochondrialstress and nuclear translocation of AIF and endonuclease G. Apoptosis 2007;12:1289–98.

39] Shimizu S, Konishi A, Kodama T, et al. BH4 domain of anti-apoptotic Bcl-2 family

members closes voltage-dependent anion channel and inhibits apoptoticmitochondrial changes and cell death. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:3100–5.

40] Zhang L, Li L, Liu K, et al. HIF-1alpha activation by a redox-sensitive pathwaymediates cyanide-induced BNIP3 upregulation and mitochondrial-dependentcell death. Free Radic Biol Med 2007;43:117–27.