Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Vanina Pogačar

Raznolikost patogenih bakterija porodice Anaplasmataceae u pasa

na području Republike Hrvatske

Diplomski rad

Zagreb, 2014.

ii

«Ovaj rad izrađen je u Laboratoriju za parazitologiju na Hrvatskom veterinarskom

institutu, pod voditeljstvom dr.sc. Relje Becka i suvoditeljstvom doc.dr.sc. Duje

Lisičića. Rad je predan na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog

fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra eksperimentalne

biologije.»

iii

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek Diplomski rad

RAZNOLIKOST VRSTA IZ PORODICE ANAPLASMATACEAE U

PASA NA PODRUČJU REPUBLIKE HRVATSKE

Vanina Pogačar

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb

Porodica Anaplasmataceae dio je obitelji malih unutarstaničnih proteobakterija koja

obuhvaća rodove Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia, Wolbachia, Aegiptianella i

Candidatus Neoehrlihia. Ove bakterije preživljavaju kao unutarstanični endosimbionti,

no istovremeno mogu uzrokovati bolesti ljudi i životinja. Bakterije roda Anaplasma

prenose se vektorima (krpelji šikare), a na području Europe najznačajniji je krpelj vrste

Ixodes ricinus. Vrste iz porodice Anaplasmataceae je složeno uzgojiti na staničnim

kulturama kao i dokazati u kliničkim uzorcima različitim bojanjima, stoga se u

istraživanjima koriste molekularne metode. U ovom diplomskom radu analizirani su

uzorci DNA izolirani iz krvi pasa arhive Laboratorija za parazitologiju Hratskog

veterinarskog instituta. DNA je naprije umnožena lančanom reakcijom polimeraze

„nested“ protokolom, a dijelovi 16S rRNA gena potom su sekvencionirani te analizirani

odgovarajućim programima. Budući da ne postoje podaci o vrstama prisutnim u RH,

cilj je bio istražiti koje su vrste iz roda Anaplasmataceae prisutne u pasa u Hrvatskoj te

utvrditi učestalost pojedinih vrsta. Od ukupno 68 uzoraka pasa u njih 22 pronađena je

DNA bakterija iz porodice Anaplasmataceae. Najzastupljenija je bila vrsta A. platys

(64 %) a pronađene su i vrste A. phagocytophilum (18 %) te Wolbachia, endosimbiont

Dirofilaria repens (18 %).

( 30 stranica, 11 slika, 4 tablice, 33 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici

Ključne riječi: unutarstanične bakterije, endosimbionti, Anaplasma platys, Anaplasma

phagocytophilum, Wolbachia, 16S rRNA

Voditelj: Dr. sc. Relja Beck

Suvoditelj: Dr.sc Duje Lisičić, doc.

Ocjenitelji: Dr. sc. Jasna Hrenović, izv. prof., Dr. sc. Božena Mitić, red. prof.

Rad prihvaćen: 10. listopada 2014.

iv

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb

Faculty of Science

Department of Biology Graduation Thesis

THE DIVERSITY OF PATOGENIC BACTERIA WITHIN THE

ANAPLASMATACEAE FAMILY IN DOGS FROM CROATIA

Vanina Pogačar

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Croatia

Anaplasmataceae is part of a family of small intracellular proteobacteria which

includes the genera Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia, Wolbachia, Aegyptianella

and Candidatus Neoehrlihia. These bacteria survive as endosymbionts in other cells,

but at the same time can cause diseases in humans and animals. Bacteria of the genus

Anaplasma are transmitted by vectors (ticks), and the most important in Europe is the

tick species Ixodes ricinus. Species of family Anaplasmataceae are complicated to

grow in cell cultures as well as to prove them in clinical samples by different coloring,

therefore the research is based on molecular methods. This thesis analyzed the samples

of DNA isolated from the blood of dogs belonging to the archives of the Laboratory of

parasitology of the Croatian veterinary institute. DNA was amplified by polymerase

chain reaction "nested" protocol, 16S rRNA gene parts sequenced and analyzed in the

appropriate programs. As there are no data on the species present in Croatia the goal

was to investigate which species of the genus Anaplasmataceae are present in dogs

from Croatia and to determine the frequency of certain species. From a total of 68

samples of dogs in 22 of them the DNA of bacteria from the family Anaplasmataceae

was found. The most abundant species was A. Platys (64 %) and species A.

phagocytophilum (18 %) and Wolbachia, endosimbiont of Dirofilaria repens (18 %)

also were found.

(30 pages, 11 figures, 4 tables, 33 references, original in: Croatian)

Thesis deposited in the Central Biological library

Key words: intracellular bacteria, endosymbiont, Anaplasma platys, Anaplasma

phagocytophilum, Wolbachia, 16S rRNA

Supervisor: Dr. Relja Beck

Co-supervisor: Dr. Duje Lisičić, Asst. Prof.

Reviewers: Dr. Jasna Hrenović, Assoc. Prof., Dr. Božena Mitić, Prof.

Thesis accepted: October 10, 2014

v

SADRŽAJ

1. UVOD .............................................................................................................................................. 1

1.1. Porodica Anaplasmataceae ................................................................................................................ 1

1.2. Najvažniji predstavnici ...................................................................................................................... 2 1.2.1. Anaplasma phagocytophilum ..................................................................................................... 2 1.2.2. Anaplasma platys ....................................................................................................................... 3 1.2.3. Erlichia canis ............................................................................................................................. 4

1.3. Rasprostranjenost vrsta bakterija iz porodice Anaplasmataceae ....................................................... 4

1.4. Prijenos vrsta bakterija iz porodice Anaplasmataceae ...................................................................... 6

1.5. Patogeneza bakterija iz porodice Anaplasmataceae .......................................................................... 7

1.6. Klinička slika ..................................................................................................................................... 9

1.7. Genetska identifikacija ...................................................................................................................... 9

1.8. Cilj istraživanja ................................................................................................................................ 10

2. MATERIJAL I METODE ....................................................................................................... 11

2.1. Materijali ......................................................................................................................................... 11 2.1.1. Uzorci DNA pasa ..................................................................................................................... 11 2.1.2. Specifične početnice ................................................................................................................ 11

2.2. Metode ............................................................................................................................................. 12 2.2.1. Protokol ................................................................................................................................... 12 2.2.2. Izdvajanje DNA ....................................................................................................................... 12 2.2.3. Lančana reakcija polimeraze.................................................................................................... 12 2.2.4. „Nested“ PCR .......................................................................................................................... 13 2.2.5. Pročišćavanje PCR produkata .................................................................................................. 14 2.2.6. Sekvenciranje ........................................................................................................................... 15 2.2.7. Analiza sekvenci ...................................................................................................................... 16

3. REZULTATI ............................................................................................................................... 17

4. RASPRAVA ................................................................................................................................ 23

5. ZAKLJUČAK ............................................................................................................................. 26

6. LITERATURA ........................................................................................................................... 27

ŽIVOTOPIS ......................................................................................................................................... I

vi

POPIS KRATICA

ATL – pufer za razgradnju tkiva i stanica (prema eng. animal tissue lysis)

BLAST – algoritam za pretraživanje sličnosti u slijedovima (prema eng. basic local

alignment search programme)

DNA – deoksiribonukleinska kiselina

HGE – humana granulocitna erlihioza

HME – humana monocitna erlihioza

PCR – lančana reakcija polimerazom (prema eng. polymerase chain reaction)

PSGL-1 – P selektin glikoprotein ligand 1

RNA – ribonukleinska kiselina

rRNA – ribosomalna RNA

TBF – groznica uzrokovana krpeljima (prema eng. tick borne fever)

1

1. UVOD

1.1. Porodica Anaplasmataceae

Porodica Anaplasmataceae je skupina malih intracelularnih proteobakterija,

visoko srodnih mitohondrijima, koja obuhvaća rodove Anaplasma, Ehrlichia,

Neorickettsia, Wolbachia, Aegyptianella i Candidus Neoehrlichia unutar reda

Rickettsiales (Slika 1) (Dunning Hotopp i sur. 2006). Ove bakterije preživljavaju kao

endosimbionti pretežno u krvotvornim stanicama sisavaca te mogu, ali i ne moraju,

uzrokovati bolesti ljudi i životinja. Bakterije iz porodice Anaplasmataceae inficiraju

beskralješnjake koji su u izobilju prisutni u okolišu, poput krpelja, kukaca, metilja,

oblića ili mekušaca. Za sve rodove osim Wolbachie poznato je da inficiraju

kralješnjake, sisavce ili ptice. Bakterije napadaju samo određene stanice domaćina, kao

što su neutrofili, monociti i makrofagi, trombociti, eritrociti ili endotelne stanice, gdje

se umnažaju i stvaraju makrokolonije u citoplazmatskim vakuolama. Tip stanice koju

će bakterija napasti ovisi o vrsti bakterije (Pruneau i sur. 2014).

Slika 1. Rodoslovno stablo porodice Anaplasmataceae izrađeno na temelju

sekvenca 16S rRNA gena (Rikihisa 2010)

2

Unutar porodice Anaplasmataceae najbolje su proučene bakterije Anaplasma

phagocytophilum i Ehrlichia chaffeensis, koje inficiraju ljude. Ovisno o vrsti stanica u

kojoj bakterija parazitira, u ljudi su opisana dva oblika bolesti: humana monocitna

erlihioza (HME) i humana granulocitna erlihioza (HGE). Uzročnici humane monocitne

erlihioze su: Ehrlichia canis, E. caffeensis i Neorickettsia sennestsu, dok su uzročnici

humane granulocitne erlihioze A. phagocytophilum i A. ewingii. Humana monocitna i

granulocitna erlihioza zabilježene su u mnogim dijelovima SAD-a, a u posljednjih

nekoliko godina zabilježeni su slučajevi humane anaplazmoze u nekim europskim

zemljama pa i u Hrvatskoj. Najvažniji rezervoari A. phagocytophilum su glodavci,

osobito vrste Apodemus sylvaticus, A. flavicolis te Chletrinomys glereolus (Cvetnić

2013).

Trenuto je poznato osam vrsta iz porodice Anaplasmataceae koje inficiraju pse:

Ehrichia canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. ruminantium, Anaplasma platys, A.

phagocytophilum, Neorickettsia helminthoeca i N. risticii (Hisashi 2005).

1.2. Najvažniji predstavnici

1.2.1. Anaplasma phagocytophilum

Najučestaliji predstavnik je Anaplasma phagocytophilum, bakterija koja uzrokuje

granulocitnu anaplazmozu različitih životinja (pasa, konja, goveda, ovaca, koza) i ljudi.

Uzročnik je sistematiziran 2001. godine u jedinstvenu vrstu temeljem genske tipizacije,

a do tada je bio poznat kao Ehrlichia equi u konja, uzročnik humane granulocitne

erlihioze te kao A. phagocytophila. Ovaj unutarstanični parazit inficira granulocite gdje

stvara makrokolonije („morule“) u citoplazmatskim vakuolama. Naziv „morula“ uzet

je iz latinske riječi za dud na kojeg izgledom podsjeća (Slika 2). Citoplazmatske morule

i vakuole variraju u veličini od 1.5 µm do 6 µm promjera. Bakterije su pleomorfne, ali

većinom dolaze u kokoidom ili elipsoidnom obliku. Ponašanje A. phagocytophilum

izvan stanice domaćina, s obzirom na obligatni parazitizam, nije dovoljno dobro

proučeno. Jedini učinkovit način da se organizam očuva izvan žive stanice jest

3

krioprezervacija na -114 °C. Na taj način stanice mogu ostati infektivne više od šest

mjeseci nakon smrzavanja (Stuen 2007).

Slika 2. Morula unutar granulocita (preuzeto: https://lookfordiagnosis.com)

1.2.2. Anaplasma platys

Bakterija Anaplasma platys vrlo je patogena za pse te uzrokuje pseću cikličku

trombocitopeniju. Prvi put je detektirana 1978. godine u SAD-u (Harvey i sur. 1978),

a dokazana je u svim dijelovima svijeta. U literaturi je možemo pronaći pod starim

imenom Erlichia platys. Prenosi se krpeljima, prvenstveno vrstom smeđeg psećeg

krpelja Rhipicephalus sanguineus, ali je moguć prijenos i nekim drugim

člankonošcima. Uništava trombocite te izaziva letargiju, anoreksiju, petehije, groznicu.

Infekcija se može dijagnosticirati bojanjem morula unutar trombocita pomoću boje

Giemsa, imunološkim testom ELISA, no najosjetljiviji i najsigurniji test je PCR. Kod

ljudi infekcija bakterijom A. platys nikad nije zabilježena (Cote 2011).

4

1.2.3. Erlichia canis

Bakterija Ehrichia canis uzrokuje pseću monocitnu erlihiozu (CME). Prvi put je

opisana 1935. godine u Alžiru. Bakterija se lokalizira u retikuloendotelnim stanicama

jetre, slezene i limfnih čvorova gdje se replicira prvenstveno u makrofazima i

limfocitima. E. canis prenosi se putem smeđeg krpelja vrste Rhiphicephalus

sanguineus koji je raširen diljem svijeta, a osobito u tropskim i suptropskim

područjima. Kod pseće monocitne erlihioze postoje tri kliničke faze: akutna,

subklinička i kronična. Bolest se očituje povišenom tjelesnom temperaturom,

depresijom, gubitkom tjelesne mase, krvarenjem, gastrointestinalnim poteškoćama te

poremećajima disanja. Laboratorijski nalazi ukazuju na trombocitopeniju, leukopeniju

i anemiju. Bolest je bila od posebnog značaja za vrijeme Vijetnamskog rata zato što je

prouzročila smrt stotina američkih vojnih pasa (Aguirre i sur. 2004; Keysary i sur.

1996).

1.3. Rasprostranjenost vrsta bakterija iz porodice Anaplasmataceae

Bakterija A. phagocytophylum uzrokuje granulocitnu anaplazmozu pasa, jelena,

mačaka, konja, preživača, glodavaca i ljudi, a može se naći na području Europe, SAD-

a i Azije. Bakterija A. chaffeensis inficira jelene, pse i ljude uzrokujući pseću erlihiozu

te humanu monocitnu erlihiozu. Najučestalija je na području SAD-a, Južne Amerike i

Azije. A. marginale i E. ruminantium inficiraju samo domaće i divlje preživače gdje

uzrokuju goveđu anaplazmozu te bolest vodenastog srca (eng. heartwater). Goveđa

anaplazmoza je najrasprostranjenija krpeljna bolest, prisutna je u tropskim i

subtropskim regijama širom svijeta. Bolest vodenastog srca prisutna je u subsaharskoj

Africi, na Karibima te otocima Indijskog oceana, a izaziva smrtnost preživača te

smanjuje produktivnost stada što uzrokuje i vrlo visoke financijske štete uzgajivača.

Rasprostranjenost bakterija iz porodice Anaplasmataceae te njihove pripadajuće

vektore i domaćine prikazuje Tablica 1 (Brenner 2005).

5

Tablica 1. Domaćini, vektori, geografska distribucija te pripadajuće bolesti za navedene

vrste iz porodice Anaplasmataceae (preuzeto iz knjige Bergeyes manual of systematic

bacteriology, 2005)

Vrsta Domaćin Vektor Bolest Geografska distribucija

A.

phagocytophilum

Čovjek, jelen,

pas, mačka,

konj, preživači,

glodavci

Krpelj Ixodes

spp.

Granulocitna

anaplazmoza,

HGA, Krpeljna

groznica

preživača

SAD, Europa, Azija

A. marginale Stoka, divlji

preživači

Krpelj

Rhicephalus

microplus,

Dermacentor

Goveđa

anaplazmoza

Širom svijeta u tropskim

i suptropskim regijama

E. chaffeensis Čovjek, jelen,

pas

Krpelj

Amblyomma

americanum

Monocitna

erlihioza, Pseća

erlihioza

SAD, Južna Amerika, i Azija

E. ruminantium Stoka, ovca,

koza, divlji

preživači

Krpelj African

Amblyomma sp.

uključujući

variegatum i

hebraeum

Vodenasto srce

(Heartwater)

Subsaharska Afrika,

Madagascar, Karibi

Wolbachia spp. oblić Brugia

malayi,

člankonožac

Anopheles

gambiae

nepoznato

nepoznato

Širom svijeta

6

1.4. Prijenos vrsta bakterija iz porodice Anaplasmataceae

Bakterije iz porodice Anaplasmataceae prenose se prvenstveno krpeljima.

Najvažniji su Riphicephalus sanguineus i Ixodes ricinus. Smeđi pseći krpelj

Rhipicephalus sanguineus važan je prijenosnik uzročnika raznih bolesti (Slika 3).

Krpelja R. sanguineus možemo naći širom svijeta no češći je u toplijim područjima.

Kako bi završio svoj životni ciklus ovom krpelju potrebna su mu tri hranjenja: kao

ličinka, kao nimfa te nakon preobrazbe u odrasli oblik. Nakon hranjenja pušta trenutnog

domaćina, a nakon preobrazbe u idući razvojni stadij traži novog (Dantas-Torres 2010).

Na području Europe najčešći prijenosnik je šumski krpelj vrste Ixodes ricinus (Slika 4).

Ixodes ricinus ima sličan razvojni stadij kao R. sanguineus. Krpelj može povećati svoju

masu nekoliko puta nakon hranjenja. Dobro nahranjene ženke mogu izleći i do 5 000

jajašaca (Bedrica i Marinculić 2006). Prevalencija infekcije krpeljem I. ricinus može

varirati od jedne geografske regije do druge kao i od stadija razvoja. Primijećena je

veća učestalost infekcije kod nimfa nego kod larva ili odraslih jedinki. Učinkovitost

prijenosa također ovisi o drugim faktorima koji uključuju istovremeno hranjenje više

krpelja na istoj jedinci te imunitet domaćina (Stuen 2007).

U nekim dijelovima Engleske, otkriveno je da prijenosnik groznice uzrokovane

krpeljima (TBF, prema eng. tick borne fever) može biti i Haemophysalis punctata. U

istočnom dijelu SAD-a češćim prijenosnikom pokazao se I. scapularis.

Vrste iz roda Neorickettsia i Wolbachia mogu se prenositi i transovarijalnim i

transstadijalnim prijenosom, dok kod rodova Anaplasma i Ehrlichia postoji samo

transstadijalni prijenos. Transstadijalni prijenos podrazumijeva prijenos od ličinke

preko nimfe do odraslog stadija krpelja dok se transovarijalni prijenos odnosi na onaj s

roditelja na potomke. Infektivne bakterije mogu preživjeti unutar krpelja i više od

godinu dana. Bakterije roda Anaplasma uspješno preživljavaju proces presvlačenja

krpelja i infektivne su već prilikom idućeg hranjenja (Woldehiwet 2010).

7

Slika 3. Ixodes ricinus Slika 4. Rhipicephalus sanguineus

(Preuzeto: www.influentialpoints.com) (Preuzeto: www.plagasenred.com.ar)

1.5. Patogeneza bakterija iz porodice Anaplasmataceae

Točni mehanizmi nastanka bolesti koje uzrokuju bakterije roda Anaplasma još su

u procesu istraživanja. Zaražene stanice in vitro podliježu lizi eritrocita te nekrozi ili

apoptozi. In vivo infekcija može biti povezana s hemolitičkom anemijom za vrstu A.

marginale i nespecifičnom bolešću iskazanom leukopenijom, blagom anemijom,

trombocitopenijom i blagim oštećenjem jetre kod vrste A. phagocytophilum. Anemija

uzrokovana A. marginale najčešće je rezultat direktne lize eritrocita. A. platys uzrokuje

cikličku trombocitopeniju povezanu s nastankom morula u trombocitima periferne krvi.

Poznata su dva mehanizma razaranja trombocita: direktno, kao posljedica replikacije

bakterije, ili indirektno, kao posljedica imunološke reakcije (Brenner 2005).

Bakterije roda Anaplasma prianjaju na površinske glikozilirane proteine stanice

svog domaćina. Površinski receptor A. phagocytophilum je P selektin glikoprotein

ligand 1 (PSGL-1) (Troese 2009). Nakon prianjanja, bakterija endocitozom ulazi u

stanicu i ostaje u vakuolama koje su u slučaju A. phagocytophilum rani endosomi.

8

Bakterijske stanice umnožavaju se unutar citoplazmatske vakuole nakon čega nastaju

stanice čvrste jezgre koje zatim egzocitozom izlaze iz stanice (Slika 5). A.

phagocytophilum onemogućava normalnu funkciju neutrofila uključujući motilitet,

fagocitozu, mehanizam oksidativnog praska, interakcije neutrofila s endotelom te

ometa regulaciju apoptoze (Carrade 2009).

Slika 5. Ulazak bakterije iz porodice Anaplasmataceae u stanicu

te stvaranje „morula“ (Rikihisa 2010)

9

1.6. Klinička slika

Karakteristični simptomi u zaraženih sisavaca su visoka temperatura, manjak

apetita, inkluzije u neutrofilima, neutropenija i trombocitopenija (Engvall i Egenvall

2002). Zabilježena je pojava pobačaja i smanjene spermatogeneze kod ovaca i goveda

(Woldehiwet i Scott 1993). Na ozbiljnost infekcije utječe nekoliko faktora kao što su

vrsta anaplazme, drugi patogeni, dob, imunološki status i opće stanje domaćina.

Klinički simptomi kod ljudi variraju od blagih, simptoma sličnih gripi, do infekcije

opasne po život. Međutim, većina ljudskih infekcija rezultira minimalnim ili nikakvim

kliničkim manifestacijama (Dumler i sur. 2005). Infekcija bakterijama porodice

Anaplasmataceae uspješno se liječi antibioticima iz skupine tetraciklina.

1.7. Genetska identifikacija

Identifikacija i klasifikacija bakterijskih vrsta iz porodice Anaplasmataceae vrši se

analizom 16S rRNA, komponenti malih podjedinica prokariotskih ribosoma. 16S

rRNA geni evolucijski su visoko uščuvani pa se stoga koriste za ranu dijagnostiku i

konstrukciju filogenetskih stabala. Izuzev 16s rRNA također se koriste vrlo

konzervirani geni ankA, groESL, msp2 ili msp4 (Stuen 2007).

Osim razlikovanja vrsta na ovaj način moguće je razlučiti i sorte bakterija koje

mogu varirati u stupnju patogenosti. Pa se tako postojanje manjih razlika u 16S rRNA

sljedova koristi za identifikaciju varijanti A. phagocytophilum koje inficiraju ljude. Pet

varijanti A phagocytophilum sa značajnim razlikama u 16S rRNA slijedu je otkriveno

da inficiraju pse (Stuen 2007).

10

1.8. Cilj istraživanja

Vrste iz porodice Anaplasmataceae složeno je uzgojiti na staničnim kulturama te

ih je teško dokazati u kliničkim uzorcima različitim bojanjima. Stoga se u

istraživanjima koriste molekularne metode, a najčešće lančana reakcija polimerazom i

posljedično sekvenciranje umnoženih dijelova 16S rRNA ili drugih gena. Budući da ne

postoje podaci o vrstama prisutnim u Hrvatskoj, cilj ovog diplomskog rada jest istražiti

koje su vrste iz obitelji Anaplasmataceae prisutne u pasa te utvrditi učestalost pojedinih

vrsta.

11

2. Materijal i metode

2.1. Materijali

2.1.1. Uzorci DNA pasa

Korišteni su uzorci DNA iz krvi pasa arhive Laboratorija za parazitologiju

Zagrebačkog veterinarskog instituta. Uzorkovanje je prethodno napravljeno na 68 pasa

stacioniranih u Zagrebu, Splitu, Visu, Puli te Imotskom. U slučaju zagrebačkih pasa

radilo se o vojnim psima koji su se kretali diljem zemlje te nije moguće ustvrditi točnu

lokaciju u trenutku infekcije nekom od bakterija iz porodice Anaplasmataceae.

2.1.2. Specifične početnice

Za dokazivanje vrsta unutar rodova anaplazmi i erlihija umnažan je ciljni odsječak

male podjedinice ribosomalne rRNA. Korišteni su parovi početnica ge3a i ge3r za

primarnu reakciju kojom su dobiveni odsječci veličine oko 932 pb. U sekundarnoj

reakciji „nested“ PCR-a, korištene su početnice ge9f i ge2 za dobivanje manjeg

odsječka od oko 546 pb (Chen i sur. 1994). Slijed nukleotida korištenih početnica

pokazan je u Tablici 2.

Tablica 2. Prikaz početnica, slijeda nukleotida te veličina umnoženog dijela DNA

Početnica: Slijed nukleotida: Veličina odsječka:

ge3a (5′ CACATGCAAGTCGAACGGATTATTC)

ge10r (5′ TTCCGTTAAGAAGGATCTAATCTCC) 932 pb

ge9f (5′ AACGGATTATTCTTTATAGCTTGCT)

ge2 (5′ GGCAGTATTAAAAGCAGCTCCAGG) 546 pb

12

2.2. Metode

2.2.1. Protokol

DNA izolirana iz krvi pasa umnožena je lančanom reakcijom polimeraze. Zatim su

izolirani uzorci koji su se elektroforezom dokazali pozitivnima. Na njima je provedena

sekundarna reakcija metodom „nested“ PCR-a. Dobiveni uzorci pročišćeni su te poslani

na sekvenciranje u tvrtku Macrogen (Amsterdam, Nizozemska). Sekvence su potom

analizirane računalnim programom Lasergen te uspoređene sa poznatim genomima

pohranjenim u bazi podataka GenBank.

2.2.2. Izdvajanje DNA

Za izdvajanje DNA korišten je komercijalni kit DNA blood and tissue (Qiagen,

Hilden, Njemačka) te automatski sustav za izdvajanje DNA „QIACUBE“ (Qiagen,

Hilden, Njemačka) prema uputama proizvođača. U ranije pripremljene uzorke dodano

je 180 μl pufera ATL i 20 μl proteinaze K. Ovako pripremljena mješavina vrtložena je

15 sekundi i centrifugirana na 14 000 okr/min tijekom jedne minute kako bi se oborile

sve čestice. Uzorci su potom inkubirani 18 sati pri temperaturi od 56 ºC. Nakon

završene inkubacije uzorci su prebačeni u automatski sustav za izdvajanje DNA

„QIACUBE” u kojem su ranije uložene i obilježene kolone te puferske otopine AL,

AW1 i AW2, 99,6 % etanol te otopina AE za ispiranje vezane DNA. Nakon završetka

automatske izolacije dobiveno je 200 μl izdvojene DNA koja će dalje biti korištena za

analizu PCR-om.

2.2.3. Lančana reakcija polimeraze

Lančana reakcija polimeraze korištena je kako bi se specifično umnožili ciljani

odsječci DNA pojedinih uzročnika. U svakoj reakciji korištene su specifične uzvodne i

nizvodne početnice, smjesa za PCR Emerald (Takara, Japan), voda slobodna od

RNA/DNA-za i ranije izdvojena DNA. Ukupan volumen po PCR reakciji bio je 50 μl,

a sastojala se od 25 μl smjese za PCR, po 1 μl svake početnice specifične za ciljane

mikroorganizme, 18 μl vode te 5 μl DNA. Reakcije su se odvijale u uređajima za PCR

13

Veriti, 2720 i 9700 (Applied Biosystems). Pri umnažanju ciljanih uzročnika korištene

su i pozitivne te negativne kontrole.

Nakon inicijalne 15-minutne denaturacije DNA, uslijedilo je 40 ciklusa kao što je

prikazano u Tablici 3.

Tablica 3. Protokol lančane reakcije polimerazom

Ciklusi PCR reakcije: Temperatura: Vrijeme:

1. denaturacija DNA 94 ºC 30sec

2. prihvaćanje početnica 55 ºC 30sec

3. sinteza komplementarnih lanaca 72 ºC 60sec

4. završno produženje lanaca 72 ºC 7min

reakcija je zaustavljena 4 ºC

2.2.4. „Nested“ PCR

Pomoću lančane reakcije polimerazom moguće je umnožiti specifične sljedove

DNA iz složene mješavine DNA. Moguće je dizajnirati početnicu kako bi se umnožio

određeni lokus iz čitavog genoma. Od jednog predloška molekule moguće je umnožiti

više od milijardu kopija PCR produkta, i to u relativno kratkom periodu. Međutim,

specifičnost PCR-a određena je specifičnošću početnica pa tako, ako se zadana

početnica može vezati za više nego jedan lokus, postoji mogućnost umnožavanja više

od jednog odsječka DNA.

Kako bi se kontrolirala specifičnost željenog produkta, koristi se sekundarna PCR

reakcija odnosno „nested“ PCR. „Nested“ PCR koristi početnice specifične za regiju

unutar već umnoženog dijela DNA. U slučaju da se u primarnoj PCR reakciji umnožio

krivi odsječak vjerojatnost da će se ista pogreška ponoviti i u sekundarnoj reakciji vrlo

je malena. Tako se dobivaju visoko specifični i kraći PCR produkti (Slika 6).

14

Slika 6. Shematski prikaz metode „nested“ PCR ( preuzeto:

http://www.ivpresearch.org/nested_pcr.htm)

2.2.5. Pročišćavanje PCR produkata

Prije određivanja nukleotidnog slijeda nužno je provesti pročišćavanje proizvoda

PCR reakcije. Za pročišćavanje proizvoda PCR-a korišten je QIAquick PCR

Purification Kit (Qiagen, Hildden, Njemačka) prema uputama proizvođača. QIAquick

PCR Purification Kit omogućuje pročišćavanje PCR proizvoda veličine od 100 bp do

10 kb uklanjanjem svih zaostalih molekula. Metoda se bazira na svojstvu silikonske gel

membrane, koja se nalazi u kolumnama, da selektivno veže DNA u uvjetima visoke

koncentracije soli dok sve druge molekule prolaze kroz membranu.

15

2.2.6. Sekvenciranje

Sekvenciranje je metoda određivanja slijeda nukleotida u željenoj sekvenci DNA

ili RNA. Najčešće je korištena Sangerova dideoksi metoda otkrivena 1977. godine, a

koristi se i danas (Slika 7). Klasična metoda zahtijeva kalup DNA, DNA-polimerazu,

početnicu, deoksiribonukleotide (dNTP) i dideoksiribonukleotide (ddNTP) koji

zaustavljaju replikaciju DNA. DdNTP-ovi mogu biti radioaktivno ili, u ovom slučaju,

fluorescentno obilježeni. Kako bi se odredile sve četiri baze, provode se četiri različita

reakcijska postupka. Pritom se dobivaju lanci različite duljine, a završni nukleotid je

označen bojom. Lanci se razdvajaju po veličini i tako se određuje točan slijed

nukleotida (Sanger 1977).

Slika 7. Sangerova metoda sekvencioniranja (preuzeto iz rada: Sequencing: how is

DNA read?, Olena Morozova, Genome BritishColumbia, 2009)

16

Tvrtka Macrogen koristi automatski sustav ABI 3730xl (Applied Biosystems) koji

se bazira na Sangerovoj metodi. Fragmenti se odvajaju pomoću kapilarne elekroforeze,

a ddNTP-ovi se očitavaju pomoću fluorescentnih signala eksicitranih laserom,

sprektralno odvojenih i uhvaćenih CCD kamerom.

2.2.7. Analiza sekvenci

Dobivene sekvence su obrađene u programu Lasergen s pripadajućim

potprogramima SeqMan i EditSeq. Obrađene sekvence provučene su kroz internetsku

bazu poznatih genoma GenBank pomoću tražilice BLAST (Basic Local Alignment

Search Tool) te je određena pripadnost vrsti bakterije iz porodice Anaplasmataceae.

17

3. Rezultati

U svrhu ovog istraživanja analizirano je 68 uzoraka DNA metodom „nested“

lančane reakcije polimeraze. Metodom kapilarne elektroforeze pozitivnima su se

pokazala 22 uzorka što čini 32 % ukupnog broja uzoraka. Drugim riječima, gotovo

jedna trećina uzoraka sadržavala je DNA neke od bakterija iz porodice

Anaplasmataceae (Slika 8).

Slika 8. Grafički prikaz udjela inficiranih jedinki u ukupnom broju testiranih pasa

Kao negativna kontrola korištena je voda bez RNA/DNA-za, a kao pozitivna

kontrola DNA A. phagocytophilum iz arhiva Laboratorija za parazitologiju Hrvatskog

veterinarskog instituta. Rezultati elektroforeze prikazani su na Slici 9. Negativna

kontrola ukazuje na to da pri provođenju reakcije PCR nije bilo kontaminacije.

Pozitivna kontrola s uzorkom DNA A. phagocytophilum dokazuje dobru provedbu svih

koraka PCR-a.

neinficirani psi68%

inficirani psi32%

Udio inficiranih jedinki u ukupnom uzorku

neinficirani psi inficirani psi

46

22

18

Slika 9. Rezultati elektroforeze nakon sekundarne reakcije “nested” PCR-om.

Pozitivni rezultati označeni su plavim kružićem, negativna kontrola zelenim

kvadratićem a pozitivna kontrola ružičastim peterokutom.

Slika se nastavlja na idućoj stranici.

19

Slika 9. Rezultati elektroforeze nakon sekundarne reakcije “nested” PCR-om.

Pozitivni rezultati označeni su plavim kružićem, negativna kontrola zelenim

kvadratićem a pozitivna kontrola ružičastim peterokutom

20

Pozitivni uzorci (n = 22) umnoženi PCR metodom pomoću selektivnih početnica

poslani su dalje na sekvenciranje. Analizom dobivenih sekvenci pronađeno je

podudaranje s tri različite vrste iz porodice Anaplasmataceae: A. platys, A.

phagocytophilum i Wolbachia sp. Prema dobivenim sekvencama, u 14 uzoraka

potvrđena je 100 % podudarnost s izolatom A. platys. Navedeni izolat pohranjen je u

bazi podataka GenBank pod pristupnim brojem: KC525894.1. Za 4 uzorka tražilicom

BLAST pronađena je 100 % podudarnost s izolatom A. phagocytophilum, pohranjenim

pod pristupnim brojem: NC_007797. Također, u 4 uzorka dokazana je vrsta Wolbachia

endosimbiont oblića Dirofilaria repens. Dobivena sekvenca imala je 100 %

podudarnost s izolatom pohranjenom u GenBank-u pod pristupnim brojem: AJ276500.

Zastupljenost pojedine vrste u ukupnom broju testiranih uzoraka iznosi 64 % za A.

platys te 18 % za vrstu A. phagocytophilum, kao i za vrstu Wolbachia sp. Grafički

prikaz raspodijele pronađenih vrsta prikazuje Slika 10.

Slika 10. Grafički prikaz raspodjele pronađenih vrsta Anaplasmataceae

A. platys64%

Wolbachia18%

A. phagocytophilum

18%

Pronađene vrste

A. platys

Wolbachia

A. phagocytophilum

21

Uzorci krvi pasa uzeti su s područja Pule, Splita, Imotskog, Visa te Zagreba. U

slučaju većine zagrebačkih pasa radilo se o vojnim psima koji su putovali diljem zemlje,

pa ne možemo ustvrditi točnu lokaciju gdje je došlo do ugriza krpelja. Od 22 pozitivna

uzorka, 13 jedinki pasa ima nepoznatu lokaciju ugriza krpelja, a za 8 jedinki lokacija

ugriza je poznata. Broj pronađenih vrsta iz porodice Anaplasmataceae prema mjestu

prebivališta pasa prikazano je u Tablici 4.

Tablica 4. Broj pronađenih vrsta iz porodice Anaplasmataceae prema mjestu

prebivališta pasa

Na Slici 11. možemo vidjeti geografsku rasprostranjenost uzoraka poznatog

podrijetla u Hrvatskoj. Deset uzoraka krvi pasa A. platys bilo je nepoznatog podrijetla,

no za dva uzorka poznato je da su iz Splita, a po jedan s Visa te iz Imotskog. Krv pasa

u kojima je pronađena Wolbachia sp. uzorkovana je u Puli, Zagrebu te Imotskom, dok

jedna lokacija nije poznata. Bakterija A. phagocytophilum utvrđena je u jednom uzorku

krvi psa iz Zagreba te tri uzorka nepoznatog podrijetla.

22

Slika 11. Geografska rasprostranjenost vrsta bakterija iz porodice Anaplasmataceae u

Hrvatskoj prema poznatim lokacijama uzorkovanja krvi pasa

23

4. Rasprava

Ovo istraživanje o raznolikosti i učestalosti vrsta iz porodice Anaplasmataceae u

pasa prvo je takvo provedeno u Hrvatskoj. S obzirom na to da do sada nisu napravljena

slična istraživanja u Hrvatskoj, dobivene rezultate možemo usporediti jedino s

istraživanjima u Europi te dijelovima svijeta podneblja sličnog ovim prostorima te s

istraživanjima o prevalenciji krpelja prijenosnika. Poznato je osam vrsta koje su

patogene za pse, od kojih četiri obitavaju na području Europe. To su: A. platys, A.

phagocytophilum, E. canis i E. chaffeensis. S obzirom na to, moglo bi se pretpostaviti

da su prisutne i u Hrvatskoj. Pronađene su bakterije A. platys i A. phagocytophilum, te

bakterija Wolbachia endosimbiont oblića Dirofilaria repens. U ovom istraživanju

nismo naišli na vrste A. chaffeensis i E. canis.

Psi su bili testirani bez obzira na prisutnost ili odsutnost simptoma. Od 68 uzoraka

22 uzorka dokazala su prisutnost traženih vrsta. Ispostavilo se da je gotovo jedna trećina

pasa u Hrvatskoj inficirana nekom od bakterija iz porodice Anaplasmataceae.

Poznato je da A. platys, uzročnik cikličke trombocitopenije, obitava pretežno u

mediteranskim zemljama, no postoji vrlo malo zapisa o pojavljivanju ove bakterije na

području Balkana. Pseća infekcija A. platys dokazana je u SAD-u, Italiji, Francuskoj,

Grčkoj, Španjolskoj, Tajvanu, Tajlandu i Venezueli. Dijelomične sekvence 16S rRNA

gena A. platys potvrđene su također u pasa iz Australije, Kine i Japana (Hisashi i sur.

2002). Prvi zabilježeni slučaj infekcije bakterijom A. platys u psa iz Hrvatske opisan je

2012. godine u istraživanju u Njemačkoj, a radilo se o psu uvezenom iz Hrvatske u

Njemačku. Napravljen je krvni premaz te su pronađene bazofilne inkluzije u

trombocitima. Da je riječ o vrsti A. platys potvrđeno je lančanom reakcijom polimeraze

(Dyachenko i sur. 2012). U ovom istraživanju, bakterija A. platys dokazana je na više

lokaliteta, a možemo primjetiti veću učestalost na području Dalmacije. Klimatski uvjeti

u Dalmaciji slažu se s onima u Španjolskoj, Grčkoj, Italiji, Japanu i Izraelu gdje je

dokazana prisutnost ove bakterije. Osim toga, prevalencija vektora Riphicephalus

sanguineus također se ispostavila češćom u toplijim mediteranskim zemljama s

obzirom na to da je krpelj osjetljiv na niske temperature (Dantas- Torres 2010).

24

Bakterija A. phagocytophilum detektirana je u sisavaca i krpelja u gotovo svim

europskim zemljama (Strle 2004). Pronađena je u pasa (Bellstrom 1989), mačaka

(Bjoersdorff i sur. 1999), konja (Bjoersdorff i sur. 1990), lisica (Petrovac i sur. 2003),

divljih svinja (Petrovec i sur. 2002) i mnogih drugih. U ovom istraživanju dokazana je

prisutnost bakterije A. phagocytophilum na području Zagreba. Nalaz A.

phagocytophilum sukladan je informacijama o geografskoj distribuciji vektora ove

bakterije, krpelja Ixodes ricinus. Ixodes ricinus široko je rasprostranjen diljem Europe

pogotovo u kontinetalnim dijelovima no prevalencija mu se pokazala rjeđom u

mediteranskim područjima zbog nižeg stupnja vlage (Beugnet 2009). Za razliku od

krpelja Riphicephalus sanguineus koji je osjetljiv na nisku temperaturu, Ixodes ricinus

osjetljiv je na stupanj vlage, ne podnosi relativnu vlažnost okoliša nižu od 80 %

(Estrada-Pena 2006).

U četiri uzorka dokazan je rod Wolbachia endosimbiont oblića Dirofilaria repens.

Ovaj nalaz nam ukazuje da su navedeni psi bili zaraženi ne samo sa bakterijom

Wolbachia, već i s oblićem koji je prijenosnik. Dirofilaria je parazit iz koljena

Nematoda, a prirodno inficira pse, mačke, rakune i medvjede (Živičnjak i sur. 2006).

Godine 2010. provedeno je istraživanje o raširenosti dirofilarija na Istarskom

poluotoku. Rezultati su pokazali da je gotovo trećina (30.5 %) nasumice izabranih pasa

(n=200) zaražena rodom Dirofilaria, od čega je 45.9 % činila vrsta D. repens (Holler i

sur. 2010). Prema tome, dokaz bakterije Wolbachia endosimbionta D. repens u ovom

istraživanju nije iznenađujuć, posebice jer je jedan nalaz lociran upravo na području

Istre, u Puli. Osim u Istri, Wolbachia je pronađena i u drugim dijelovima Hrvatske.

Uzorak od 68 pasa mogao bi se smatrati preliminarnim istraživanjem koje je nužno

napraviti prvo na manjem broju uzoraka kako bi se ustanovilo da li je šire istraživanje

potrebno. Visoki udio od skoro trećine nasumično testiranih pasa koji su se ispostavili

kao nosioci neke od vrsta iz porodice Anaplasmataceae dobar je indikator kako bi

opsežnije istraživanje itekako bilo potrebno.

S obzirom na to da posljedice zaraze vrstama bakterija iz porodice

Anaplasmataceae mogu varirati od blagih do letalnih, a slično istraživanje do sad nije

rađeno, ispitati učestalost infekcije te identificirati vrste patogena prvi je važan korak

ka zaštiti pasa.

25

Ovim istraživanjem ukazana je potreba za daljnjim ispitivanjima

rasprostranjenosti, prevalencije, infektivnosti te vektorskog prijenosa bakterija iz

porodice Anaplasmataceae na većem broju uzoraka kako bi se dobili statistički

precizniji podaci o stanju zaraze pasa u Hrvatskoj. Buduća istraživanja trebala bi se

usmjeriti također na prevenciju zaraze. Jedan od pristupa mogao bi biti razvoj

učinkovitije zaštite od ugriza krpelja koji prenose zarazu. Unatoč mnogobrojnim

oblicima repelenata, ugrizi krpelja i dalje su vrlo česti. Drugi pristup mogao bi biti

razvoj cjepiva koja bi pružala zaštitu od same infekcije bakterijama. Trenutno

učinkovito cjepivo ne postoji.

26

5. Zaključak

Istraživanje je provedeno na 68 nasumično izabranih uzoraka krvi pasa arhive

Laboratorija za parazitologiju veterinarskog instituta. Cilj istraživanja bio je utvrditi

koje su vrste bakterija iz porodice Anaplasmataceae prisutne kao i utvrditi učestalost

pojedinih vrsta u pasa u Hrvatskoj.

Dokazana je prisutnost vrsta iz porodice Anaplasmataceae u 22 uzorka, odnosno

32 %. Utvrđena je prisutnost tri vrste: A. platys, A phagocytophilum i Wolbachia

endosimbiont oblića Dirofilaria repens.

Najučestalija vrsta sa 68% pokazala se A. platys, dok su A. phagocytophilum i

Wolbachia endosimbiont D. repens bile podjednako zastupljene sa udijelom od 18 %

PCR-om pozitivnih pasa.

Kako bi se detaljnije ispitala pojavnost i učestalost vrsta bakterija iz porodice

Anaplasmataceae u populaciji pasa u Hrvatskoj potrebno je napraviti šire istraživanje

na većem broju uzoraka.

27

6. LITERATURA

Aguirre E., Sainz A., Dunner S., Amusategui I., Lopez L., Rodrıguez-Franco F.,

Luaces I., Cortes O., Tesourod M. A. (2004): First isolation and molecular

characterization of Ehrlichia canis in Spain. Veterinary Parasitology 125: 365–372.

Bedrica Lj., Marinculić A. (2006): Krpelji šikare i bolesti uzrokovane nekim krvnim

patogenim organizmima pasa i mačaka. Hrvatski Veterinarski Vjesnik 2: 99-111-

Bellstrom L. (1989): Fastingburna rickettsioser. Svensk Veterinartidning 41: 549–

553.

Beugnet F., Marié J. L. (2009): Emerging arthropod borne diseases of companion

animals in Europe. Veterinary Parasitology 163: 298-305.

Bjoersdorff A., Svendenius L., Owens J.H. and Massung R.F. (1999): Feline

granulocytic ehrlichiosis – a report of a new clinical entity and characterisation of the

infectious agent. Journal of Small Animal Practice 40: 20–24.

Brenner J. D. (2005): Bergeys manual of systematic bacteriology, second edition,

volume two. Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State

University, East Lansing, MI 48824-4320, USA

Carrade D.D, Foley J.E., Borjesson D.L., Sykes J.E. (2009): Canine granulocytic

anaplasmosis: a review. Journal of Veterinary Internal Medicine 23: 1129–1141.

Chen, S. M., Dumler J. S., Bakken J. S., and Walker D. H. (1994): Identification of a

granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease. Journal

od Clinical Microbiology 32: 589–595.

Cvetnić Ž. (2013): Bakterijske i gljivične zoonoze. Medicinska nakada, Zagreb

28

Cote E. (2011): Clinical veterinary advisor dogs and cats. Elsevier, St. Louis

Dantas-Torres (2010): Biology and ecology of the brown dog tick, Rhipicephalus

sanguineus. Parasites & Vectors 3: 26.

Dyachenko V., Pantchev N., Balzer H. J., Meyersen A., Straubinger R. K. (2012):

First case of Anaplasma platys infection in a dog from Croatia. Parasites & Vectors 5:

49.

Dumler J. S., Choi K. S., Garcia J. C., Barat N. S., Scorpio D. G., Garyu J.W., Grab

D. J., Bakken J. S. (2005): Human granulocytic anaplasmosis and Anaplasma

phagocytophilum. Emerging Infectious Diseases 11: 1828–1834.

Dunning Hotopp J. C., Lin M., Madupu R., Crabtree J., Angiuoli S. V., Eisen J. A.

(2006): Comparative genomics of emerging human ehrlichiosis agents. PLoS

Genetics 2: e21.

Engvall E.O., Egenvall A. (2002): Granulocytic ehrlichiosis in Swedish dogs and

horses. Internal Journal of Medical Microbiology 291: 100–103.

Estrada-Pena A., Venzal M., Sanchez C. (2006): The tick Ixodes ricinus: distribution

and climate preferences in the western Palaearctic. Medical and Veterinary

Entomology 20: 189–197.

Harvey J. W., Simpson C. F., Gaskin J. M. (1978): Cyclic thrombocytopenia induced

by a Rickettsia-like agent in dogs. Journal of Infectious Diseases 137, 182–188.

Hisashi I., Kaori F., Koutaro M., Masaru O., Kenji N., Ryusei K., Munetaka H.,

Takafumi O. (2002) : Demonstration of Anaplasma (Ehrlichia) platys inclusions in

peripheral blood platelets of a dog in Japan. Veterinary parasitology 110: 145-52.

Hisashi I., Oyamada M., Kelly P. J., Jacobson L. A., Fournier P. E., Itamoto K.,

Okuda M., Brouqui P. (2005): Molecular Detection of a New Anaplasma Species

29

Closely Related to Anaplasma phagocytophilum in Canine Blood from South Africa.

Journal of Clinical Microbiology 43: 2934-2937.

Holler D., Racz A., Bošnir J., Petrak O. (2010): Raširenost dirofilarioze na području

unutrašnjosti istarskoga poluotoka. Medica Jadertina 40: 67-74.

Keysary A., Waner T., Rosner M., Warner C. K., Dawson J. E., Zass R., Biggie K. L.,

Harrus S. (1996): The first isolation, in vitro propagation, and genetic characterization

of Ehrlichia canis in Israel. Veterinary Parasitology 62, 331-340.

Pruneau L., Moumène A., Meyer D. F., Marcelino I., Lefrançois T., Vachiéry N.

(2014): Understanding Anaplasmataceae pathogenesis using “Omics” approaches.

Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 4: 86.

Petrovec M., Bidovec A., Sumner J. W., Nicholson W. L., Childs J. E. and Avsic-

Zupanc T. (2002): Infection with Anaplasma phagocytophila in cervids from

Slovenia: Evidence of two genotypic lineages. Wiener Klinische Wochenschrift 114:

641–647.

Petrovec M., Sixl W., Schweiger R., Mikulasek S., Elke L., Wust G., Marth E.,

Strasek K.Stunzner D. and Avsic-Zupanc T. (2003): Infections of wild animals with

Anaplasma phagocytophilum in Austria and the Czech Republic. Annals of the New

York Academy of Sciences 990: 103–106.

Rikihisa Y. (2010): Anaplasma phagocytophilum and Ehrlichia chaffeensis

subversive manipulation of host cells. Nature Reviews Microbiology 8: 328-339.

Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. (1977): DNA sequencing with chain-terminating

inhibitors. Journal of Molecular Microbiology 94: 441-448.

Strle F. (2004): Human granulocytic ehrlichiosis in Europe. International Journal of

Medical Microbiology 293: 27–35.

30

Stuen, S. (2007): Anaplasma phagocytophilum - the most widespread tick-borne

infection in animals in Europe. Veterinary Research Communications 31: 79–84.

Troese M. J., Carlyon J. A. (2009): Anaplasma phagocytophilum dense-cored

organisms mediate cellular adherence through recognition of human P-selectin

glycoprotein ligand 1. Infection and Immunity 77: 4018- 4027.

Woldehiwet Z. (2010): The natural history of Anaplasma phagocytophilum.

Veterinary parasitology 167: 108-122.

Woldehiwet Z., Scott G. R. (1993): Rickettsial and chlamydial diseases of domestic

animals. Pergamon Press 84: 233–254.

Živičnjak T., Martinkovic F., Beck R. (2006): Canine Dirofilariosis in Croatia. Spread

and public health impact. Proceedings of the 5th Croatian congress on infectious

diseases 23 – 2

Životopis

Vanina Pogačar rođena u Zagrebu 11.10.1988 godine završila je osnovnu školu

Voltino nakon čega upisuje Hotelijersko- turističku strukovnu školu. Po završetku

srednje škole 2007. godine upisuje smjer opće biologije na Prirodoslovno-

matematičkom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu. Nakon završene tri godine

preddiplomskog studija nastavlja školovanje na istom fakultetu upisom diplomskog

studija Eksperimentalne biologije, modul fiziologija i imunobiologija. 2011. Dobiva

posebnu Rektorovu nagradu za sudjelovanje u manifestaciji “Noć biologije” te iste

godine odlazi na studentski program “Work and travel” u SAD gdje usavršava engleski

jezik te stječe radno iskustvo. Treći semester diplomskog studija dobiva ERASMUS

stipendiju te odlazi na razmjenu studenata na Sveučilište u Gironi, Španjolska gdje

pohađa stručne kolegije kao i laboratorijsku praksu iz područja genetike. Koristi se

Microsoft Office programskim paketom.