Syllabus Celbiochemie (2011-2012) Deel I: Eigenschappen van eiwittenDe Cel Levende organismen zijn opgebouwd uit cellen. Een volwassen mens bestaat uit zon 100 miljard cellen, die tezamen de specifieke weefsels van ons lichaam vormen. Elk van die cellen bevat dezelfde genetische informatie (DNA) in de kern. Toch kunnen wij in ons lichaam zon 200 verschillende celtypen onderscheiden, waaronder hartspiercellen, zenuwcellen, huidcellen en oogcellen. Deze cellen verschillen van elkaar doordat zij andere gedeelten van het DNA aflezen tot RNA en eiwit. Een menselijke cel heeft een diameter van ongeveer 10 m. In de cel kunnen we verschillende organellen onderscheiden, die elk een specifieke functie hebben:

Celkern (nucleus): hierin ligt de genetische informatie van de cel opgeslagen (bij de mens in 2 x 23 chromosomen). Endoplasmatisch reticulum (ruw en glad): hierop vindt de eiwitsynthese plaats (via de Ribosomen). Mitochondrin: hierin vindt de productie van energie voor de cel plaats (ATP). Zij zijn waarschijnlijk ontstaan uit bacterin en bevatten hun eigen DNA.

1

Golgi-apparaat: hierin worden eiwitten bewerkt die gesynthetiseerd zijn in het endoplasmatisch reticulum, en die vervolgens naar plaatsen binnen en buiten de cel worden getransporteerd. Lysosomen: hierin worden afvalstoffen van de cel afgebroken. Plasma-membraan: vetachtige bilaag die het binnenste van de cel (Cytoplasma) afscheidt van de buitenwereld. Aan de binnenkant van de plasma-membraan zitten eiwitten die de cel hun vorm en stevigheid geven (Cytoskelet). Centriool: buisjes van eiwitten (microtubuli) die van belang zijn bij de celdeling.

Chemische Bindingen Atomen kunnen met elkaar een chemische binding aangaan door electronenparen met elkaar te delen. Wij spreken dan van een covalente binding, en deze wordt aangegeven met een streepje tussen de atomen. Covalente bindingen zijn sterk en kunnen niet eenvoudig worden verbroken door de temperatuur te verhogen, of door zouten of apolaire stoffen (zoals organische oplosmiddelen) toe te voegen. Daarnaast bestaan er niet-covalente interacties, waarbij het ene molecuul door een ander moleculen wordt aangetrokken of afgestoten. Voorbeelden zijn: - ionen in oplossing (Na+ en Cl-) - H2O moleculen die onderling H-bruggen vormen waarbij de - van het O-atoom een interactie aangaat met de + van de H-atomen. - Zeepmoleculen waarvan de vetachtige gedeelten bij elkaar gaan zitten om zich van water af te keren. Niet-covalente interacties zijn niet permanent, en daardoor juist erg gevoelig voor temperatuur, ionen en apolaire stoffen. Voor de structuur en functie van biologische macromoleculen zoals eiwitten, spelen nietcovalente interacties een belangrijke rol (zie bovenstaande figuur). Polaire groepen kunnen Hbruggen met elkaar vormen (vooral O-H en N-H met C=O), geladen groepen kunnen elkaar via ionogene interacties aantrekken (bijv. NH3+ en COO-) of juist afstoten (bijv. NH3+ en NH3+ ), terwijl apolaire groepen (bevatten vooral C en H-atomen) zich gezamenlijk van de waterige omgeving kunnen afkeren (hydrofobe interactie). H2O speelt zelf een belangrijke rol bij niet-covalente interacties: het kan zelf H-bruggen met macromoleculen vormen, het verzwakt ionogene interacties door zijn hoge dilectrische constante (wat nog versterkt wordt als er ionen zijn opgelost), en maakt hydrofobe interacties mogelijk.2

Biologische Macromoleculen Cellen bevatten naast water (H2O) en ionen (Na+, K+, Cl-, Ca2+, etc) ook organische verbindingen. Deze organische verbindingen kunnen langere ketens vormen (covalente binding) of spontaan clusters vormen (niet-covalente interactie), waardoor functionele macromoleculen ontstaan. De belangrijkste biologische macromoleculen met hun functie zijn: Eiwitten (aminozuren) Suikers (koolwaterstoffen) Nucleotiden Lipiden (vetten) Structuur cel; enzymen voor chemische reacties Energiebron; structuur bacterin en plantencellen Informatie (DNA, RNA); Energieoverdracht (ATP) Energiebron; Structuur membranen (nietcovalent)

Functie van eiwitten Eiwitten zijn de belangrijkste regelmoleculen van ons lichaam. Zij bestaan uit lineaire ketens van aminozuren. In de natuur worden slechts 20 verschillende aminozuren gebruikt om alle eiwitten mee te maken. De belangrijkste functies van eiwitten zijn: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Katalytische activiteit (enzym) Transportfunctie (transport stoffen over membranen) Structurele functie (cytoskelet: binnenkant cel; matrix-eiwitten: buitenkant cel) Beweging (spierwerking) Immuunsysteem (afweer tegen lichaamsvreemde stoffen) Signaalmoleculen (eiwithormonen zoals insuline) Signaaltransductie (herkenningseiwitten op het celoppervlak die signalen van buiten de cel in kunnen sturen)

Aminozuren De 20 aminozuren waaruit eiwitten zijn opgebouwd, zijn zogenoemde L--aminozuren. Zij bestaan uit een centraal C-atoom met daaraan een H, een NH2, een COOH groep, en een restgroep (R). Deze restgroep is voor ieder aminozuur verschillend. Het centrale C-atoom van de meeste aminozuren bindt vier verschillende chemische groepen, en is daarom asymmetrisch. Er bestaan dan ook twee vormen van deze aminozuren (D en L). De natuur gebruikt voor de opbouw van eiwitten uitsluitend de L-vorm. Eiwitten zijn lineaire ketens van aminozuren. Zij worden gevormd doordat de COOH groep van het ene aminozuur een covalente binding aangaat met de NH2 groep van een ander aminozuur. Er ontstaat dan een peptide binding (O=C-N-H) onder afsplitsing van H2O. Uiteindelijk zal in de ontstane eiwitketen altijd n aminozuur een vrije -NH2 groep bevatten3

(N-terminaal), en n aminozuur een vrije COOH groep (C-terminaal). De aminozuurvolgorde van een eiwit wordt altijd aangegeven van N-terminaal naar C-terminaal. Kleinere eiwitten worden ook wel (poly-)peptiden genoemd.

Chemische structuur van aminozuren

De R-groep van aminozuren, ook wel zijketen genoemd, kunnen COOH of NH2 groepen bevatten die een H+ kunnen afstaan of opnemen (zgn. ioniseerbare groep; zie pKR in onderstaande tabel). Aspartaat is de zoutvorm van Asparaginezuur, Glutamaat van Glutaminezuur. Asparagine en Glutamine (met een O=C-NH2 groep) zijn niet ioniseerbaar. Geladen en polaire zijketens zijn doorgaans hydrofiel, apolaire en aromatische zijketens hydrofoob (zie hydropathy index in onderstaande tabel).

4

Fysisch-chemische eigenschappen van aminozuren

5

De lading van aminozuren hangt af van de pH Alle 20 aminozuren die in eiwitten voorkomen, bevatten een COOH groep en een NH2 groep aan het centrale C-atoom (behalve Pro). Daarnaast kunnen zij een COOH groep (Glu; Asp) of een NH2 groep (Lys; Arg) in de zijketen bevatten. Een COOH groep kan als zuur een H+ afstaan; een NH2 groep kan als base een H+ opnemen. De ligging van elk zuur-base evenwicht hangt af van de pH volgens de Henderson-Hasselbach vergelijking. Met behulp van deze vergelijking is bij iedere pH te bepalen voor hoeveel procent een zure of basische groep is geoniseerd.

6

Berekening van het iso-electrisch punt van losse aminozuren en peptiden Van een klein eiwit (peptide) kan voor elke ioniseerbare groep (-COOH of NH2) de netto lading als functie van de pH berekend worden. Belangrijk daarvoor is eerst te bepalen hoeveel ioniseerbare groepen een peptide heeft, en wat de pK waarde van ieder van die groepen is (zie bovenstaande tabel). Op basis daarvan kan berekend worden bij welke pH de netto lading van een los aminozuur of van een peptide nul is (iso-electrisch punt, afgekort IEP of pI). Onderstaand een uitgewerkt voorbeeld voor het peptide Met-Lys-Leu (pK afgerond op een gehele pH waarde).

7

Modificatie van aminozuren in eiwitten Als eenmaal een eiwit is gemaakt door aminozuren in een specifieke volgorde achter elkaar te zetten, kunnen sommige aminozuren nog veranderd worden (post-translationele modificatie): 1. Aan een aminozuur met een OH groep in de zijketen kan een fosfaat-groep gekoppeld worden (fosforylatie); bij: Ser, Thr, Tyr 2. Aminozuren met een SH groep in de zijketen kunnen met elkaar reageren en een S-S brug vormen; bij: Cys 3. Van het N-terminale aminozuur kan de vrije NH2 groep met azijnzuur (CH3-COOH) reageren tot NH-CO-CH3 (acetylering) Eiwitstructuren Eiwitten kunnen hun functie doorgaans alleen uitoefenen als zij op een bepaalde manier zijn opgevouwen (conformatie of drie-dimensionale structuur). Verlies van deze functionele conformatie wordt denaturatie genoemd. Denaturatie kan reversibel zijn, namelijk als het eiwit zich weer opnieuw tot de juiste conformatie kan opvouwen, of irreversibel als het verlies van drie-dimensionale structuur niet meer hersteld kan worden (voorbeeld van reversibele denaturatie: oplossen van gelatine-poeder in water; voorbeeld irreversible denaturatie: koken van een ei). Bij de structuur van eiwitten worden vier processen onderscheiden: 1. Primaire structuur: dit is de volgorde van de aminozuren zoals die genetisch is vastgelegd in het DNA. 2. Secundaire structuur: deze ontstaat doordat eiwitten zich zodanig kunnen opvouwen dat er H-bruggen ontstaan tussen de C=O en de N-H groepen van de peptide-binding (voorbeelden van secundaire structuur zijn de -helix en de -sheet). 3. Tertiaire structuur: deze ontstaat doordat zijketens van verschillende aminozuren nietcovalente interacties met elkaar aangaan; deze kan plaatsvinden door de vorming van H-bruggen, door electrostatische interactie (+ en lading), of door hydrofobe interactie (apolaire ketens die bij elkaar gaan zitten om zich van water af te schermen). Ook de (covalente) vorming van S-S bruggen speelt een belangrijke rol bij de tertiaire structuur. 4. Quaternaire structuur: eiwitten kunnen complexen vormen die bestaan uit meerdere eiwitketens (subunits). De eiwitketens in zon complex zijn niet-covalent aan elkaar gebonden, maar gaan een interactie met elkaar aan via H-bruggen, ionogene interactie of hydrofobe interactie (voorbeeld: hemoglobine, het zuurstof-transporterend eiwit in ons bloed, bestaat uit vier subunits: twee -ketens en twee -ketens). Men gaat er van uit dat de optimale drie-dimensionale structuur van een eiwit vastligt in de genetisch bepaalde primaire structuur (aminozuurvolgorde). De juiste vouwing van eiwitten in de cel vindt plaats in het endoplasmatic reticulum.

8

Voorbeelden van eiwitstructuren 1. Primaire structuur (bijv. H2N- Ala (aa1)- Leu (aa2)- Ser (aa3)-COOH). Merk op dat de restgroepen (R1, R2, R3) om en om de andere kant op wijzen (nummering R2 en R3 onjuist).

2. Secundaire structuur

Alpha-helix

Beta-sheet

9

Bij de -helix (links) heeft de eiwitketen de vorm van een rechtsdraaiende spiraal, waarbij de C=O van een peptide-binding (in de figuur bijv. van aa2) een H-brug vormt met een N-H groep van een peptide-binding vier aminozuren verderop in de keten (in dit geval van aa6). Bij de -sheet (rechts) heeft de eiwitketen een vlakke structuur met een haarspeldachtige bocht, waarbij een C=O van een peptide-binding aan de ene kant van de bocht (rood), een H-brug kan vormen met een N-H groep van een peptide-binding aan de andere kant van de bocht (blauw), en vice versa. 3. Tertiaire structuur De uiteindelijke conformatie van een eiwit ontstaat doordat er niet alleen H-bruggen gevormd worden tussen de peptide-bindingen, maar er ook covalente (S-S bruggen) en niet-covalente (H-bruggen; ionogeen; hydrofoob) interacties ontstaan tussen de Rgroepen. Als gevolg daarvan zullen sommige gedeelten van een eiwit een -helix structuur hebben, andere gedeelten een -sheet, en weer andere gedeelten een structuur hebben die niet als -helix of -sheet te omschrijven is. De conformatie van een eiwit is te bepalen met Rntgen diffractie (X-ray) van eiwitkristallen of met NMR analyse van (kleine) eiwitten in oplossing. In de uiteindelijke conformatie (figuur links) worden de -helix gedeelten aangegeven met een spiraal, en de -sheet gedeelten met een pijl (gericht van N-terminaal naar C-terminaal)

4. Quaternaire structuur Drie-dimensionale structuur van hemoglobine (rechts), bestaande uit het twee ketens (rood) en twee -ketens (blauw). Alle vier ketens bevatten gedeelten met een -helix structuur.

10

Eigenschappen van eiwitten Ons lichaam bevat honderden verschillende eiwitten die elk een specifieke functie hebben. Aangezien alle eiwitten uit lineaire ketens van aminozuren bestaan, wordt de functie van een eiwit bepaald door het aantal aminozuren in de eiwitketen, en de specifieke opeenvolging van R-groepen. Gebaseerd hierop kunnen aan elk eiwit drie karakteristieke eigenschappen worden toegekend: 1. Molmassa (M): deze komt overeen met het aantal gram eiwit dat nodig is voor 1 mol (getal van Avogadro) aan moleculen, en wordt uitgedrukt in Daltons (Da). Voor 1 mol H-atomen is 1 gram nodig, en dus is de molmassa van een H-atoom 1 Da. Voor eiwitten wordt de molmassa meestal uitgedrukt in kDa (1000 Da). De molmassa van een eiwit wordt bepaald door het aantal aminozuren in de eiwitketen. De waarde kan experimenteel worden bepaald (zie chromatografie) of worden berekend door de molmassa van alle ingebouwde aminozuren op te tellen, verminderd met het aantal H2O moleculen dat tijdens de vorming van het eiwit is afgesplitst. 2. Iso-electrisch punt (IEP of pI): dit is de pH van de oplossing waarbij de netto lading van een eiwit nul is. De pI kan experimenteel worden bepaald (zie chromatografie) of berekend worden uit de pK waarden van de vrije NH2 en COOH groepen in het eiwit. Een lage pI waarde duidt op een relatief overschot aan aminozuren met een COOH groep (Glu, Asp), terwijl een hoge pI waarde duidt op een relatief overschot van aminozuren met een NH2 groep (Lys, Arg). 3. Apolair karakter: dit wordt bepaald door de relatieve bijdrage aan apolaire en aromatische aminozuren in het eiwit. Theoretisch kan het apolair karakter van een eiwit worden bepaald door de waarden voor de hydropathyindex van de individuele aminozuren op te tellen (zie tabel; hoe sterker positief de waarde, des te meer apolair het eiwit) . Experimenteel kan het apolair karakter worden bepaald door het verdelingsevenwicht (Kap) van een eiwit tussen een waterfase en een niet- mengbare organische vloeistof (bijv. hexaan) te bepalen (zie figuur). De beide fasen worden geroerd in de aanwezigheid van het eiwit, en na ontmenging wordt de concentratie van het eiwit in zowel de apolaire als de polaire fase gemeten. De verhouding van deze twee concentraties is Kap. Hoe meer apolaire zijketens een eiwit bevat, des te hoger zal de concentratie in hexaan bedragen( hoge Kap waarde). Hoewel de hydrophathy-index en Kap op dezelfde eigenschap berusten, zijn de getalwaarden niet te vergelijken.

11

Oplosbaarheid van eiwitten De netto lading van een eiwit hangt af van de pH van het waterig medium. Indien wij een zuiver eiwit in oplossing hebben, zullen alle eiwitmoleculen dezelfde netto lading hebben en elkaar dus afstoten, hetgeen de oplosbaarheid verhoogt. Bij het iso-electrisch punt zal de oplosbaarheid van zuivere eiwitten het laagst zijn, omdat de eiwitten dan een netto lading nul hebben en elkaar dus het minst zullen afstoten. Als we een netto positief (pH < pI) en een netto negatief (pH > pI) eiwit gezamenlijk in oplossing brengen, kunnen deze twee eiwitten elkaar aantrekken en samen een complex vormen dat onoplosbaar is (neerslag). Door het toevoegen van ionen kunnen dergelijke complexen weer oplossen. Dit komt omdat ionen in oplossing geladen groepen afschermen, waardoor positief en negatief geladen groepen elkaar minder goed kunnen aantrekken. In de afwezigheid van ionen lossen veel eiwitten slecht op omdat zij dan geen goede conformatie kunnen aannemen. Maar ook bij heel hoge zoutconcentraties (bijv. in 6M ammonium-sulfaat) slaan de meeste eiwitten neer, omdat de ionen dan het water binden dat nodig om de eiwitten in een goede conformatie te houden. Door in dat laatste geval water toe te voegen, neemt de ionconcentratie af en zal het eiwit weer in oplossing gaan (reversibele denaturatie). Chromatografische scheiding van eiwitten Eiwitscheidingstechnieken worden ook wel aangeduid met de term chromatografie (letterlijk: het schrijven/scheiden van gekleurde stoffen). Eiwitten kunnen van elkaar gescheiden worden op basis van hun verschillen in molmassa, iso-electrisch punt of apolair karakter. Er wordt onderscheid gemaakt tussen: 1. Analytische technieken: Deze zijn bedoeld om te identificeren welke eiwitten zich in een monster bevinden en wat hun eigenschappen zijn (M, pI). De analyse vindt plaats op een klein deel van het testmonster en kan onder denaturerende omstandigheden plaatsvinden (voorbeelden: SDS gel-electroforese; iso-electric focussing). 2. Preparatieve technieken: Deze zijn bedoeld om eiwitten zuiver en in actieve vorm in handen te krijgen. De analyse-methoden zijn grootschalig en vinden plaats onder nietdenaturerende condities (voorbeelden: gelpermeatie-chromatografie; ion-uitwisselingschromatografie; reversed-phase chromatografie; affiniteits-chromatografie). SDS gel-electroforese (SDS-PAGE) Dit is een analytische techniek waarbij eiwitten op grootte worden gescheiden. De techniek wordt gebruikt om de eiwitten te identificeren die zich in een testmonster bevinden en om te bepalen wat hun molmassa is.

12

SDS (sodium dodecyl sulphate) vormt micellen in water (figuur links). Eiwitten in SDS worden lineair uitgerekt (denaturatie) en opgenomen in de micel. Door de negatieve lading van het SDS worden zowel de grootte als de lading van de SDS-eiwit complex uitsluitend bepaald door de molmassa van het eiwit. SDS-eiwit complex worden op een poly-acrylamide gel (figuur rechts) gebracht, en door middel van een electrisch veld (positieve lading onder) de gel ingetrokken. Door wrijving bewegen kleinste eiwitten zich het snelst door de gel. Kleuring van de eiwitten op gel vindt plaats met Coomassie blue of zilver staining. De molmassa van een onbekend eiwit kan bepaald door parallel een aantal ijkeiwitten met bekende molmassa op te brengen.

Iso-electric focusing Dit is een analytische techniek waarbij eiwitten op lading worden gescheiden. De techniek wordt gebruikt om het iso-electrisch punt van een eiwit te bepalen. In combinatie met SDS electroforese kunnen eiwitten in complexe mengsels 2-dimensionaal van elkaar gescheiden worden tot individuele spotjes.

13

In een buisje met acrylamide gel kan met behulp van zgn. ampholytes en een tijdelijk aangelegd electrisch veld een stabiele pH gradient worden aangelegd (boven hoge pH, onder lage pH). Het eiwitmonster wordt nu zonder SDS op de gel gebracht, waarna de eiwitten door een electrisch veld (beneden positief) de gel worden ingetrokken. Tijdens het bewegen in de gel verandert de lokale pH, en daarmee ook de netto lading van het eiwit. Als een eiwit bij een pH komt die gelijk is aan zijn pI, zal zijn netto lading nul worden en zal het eiwit niet verder meer de gel in bewegen (figuur links boven). Na iso-electric focusing kan de gel, met daarin de op lading gescheiden eiwitten, horizontaal op een SDS gel gebracht worden en kunnen de eiwitten vervolgens verticaal op molmassa worden gescheiden (figuur rechts). Alle eiwitten in het testmonster zijn dan 2-dimensionaal op zowel lading als grootte van elkaar gescheiden. Van individuele eiwitspotjes kan dan een gedeeltelijke aminozuur-volgorde worden bepaald met behulp van massaspectrometrie, waarna aan de hand van de bekende DNA sequentie van het menselijk genoom van elk spotje kan worden bepaald om welk eiwit het gaat (proteomics). Preparatieve chromatografie Bij preparatieve chromatografie wordt gebruik gemaakt van een kolom (cylindrische buis), die gevuld is met cellulose-korreltjes (beads). Afhankelijk van de soort chromatografie wordt er aan deze beads een bepaalde chemische groep gehecht, die bepaalt of eiwitten al dan niet aan de kolom gaan binden. De kolom met beads wordt doorgespoeld met een buffer, die via een bovenstaand vloeistofreservoir wordt toegevoegd. Indien er een mengsel van eiwitten op een met beads gevulde kolom wordt gebracht, zullen door de eigenschappen van het kolommateriaal sommige eiwitten snel en andere langzaam door de kolom heen lopen (groen > rood > blauw> bruin).

Onderaan de kolom staan reageerbuisjes waarin de buffer en de eiwitten die van de kolom afkomen (elueren) worden opgevangen. Na een vastgestelde tijd schuift een volgende buis14

(fractie) onder de kolom en vangt de volgende hoeveelheid buffer op. Of er eiwit van de kolom afkomt, kunnen we meten aan de mate van lichtabsorptie bij 280 nm (A280). In het kolom-elutieprofiel staat de A280 uit tegen de tijd (t) of tegen het fractie-nummer (zie figuur boven rechts). Bij sommige vormen van kolom-chromatografie blijft de buffer gedurende de elutie dezelfde (isocratische elutie), terwijl bij andere vormen van kolom-chromatografie de buffer tijdens de elutie verandert (gradint-elutie). Een eventuele gradint wordt in het kolomelutieprofiel aangegeven,

Beads voor gelpermatie-chromatografie (links), ion-uitwisselingschromatografie (midden) en reversed phase chromatografie (rechts)

Gelpermeatie-chromatografie 1. Scheiding op grootte (molmassa). 2. Beads bevatten porin van een bepaalde grootte, waarin kleine eiwitten (P1) wel en grote eiwitten (P2) niet kunnen binnendringen. 3. De eiwitten binden niet aan de beads. 4. Isocratische elutie zonder gradient (licht gebufferde zoutoplossing). 5. Grootste eiwitten elueren het eerste.

Ion-uitwisselings-chromatografie 1. Scheiding op lading. 2. Aan de beads zijn zure (-COOH) of basische (-NH2) groepen gekoppeld (bijv. CM: carboxy-methyl cellulose; DEAE: di-ethyl-amino-ethyl cellulose). Deze beads werken alleen als ionenwisselaar bij een pH waarbij deze ioniseerbare groepen geladen zijn (COO- of NH3+).

15

3. Eiwitten met eenzelfde lading als de beads worden niet gebonden en elueren snel van de kolom. 4. Eiwitten met tegengestelde lading als de beads worden gebonden en elueren niet spontaan van de kolom. 5. Gebonden eiwitten kunnen van de beads gelueerd worden door de zoutsterkte van de buffer te verhogen (gradint-elutie). Bij de geleidelijke verhoging van de zoutsterkte zullen de minst geladen eiwitten het eerste elueren. Reversed-phase-chromatografie 1. 2. 3. 4. Scheiding op apolair karakter. Aan de beads zijn lange apolaire ketens gekoppeld (bijv. C8 of C18-silica). Eiwitten worden in een waterig milieu op de kolom gebracht. Alle eiwitten binden met hun apolaire zijketens aan de kolom, zodat deze zich van het water kunnen africhten (hydrofobe interactie). 5. Eiwitten worden gelueerd door een gradint aan te leggen van een apolaire vloeistof (ethanol, acetonitril (MeCN), propanol). Deze apolaire oplosmiddelen zijn volledig mengbaar met water. 6. Eiwitten met het minste aantal apolaire groepen (lage Kap) zullen het eerst elueren. 7. Door het gebruik van apolaire vloeistoffen bestaat het risico op eiwit-denaturatie.

Affiniteitschromatografie

1. Aan beads zijn chemische stoffen gebonden, die specifiek een bepaald eiwit binden (voorbeeld: antilichamen) 2. Alle eiwitten zullen door kolom lopen, alleen het specifiek herkende eiwit zal binden (1-stap zuivering) 3. Elutie van gebonden eiwit door verhoging van de zoutsterkte (gradint-elutie) 4. Antilichamen zijn immunoglobulinemoleculen die bestaan uit twee zware en twee lichte ketens, aan elkaar gebonden via S-S bruggen. Een deel van het antilichaammolecuul is variabel (herkent specifieke antigen), een ander deel is vast (specifiek voor de diersoort waarin antilichaam is gemaakt). Het Fc gedeelte van16

immunoglobuline-molecuul bestaat uit twee ketens (dimeer), terwijl het Fab gedeelte uit vier ketens bestaat (tetrameer).

Voorbeelden van gelpermeatie-chromatografie, ion-uitwisselingschromatografie en reversed-phase chromatografie voor het scheiden van een mengsel van vier modeleiwitten

17

Stapsgewijs zuiveren van eiwitten Bij complexe eiwitmengsels is het doorgaans niet mogelijk om met een enkele chromatografie-kolom het eiwit van interesse geheel gezuiverd in handen te krijgen. De kans is namelijk groot dat er verontreinigende eiwitten aanwezig zijn met vergelijkbare molmassa, iso-electrisch punt of apolair karakter. In dat geval kunnen ion-uitwisselingschromatografie, gelpermeatie-chromatografie en reversed phase chromatografie successievelijk achter elkaar gebruikt worden. Bij elke chromatografiestap worden alleen die fracties van de vorige kolom meegenomen, waarin het eiwit van interesse zich bevindt. Het tussenresultaat kan na iedere kolomstap met SDS electroforese zichtbaar worden.

1. 2. 3. 4. 5.

Cel-extract Laan 1 na ion-uitwisselingschromatografie Laan 2 na gelpermeatie-chromatografie Laan 3 na reversed phase chromatografie Eiwit markers (molmassa)

Het is essentieel dat men bij iedere kolomstap de fracties kan identificeren, waarin het eiwit van interesse zich bevindt. Voor het opzuiveren van een enzym kan dit door in de kolomfracties de enzym-activiteit te meten. Voor een eiwit-hormoon kan dit door in de kolomfracties de hormoon-activiteit te meten. De mate van zuivering van elke kolomstap kan bepaald worden door de specifieke activiteit (SA) van het eiwit van interesse te meten. De SA van een preparaat is gedefinieerd als de aanwezige hoeveelheid van het gezuiverde eiwit, gedeeld door de totale hoeveelheid eiwit; ofwel voor een hormoon of enzym als de aanwezige activiteit van het gezuiverde eiwit, gedeeld door de totale hoeveelheid eiwit. Hoe hoger SA, des te zuiverder is het eiwit. Aantonen van een specifieke eiwit via immunoblotting Coomassie blue en zilver staining zullen alle eiwitten op een SDS gel aankleuren. Als men beschikt over een specifiek antilichaam tegen een bepaald eiwit, is het mogelijk in het SDS patroon van een complex eiwitmengsel alleen dit specifieke eiwit aan te tonen. Antilichamen kunnen echter niet een polyacrylamide gel binnendringen. Daarom moeten de eiwitten op de SDS gel (zonder aankleuren) eerst overgeblot worden cellulose-papier. Dit gebeurt door een stuk cellulose-papier op de gel te leggen en aan de papierkant een positieve spanning aan te leggen. De negatief geladen eiwit-SDS complexen zullen dan vanuit de gel het papier in18

bewegen. Het cellulose-papier kan nu gencubeerd worden met het specifieke antilichaam. Om de plaats zichtbaar te maken waar het antilichaam bindt, moet het antilichaam gelabeld worden met 125I (radio-actief) of met het enzym peroxidase. Dit enzym kan ter plaatse een kleurloos substraat omzetten in een gekleurd product. Deze techniek heet immunoblotting of ook wel Western blotting. De meeste antilichamen worden in konijn gemaakt (zgn. polyclonale antilichamen) en hebben dus alle hetzelfde konijn-specifieke Fc fragment. Hiervan kan gebruik gemaakt worden om binding van een specifiek antilichaam op een blot zichtbaar te maken, zonder dat ieder antilichaam individueel gelabeld hoeft te worden. Commercieel is een peroxidase-gelabeld antilichaam beschikbaar dat gericht is tegen konijn Fc. Dat staat bekend goat-anti-rabbitperoxidase (GARPO). De blot kan nu eerst gencubeerd worden met het specifieke antilichaam (dat zelf niet eerst gelabeld hoeft te worden) en vervolgens met GARPO om de plaats waar het specifieke antilichaam is gebonden, zichtbaar te maken.

Links: SDS gel van markereiwitten en complex eiwit-mengsel, gekleurd met Coomassie Blue. Midden: Eiwitblot gencubeerd met 125I-antilichaam tegen 48 kDa eiwit. Rechts: Prinicipe van kleuring met een peroxidase-gelabeld secondair antilichaam (GARPO)

19

Eiwitten als enzymen

Anders dan in een reageerbuis vinden chemische reacties in ons lichaam alleen plaats als er een specifiek enzym aanwezig is dat werkt als een katalysator. Als resultaat van de evolutie codeert ons DNA alleen maar voor enzymen die ons lichaam ook echt nodig heeft.

Een chemische reactie kan alleen plaatsvinden als er netto energie (reactie-warmte E) bij vrij komt. Een enzym benvloedt niet de waarde van E voor een chemische reactie, en dus ook niet de ligging van een chemisch evenwicht. De snelheid waarmee een chemische reactie plaatsvindt, hangt af van de activeringsenergie. De energie die vrijkomt bij de botsing van moleculen kan gebruikt worden om de activeringsenergie te overwinnen. Een enzym is in staat de activeringsenergie te verlagen, waardoor de reactiesnelheid sterk toeneemt. Kortom, de omzetting van A en B naar C en D zal zonder enzym op zijn hoogst zeer traag verlopen (hoge activeringsenergie), terwijl de reactie met enzym zeer snel zal verlopen (lage activeringsenergie). Michaelis-Menten kinetiek Wil een enzym E de chemische reactie S(ubstraat) => P(roduct) mogelijk maken, dan zullen het enzym en het substraat-molecuul in oplossing eerst met elkaar moeten botsen. Dit gebeurt door de zgn. Brownse of warmte-beweging van moleculen in zowel gassen als vloeistoffen. Als E en S op een juiste manier met elkaar botsen, kan er tijdelijk een enzym-substraatcomplex ES gevormd worden (associatie-proces). In de korte tijd dat dit complex bestaat, kan S door E worden omgezet in P. Gebeurt dat niet, dan gaan E en S weer uit elkaar (dissociatieproces). In onderstaand schema wordt voor elk van deze deelprocessen een snelheidsconstante (k) gegeven. k1 k2

E + S ES E + Pk-1

Volgens de formules van de reactie-kinetiek wordt de snelheid waarmee E en S associren tot ES, gegeven door k1 [E].[S], terwijl de snelheid waarmee ES weer uiteenvalt in E en S wordt20

gegeven door k-1 [ES]. Het meest interessant is echter de snelheid waarmee ES wordt omgezet in E en P, omdat dat de snelheid is waarmee het product P wordt gevormd. Volgens het reactieschema is deze omzettingssnelheid v0 gelijk aan k2 [ES]. Uit bovenstaande volgt dat de snelheid waarmee het complex ES gevormd wordt, gegeven wordt k1 [E].[S], terwijl de snelheid waarmee het weer afgebroken, ofwel in de vorm van E en S, ofwel in de vorm van E en P, gegeven wordt door (k2 + k-1) [ES]. Indien we er van uitgaan dat de snelheid waarmee ES wordt gemaakt gelijk is aan de snelheid waarmee het wordt afgebroken (zgn. steady state conditie), geldt k1 [E].[S] = (k2 + k-1) [ES]. Van de toegevoegde hoeveelheid enzym (Et) zal een deel in vrije vorm voorkomen (E) en een deel als ES complex. In bovenstaande formule geldt dus dat [E] = [Et] [ES]. Vullen we dit voor [E] in, dan blijkt [ES] = .

/

Aangezien de omzettingssnelheid waarmee het product P gevormd wordt, evenredig is met de concentratie van ES (v0 = k2 [ES]), geldt

v0 =

.

.

In deze formule is Km de Michaelis-Menten constante, die gedefinieerd is als (k2 + k-1)/ k1. Uit bovenstaande formule blijkt dat de omzettingssnelheid (v0) afhangt van de aangeboden substraatconcentratie (S). Aangezien door de enzymreactie de hoeveelheid substraat geleidelijk zal afnemen, meten wij de omzettingssnelheid altijd direct na toevoegen van substraat, omdat alleen dan de waarde van S precies bekend is. De v0 in de formule wordt dan ook de initile omzettingssnelheid genoemd. Een enzym werkt op zijn hardst (v0 = Vmax) als S in zeer hoge concentratie aanwezig is. Uit de formule blijkt dat als [S] >> Km, v0 = k2.[Et], en dus geldt dat k2.[Et] = Vmax. Dit leidt tot de zgn. Michaelis-Menten vergelijking:

v0 =

.

De waarden van Vmax en Km hangen af van het aard van het enzym, de aard van het substraat, de temperatuur en pH, maar niet van de substraat-concentratie S. Vmax neemt lineair toe met de toegevoegde enzym-concentratie Et, terwijl Km onafhankelijk is van Et. Uit de Michaelis-Menten vergelijking blijkt verder dat als [S] = Km, v0 = Vmax. De MichaelisMenten constante Km kan dan ook gedefinieerd worden als de substraatconcentratie waarbij de omzettingssnelheid v0 de helft is van de maximale omzettingssnelheid Vmax. Hoe hoger de Km, des te hoger de substraat-concentratie die nodig is om het enzym maximaal te laten werken.21

Bepaling van Vmax en Km Om de waarden van Vmax en Km te bepalen, meten we de omzettingssnelheid v0 als functie van de substraatconcentratie [S]. In onderstaande grafiek is de waarde van v0 uitgezet bij toenemende concentraties van [S], gebaseerd op waarden van Vmax=1 en Km=1.

Michaelis-Menten plot1 0,9 0,8 0,7 0,6 Vo 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2 4 6 [S] 8 10 12

Stel dat we op basis van deze Michaelis-Menten plot zouden willen vaststellen welke waarden Vmax en Km hebben. Ook bij de hoogst weergegeven waarde van [S] (hier 10 x Km) is v0 nog maar 90% van Vmax. En zolang Vmax niet bekend is, kan ook Km, zijnde de waarde van [S] waarbij v0 half-maximaal is, niet eenduidig bepaald worden. De waarden van Vmax en Km kunnen wel eenduidig bepaald als de meetgegevens eerst dusdanig worden uitgezet dat de punten op een rechte lijn liggen. Deze rechte lijnen kunnen dan gextrapoleerd worden om de waarden van Vmax en Km te berekenen. Wij zullen twee manieren beschrijven om de Michaelis-Menten vergelijking in een lineaire vorm om te zetten, de Lineweaver-Burk plot en de Eadie-Hofstee plot. De Michaelis-Menten vergelijking kan herschreven worden tot

=

(

) + (

)

Door nu 1/v0 (op de Y-as) uit te zetten tegen 1/[S] (op de X-as) zullen de meetpunten op een rechte lijn liggen, waarbij het afgesneden stuk op de Y-as gelijk is aan 1/Vmax, en de helling (trendlijn) van de rechte lijn gelijk is aan (Km/Vmax). Uit deze twee waarden kan dan berekend worden hoe groot Vmax en Km zijn. Deze manier van uitzetten van enzymkinetiekgegevens staat bekend als de Lineweaver-Burk plot. Deze plot heeft als voordeel dat alle meetpunten bijdragen aan het bepalen van de waarden van Vmax en Km. Nadeel is echter dat de waarden van 1/[S] doorgaans niet gelijkmatig verdeeld zijn over de X-as. Daardoor is de Lineweaver-Burk plot is erg gevoelig voor meetfouten bij lage [S]-waarden.22

Lineweaver-Burk plot3,5 3 2,5 2 1/V0 1,5 1 0,5 0 0 0,5 1 1/[S] 1,5 2 2,5

De Lineweaver-Burk plot gebaseerd op bovenstaande meetgegevens geeft aan dat bij [S]= (ofwel 1/[S] = 0) de waarde 1/Vmax = 1, terwijl de helling van de lijn (=Km/Vmax) ook gelijk is aan 1. (Door extrapolatie van de rechte lijn kan ook het afgesneden stuk met de X-as bepaald worden; dit komt overeen met -1/Km). De problemen van de Lineweaver-Burk plot kunnen grotendeels opgelost worden met de Eadie-Hofstee plot. De Michaelis-Menten vergelijking wordt daartoe herschreven tot

v0 = Vmax Km. (

)

Door nu v0 (op de Y-as) uit te zetten tegen v0/[S] (op de X-as) zullen de meetpunten op een rechte lijn liggen, met als helling (-Km) en als afgesneden stuk met de Y-as Vmax. De Eadie-Hofstee plot gebaseerd op bovenstaande meetgegevens (zie onderstaande figuur) laat een afgesneden stuk op de Y-as (Vmax) van 1 zien, terwijl de helling (-Km) een waarde heeft van -1. (Door extrapolatie van de rechte lijn kan ook het afgesneden stuk met de X-as bepaald worden; dit komt overeen met Vmax/Km). In de Eadie-Hofstee plot liggen de meetpunten doorgaans gelijkmatiger verdeeld over de X-as dan in de Lineweaver-Burk plot. Let er op dat zowel in de Lineweaver-Burk als in de Eadie-Hofstee plot het meetpunt met [S]=0 niet wordt meegenomen.

23

Eadie-Hofstee plot1 0,9 0,8 0,7 0,6 V0 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,1 0,2 0,3 V0/[S] 0,4 0,5 0,6 0,7

Reversibele en irreversibele remming van enzymen Er zijn veel stoffen die de werking van enzymen kunnen remmen. Wij spreken dan van inhibitors. Daarbij wordt een onderscheid gemaakt tussen irreversibele en reversibele inhibitors. Een irreversibele inhibitor bindt met een bepaalde snelheid aan het enzym en eenmaal gebonden laat het niet meer los. Zodra het enzym de inhibitor gebonden heeft, is het inactief. Irreversibele inhibitors binden vaak covalent aan aminozuren in het actief centrum van het enzym (voorbeeld: het neurotoxine DFP dat het enzym acetylcholine-esterase remt). Reversibele inhibitors binden het enzyme met een bepaalde snelheid (associatie), maar na zekere tijd laten ze weer los (dissociatie). In de periode dat de inhibitor aan het eiwit gebonden is, is het enzym inactief; maar zodra de inhibitor dissocieert, kan het enzym weer substraat in producten omzetten. Binnen de reversibele inhibitors onderscheiden wij competitieve inhibitors en non-competitieve inhibitors. Een competitieve inhibitor bindt het enzym op dezelfde plaats waar ook het substraat bindt. Verschil is alleen dat het substraat door de enzymreactie kan worden omgezet in een product, terwijl de inhibitor niet kan worden omgezet. Competitieve inhibitors lijken qua structuur vaak erg op substraatmoleculen. Non-competitieve inhibitors binden het enzym op een andere plaats dan het substraat. Door binding van de non-competitieve inhibitor verandert de conformatie van het enzym, waardoor deze geen substraat meer kan binden. De site waar de non-competitieve inhibitor aan het enzym bindt, wordt de allostere site genoemd. (Voorbeelden: het enzym hexokinase kan glucose in de aanwezigheid van ATP omzetten in glucose-6-fosfaat. Het glucose-analoog 2-deoxy-glucose kan wel door het enzym worden gebonden, maar niet in product worden omgezet, en werkt dus als competitieve inhibitor. Het enzym carbonic anhydrase is van belang voor de afvoer van CO2 uit ons bloed. Acetazolamide bindt carbonic anhydrase op een andere site dan CO2, maar verandert de conformatie van het enzym dusdanig dat CO2 vervolgens niet meer kan binden. Het werkt dus als een non-competitieve inhibitor).24

Kinetiek van competitieve inhibitors

Stel dat het enzym E de keus heeft om ofwel het substraat S te binden en het om te zetten in product P, ofwel de inhibitor I te binden die het niet kan omzetten in producten. Dit zal aanleiding geven tot onderstaand reactie-schema: k1 k2

E + S ES E + Pk-1 k3

E + I EIk-3 Omdat S en I concurreren voor dezelfde binding site, zal er meer S nodig zijn om de halfmaximale omzettingssnelheid te bereiken. I zal dus de waarde van Km verhogen. Als wij echter een grote overmaat S toevoegen, zal de kans dat het enzym de inhibitor I bindt verwaarloosbaar klein worden. I heeft dus geen effect op de Vmax van de reactie. Indien wij in de aanwezigheid van een vaste concentratie I de omzettingsnelheid v0 als functie van [S] bepalen, zal de reactie aan de Michaelis-Menten kinetiek voldoen, alleen zal de verkregen waarde van Km' mede bepaald worden door de aanwezige concentratie I, alsmede de snelheid waarmee het enzym de inhibitor I bindt en weer loslaat. Dit laatste wordt uitgedrukt in een constante Ki = k-3/k3. Aangetoond kan worden dat in de aanwezigheid van een competitieve inhibitor geldt:

v0 =

.

=

.

Uit deze formule blijkt dat de reactie aan de Michaelis-Menten kinetiek voldoet, maar dat de verkregen waarde van Km' wordt bepaald door de Km-waarde van de enzym-substraat binding en de Ki-waarde van de enzym-inhibitor binding, gegeven door Km' = Km (1 + [I]/Ki).25

In onderstaande Michaelis-Menten (MM) plot is de waarde van v0 uitgezet bij toenemende concentraties van [S], gebaseerd op waarden van Vmax=1 en Km=1, maar dan in de aanwezigheid van een competitieve inhibitor I met een Ki=5, die getest is bij concentraties 0; 5; 10 en 15. Uit de plot blijkt dat de Vmax niet verandert door de aanwezigheid van I, maar wel de concentratie van [S] waarbij het enzym op half-maximale snelheid werkt (Km'). Dit is nog duidelijker in de Eadie-Hofstee (EH) plot. Alle lijnen zijn lineair, en snijden na extrapolatie de Y-as bij 1 (=Vmax). De helling van de lijn (-Km') is afhankelijk van de concentratie inhibitor. Het afgesneden stuk van de X-as (Vmax/Km) blijkt af te nemen met toenemende [I]. Om nu de grootte van Ki te bepalen, kan de gemeten waarde van Km' uitgezet worden tegen de betrokken waarde van [I]. Volgens de formule Km' = Km (1 + [I]/Ki) levert dit levert een rechte lijn op, met helling Km/Ki en afgesneden stuk op de Y-as gelijk aan Km.

Competitieve inhibitor in MM plot1 0,9 0,8 0,7 0,6 V0 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2 4 6 [S] 8 10 12

[I]=0 [I]=5 [I]=10 [I]=15

Competitieve inhibitor in EH plot1 0,9 0,8 0,7 0,6 V0 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,2 0,4 V0/[S] 0,6 0,8

[I]=0 [I]=5 [I]=10 [I]=15

26

Kinetiek van non-competitieve inhibitors

Stel dat een enzym E het substraat S en de inhibitor I op een andere site bindt. Zodra I gebonden is, kan S niet meer binden of, als het al gebonden is, in ieder geval niet meer worden omgezet in P. Dit zal aanleiding geven tot onderstaand reactie-schema: k1 k2

E + S ES E + Pk-1 k3

E + I EIk-3 k3

ES + I ESIk-3 Het gedeelte van het enzym dat I gebonden heeft, zal geen productvorming geven. Als gevolg hiervan zal de voor de enzymreactie beschikbare concentratie enzym (Et) verlaagd zijn, en dus zal Vmax = k2. [Et] afnemen met toenemende inhibitor-concentratie. Die enzym-moleculen die geen I gebonden hebben, zullen echter het substraat op normale binden en omzetten. De Km van de reactie zal door de aanwezigheid van een non-competitive inhibitor dus niet veranderen. Aangetoond kan worden dat in de aanwezigheid van een non-competitieve inhibitor geldt:. . /

v0 =

=27

Uit deze formule blijkt dat de reactie aan de Michaelis-Menten kinetiek voldoet, maar dat de verkregen waarde van Vmax' afneemt met toenemende concentratie en mate van affiniteit van het enzym voor de inhibitor, gegeven door Vmax' = Vmax / (1+ [I]/Ki). In onderstaande Michaelis-Menten plot is de waarde van v0 uitgezet bij toenemende concentraties van [S], gebaseerd op waarden van Vmax=1 en Km=1, maar dan in de aanwezigheid van een non-competitieve inhibitor I met een Ki=5, die getest is bij concentraties 0; 2.5; 5 en 10.

Non-competitieve inhibitor in MM plot1 0,9 0,8 0,7 0,6 V0 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2 4 6 [S] 8 10 12

[I]=0 [I]=2.5 [I]=5 [I]=10

Non-competitieve inhibitor in EH plot1 0,9 0,8 0,7 0,6 V0 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,2 0,4 V0/[S] 0,6 0,8

[I]=0 [I]=2.5 [I]=5 [I]=10

28

Uit de Michaelis-Menten plot blijkt dat de waarde van Vmax' sterk afneemt met toenemende concentratie I. De helling van de Eadie-Hofstee plot verandert niet door de non-competitieve inhibitor, hetgeen inhoudt dat de Km niet wordt benvloed door een degelijke remmer. Om de grootte van Ki te bepalen, kan uit het afgesneden stuk van de Y-as voor elke waarde van [I] een waarde van Vmax' bepaald worden. Gebruik makend van de formule Vmax' = Vmax / (1+ [I]/Ki) kan vervolgens Vmax' uitgezet worden tegen Vmax'.[I], hetgeen een rechte lijn oplevert met afgesneden stuk Vmax en helling -1/Ki. Gemengde inhibitie Om experimenteel te bepalen of een inhibitor competitief of non-competitief werkt, zal de Michaelis-Menten plot bepaald moeten worden bij verschillende concentraties van de inhibitor. Blijkt dat in de Eadie-Hofstee plot de helling wel wordt benvloed, maar niet het afgesneden stuk op de Y-as, dan hebben wij te maken met competitieve inhibitie. Blijkt juist dat de helling van de Eadie-Hofstee plot niet wordt benvloed, maar wel het afgesneden stuk van de Y-as, dan hebben wij te maken met non-competitieve inhibitie. Veel inhibitors blijken zowel de Vmax als de Km van de enzymreactie te benvloeden. Wij spreken dan van gemengde inhibitie. Dit kan onder andere gebeuren als de Ki-waarde voor de reactie E+IEI anders is dan voor ES+IESI. In dat geval zal in de Eadie-Hofstee plot zowel de helling als het afgesneden stuk van de Y-as door de inhibitor benvloed worden.

Spectrofotometrische analyse: de wet van Lambert-Beer Veel stoffen in oplossing zijn in staat om licht van een bepaalde golflengte te absorberen. Gekleurde stoffen doen dit bij een golflengte waar onze ogen gevoelig voor zijn, maar eiwitten zijn bijvoorbeeld in staat om ultraviolet licht met een golflengte van 280 nm te absorberen. Dit komt met name door de aanwezigheid van aromatische aminozuren, zoals tyrosine en tryptophan. Er blijkt een eenduidige relatie te bestaan tussen de concentratie van een stof in oplossing en de mate waarin die oplossing licht van een bepaalde golflengte kan absorberen. Dit staat geformuleerd in de wet van Lambert-Beer.

29

Stel dat in een cuvet met diameter d zich een eiwitoplossing bevindt met concentratie c. Laten wij nu licht van in dit geval 280 nm met een intensiteit I0 op de cuvet vallen, dan zal een deel van het licht geabsorbeerd wordt, zodat de intensiteit van het licht dat uit de cuvet komt, lager dan I0 zal zijn. Deze wordt I1 genoemd. Het deel van het licht dat doorgelaten wordt (I1/I0) staat dan bekend als de transmissie (T). Wil een eiwit een lichtdeeltje kunnen absorberen, dan moeten beide in de oplossing eerst met elkaar botsen. De kans daarop is evenredig met de lichtintensiteit ter plaatse en met de eiwitconcentratie (die in de gehele oplossing constant is). De lichtintensiteit neemt echter geleidelijk af tijdens de doorgang door de cuvet, met als gevolg dat er in de eerste helft van de cuvet meer licht zal worden geabsorbeerd dan in de tweede helft. Het gevolg is dat de afname van de lichtintensiteit niet lineair is met de cuvetdiameter (d) en eiwitconcentratie (c), maar logaritmisch. In formule: T=

= 10

In deze wet van Lambert-Beer is een constante, die afhangt van de aard van de gemeten stof en de gebruikte golflengte. Deze constante wordt de extinctie-cofficient genoemd. Meestal wordt niet de transmissie (T = I1/I0) gemeten, maar de absorptie (A), ook wel extinctie (E) genoemd, die gedefinieerd is als A = - 10log T = .c.d. Het voordeel van het werken met A is dat deze evenredig is met de concentratie van de stof in oplossing. Als wij van diverse bekende concentraties van een stof (c) de waarde van A bepalen, kunnen wij een zogenoemde ijklijn maken, waarin A staat uitgezet tegen c. Uit het verkregen lineaire verband kan dan de waarde voor bepaald worden. Is eenmaal bekend, dan kan bij iedere gemeten waarde van A de bijbehorende concentratie berekend worden. De waarde van voor eiwitten is relatief constant, en daardoor kan voor eiwitten de ijklijn met een standaard-eiwit gemeten worden (bijvoorbeeld bovine serum albumine) en de verkregen waarde van ook gebruikt worden om de concentratie van andere eiwitten in oplossing te bepalen.

30

Syllabus Celbiochemie (2011-2012) 2012) Deel I Bioenergetica II:De Bioenergetica bestudeert hoe cellen aan hun energie komen en hoe zij deze energie energetica kunnen gebruiken om processen mogelijk te maken die op zich energie kosten. Een centrale rol hierbij speelt het molecuul ATP (adenosine triphosphate). Verbranding van suikers en vetten levert energie op in de vorm van ATP, terwijl transportprocessen die energie kosten ATP verbruiken.

Structuur van suikers Suikers, ook wel koolhydraten genaamd, bestaan uit een koolstofketen met daaraan alcohol aten alcohol-, aldehyde-, keton- en/of carbonzuurgroepen. Wij onderscheiden aldose-suikers en ketosesuikers. De simpelste aldose-suiker is glyceraldehyde, de simpelste ketose-suiker is suiker ketose suiker dihydroxy-aceton. Deze twee suikers hebben evenveel C-, H- en O-atomen, en kunnen door C atomen, het enzym isomerase in elkaar worden omgezet (aldose-ketose omzetting).

Merk op dat het tweede C-atoom van glyceraldehyde een asymmetrisch C-atoom is. atoom atoom31

Asymmetrische C-atomen (D/L regel)

32

Wij spreken dus af dat de in de platte structuur van glyceraldehyde de -H en -OH naar voren het blad uitsteken, en de -CHO en -CH2OH naar achteren het blad insteken. Per definitie tekenen wij in D-glyceraldehyde de CHO omhoog, de -CH2OH omlaag, en de OH aan het middelste C-atoom naar rechts. Alle verbindingen in de natuur die met behoud van asymmetrie uit D-glyceraldehyde gemaakt kunnen worden, noemen wij D-verbindingen. Hiertoe behoren alle in de natuur voorkomende suikers. Per definitie tekenen wij in L-glyceraldehyde de CHO omhoog, de -CH2OH omlaag, en de OH aan het middelste C-atoom naar links. Alle verbindingen in de natuur die met behoud van asymmetrie uit L-glyceraldehyde gemaakt kunnen worden, noemen wij L-verbindingen. Hiertoe behoren alle in de natuur voorkomende aminozuren. De D/L-regel is een kwestie van afspraak en heeft dus niets met links- of rechtsdraaiend te maken. Enkelvoudige chemische bindingen, zoals een C-C, C-O of C-H, zijn vrij draaibaar. In een tetrader kun je n groep vasthouden en de andere drie ten opzichte van elkaar draaien, met behoud van asymmetrie. Onderstaande verbindingen zijn dus gedraaide vormen van Dglyceraldehyde (links) en L-glyceraldehyde (rechts). Je mag echter niet alle vier groepen in de vlakke projectie ten opzichte van elkaar draaien, want dan krijg je de andere isomeer.

Asymmetrische C-atomen (R/S regel) Voor complexe organische verbindingen met een asymmetrisch C-atoom is het vaak moeilijk te bepalen of dit in de natuur uit D-glyceraldehyde of L-glyceraldehyde is ontstaan. Vandaar dat er naast de D/L-regel de meer rationele R/S-regel bestaat, waarmee de absolute configuratie van een stof kan worden vastgelegd.

33

N.B. Er is geen relatie tussen D/L en R/S configuratie. In de citroenzuurcyclus zullen wij zien dat sommige enzymen ook niet-asymmetrische C-atomen als asymmetrisch kunnen behandelen.

34

Aldose suikers Rechts staat de algemene structuur van een aldose-suiker. De aldehyde-groep wordt altijd naar boven getekend (C-atoom nummer 1). De OH op het voorlaatste C-atoom staat altijd naar rechts (want alle natuurlijke suikers zijn Dsuikers). Elk extra ingevoegd C-atoom bevat een H en een OH groep, en is asymmetrisch. Aangezien de OH op het voorlaatste C-atoom altijd naar rechts staat, zijn bij de andere Catomen de vorm met OH naar rechts en OH naar links niet elkaars spiegelbeeld. Zij hebben daarom ieder een eigen naam (zgn. epimere vormen).

Binnen de aldose-suikers bestaan Binnen de aldose-suikers bestaan er dan ook twee tetrose suikers (4 er dan ook twee tetrose suikers (4 C-atomen; erythrose en threose), C-atomen; erythrose en threose), vier pentoses (5 C-atomen; bijv. vier pentoses (5 C-atomen; bijv. ribose), en acht hexoses (6 Cribose), en acht hexoses (6 Catomen; bijv. mannose, glucose atomen; bijv. mannose, glucose en galactose). Zie bijgevoegde en galactose). Zie bijgevoegde structuren. structuren.

35

Ketose suikers Ketose-suikers hebben als eerste C-atoom een CH2OH groep, en op het tweede C-atoom een keto-groep. Op het voorlaatste C-atoom hebben zij een OH groep naar rechts (D-suiker) en op het laatste C-atoom wederom een CH2OH groep. In tegenstelling tot glyceraldehyde heeft dihydroxy-aceton geen asymmetrisch C-atoom. Die ontstaan pas als er extra C-atomen met H en OH groep worden ingebouwd. Daarvan heeft het voorlaatste C-atoom altijd de OH naar rechts. Er is dus maar n ketose-suiker met 4 C-atomen, 2 met 5 C-atomen en 4 met 6 C-atomen. Daarvan is de belangrijkste het D-fructose (zie onderstaande structuur). D-fructose is de ketose-vorm van D-glucose, en beide vormen kunnen enzymatisch in elkaar omgezet worden (aldose-ketose omzetting).

(Links: algemene structuur van ketose-suikers, rechts fructose, de belangrijkste 6C-ketose)

Ringstructuur van suikers Suikers met 5 of 6 C-atomen kunnen ringstructuren vormen. Dit komt doordat de -OH groep op het voorlaatste C-atoom met zijn - aanvalt op de + van het C-atoom van de aldehydegroep (C1 bij aldose-suikers) of keto-groep (C2 bij ketose-suikers). Er ontstaat dan een heterocyclische verbinding van ofwel 5 C-atomen en 1 O-atoom (pyranose), ofwel van 4 Catomen en 1-O-atoom (furanose). Onderstaand is de ringstructuur van D-glucose aangegeven. Door de ringsluiting gaat de aldehyde-groep op C1 over in een OH groep. Het gevolg is dat C1 nu een nieuw asymmetrisch C-atoom wordt, waarbij deze OH ofwel aan dezelfde kant van de ring komt te staan als de -CH2OH groep (-vorm) ofwel aan de tegenovergestelde kant van de ring (-vorm). Zolang er aan deze OH groep op C1 geen andere chemische groep gezet wordt, kan glucose zowel in de open structuur (1%), de -vorm (33%) of de vorm (66%) voorkomen. We spreken hier van een dynamisch evenwicht, waarbij een enkel glucose-molecuul steeds van een open structuur overgaat naar een van de beide ringstructuren, dusdanig dat het molecuul zich netto 1% van de tijd in de open structuur bevindt, 33% in de -vorm en 66% in de -vorm.36

De ringstructuur van glucose in de -vorm heet -Dglucopyranose, die in de -vorm -D-glucopyranose. Zodra de OH groep op C1 door een chemische reactie wordt omgezet in een andere groep (bijv. OCH3), kan de suiker niet meer overgaan in de open structuur, en zit hij dus vast in ofwel de vorm ofwel de -vorm van de ringstructuur.

Fructose kan een 5-ring vormen waarbij de keto-groep op C2 overgaat in een OH groep. Ook hierbij ontstaat weer een nieuw asymmetrisch C-atoom, en onderscheiden we naast de open structuur de ringstructuren -D-fructofuranose en -D-fructofuranose. Zolang de OH op C2 niet in een andere groep is omgezet, zijn de drie vormen in een dynamisch evenwicht met elkaar. Overigens kan fructose ook een 6-ring vormen, als niet de OH op C5, maar die op C6 aanvalt op de keto-groep van C2. Aldose-suikers met 5 C-atomen, zoals ribose, kunnen een vijfring vormen, en door die ringen aan elkaar te koppelen vormt dit de backbone van het RNA.

37

Suikers vormen polymeren De meeste in de natuur voorkomende suikers bestaan uit ketens van hexose of pentoseeenheden. De bekendste voorbeelden hiervan zijn de disacchariden sucrose (zoetstof) en lactose (melksuiker).

Sucrose bestaat uit een glucose, gebonden aan een fructose. De binding is ontstaan doordat een OH groep van glucose een ether-binding is aangegaan met een OH van fructose (C-OH + HO-C C-O-C + H2O). Doordat in glucose de OH van C1 en bij fructose de OH van C2 bij deze etherbinding zijn betrokken, zit zowel de glucose- als de fructose eenheid in het sucrose-molecuul vast in de ringstructuur en kunnen zij niet overgaan in een open structuur. Lactose bestaat uit een galactose, die via een etherbinding verbonden is aan een glucose. Bij deze etherbinding is de OH van C1 van galactose betrokken, maar de OH van C4 van glucose. De OH van C1 van glucose is dus onveranderd, en vandaar dat de glucose-ring in lactose in zowel de open structuur, de -vorm als de -vorm kan voorkomen. Als energiebron worden suikers vaak opgeslagen in langere ketens. Voorbeelden hiervan zijn glycogeen (in spieren), zetmeel en cellulose (in planten). Ook bevatten veel eiwitten die door de plasmamembraan heen steken, suikergroepen. Wij spreken dan van glycoproteinen. Dergelijke, vaak complexe, suikergroepen op eiwitten spelen onder andere een rol bij afweerreacties van het lichaam. Voorbeeld hiervan zijn de A-, B- en O- bloedgroepen.

38

Energie en entropie De eerste hoofdwet van de thermodynamica (warmteleer) zegt dat energie wel van de ene in de andere vorm kan overgaan, maar dat energie niet gemaakt kan worden of verloren kan gaan. Een pen die wij op een meter afstand boven de grond houden, heeft potentile energie. Zodra wij de pen loslaten, zal deze door de zwaartekracht steeds sneller naar beneden vallen, waarbij de potentile energie wordt omgezet in kinetische energie. Eenmaal op de grond wordt deze kinetische energie omgezet in warmte, waarbij de moleculen van de pen en van de vloer iets sneller zullen gaan bewegen. Volgens de eerste hoofdwet van de thermodynamica is het theoretisch ook mogelijk dat bewegende moleculen in de vloer hun energie op de pen overdragen, waardoor deze een meter de lucht ingeschoten wordt. Dit vereist echter dat alle moleculen in de vloer zich tegelijk in dezelfde richting (omhoog) bewegen. De kans dat dit gebeurt is echter zo onwaarschijnlijk klein, dat in de praktijk een omhoogvallende pen nooit wordt waargenomen. Bovenstaand voorbeeld geeft aan dat van alle processen die volgens de wet van behoud van energie mogelijk zijn, sommige wel en andere niet waarschijnlijk zijn. Deze waarschijnlijkheid waarmee processen optreden, kunnen wij bestuderen aan de hand van 20 kaarten, elk met een rode en een blauwe kant. Als wij deze kaarten in de lucht gooien, is de kans erg klein dat alle kaarten met de rode of juist met de blauwe kant naar boven komen te liggen. Veel waarschijnlijker is het dat 10 kaarten met de blauwe en 10 met de rode kant naar boven komen te liggen. Dat komt doordat er maar 1 configuratie mogelijk is met 20 rode (of 20 blauwe) kaarten omhoog, terwijl er 252 vergelijkbare configuraties zijn met 10 rode en 10 blauwe kaarten omhoog.

Wij kunnen deze waarschijnlijkheid kwantificeren met het begrip entropie (S). Volgens de Boltzmann vergelijking wordt deze gegeven door S = k. ln W, waarin k de Boltzmann constante is (gasconstante R gedeeld door getal van Avogadro) en W het aantal mogelijke configuraties dat leidt tot eenzelfde uitkomst (vergelijkbare configuraties). W is veel groter voor 10 rood/10 blauw dan voor 20 rood/0 blauw of 0 rood/20 blauw, en dus kunnen wij zeggen dat van alle mogelijke configuraties 10 rood/ 10 blauw de hoogste entropie heeft. Dus hoe hoger de entropie, des te waarschijnlijker is het dat een bepaalde situatie zich zal voordoen.

39

Gibbs energie De natuur streeft naar een zo laag mogelijke potentile energie. Dat betekent dat bij spontaan optredende processen potentile energie via andere energievormen uiteindelijk wordt omgezet in warmte. De potentile en kinetische energie van een systeem die beide in warmte omgezet kunnen worden, worden gezamenlijk aangeduid met de term enthalpie (H). Bij processen waarbij energie in de vorm van warmte vrij komt, neemt H af (ofwel H0, maar omdat S>0 (en ook T.S>0) zorgt het toch voor een G 0, dan ligt het evenwicht naar links (reactie verloopt niet goed) en is G < 0 dan ligt het evenwicht naar rechts (reactie verloopt wel goed). In de praktijk kunnen wij G-waarden op twee manieren interpreteren. Voor een gesoleerd systeem (bijv. in een reageerbuis) bepaalt G de ligging van het chemisch evenwicht. Bij een cascase van reacties bepaalt41

G de hoeveelheid Gibbs-energie die vrijkomt als 1 mol A en 1 mol B geheel omzet worden in 1 mol C en 1 mol D.

Hoog-energetische verbindingen

ATP (adenosine-triphosphate) is de centrale energiedrager in ons lichaam. Bij processen waarbij energie vrijkomt (bijv. de verbranding van suiker) zal de cel proberen om zoveel mogelijk van de vrijkomende energie om te zetten in ATP eenheden. Aan de andere kant kunnen processen in de cel die energie vereisen, alleen plaatsvinden dankzij de inzet van ATP moleculen. Voor 90% van alle energie-vragende processen in de cel wordt ATP gebruikt, maar sommige processen zijn afhankelijk van GTP (guanidide-triphosphate) of UTP (uridinetriphosphate).

ATP (zie afbeelding) heeft achter elkaar drie negatief geladen fosfaat-groepen en het afsplitsen van de laatste fosfaat-groep, waardoor ADP (adenosine-diphosphate) ontstaat, levert veel energie op (G = - 30 kJ/mol). Dat wil niet zeggen dat in waterig milieu ATP spontaan in ADP en Pi uiteenvalt, want de activeringsenergie voor deze reactie is zeer hoog en vindt zonder enzym niet plaats. Bindingen waarbij bij afsplitsing (meestal door hydrolyse met water) tenminste 30 kJ/mol vrijkomt, noemen wij per definitie hoog-energetische verbindingen. Wij geven een dergelijke binding aan met een in plaats van met een . Chemisch gezien is een hoog-energetische binding overigens niet anders dan een gewone binding (namelijk: een gedeeld electronenpaar), alleen komt er bij deze hydrolyse relatief veel energie vrij. Andere voorbeelden van stoffen met een hoog-energetische binding zijn: phospho-enol-pyruvaat (G = - 60 kJ/mol) en acetyl-CoA (G = - 30 kJ/mol). Het Coenzym A is en groot molecuul dat een acetyl-groep in de vorm van een hoog-energetische thiol-ester kan binden.

42

Acetyl- Coenzyme A

Voor processen waarbij meer dan 30 kJ/mol vereist is, kunnen twee fosfaat-groepen van ATP tegelijk worden afgesplitst, waarbij AMP (adenosine mono-phosphate) en PPi (pyrofosfaat) onstaan. De eerste hydrolyse-stap heeft op zich al een G = - 30 kJ/mol, maar vervolgens kan PPi gesplitst worden in twee losse Pi groepen, ook met een G = - 30 kJ/mol. In totaal heeft de reactie ATP AMP + PPi, met daarop volgend PPi 2Pi, dus een G = - 60 kJ/mol. Bij berekeningen hoeveel ATP eenheden een proces kost, gaan wij uit van een energie-inzet van -30 kJ/mol per ATP molecuul (dus equivalent van ATP naar ADP). Indien voor een reactie de pyrofosfaat-reactie wordt gebruikt (inzet - 60 kJ/mol) zullen wij dit als 2 ATP eenheden aanmerken. Dat blijkt ook uit het feit dat het gevormde AMP met ATP zal kunnen reageren tot 2 ADP, zodat in totaal 2 ATP moleculen bij de pyrofosfaat-reactie betrokken zijn.

Gekoppelde chemische reacties Chemische reacties die Gibbs energie opleveren (G < 0) worden exergone reacties genoemd, reacties die Gibbs energie kosten (G > 0) worden endergone reacties geneoemd. Afbraakreacties van complexe stoffen (bijv. suikers) zijn meestal exergoon, de opbouw van complexe moleculen in ons lichaam is een endergoon proces. Aangezien endergone reacties niet spontaan kunnen plaatsvinden, moet de cel hiervoor hoogenergetische verbindingen inzetten. Als voorbeeld, voor de afbraak van glucose is het nodig dat deze suiker eerst gefosforyleerd wordt. Echter de reactie waarbij glucose een los fosfaat-molecuul uit de oplossing opneemt en bindt, is sterk endergoon: glucose + Pi glucose-6-fosfaat (G = +14 kJ/mol). Indien echter tegelijkertijd de reactie ATP ADP + Pi optreedt (G = - 30 kJ/mol), kunnen deze twee processen gecombineerd worden tot ATP + glucose ADP + glucose-6-fosfaat, met een G = - 16 kJ/mol.

Het enzym dat deze reactie kan verzorgen, heet glucokinase of hexokinase. Het bindt zowel glucose (geel) als ATP (groen), en draagt een hoog-energetische fosfaatgroep over van ATP naar glucose. De exergone deelreactie (ATP ADP) en endergone deelreactie (glucose glucose-6-fosfaat) zijn vinden dus gekoppeld plaats en worden door hetzelfde enzym verzorgt. In conclusie, endergone reacties in de cel worden mogelijk gemaakt de inzet van hoog-energetische verbindingen en gekoppelde enzymatische reacties.43

Mechanismen van ATP vorming Er zijn drie principieel verschillende manieren waarop ATP in de natuur gegenereerd kan worden: Fotosynthese Onder invloed van licht kan in planten rechtstreeks ATP gevormd worden. Dit proces vindt niet plaats in dierlijke cellen. Substraat-fosforylatie Een hoogenergetische verbinding kan zijn energie overdragen op ADP, waardoor deze wordt omgezet in ATP. Een dergelijke kan reactie kan altijd plaatsvinden, ook als er geen O2 aanwezig is (dus zowel onder aerobe als anaerobe omstandigheden). Voorbeeld: phospho-enol-pyruvaat + ADP pyruvaat + ATP Oxidatieve fosforylering Veel stappen bij de afbraak van suikers zijn oxidatie-reacties. Oxidaties (ox) zijn per definitie reacties waarbij electronen vrijkomen. Deze electronen kunnen niet in vrije vorm voorkomen, maar moeten door een electronen-acceptor worden opgenomen (voorbeelden: FAD en NAD+). Door de opname van electronen worden deze stoffen gereduceerd (tot FADH2 en NADH). Reducties (red) zijn per definitie reacties waarbij electronen worden opgenomen. De gereduceerde electronen-acceptors dragen hun electronen vervolgens in een aantal stappen over op O2, waarbij uiteindelijk ATP wordt gevormd. Dit proces van zogenoemde oxidatieve fosforylering kan dan ook alleen plaatsvinden onder aerobe omstandigheden. Oxidatiereacties zijn doorgaans exergoon, en reductie-reacties endergoon. Voorbeeld 1: ethaan etheen + 2H+ + 2e (ox) (G < 0) + FAD + 2H + 2e FADH2 (red) (G > 0) (de gekoppelde reactie is exergoon) FADH2 draagt opgenomen electronen over op O2 ( 2 ATP) Voorbeeld 2: ethanol ethanal + 2H+ + 2e (ox) (G < 0) NAD+ +H++2eNADH red (G > 0) (de gekoppelde reactie is exergoon) NADH draagt opgenomen electronen over op O2 (3ATP De reductie van NAD+ is sterker endergoon dan die van FAD. NAD+ kan dan ook alleen maar als electronen-acceptor worden gebruikt, als de bijbehorende oxidatie-reactie voldoende exergoon is. Dat is wel het geval bij de oxidatie van een alcohol tot een aldehyde (voorbeeld 2), maar niet bij de oxidatie van een alkaan naar een alkeen (voorbeeld 1).

44

Oxidatieschema van koolwaterstoffen Ialgemeen - bij oxidatie-reacties komen electronen vrij - bij reductie-reacties worden electronen opgenomen - oxidatie-reacties kunnen resulteren in: * andere metaal-valentie: Fe2+ Fe3+ + e * dehydrogenatie: C2H6 C2H4 + 2H+ + 2e (R1/1) alkaan naar alkeen en alcohol H H R C C H H H alkaan FAD +2H+ +2e ox R C C H +2H+ +2e H H alkeen FADH2 2 ATP H H H H R C C H of R C C H H OH OHH primaire alcohol secundaire alcohol

red

R C C H hydraH H tatie alkeen

+H2O

(R1/2a) primaire alcohol naar aldehyde H H R C C H H OH primaire alcohol NAD+ +H+ +2e ox H H R C C O H aldehyde NADH +2H+ +2e

red

3 ATP

(R1/2b) secundaire alcohol naar keton H H R C C H OHH secundaire alcohol NAD+ +H+ +2e ox H R C C H +2H+ +2e O H keton NADH 3 ATP

red

45

Oxidatieschema van koolwaterstoffen II(R1/3a) aldehyde naar carbonzuur H H ox R C C -1 H2O O H aldehyde NAD+ +H+ +2ered

H OH +2H+ +2e R C C O H carbonzuur NADH 3 ATP

(R1/3b) aldehyde naar carbonzuur-f osf aat P H H H O ox +2H+ +2e R C C R C C O -1 P O H H carbonzuur-fosfaat aldehyde NAD+ +H+ +2e P-1 ADP red

NADH

3 ATP

H O R C C O H

H OH R C C O H carbonzuur

1 ATP

carbonzuur-fosfaat

(R1/4) oxidatieve decarboxylering OH * +1 CO2 ox-1 CoASH

* R C C O O -ketozuur

R C SCoA +2H+ +2e O zuur-CoA thiolester NADH R C OH O carbonzuur 3 ATP 1 ATP

NAD+ +H+ +2e

red

R C SCoA -1 ADP O zuur-CoA thiolester

+1 CoASH

46

47

48

49

Citroenzuurcyclus II (alleen aeroob)

O

OH O 2 OH O 2 OH O 2 OH C C C C 3 3 3 3 CH2 +1 FADH2 C H hydra- H C OH +1 NADH C O 3 3 3 tatie CH2 (R1/1) H C 3 (R1/2b) CH2 CH2 2 2 2 2 C C C C O OH O OH O OH O OH2

barnsteenzuur (succinaat)

fumaarzuur

appelzuur (malaat)

oxaalazijnzuur

Netto energiewinst: 1 acetyl-CoA 1 oxaalazijnzuur: 3 NADH, 1 FADH2, 1 GTP Netto energiewinst in ATP eenheden (aeroob): - 1 glucose: 38 (36) ATP - 1 glyceraldehyde-3-fosfaat: 20 ATP - 1 pyruvaat: 15 ATP - 1 acetyl-CoA: 12 ATP Netto energiewinst in ATP eenheden (anaeroob): - 1 glucose: 2ATP ENERGIEWINST-SCHEMA BIJ AFBRAAK GLUCOSE glucose-1 ATP -1 ATP 2x

glyceraldehyde-3-fosfaat+1 NADH +1 ATP +1 ATP -1 NADH (anaeroob) +1 NADH

pyruvaat

lactaat

acetyl-CoA oxaalazijnzuur CZC+1 NADH +1 FADH2 +1 NADH +1 NADH +1 GTP

50

Deaminering van aminozuren(energie neutraal: G0' = 0) R1 H C NH2 C O OH aminozuur alanine asparaginezuur glutaminezuur + X C O C O OH R1 C O C O OH -ketozuur pyruvaat oxaalazijnzuur -keto-glutaarzuur + X H C NH2 C O OH NH2-donor

NH2-acceptor

-oxidatie van vetzurenH H H H OH -2 ATP R C C C C C O -1 CoASH H H H H vetzuur H H R C C C C C H H H H O H H H H R C C C C C H H OHH O H H H H R C C C C C H H H H O SCoA

vetzuur-CoA thiolester aantal C-atomen: n SCoA

+1 FADH2 (R1/1)

hydratatie

SCoA

+1 NADH

H H H R C C C C C (R1/2b) H H O H O

SCoA

H H H R C C C SCoA + H C C SCoA -1 CoASH H H O H O vetzuur-CoA (n-2) acetyl-CoAhydrolyse

H H H OH Netto energiewinst: 1 H C C C C geeft 27 ATP O H H H

51

Oxidatieve fosforylering- vindt plaats aan de binnenmembraan van mitochondrien - omvat electronentransport van NADH (of FADH2) naar O2 - stapsgewijze oxidatie en reductie van electronencarriers - NADH, FADH2, CoQ worden geoxideerd door dehydrogenatie, andere electronencarriers door verandering van valentie (Fe2+, Cu+)4H+ rotenon 4H+ antimycine 2H+ cyanide

NADH

(complex I)

O2 ubiquinon Cyt.C (complex III) (complex IV) (CoQ)

(complex II)

FADH2 - chemi-osmotische theorie (Mitchell): netto transport van electronen uit de mitochondrien leidt tot een electrochemische gradient van protonen (combinatie van pH en ladingsgradient) die als proton-motive force (pmf) de ATPase aanzet om ADP om te zetten in ATP (complex V) NADH2e

CoQ

2e

Cyt.C

2e

O2 DNP (ontkoppelaar): maakt mitochondriale membraan permeabel voor protonen Oligomycine: remt mitochondriale ATPase

H+

ATP

52

Structuur en functie van vetzuren Vetzuren bestaan uit lange, verzadigde koolwaterstof-ketens, eindigend met een COOH groep. Algemeen kunnen wij hun structuur dus weergeven als CH3-(CH2)n -COOH. De meeste vetzuren in ons lichaam hebben een lengte van 16 tot 22 koolstof-atomen. Naast verzadigde vetzuren bestaan er ook onverzadigde vetzuren, die een of meer dubbele bindingen bevatten. Cis-dubbele bindingen induceren een knik in de structuur van een vetzuur, terwijl trans-dubbele bindingen dat in veel mindere mate doen.

Vetzuren kunnen op twee manieren worden genummerd. De COOH groep is officieel het nummer C1, maar daarnaast wordt het laatste C-atoom (CH3-groep) vaak als het omega () C-atoom aangeduid. Naast verzadigde vetzuren (geen dubbele bindingen) kennen wij dan ook -9 vetzuren (laatste cis dubbele binding 9 C-atomen van het eind), -6 vetzuren (laatste cis dubbele binding 6 C-atomen van het eind) en -3 vetzuren (laatste cis dubbele binding 3 Catomen van het eind). Onderstaand een overzicht van de belangrijkste vetzuren: naam palmitinezuur stearinezuur elaidinezuur oliezuur linolzuur arachidonzuur linoleenzuur eicosapentaeenzuur (EPA) docosahexaeenzuur (DHA) code C16:0 C18:0 C18:1 trans C18:1 cis C18:2 cis C20:4 cis C18:3 cis C20:5 cis C22:6 cis dubbele bindingen verzadigd verzadigd 9 9 9,12 5,8,11,14 9,12,15 5,8,11,14,17 4,7,10,13,16,1953

laatste dubbele binding nvt nvt -9 -9 -6 -6 -3 -3 -3

Verzadigde vetzuren (C16:0; C18:0) komen vooral in dierlijke vetten, roomboter, cacao en palmolie voor. Trans-onverzadigde vetzuren komen van nature niet bij de mens voor, maar ontstaan vooral bij het kunstmatig verzadigen van dubbele bindingen in olin (hardingsproces om olin langer houdbaar te maken). Oliezuur komt vooral voor in olijfolie en eieren, terwijl linolzuur veel voorkomt in zonnebloem-olie (dieet-margarine). Van de -3 vetzuren komt linoleenzuur vooral voor in plantaardige olin en walnoten, terwijl EPA en DHA vooral gevonden worden in vette vis. Verzadigde vetzuren en -9 vetzuren (oliezuur) kan ons lichaam zelf aanmaken, maar -6 en -3 vetzuren moeten essentieel via onze voeding worden opgenomen. Wel kunnen wij van essentile vetzuren de keten verlengen (per groep van 2C-atomen aan COOH), maar alleen extra dubbele bindingen tussen -9 en de COOH groep aanleggen. De enige echte essentile vetzuren voor ons lichaam (zie figuur links) zijn dan ook linolzuur (waar wij de overige -6 vetzuren uit kunnen synthetiseren) en linoleenzuur (waar wij de overige -3 vetzuren uit kunnen synthetiseren).

Het -6 vetzuur arachidonzuur kunnen wij dus zelf maken uit het -6 vetzuur linolzuur (zie figuur links), door ketenverlenging en het aanleggen van extra dubbele bindingen aan de COOH kant. Uit arachidonzuur kan ons lichaam farmacologisch belangrijke stoffen maken, waaronder prostaglandinen. Dit zijn cyclische vormen van arachidonzuur, waaraan extra OH groepen zijn gekoppeld. Het prostaglandine E2 (zie figuur rechts) verlaagt de bloeddruk, ontspant de gladde spieren en reguleert de persween. Het eten van verzadigde en trans-vetzuren leidt tot een verhoging van cholesterol in ons bloed, en daarmee een verhoogde kans op hart- en vaatziekten. Zowel -6 vetzuren (linolzuur; Becel) als -3 vetzuren (visolie) verlagen het cholesterol-gehalte van ons bloed.54

De gemiddelde Europeaan krijgt te weinig -3 vetzuren binnen. Hebben Eskimos in hun voeding een -6/ -3 verhouding van 2:1, bij ons is die verhouding 20:1. Of dit ook de reden is dat bij Eskimos minder hart-en-vaatziekten en kanker voorkomen, wordt momenteel uitgebreid onderzocht. Triglyceriden en fosfolipiden Vetzuren zijn een belangrijke energiebron voor ons lichaam. Vetopslag vindt plaats in de vorm van triglyceriden; deze bestaan uit 3 vetzuurmoleculen, die elk via een ester-binding gekoppeld aan een van de 3 OH groepen van glycerol (zie bovenste helft figuur). Fosfolipide-moleculen vormen de bouwstenen van biologisch membranen. Fosfolipide-moleculen hebben een apolair gedeelte (2 vetzuren gekoppeld aan C1 en C2 van glycerol) en een polair gedeelte, dat gekoppeld is aan de C3 van glycerol. Dit polaire gedeelte bestaat uit een fosfaat-groep en een polaire kopgroep (in figuur linksonder is dat de base choline). De fosfolipiden in biologische membranen hebben meestal een verzadigd vetzuur op C1 en een onverzadigd vertzuur op C2. In fosfolipide-moleculen is C2 asymmetrisch. Alle natuurlijk voorkomende fosfolipide-moleculen hebben op C2 de L-configuratie (dus afgeleid van L-glyceraldehyde; dat is niet in deze figuur te zien). Cholesterol en cholesterol-ester Cholesterol is ook een belangrijke component van biologische membranen. Het molecuul bestaat uit een steroide-kern, een vertakte alkyl zijketen, en een kleine polaire kop (-OH). In het bloed wordt cholesterol getransporteerd als cholesterol-ester, waarbij deze OH groep via een esterbinding gekoppeld is aan een vetzuur. Ongeveer 2/3 van het cholesterol wordt door ons lichaam zelf aangemaakt (dit kan geremd worden met zgn. statines). De overige 1/3 krijgen wij via onze voeding binnen (met name via voedingsmiddelen met veel verzadigde vetzuren, zoals kaas, vlees en ei). Cholesterol is ook de bron voor steroid hormonen in ons lichaam, waaronder estrogeen, testosteron, vitamine D en cortisol. Hoewel cholesterol een slechte naam heeft, is het dan ook onmisbaar voor het functioneren van ons lichaam.

55

Lipoproteinen Via ons bloed worden vetten en cholesterol getransporteerd tussen de lever en vetweefsel. Dit gebeurt in de vorm van zgn. lipoproteinen. De kern, die bestaat uit triglyceriden en cholesterol-ester, wordt omgeven door een enkele laag van fosfolipiden en (niet-veresterd) cholesterol, zodat de buitenkant van de lipoproteinen polair is, en zij dus goed in water oplossen.

56

De buitenkant van lipoproteinen bevat daarnaast specifieke eiwitten, die bekend staan als apolipoproteinen. De bekendste lipoproteinen zijn LDL (low density lipoprotein) and HDL (high density lipoprotein). LDL, dat het eiwit ApoB bevat, heeft veel triglyceriden en cholesterol-ester in zijn kern, en staat bekend als slecht cholesterol als het gaat om het risico voor hart en bloedvaten. HDL, dat onder andere de eiwitten ApoA en ApoC bevat, heeft weinig triglyceriden en cholesterol-ester in zijn kern, en staat bekend als goed cholesterol. Structuur van fosfolipiden Zoals eerder aangegeven, bestaan fosfolipiden uit een glycerol-molecuul met daaraan gekoppeld twee vetzuren, een fosfaatgroep en een polaire kopgroep. De belangrijkste polaire kopgroepen zijn: ethanolamine (HO-CH2-CH2-NH2); choline (HO-CH2-CH2-N-(CH3)3); serine (aminozuur met zijketen HO-CH2) en glycerol (HO-CH2-CHOH-CH2-OH). Deze verbindingen kunnen met hun OH groep een OH van de fosfaatgroep binden via een etherbinding, onder afsplitsing van H2O (dus P-O-C).

Fosfolipiden met deze polaire kopgroepen heten phosphatidyl-ethanolamine (PE), phosphatidyl-choline (PC), phosphatidyl-serine (PS) en phosphatidyl-glycerol (PG). De fosfaatgroep heeft altijd een enkele negatieve lading, terwijl de polaire kopgroep positief57

(choline, ethanolamine) of neutraal (serine, glycerol) kan zijn. Als gevolg daarvan zijn fosfolipiden in zijn geheel ofwel neutraal (PE, PC) of negatief (PS, PG) geladen. Als alleen de fosfaatgroep aanwezig is, maar de polaire kopgroep ontbreekt, spreken wij van phosphatidic acid (PA), dat negatief geladen is. Bovenstaande fosfolipiden zijn vooral van belang voor de structuur van biologische membranen. Een fosfolipide dat daarnaast van belang is voor het doorgeven van signalen van buiten naar binnen de cel, is phosphatidyl-inositol (PI). Dit heeft als polaire kopgroep een cyclische suikerring met 6 OH groepen. Aan deze suikerring kunnen extra fosfaat-groepen geplaatst worden, waardoor de belangrijke stoffen phosphatidyl-inositol-phosphate (PIP) en phosphatidyl-inositol-bisphosphate (PIP2) ontstaan. Al deze inositol-houdende lipiden hebben een netto negatieve lading. Naast fosfolipiden, die zijn opgebouwd vanuit glycerol, bestaan er ook sphingolipiden, die zijn opgebouwd vanuit het molecuul sphingosine. Het belangrijkste lipide-molecuul uit deze klasse is sphingomyeline (Sph) dat evenals PC een negatieve fosfaat-groep heeft met daaraan gekoppeld een positieve choline-groep. Sph is dan ook neutraal van lading. Liposomen en micellen Als fosfolipiden in een waterig milieu worden gebracht, vormen zij (dankzij hun cylindrische vorm) spontaan bilagen, waarbij de apolaire vetzuren van het water afgekeerd worden, en de polaire kopgroepen naar het water toe gericht worden. Dergelijke kunstmatige bilagen van fosfolipide-moleculen in waterig milieu worden liposomen (of ook wel vesicles) genoemd. Binnen in het liposoom bevindt zich een waterig compartiment. In dit waterig compartiment kunnen stoffen worden opgeslagen. Liposomen spelen dan ook een belangrijke rol bij drug delivery van geneesmiddelen in het lichaam.

Lipide-moleculen die maar n vetzuur-molecuul hebben (zgn. lysolipiden), kunnen (vanwege hun wig-vorm) geen bilaag vormen, omdat hun apolaire volume te klein is. In plaats daarvan vormen zij in waterig milieu spontaan micellen, zoals wij dat ook gezien hebben bij detergentia zoals SDS.58

Cholesterol reguleert de membraan-vloeibaarheid membraan Cholesterol in biologische membranen heeft een dubbele functie. Fosfolipiden met verzadigde vetzuren bevinden zich bij een fysiologische temperatuur van 37C in een vaste, geordende toestand (crystalline state), vergelijkbaar met de vaste vorm van vetten. Door de temperatuur , te verhogen, kunnen dergelijke fosfolipiden smelten tot een vloeibare, niet-geordende geordende toestand (liquid-crystalline state), vergelijkbaar met de vloeibare vorm van een olie. De crystalline temperatuur waarbij dit smelten optreedt, staat bekend als de fase-overgangstemperatuur (Tm) fase overgangstemperatuur van een lipid. Bij fosfolipiden met onverzadigde vetzuren ligt Tm ruim beneden de 37C, on zodat deze zich onder fysiologische omstandigheden al in een vloeibare toestand bevinden..

Cholesterol gaat in membranen tussen de fosfolipide-moleculen in zitten. Het resultaat is dat fosfolipide moleculen fosfolipiden in de vaste crystalline state vloeibaarder worden (vaste pakking wordt en verbroken), terwijl fosfolipiden in de vloeibare liquid-crystalline toestand minder vloeibaar , liquid crystalline worden. Voor het goed functioneren van biologische membranen is het van groot belang dat hun fosfolipiden voldoende vloeibaar zijn. Als wij veel verzadigde vetzuren eten, zal ons zijn. lichaam veel cholesterol aanmaken om onze membranen de benodigde vloeibaarheid te geven. Als wij voldoende onverzadigde vetzuren eten, hoeft ons lichaam dus minder cholesterol aan te maken. De beste manier om het cholesterol gehalte van ons bloed te verlagen, is dan ook om minder verzadigd vet te eten. Fluid Mosaic Model voor biologische membranen Biologische membranen bestaan uit een lipide bilaag (fosfolipiden, cholesterol) met daaraan diverse soorten eiwitten gebonden. Integrale eiwitten steken door de lipide-bilaag heen. oorten bilaag Dergelijke eiwitten hebben doorgaans een alpha-helix van apolaire aminozuren, dat hydrofobe alpha , interacties aan kan gaan met het apolaire deel van de bilaag. Integrale eiwitten heb bilaag. hebben vaak een functie als transport-eiwit (stoffen de cel in en uit transporteren) of als receptor (signalen eiwit59

van buiten de cel opvangen en naar het binnenste van de cel doorgeven). Perifere eiwitten zitten aan de binnen- of buitenkant van de cel, en hechten zich aan de lipide bilaag met name via electrostatische interacties (bijv. via de negatieve fosfaatgroep van de fosfolipiden). De perifere eiwitten aan de binnenkant van de plasmamembraan (cytoskelet-eiwitten) spelen een belangrijke rol bij de specifieke vorm die cellen kunnen aannemen (bijv. uitlopers in zenuwcellen; bloedcellen die door nauwe haarvaten moeten kunnen bewegen). De perifere eiwitten aan de buitenkant van de plasmamembraan (hechtings-eiwitten) spelen een belangrijke rol bij de hechting van cellen aan elkaar (bijv. voor de vorming van organen) en aan eiwitten van de zgn. extracellulaire matrix (bedoeld voor versteviging en structuur van weefsels).

Zowel eiwitten als lipiden aan de buitenkant van de cel kunnen suikergroepen bevatten. Deze spelen een belangrijke rol bij de herkenning van cellen, bijvoorbeeld door ons afweersysteem (bijv. A-, B- en O- bloedgroepen). Fosfolipide moleculen kunnen zich niet snel van de ene monolaag naar de andere bewegen, een proces dat bekend staat als flip-flop. Wel kunnen de fosfolipiden zich snel bewegen in het vlak van de lipide-bilaag, een proces dat bekend staat als laterale diffusie. Integrale membraan-eiwitten kunnen ook lateraal bewegen, maar vaak wordt dit beperkt door binding aan eiwitten van het cytoskelet. Fosfolipiden in biologische membranen zijn asymmetrisch verdeeld De plasma-membraan van zoogdiercellen heeft een andere fosfolipide-samenstelling dan de membraan van de diverse intracellulaire organellen. Het meest opvallend is het verschil met de membraan van mitochondrin, die veel minder cholesterol en veel meer phosphatidylethanolamine bevat. Ook bevat de mitochondriale membraan het lipide-molecuul cardiolipin, dat normaal gesproken alleen bij lagere organismen zoals bacterin voorkomt. Dit is n van de argumenten op basis waarvan verondersteld wordt dat mitochondrin ontstaan zijn uit een symbiose tussen eukaryotische cellen en aerobe bacterin.60

Rode bloedcellen (erythrocyten) bevatten alleen een plasma-membraan, omdat zij hun intracellulaire organellen hebben verloren. Van deze plasma-membraan is aangetoond dat de neutrale fosfolipiden PC en Sph zich vooral in de buitenste monolaag bevinden, terwijl de negatief geladen fosfolipiden PS, PA en PI zich nagenoeg uitsluitend in de binnenste monolaag bevinden. Van andere cellen is aangetoond dat zodra PS aan de buitenkant van de cel terechtkomt, dit de cel kan aanzetten tot geprogrammeerde celdood (apoptose).

Diffusie en osmose De plasma-membraan vormt de scheiding tussen de interne en externe wereld van de cel. De membraan moet er voor zorgen dat belangrijke stoffen door de cel kunnen worden opgenomen, zonder dat dergelijke stoffen ongecontroleerd de cel weer kunnen verlaten. Biologische membranen zijn daarom semi-permeabel, hetgeen inhoudt dat sommige stoffen wel, en andere niet, door de membraan heen kunnen diffunderen.

De lipide-bilaag met zijn apolair karakter laat alleen kleine, ongeladen moleculen spontaan door. Daartoe behoren onder andere H2O en glycerol. Overigens vereist de permeatie van H2O en glycerol door een lipide-bilaag wel een hoge activeringsenergie, want eerst moeten hun Hbruggen met (andere) water-moleculen worden verbroken. Grotere, ongeladen moleculen (zoals glucose) en geladen stoffen, zoals Na+, K+ en Cl-, kunnen niet spontaan door een lipidebilaag diffunderen. Daarvoor zijn specifieke transport-eiwitten in de membraan nodig.

61

Indien glycerol (verdund in een zoutoplossing) aan de buitenkant van een cel wordt gebracht, zoutoplossing) gebracht zal het spontaan door de lipide-bilaag de cel ingaan. Dit proces van spontane diffusie zal bilaag ingaan doorgaan, totdat de concentratie van glycerol (blauwe 6-hoekjes) binnen en buiten de cel rgaan, va gelijk is (Cin = Cout). Bij de diffusie van glycerol door de membraan komt geen warmte vrij. De drijvende kracht voor spontane diffusie is dan ook volledig een winst aan entropie.

Ook H2O kan door de bilaag diffunderen, maar zolang de totale concentratie aan opgeloste deeltjes aan beide zijden van de membraan gelijk is, zal er per tijdseenheid evenveel water de cel instromen als uitstromen. Is echter de concentratie van opgeloste deeltjes aan de ene kant omen. van de membraan anders dan aan de andere kant, zal de H2O-concentratie aan beide zijden concentratie van de membraan iets anders zijn. Als gevolg daarvan zal er netto water stromen van het compartiment met lage naar dat met hoge concentratie opgeloste deeltjes (suiker(suiker-moleculen in het voorbeeld). Dit proces, dat bekend staat als osmose, gaat door totdat de concentratie aan , opgeloste stoffen in beide compartimenten gelijk is. De som van het aantal opgeloste deeltjes in een oplossing (toniciteit) wordt uitgedrukt in de hoeveelheid Osmol/liter (OsM). Voor hoeveelheid sucrose geldt dat 1OsM overeenkomt met met 1 mol/liter, terwijl voor NaCl, dat in water uiteenvalt in 2 deeltjes, geldt dat 1 OsM overeenkomt met 0.5 mol/liter.

Het cytoplasma van een cel heeft een toniciteit van 300 mOsM, vooral door de aanwezigheid mOsM, van K+ en Cl- ionen. Oplossingen met een toniciteit hoger dan 300 mOsM heten hypertoon (cellen krimpen er in), terwijl oplossingen met een toniciteit lager dan 300 mOsM heten hypotoon (cellen zwellen er in op).62

Kanalen, carriers en pompen Zoals gezegd, zijn er maar weinig stoffen die spontaan door een lipide-bilaag kunnen diffunderen (bijv. H2O, glycerol). Om andere stoffen de cel in en uit te krijgen, zijn specifieke transport-eiwitten nodig. Daarbij kan een onderscheid worden gemaakt tussen kanalen en carriers. Kanalen vormen een opening in de membraan, waardoor specifiek een bepaald ion (meestal Na+, K+, Ca2+ of Cl-) kan diffunderen. Kanalen kunnen, naar behoefte, open en dicht worden gezet. Kanalen geven aanleiding tot een hoge transport-snelheid en zijn niet verzadigbaar. Dat houdt is dat het kanaal het ion waarvoor het specifiek is, ongehinderd doorlaat (geen maximum snelheid). Carriers zijn membraan-eiwitten die de te transporteren stof aan de ene kant van de membraan binden, deze vervolgens in zich opsluiten, en ze daarna aan de andere kant van de membraan weer loslaten. Aangezien carriers na binding van de stof eerst een conformatieverandering moeten ondergaan, de stof weer moeten loslaten en vervolgens weer leeg naar de oorspronkelijke kant van de membraan moeten terugkeren, kunnen carriers stoffen met veel lagere snelheid transporteren dan kanalen. Daarenboven zijn carriers verzadigbaar. Dat houdt in dat bij steeds toenemende concentratie van de transporteren stof er een maximum transportsnelheid zal optreden. Ook al zal de leeg terugkerende carrier onmiddellijk door botsing een nieuw substraat-molecuul binden, dan heeft de carrier toch tijd nodig om het substraatmolecuul naar de andere kant van de membraan te transporteren en weer leeg terug te komen. De kinetiek waarmee carriers stoffen transporteren, lijkt dan ook erg veel op de kinetiek waarmee enzymen werken. Voor de transportsnelheid via carriers geldt dan ook de formule:.

V0 =

In deze formule is V0 de initile transportsnelheid, die gemeten wordt onmiddellijk na toevoegen van het transporteren substraat-molecuul [S] aan de buitenkant van de cel, Vmax de maximale transportsnelheid die optreedt als [S] = , en Kt de transport-constante die aangeeft bij welke [S] de transport-snelheid de helft van Vmax bedraagt. Deze constante Kt wordt bepaald door de affiniteit waarmee de carrier het substraat bindt, en de tijd die de carrier nodig heeft om het gebonden substraat-molecuul binnen af te leveren en leeg weer terug te keren. Kanalen (bijv. Na+-kanaal; K+-kanaal) en carriers (bijv. glucose-carrier) kunnen stoffen alleen transporteren van een hoge naar een lage concentratie (met de concentratie-gradint mee). Wij63

zullen echter zien dat er ook transport nodig is, waarbij stoffen van een lage naar een hoge concentratie getransporteerd moeten worden. Eiwitten die ionen tegen hun gradint in transporteren, worden pompen genoemd. Een voorbeeld is de Ca2+-ATPase, die Ca2+ uit de cel pompt, en er daarmee voor zorgt dat de Ca2+-concentratie in de cel veel lager is dan buiten de cel. De energie die het kost om Ca2+ tegen zijn gradint in naar buiten de cel te pompen, wordt geleverd door de hydrolyse van ATP. Actief transport, passief transport en co-transport Men kan bij transport-processen door carriers onderscheid maken tussen actief en passief transport. Bij passief transport vindt de diffusie van stoffen over de membraan plaats in de richting van hun concentratie-gradint. Deze processen vereisen doorgaans geen energie en worden gedreven door de te behalen winst aan entropie (voorbeeld: glucose-opname in de rode bloedcel). Actief transport zijn alle transport-processen waarbij stoffen tegen hun concentratie-gradint in worden getransporteerd. Daarbij kan onderscheid worden gemaakt tussen primair en secondair actief transport. Bij primair actief transport wordt een stof tegen zijn concentratie-gradint in getransporteerd (van x naar X), waarbij de benodigde energie geleverd wordt door hydrolyse van een hoog-energetische verbinding zoals ATP (voorbeeld: Ca2+-ATPase). Bij secondair actief transport wordt de ene stof tegen zijn concentratie-gradint in getransporteerd (van s naar S), terwijl tegelijkertijd een andere stof met zijn concentratie-gradint mee wordt getransporteerd (van X naar x). De benodigde energie voor het actieve transport (van S) wordt daarbij geleverd door de Gibbs-energiewinst die vrijkomt doordat de andere stof (hier X) met zijn gradient mee wordt getransporteerd (om de stof x vervolgens tegen zijn concentratie-gradint weer de cel uit te pompen, is wel weer ATP energie nodig). Een voorbeeld is de Na+/glucose cotransporter in epitheelweefsel, die glucose tegen zi