UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS
BIOLGICAS
METABOLISMO DE LOS FENILPROPANOIDES Y PROTENAS RELACIONADAS CON
LA PATOGNESIS EN EL MECANISMO DE RESPUESTA DE UVA DE MESA (VITIS
VINIFERA L. CV. CARDINAL) A ELEVADAS CONCENTRACIONES DE CO2 Y BAJAS
TEMPERATURAS
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Irene
Romero de la Fuente
Bajo la direccin de las doctoras M Teresa Snchez-Ballesta y
Carmen Merodio Moreno
Madrid, 2009
ISBN: 978-84-692-1103-8
Irene Romero de la Fuente, 2009
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Metabolismo de los fenilpropanoides y protenas relacionadas con
la patognesis en el mecanismo de respuesta de uva de mesa (Vitis
vinifera L. cv. Cardinal) a elevadas concentraciones de CO2 y bajas
temperaturas
TESIS DOCTORAL IRENE ROMERO DE LA FUENTE MADRID, 2008
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLGICAS
Metabolismo de los fenilpropanoides y protenas relacionadas con
la patognesis en el mecanismo de respuesta de uva de mesa (Vitis
vinifera L. cv. Cardinal) a elevadas concentraciones de CO2 y bajas
temperaturas
Memoria presentada por IRENE ROMERO DE LA FUENTE para optar al
grado de DOCTORA en CIENCIAS BIOLGICAS
Directoras DRA. M TERESA SANCHEZ-BALLESTA DRA. CARMEN MERODIO
MORENO Cientficos Titulares del CSIC
Madrid, 2008
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTFICAS INSTITUTO DEL FRO
C/ Jos Antonio Novais, 10 28040, Madrid Tlf: 91-5492300
M Teresa Snchez Ballesta, Doctora en Farmacia, contratada del
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas adscrito al
Instituto del Fro de Madrid
Certifica: que D Irene Romero de la Fuente ha realizado bajo su
codireccin el trabajo con el ttulo: Metabolismo de los
fenilpropanoides y protenas relacionadas con la patognesis en el
mecanismo de respuesta de uva de mesa (Vitis vinifera L. cv.
Cardinal) a elevadas concentraciones de CO2 y bajas temperaturas,
que presenta para optar al grado de Doctor en Biologa Para que
conste a los efectos oportunos, firma el presente certificado en
Madrid a 14 de diciembre de 2007.
M Teresa Snchez Ballesta
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTFICAS INSTITUTO DEL FRO
C/ Jos Antonio Novais, 10 28040, Madrid Tlf: 91-5492300
Carmen Merodio Moreno, Doctora en Biologa, cientfico titular del
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas adscrito al
Instituto del Fro de Madrid
Certifica: que D Irene Romero de la Fuente ha realizado bajo su
codireccin el trabajo con el ttulo: Metabolismo de los
fenilpropanoides y protenas relacionadas con la patognesis en el
mecanismo de respuesta de uva de mesa (Vitis vinifera L. cv.
Cardinal) a elevadas concentraciones de CO2 y bajas temperaturas,
que presenta para optar al grado de Doctor en Biologa Para que
conste a los efectos oportunos, firma el presente certificado en
Madrid a 14 de diciembre de 2007.
Carmen Merodio Moreno
Quiero mostrar mi ms sincero agradecimiento a todas las personas
que han contribuido directa o indirectamente a la realizacin de
esta tesis. Habis sido muchos, as que espero no dejarme a nadie en
el tintero. A mis directoras de tesis, Maite y Carmen, por la
oportunidad que me habis brindado al confiar en m para que llevara
a cabo este trabajo. Maite, muchas gracias por haberme enseado
tanto en este corto periodo de tiempo; por tu entrega, paciencia y
dedicacin. Ha sido un placer poder compartir contigo tan buenos
momentos a lo largo de estos cuatro aos: en el laboratorio, en los
cafs, en quedadas varias, Congresos. y estoy segura de que sern
muchos ms! Gracias porque adems de ser un ejemplo a seguir a nivel
profesional, puedo decir que eres mi amiga. Carmen, muchas gracias
por tu apoyo y ayuda en la elaboracin de esta tesis. Me he sentido
muy acogida y arropada en el grupo desde el primer da que llegu.
Gracias por tus consejos, conocimientos y por los buenos momentos
que hemos compartido. Tambin quiero dar las gracias de manera
especial a Mara I. Escribano; sin tu ayuda esta tesis habra costado
bastante ms. Gracias por los consejos, conversaciones y momentos
agradables de estos aos. Adems, a todos los que habis trabajado en
el grupo coincidiendo con mi estancia: A Oskir, por tu ayuda en el
laboratorio, por tu compaa durante este caminar, por los ratos
divertidos que hemos compartido, risas, bromas, cenas y bailes
asincrnicosy, principalmente, por ser mi amigo. Hemos pasado muchos
momentos juntos y has estado en los buenos (la mayora), y en los no
tan buenosGracias! A Carlos (Charly), porque aunque has llegado el
ltimo ao, hemos trabajado codo a codo muchos das y ha sido un
tiempo vivido muy intensamente. Muchas gracias por tu ayuda en el
laboratorio y por las ancdotas y risas que hemos compartido; aunque
este ao los resultados se hicieron esperaral final salieron!!!
(Barabarabarab!). A todos los que han pasado por este laboratorio:
Roberto, por tu ayuda y apoyo los primeros aos cuando aparec por el
laboratorio; Helena, Raquel, Patricia y Paloma. Y a los tcnicos:
Delfina, Oscar B., Olga, Miguel A. y Fernando. Gracias, porque la
buena compaa es un factor muy importante para que las cosas salgan
adelante. A la maja remaja (Sonia), por amenizar los cafs matutinos
y dems fiestas de guardar. Gracias por la oportunidad que me diste
de asistir al curso en Kiel (fue toda una experiencia!); por ser
tan autntica y por tus cuidados: Viva el hornazo! (Aunque a veces
vayas de durate tengo cal). A Mara Hidalgo, gracias por tu apoyo.
Aunque has venido hace poco ha dado tiempo de sobra para pasar
buenos ratos y compartir preocupaciones y alegras. Y espero que
siga siendo as. A los compis de la sala de becarios; sois muchos
los que habis pasado por la salita, pero especialmente os agradezco
a los actuales la paciencia y el apoyo que me habis dado en estos
meses de enclaustramiento. A Sara, por tu alegra, tus nimos y tu
apoyo. Me alegro que nos volvisemos a encontrar aqu despus de los
aos de facultad (Quin nos lo iba a decir, eh?). A las vecinas de
enfrente: Tati, Tati, Tati (con musiquita, claro) y Ailn
(por surtirme de chicles), porque me habis hecho pasar muy
buenos momentos. A Mariv, Pilar y Pedro, por vuestros buenos
consejos y nimos. A todos los investigadores y compaeros del
Departamento de Ciencia y Tecnologa de Productos Vegetales, a los
que estuvieron y a los que actualmente estn; especialmente a Cris,
Patri, Eva, Ins, Clara y Fer con los que he compartido buenos
momentos. Y al Departamento de Ciencia y Tecnologa de Productos
Lcteos; por vuestra amabilidad, y generosidad al compartir equipos
y material que han facilitado la realizacin de esta tesis. A Teresa
Requena, Marta, Raquel, Toms y Cris. A los actuales compis de sala
de Maite y Sonia (extensin 284), a la que tanto he llamado y
visitado: Luis, Nacho, Sonia, Carmen. Gracias por vuestra
paciencia. Al Instituto del Fro donde he podido llevar a cabo este
trabajo; al CSIC por el soporte econmico; y al Departamento de
Fisiologa Vegetal de la Facultad de Biologa (UCM). A todos mis
amigos, por animarme y estar preocupados por mi incierto porvenir
desde que me lanc de cabeza en este difcil, y a la vez
gratificante, mundo de la investigacin. A mis amigas del cole: Isa,
Miry (por extensin a Alfon) y Ro, a las que conozco de toda la
vida, como se suele decir, y con las que he viajado y disfrutado
tanto estos aos: de marcha, en conciertos, comiendo (cmo nos gusta,
eh?) A Natalia y Melania, por los cafs y buenos momentos de charla
que hemos tenido. A Sandra (y familia), porque s que estis ms cerca
que la distancia fsica que nos separa. A mis compaeras de la
Facultad. Especialmente a Esthercita, por tu amistad. Anda que no
hemos pasado horas en este Campus! Gracias por los buenos momentos
que hemos compartido, y tambin por estar en los momentos menos
buenos, que de todo hay en la vida. S que aunque haya etapas que
nos veamos menos podremos contar siempre la una con la otra.
Gracias por tu apoyo y ojal podamos celebrar muchos xitos en breve:
nimo con las Oposiciones! A mis amigos de la parroquia, a mis
chavales del grupo y especialmente a Giuseppe y Mane. Gracias por
vuestro cario y por apoyarme siempre. A Ani, por tu alegra, por tu
ayuda con el ingls y por tus sabios consejos. Y casi finalizando,
pero sin restar importancia ni emocin, a mis amigos del pueblo, a
Alberto, y a mi pea de Montalbanejo. Gracias por vuestros nimos.
Con especial dedicacin a Lore (gracias por tu amistad incondicional
en todos estos aos), Javi (Farru), Ana, Raquel, Amparo, David
(Pati), Alicia, Alex (Conejo), David (Liebre) y dems. Que sois
muchos, copn!!! A todos. Ahora s, para terminar, quiero agradecer A
TODA MI FAMILIA el cario y apoyo que me ha dado siempre; y, sobre
todo, durante el periodo de la tesis. Especialmente a los que ya no
nos acompaan fsicamente, pero que siento muy cerca, a mi padre y a
mi abuelo Abel. Y a las personas con las que comparto el da a da: a
mi madre, por mimarme tanto, por confiar en mis proyectos y porque
s que puedo contar contigo y ser as siempre. A Fede, por tu apoyo
incondicional y generoso; por hacerme rer en los momentos regulines
y por los muchos y buenos momentos que hemos compartido (y los que
nos quedan por vivir!). Y a Alex, mi hermanito querido (Ratn!), por
aguantar mis cosillas, que no es poco! GRACIAS.
A mi madre y a mi hermano A Fede
El futuro pertenece a los que creen en la belleza de sus sueos
(Eleanor Roosevelt)
ABREVIATURAS aa ABA ACC AFP AOX APX CA CAT CBD CBF CHS CoA COR
HR HSP HPLC-DAD-MS JA LEA LOX nsLTP MAP MAPK MeJA MeSA mRNA PAL Pb
PEP POD PPO PR Put ROS SA SAR SOD Spd Spm STS UV Aminocidos cido
abscsico 1-aminociclopropano-1-carboxilato Antifreeze proteins
Alternativa Oxidasa Ascorbato peroxidasa Atmsfera controlada
Catalasa Cysteine-rich chitin-Binding Domain Cysteine Binding
Factor Chalcona sintasa Coenzima A Cold Regulated Humedad relativa
Heat Shock Proteins Cromatografa de lquidos de alta
eficacia-Deteccin Diodo Array-Espectrometra de Masas cido jasmnico
Late Embriogenesis Abundant Lipooxigenasa Protenas transportadoras
de lpidos no especficas Empaquetamiento en atmsferas modificadas
Mitogen-Activated Protein Kinase Metil Jasmonato Metil Salicilato
RNA mensajero L-fenilalanina amonio-liasa Pares de bases Fosfoenol
piruvato Peroxidasa Polifenol oxidasa Pathogenesis related
Putrescina Reactive oxygen species cido saliclico Sistema de
resistencia adquirida Superxido dismutasa Espermidina Espermina
Estilbeno sintasa Ultravioleta
Indice
INTRODUCCIN1. Caractersticas y parmetros de calidad de uva de
mesa ........................................... 1 2. Mecanismos
implicados en la infeccin y respuesta del fruto al ataque fngico
...... 4 2.1. Factores intrnsecos implicados en el ataque fngico
......................................... 4 2.2. Factores
ambientales o extrnsecos implicados en el ataque por Botrytis.
Temperatura y
humedad.......................................................................................
5 2.3. Factores endgenos implicados en la respuesta a la infeccin.
Respuestas fisiolgicas, bioqumicas y moleculares inducidas en las
plantas en respuesta al ataque fngico
..................................................................................................
6 3. Conservacin de frutos y hortalizas a bajas temperaturas
........................................... 9 3.1. Respuestas
fisiolgicas, bioqumicas y moleculares asociadas a la conservacin a
bajas temperaturas
..........................................................................
10 a) Estrs
oxidativo..............................................................................................
12 b) Regulacin proteica
.......................................................................................
13 c) Regulacin
hormonal.....................................................................................
15 c.1) Etileno
....................................................................................................
15 c.2) cido abscsico y cido
giberlico.........................................................
16 d) Mecanismos
moleculares...............................................................................
17 e) Otros compuestos
endgenos.........................................................................
19 e.1)
Poliaminas..............................................................................................
19 e.2) Betana
glicina........................................................................................
21 e.3) cido saliclico y cido jasmnico
........................................................ 21 e.4)
Azcares y polialcoholes
.......................................................................
22 4. Tecnologas para la conservacin de uva de mesa. Tratamientos
gaseosos .............. 22 4.1. Generadores de dixido de
azufre.....................................................................
22 4.2. Atmsferas
controladas.....................................................................................
24 4.3. Atmsferas
modificadas....................................................................................
25 4.4. Ozono
................................................................................................................
26 4.5. Jasmonatos y salicilatos
....................................................................................
27 4.6. Otros tratamientos
.............................................................................................
28 a) Etanol y
sorbatos............................................................................................
28 b) Hexenal
..........................................................................................................
29 c) cido
actico..................................................................................................
29 d) Pretratamientos con CO2
................................................................................
30
OBJETIVOS
...................................................................................................................
31 CAPTULO 1. Efecto de elevadas concentraciones de CO2 en los
cambios metablicos asociados con la respuesta de uva de mesa a 0C.
Metabolismo de fenilpropanoides- INTRODUCCIN 1. Biosntesis de los
compuestos fenlicos
....................................................................
34 1.1. Enzimas reguladoras de la ruta de los fenilpropanoides:
L-fenilalanina amonio-liasa, chalcona sintasa y estilbeno
sintasa............................................ 35 1.2.
Derivados fenilpropanoides: trans-resveratrol y
antocianos............................. 38 2. Regulacin de los
fenilpropanoides
...........................................................................
42
Indice
- ARTCULO
1...................................................................................................................
47
Resumen..........................................................................................................................
48 - ARTCULO
2...................................................................................................................
57
Resumen..........................................................................................................................
58 - ARTCULO
3...................................................................................................................
67
Resumen..........................................................................................................................
68 - ARTCULO
4...................................................................................................................
79
Resumen..........................................................................................................................
80 - DISCUSIN 1. Evolucin de la calidad de uvas conservadas con
altos niveles de CO2 y bajas
temperaturas...................................................................................................................
95 1.1. Parmetros de calidad de la baya
......................................................................
95 1.2. Parmetros de calidad asociados al
racimo....................................................... 97 2.
Aislamiento y caracterizacin de los genes que codifican las
principales enzimas implicadas en la ruta de los fenilpropanoides
(PAL, STS, CHS) .................................. 99 3. Contenido
de trans-resveratrol en los extractos de piel de uva
............................... 102 4. Antocianos totales y
capacidad antioxidante de la piel de uva de mesa conservada a 0C y
altos niveles de CO2
........................................................................................
103 5. Identificacin y cuantificacin de los principales antocianos
presentes en la piel de uva. Capacidad antioxidante de los
antocianos cuantificados ................................ 105
CAPTULO 2. Efecto del CO2 en la mejora de la uva de mesa con
respecto al ataque por hongo. PRs- INTRODUCCIN 1. Caractersticas
generales de protenas relacionadas con la patognesis (PRs) ......
111 2.
Quitinasas...............................................................................................................
112 3. -1,3-glucanasas
....................................................................................................
115 4. Regulacin gnica de quitinasas y
-1,3-glucanasas............................................. 117 -
ARTCULO
5.................................................................................................................
123
Resumen........................................................................................................................
124 - ARTCULO
6.................................................................................................................
133
Resumen........................................................................................................................
134 - ARTCULO
7.................................................................................................................
169
Resumen........................................................................................................................
170 - DISCUSIN 1. Anlisis de la infeccin fngica de la uva de mesa
............................................... 189 2. Aislamiento
y caracterizacin del gen que codifica una -1,3-glucanasa de clase I
......................................................................................................................
190 2.1. Estudio de la expresin de -1,3-glucanasa de clase I
durante la conservacin de uva a 0C
.....................................................................................
190 2.2. Expresin, purificacin y caracterizacin de la
-1,3-glucanasa de clase I ... 192 2.3. Estudio de la funcionalidad
de la -1,3-glucanasa recombinante................... 193 3.
Aislamiento y caracterizacin del gen que codifica una quitinasa
bsica de clase I
......................................................................................................................
195
Indice
3.1. Estudio de la expresin de la quitinasa de clase I durante
la conservacin de uva a 0C
...........................................................................................................
195 3.2. Estudio de la expresin de la quitinasa de clase I durante
el periodo de vida comercial de uva a
20C.........................................................................................
197 3.3. Expresin y purificacin de una quitinasa de clase I
...................................... 198 3.4. Estudio de la
funcionalidad de la quitinasa recombinante
.............................. 199
DISCUSIN GENERAL1. Efecto de la aplicacin de elevadas
concentraciones de CO2 en los cambios metablicos asociados con la
respuesta de uva de mesa a 0C.............................. 201 2.
Efecto residual del CO2 en la mejora de la uva de mesa, con
respecto al ataque por hongo, a travs del metabolismo de los
fenilpropanoides y PRs..................... 203
CONCLUSIONES
......................................................................................................
207
BIBLIOGRAFA.........................................................................................................
211
Introduccin
Introduccin
El empleo de tecnologas no contaminantes es necesario para
dinamizar la oferta de productos hortofrutcolas frescos en las
diferentes fases de produccin, cosecha y postcosecha. En este
sentido, es necesaria su incorporacin en la fase de produccin
permitiendo una mayor biodiversidad, al mismo tiempo que se
mantienen los rendimientos y se mejora el control fitosanitario
reduciendo el uso de productos qumicos. Una vez obtenidos productos
frescos de calidad, los procesos de manejo postcosecha y la
logstica de la comercializacin para mantener la calidad, garantizar
la seguridad y reducir las prdidas de producto, constituyen
objetivos fundamentales en las actuales investigaciones en
fisiologa y tecnologa postcosecha. En el caso concreto de la uva de
mesa, muy susceptible a las prdidas de agua y a la infeccin fngica
causada principalmente por Botrytis cinerea Pers. durante su
conservacin a bajas temperaturas, las tecnologas postcosecha se
centran en evitar la proliferacin del hongo y en mantener los
parmetros de calidad de la uva durante su periodo de vida til.
1. CARACTERSTICAS Y PARMETROS DE CALIDAD DE UVA DE MESA La uva o
grano de uva es el nombre que recibe el fruto que crece formando
racimos de la vid comn. Pertenece al gnero Vitis de la familia
Vitceas, que incluye unas 600 especies de arbustos, por lo general
trepadores y que producen frutos en baya. Dentro del gnero Vitis se
incluyen unas 20 especies cultivadas por sus frutos y algunas por
sus hojas que se consumen como verdura. Ms del 95% de la produccin
total de uva proviene de la vid europea que pertenece a la especie
Vitis vinifera L. y cuyas variedades se destinan principalmente a
vinificacin. La composicin de la uva vara segn se trate de uvas
blancas o tintas. En ambas destacan dos tipos de nutrientes: los
azcares (siendo la glucosa y la fructosa ms del 99%
1
Introduccin
de los hidratos de carbono en el zumo de uva y constituyendo del
12 al 27% del peso fresco de la baya madura) (Hofacher et al.,
1976), y las vitaminas (principalmente cido flico y vitamina B6).
La fraccin cida de las uvas est formada principalmente por los
cidos tartrico y mlico, constituyendo alrededor del 90% de la
acidez total (Winkler et al., 1974). Otros cidos orgnicos
encontrados en proporciones variables pero siempre a bajas
concentraciones son los cidos ctrico (5-10% de la acidez total),
succnico, fumrico, actico, gliclico, lctico, acontico, qunico,
siqumico y mandlico (Ruffner, 1982). Entre los minerales, el
potasio es el ms abundante y se encuentra en mayor cantidad en uva
tinta; mientras que el magnesio y el calcio estn en cantidades
moderadas y son ms abundantes en uva blanca. Tambin abundan
compuestos con reconocidas propiedades beneficiosas para la salud,
tales como flavonoides, antocianos, y taninos, responsables al
mismo tiempo del aroma, color, y textura caractersticos de estos
frutos. La uva de mesa es un fruto importante en la dieta
mediterrnea que se consume casi todo el ao. El cultivo de uva de
mesa en Espaa supone un 2,6 % del total de uva cultivada. Segn el
Instituto Nacional de Estadstica, la superficie agrcola destinada a
la produccin de uva de mesa en Espaa en el ao 2005 fue de 26445 Ha.
Las uvas, como otros frutos no climatricos, no maduran despus de
cosechadas; alcanzando el ptimo de aceptabilidad en apariencia,
sabor y textura mientras estn en la vid. Su ndice de madurez se ha
basado, tradicionalmente, en el contenido de slidos solubles (Brix)
y tambin en el valor de acidez titulable, as como en la relacin
azcares/cidos de las bayas (Guelfat-Reich y Safran, 1971). La
apariencia es determinada principalmente por el color,
especialmente en variedades coloreadas, en las que existen
requerimientos mnimos que varan con la variedad y el grado estndar.
El grado estndar designa el porcentaje de bayas por racimo, el cual
debe mostrar una intensidad mnima de color y cobertura (Nelson,
1979). La cera de la superficie de las bayas es un factor de
2
Introduccin
calidad muy importante en la uva de mesa; la manipulacin
postcosecha en ocasiones destruye esta cera, haciendo que la piel
est ms brillante que el efecto deseable que aporta la cera. El
aroma es un carcter importante y complejo de la calidad de uva ya
que es una mezcla de cientos de compuestos voltiles diferentes
sintetizados durante la maduracin (Gunata et al., 1985a,b; Strauss
et al., 1986). Aunque los compuestos precursores de estas
sustancias se encuentran en las hojas (Gunata et al., 1986), la
sntesis y evolucin del aroma tiene lugar en las bayas; y de hecho,
las sustancias aromticas estn localizadas principalmente en la piel
de las mismas (Winkler et al., 1974). Las uvas estn sujetas a
serias prdidas de vapor de agua, que causan desecamiento y
oscurecimiento del raquis, roturas e incluso marchitamiento de las
bayas y prdida de peso del racimo (Nelson, 1979). Por esto, los
racimos deben ser enfriados lo antes posible despus de la cosecha.
En este contexto, el sudado de la uva, como resultado de cambios
drsticos y rpidos en la temperatura durante el almacenamiento,
causa serios problemas asociados a la podredumbre por Botrytis
cinerea, que es junto a las prdidas de agua, uno de los principales
responsables de las prdidas postcosecha que determinan la vida til
de la uva de mesa (Lavee y Nir, 1986; Crisosto et al., 2002). La
uva de mesa cv. Cardinal se caracteriza por su color rojo violeta,
presenta una pulpa jugosa y aromtica y piel de espesor medio. Su
maduracin es temprana, variando desde mediados de julio a finales
de agosto, dependiendo de las zonas. Aunque su origen es
californiano, es una variedad muy cultivada en todo el mundo. En
Espaa, se cultiva en formas libres mayoritariamente en las
provincias de Valencia, Alicante y Castelln, donde se obtienen unas
producciones de aproximadamente 6000-7000 kg/Ha.
3
Introduccin
2. MECANISMOS IMPLICADOS EN LA INFECCIN Y RESPUESTA DEL FRUTO AL
ATAQUE FNGICO
2.1. Factores intrnsecos implicados en el ataque fngico El hongo
Botrytis cinerea es un patgeno necrotrfico que coloniza tejidos
senescentes o muertos, pero debido a que es capaz de infectar
tambin a bajas temperaturas, puede producir importantes prdidas
econmicas durante la conservacin en fro (Mansfield y Hutson, 1980).
Al igual que otros patgenos, B. cinerea utiliza 3 vas principales
para penetrar en el tejido del husped: (i) a travs de aberturas
naturales tales como lenticelas, finales de tallos e interfases
pedicelo-fruto; (ii) por grietas directas de la cutcula del husped
que pueden ocurrir en cualquier momento durante el periodo de
crecimiento y desarrollo del fruto; (iii) y a travs de heridas
causadas por agentes biticos y/o abiticos durante el almacenamiento
(Prusky y Lichter, 2007). Los procesos de penetracin pueden pasar
desapercibidos para el husped, o pueden promover rpidas seales de
defensa que resultan en la induccin de compuestos de defensa para
limitar el desarrollo del hongo. El periodo desde la infeccin hasta
la activacin del desarrollo del hongo y expresin de los sntomas se
designa etapa quiescente (Prusky, 1996). Esta etapa podra ser el
resultado de una respuesta localizada del husped que se asocia a
menudo con un estallido oxidativo, que da lugar a la produccin de
especies reactivas de oxgeno (ROS). La produccin de ROS en las
clulas ha sido tambin relacionada con los procesos de defensa de
las plantas (Brisson et al., 1994). Se ha observado que tanto la
inoculacin del pericarpo de aguacate con Colletotrichum
gloeosporioides como el tratamiento de cultivos celulares de
aguacate con el elicitor de la pared celular de C. gloeosporioides,
aumentaron la produccin de ROS (Beno-Moualem y
4
Introduccin
Prusky, 2000). Tambin, se han descrito cambios en el pH tisular
de los frutos asociados a los procesos de maduracin e infeccin por
patgenos (Wang et al., 2004). Los hongos son capaces de alcalinizar
el ambiente debido a la secrecin activa de amonio liberado en las
reacciones de proteolisis y desaminacin de los aminocidos (Eshel et
al., 2002). En el caso de B. cinerea la acidificacin de los tejidos
del husped es debido a la secrecin de cidos orgnicos, concretamente
de cido oxlico (Rollins y Dickman, 2001; Manteau et al., 2003). La
transicin de la etapa biotrfica a la necrotrfica-saproftica parece
estar relacionada con factores que son modulados a nivel
intracelular y que estn afectados por los nutrientes y el pH del
ambiente. Cada uno de los compuestos secretados (cidos orgnicos o
amonio) juegan un papel fisiolgico crucial en la iniciacin del
desarrollo necrotrfico. Existen varias especulaciones acerca de las
vas por las cuales la secrecin de cidos orgnicos aumenta los
centros de virulencia. El oxalato podra debilitar al husped, al ser
txico para l, lo que facilitara su invasin. Asimismo, se ha
propuesto como hiptesis que la quelacin de calcio de la pared
celular por parte del oxlico y cidos glucnicos debilita la pared
celular del husped y facilita su penetracin (Hadas et al., 2007).
Finalmente, la secrecin de oxalato podra suprimir la generacin de
ROS y las respuestas de defensa asociadas, contribuyendo de este
modo a la activacin del modo de desarrollo necrotrfico (Cessna et
al., 2000).
2.2. Factores ambientales o extrnsecos implicados en el ataque
por Botrytis. Temperatura y humedad. Estudios acerca de la
viabilidad del hongo almacenado a bajas temperaturas demostraron
que, mientras que la agresividad patognica de los conidios de B.
cinerea almacenados a -80C era casi igual a la de los conidios
frescos, sta decreca segn
5
Introduccin
aumentaba la temperatura de almacenamiento (Gindro y Pezet,
2001). Puesto que la actividad de estos microorganismos contina a
bajas temperaturas, los frutos son susceptibles al progreso de la
infeccin durante su conservacin frigorfica. La humedad relativa
(HR) tambin afecta al desarrollo de la infeccin, pero su efecto es
dependiente de la temperatura. Estudios con flores Freesia
infectadas por B. cinerea a distintas condiciones de temperatura y
HR mostraron que la infeccin fue severa en las plantas almacenadas
a 5, 12 y 20C a HR del 100%; mientras que no hubo lesiones cuando
fueron almacenadas a HR de 80 a 90% a 5C ni a 20C (Darras et al.,
2006). Por consiguiente, la temperatura de conservacin y humedad
relativa ambiental son parmetros esenciales a tener en cuenta a la
hora de evitar la supervivencia y multiplicacin de estos
hongos.
2.3.
Factores endgenos implicados en la respuesta a la infeccin.
Respuestas
fisiolgicas, bioqumicas y moleculares inducidas en las plantas
en respuesta al ataque fngico. Las plantas responden al ataque por
patgenos mediante la induccin de diferentes mecanismos de defensa.
Estos incluyen respuestas especficas que operan a travs de la accin
de molculas seal tales como el cido saliclico (SA), el cido
jasmnico (JA), o el etileno, y que generan la acumulacin de
protenas relacionadas con la patognesis (PRs, del ingls
Pathogenesis-Related proteins), fitoalexinas, u otros compuestos
fenlicos (Elad, 1997; Dong, 1998; Feys y Parker, 2000). Se ha
observado un aumento en el contenido de la fitoalexina resveratrol
en hojas y frutos infectados con el hongo (Jeandet et al., 1995).
Asimismo, se ha observado la acumulacin de barreras mecnicas como
carbohidratos y glicoproteinas ricas en hidroxiprolina entre las
paredes celulares para limitar la invasin de las hifas del hongo
(Showalter et al., 1985).
6
Introduccin
El cido abscsico (ABA) es una de las hormonas relacionadas con
la interaccin planta-patgeno. Se ha descrito que mutantes de tomate
(sitiens) (Lycopersicon esculentum Mill. Cv Moneymarker) con
niveles de ABA reducidos son mucho ms resistentes al ataque por B.
cinerea que las plantas de tipo salvaje (Audenaert et al., 2002).
Por otro lado, estudios realizados en tomate con aplicaciones de
ABA exgeno mostraron que aumentos en el contenido de ABA por encima
del nivel basal no incrementaron la susceptibilidad de los frutos a
B. cinerea (Achuo et al., 2006). En Arabidopsis, se ha descrito que
el pretratamiento con metil jasmonato (MeJA) caus una eficiente
reduccin de porcentaje de podredumbre causado por Alternaria
brassicicola, B. cinerea o Plectosphaerella cucumerina (Thomma et
al., 2000). Asimismo, mutantes de Arabidopsis (npr1), que
presentaban alterada la resistencia frente a patgenos bacterianos y
fngicos, mostraron defectos en la acumulacin, percepcin o seal de
transduccin del SA. Los resultados mostraron que la resistencia
local frente a B. cinerea requiere seales mediadas por etileno,
jasmonato y SA (Ferrari et al., 2003). A nivel molecular, se ha
observado la acumulacin de distintas protenas PRs. Algunas de ellas
son enzimas hidrolticas capaces de degradar componentes de la pared
celular de patgenos, como quitinasas o -1,3-glucanasas. Los niveles
de estas protenas o su correspondientes actividades, incrementan en
hojas de uva infectadas con B. cinerea (Derckel et al., 1999).
Tambin se han detectado incrementos en los niveles de distintos
mRNAs que codifican PRs en hojas y/o granos como respuesta a los
agentes causales de la podredumbre gris (Busam et al., 1997a) as
como durante el proceso de desarrollo de la uva (Davies y Robinson,
2000). En fresa inoculada con Colletotrichum, se observ que la
induccin de la expresin de genes de quitinasa de clase II estaba
regulada diferencialmente en respuesta al patgeno (Anwar y Ding,
2004). La quitinasa CHV5, purificada de uva y que presenta gran
homologa con varias quitinasas de clase IV, parece
7
Introduccin
conferir una mayor proteccin frente a patgenos que la mayora de
las quitinasas estudiadas y fue capaz de inhibir hasta un 50% la
germinacin de los conidios de B. cinerea con una concentracin de
7.5 g mL-1 de protena (Derckel et al., 1998). Por otro lado, en
uvas Chardonnay infectadas con Uncinula necator se observ un
aumento en los niveles de una protena tipo taumatina (VvTL2) en
comparacin con las uvas no infectadas (Girbau et al., 2004). Adems
de estas protenas hidrolticas, tambin se han observado aumentos en
los niveles de expresin de los genes que codifican protenas
relacionadas con el metabolismo de los fenilpropanoides tales como
la L-fenilalanina amonio-liasa (PAL) y la estilbeno sintasa (STS)
(Sparvoli et al., 1994) como respuesta al ataque por patgenos en la
vid. Bzier et al. (2002), adems de analizar algunas PRs y la
expresin de los genes que codifican las enzimas PAL y STS, clonaron
y caracterizaron el gen que codifica la protena inhibidora de la
poligalacturonasa (PGIP), cuyos niveles de expresin se indujeron en
respuesta a la infeccin por B. cinerea. PGIP inhibi la actividad de
la poligalacturonasa secretada por los hongos fungitxicos y aument
la estabilidad de los oligalacturnidos activos as como el elicitor
in vitro (Cervone et al., 1989). Se ha investigado el papel de los
oligogalacturnidos (OGA), compuestos liberados de las pectinas de
la pared en las clulas heridas, para inducir las respuestas de
defensa en vides y su proteccin frente a B. cinerea. Estudios
cinticos con clulas de Vitis mostraron que los OGA inducen una
rpida y transitoria generacin de perxido de hidrgeno (H2O2),
seguida de un aumento en la expresin de genes que codifican
protenas implicadas en la ruta de los fenilpropanoides, y estimulan
las actividades de quitinasa y -1,3-glucanasa, lo que podra estar
relacionado con una mayor respuesta de defensa de la planta frente
al hongo (Aziz et al., 2004).
8
Introduccin
Tambin se ha estudiado el papel del calcio en el mantenimiento
de la estabilidad e integridad de la pared celular as como de la
membrana plasmtica en la piel de uva por medio de la quelacin de
sustancias pcticas (Chardonnet et al., 1997). Adems, se ha
observado que la aplicacin exgena de calcio incrementa su contenido
en bayas y aumenta la resistencia a Botrytis en racimos conservados
a bajas temperaturas (Miceli et al., 1999). La mayor resistencia a
B. cinerea se atribuy a la participacin de los iones de calcio en
la estabilizacin de la estructura de la pared celular en hojas de
Vitis (Bowen et al., 1992).
3. CONSERVACIN DE FRUTOS Y HORTALIZAS A BAJAS TEMPERATURAS La
conservacin a bajas temperaturas, por encima de las de congelacin,
es una de las tcnicas ms utilizadas para mantener la calidad y
prolongar el periodo de vida til de frutos y hortalizas: reduciendo
la tasa de respiracin y disminuyendo tanto la prdida de agua por
transpiracin como la produccin de etileno y el desarrollo de
microorganismos. Sin embargo, debido a la alta susceptibilidad de
determinados productos hortofrutcolas de origen tropical y
subtropical al dao por fro, o bien a consecuencia de la aplicacin
de temperaturas inferiores a la ptima de conservacin (subptimas) en
frutos tolerantes a las bajas temperaturas, se pueden provocar
importantes prdidas de calidad del producto durante su conservacin
(Morris 1982; Jackman et al., 1989). La naturaleza y severidad de
los sntomas de dao por fro depende de la especie, variedad, tejido
y estado de desarrollo o maduracin, as como de la intensidad y
duracin de la exposicin a las condiciones de estrs (Salveit y
Morris, 1990). En uva de mesa, el empleo de temperaturas prximas a
0C, puede provocar en algunas variedades disfunciones fisiolgicas
que conducen a una prdida de calidad. Uvas cv. Jingxiu almacenadas
durante 3 das a -2C, presentaron daos en la ultraestructura de las
clulas del pericarpo, desrdenes en la lamela estromal de los
9
Introduccin
cloroplastos o plastidios, prdida de paredes celulares y
alteraciones en la membrana nuclear (Zhang et al., 2005). Adems, en
estas condiciones, el periodo de conservacin de la uva de mesa es
limitado debido a su gran susceptibilidad al ataque fngico.
3.1. Respuestas fisiolgicas, bioqumicas y moleculares asociadas
a la conservacin a bajas temperaturas. A pesar de que existen
distintas teoras en la bibliografa, la mayora de los autores estn
de acuerdo en que el proceso de dao por fro debera considerarse en
dos etapas: una primera etapa en que el dao ocurrira de forma
inmediata por la exposicin a una temperatura crtica, y
posteriormente una segunda en la que se originaran otros procesos
secundarios dependientes del tiempo y de la temperatura de
exposicin que conduciran a los sntomas visibles de la lesin (Raison
y Lyons, 1986). Las diferencias en lpidos y cidos grasos entre las
distintas plantas determinaran sus diferentes susceptibilidades, de
forma que el cambio de fase de un estado lquido-cristalino a un
estado slido-gel en los lpidos de membrana alterara tanto la
permeabilidad como la energa de activacin de las enzimas unidas a
membrana, explicando as las alteraciones metablicas de estas
clulas. La validez de la teora sobre la fase de transicin de los
lpidos, ha sido cuestionada ya que se ha observado que, en las
plantas susceptibles a los daos por fro, solamente entre el 25% de
los lpidos sufren la fase de transicin a temperaturas de dao por
fro (Raison y Wright, 1983; Raison y Orr, 1986), por lo que no
parece claro que un cambio en una pequea fraccin de lpidos pueda
influir tanto en el desarrollo de los daos (Salveit y Morris,
1990). Otro aspecto problemtico de esta teora es que la temperatura
a la cual tiene lugar la fase de transicin en la membrana depende
del grado de insaturacin de los cidos grasos de los lpidos. Adems,
no siempre existen diferencias en la composicin de los lpidos de la
membrana entre las especies sensibles y tolerantes (Patterson et
al., 1978;
10
Introduccin
Priestley y Leopold, 1979). El mutante de Arabidopsis thaliana
fab1, tolerante a las bajas temperaturas, contiene un elevado nivel
de cidos grasos saturados en fosfatidilglicerol, muy superior al
que presentan especies sensibles al fro (Wu y Browse, 1995). Aunque
el sensor de las plantas a las bajas temperaturas no ha sido
identificado definitivamente, los descubrimientos de los ltimos aos
continan apuntando, entre otros factores, hacia una disminucin en
la fluidez de la membrana (Beck et al., 2007). La cianobacteria
Synechocystis PCC6803 tiene al menos dos sensores para bajas
temperaturas, uno de los cuales es una histidina quinasa clsica, y
posee los componentes proteicos Hik33 y Hik19 (Browse y Xin 2001).
Debido a que no se han detectado homlogos a los genes Hik33 y Hik19
en plantas, se han propuesto conceptos alternativos a la percepcin
del fro. Uno de ellos sugiere que el aumento de la viscosidad de
membrana afecta a los canales de Ca2+, induciendo un aumento de la
concentracin de calcio citoslico, el cual sucesivamente activa una
MAPK u otras cascadas de transduccin de seales (Monroy y Dhindsa,
1995) (Fig. I).
11
Introduccin
Percepcin de estrs Generacin de seales
Expresin gnica Protenas
Protenas funcionales Canales de agua Dehidrinas (protenas LEA)
Protenas anticongelantes Chaperonas Enzimas detoxificadoras
Protenas reguladoras Factores de transcripcin y protenas
asociadas (MYB, MYC, bZIP, CBF 1,2,3) Protenas quinasas (MAPK,
MAPKK) Amplificadores de seal (Fosfolipasa C, protenas 14-3-3)
Enzimas biosintticas que producen compuestos de bajo peso
molecular (azcares, betanas, prolina, antioxidantes)
TOLERANCIA AL ESTRS POR FRO O SEQUA Fig. I. Factores de
tolerancia a estrs producidos por las plantas en las respuestas
adaptativas a bajas temperaturas y sequa.
A) Estrs oxidativo Los estreses abiticos activan mltiples
reacciones de defensa en las plantas, algunas de las cuales pueden
proteger frente a distintos estreses. Las enzimas catalasa (CAT),
superoxido dismutasa (SOD), ascorbato peroxidasa (APX), peroxidasa
(POD) y glutation reductasa (GR), pueden proteger frente al dao
causado por radicales libres o ROS (como son el superxido, el
oxgeno singlete y el radical hidroxilo) generados por distintos
estreses incluyendo las altas y bajas temperaturas (Wang, 1995). El
almacenamiento a bajas temperaturas puede alterar el equilibrio
entre la produccin de radicales libres y los mecanismos de defensa
a favor del primero. As, el balance entre la formacin y la
detoxificacin de ROS es crtico para la supervivencia de la clula
durante 12
Introduccin
el almacenamiento en fro (Zhang et al., 1995). El complejo
sistema antioxidante por el cual las plantas se protegen contra los
efectos de las especies reactivas de oxgeno incluye, a parte de las
enzimas mencionadas anteriormente, antioxidantes liposolubles
(-tocoferol y -caroteno), reductores hidrosolubles (ascorbato y
glutation) (Zhang et al., 1995) y compuestos derivados de la ruta
de los fenilpropanoides (fenoles, antocianos y estilbenos entre
otros). Las plantas que contienen niveles ms elevados de
antioxidantes, enzimticos o no enzimticos, son ms tolerantes a las
bajas temperaturas y otros tipos de estrs. La transformacin de
plantas de tabaco con el gen de la Cu/Zn-SOD de guisante indujo un
aumento en la resistencia al estrs oxidativo causado por la
exposicin a las bajas temperaturas (3C) en presencia de luz de
intensidad moderada (Gupta et al., 1993). Tambin se sabe que las
plantas modulan sus defensas antioxidantes cuando se exponen a
bajas temperaturas. Se ha observado un aumento en la actividad APX
y POD en pimiento dulce (Yamauchi et al., 1975), y de SOD y CAT en
tomate en respuesta al fro (Michalski y Kaniuga, 1981). En las
variedades de manzana Golden Delicious y Fuji almacenadas en fro la
actividad CAT se duplic; mientras que la SOD disminuy en Golden
Delicious y aument en Fuji (Masia 1998). En uva, los estudios
realizados con enzimas antioxidantes estn relacionados con la
infeccin por distintos patgenos (Musetti et al., 2007). Hasta el
momento no se ha estudiado la relacin de estas enzimas con las
bajas temperaturas.
B) Regulacin proteica Son numerosos los cambios fisiolgicos y
bioqumicos en frutos inducidos por la exposicin a bajas
temperaturas (Wang, 1990). Estos cambios podran estar relacionados
con modificaciones en la estructura terciaria de protenas
especficas (Linderstrom-Lang y 13
Introduccin
Schellman, 1959), con cambios en su actividad enzimtica y en la
poblacin de mRNAs especficos (Watkins et al., 1990). Con respecto
al metabolismo de los fenilpropanoides, enzimas clave como la PAL y
la chalcona sintasa (CHS) presentan cambios en su actividad
(Sanchez-Ballesta et al., 2000; Wang et al., 2007) y en sus
caractersticas cinticas (Maldonado et al., 2007) como respuesta a
las bajas temperaturas en diversos frutos. Como producto final de
la ruta catalizada por la enzima PAL, se originan compuestos
relacionados con la necrognesis y con el pardeamiento de los
productos vegetales (Dangyang y Salveit, 1989), as como otros
compuestos implicados en la coloracin, textura y capacidad
antioxidante de los mismos. La induccin de la PAL se ha considerado
un mecanismo de defensa frente distintos estreses biticos y
abiticos (Haga et al., 1988). En ctricos, se ha observado que el
flavedo era capaz de responder al ataque por patgeno aumentando los
niveles de transcrito de la PAL as como la actividad de la misma
enzima (Ballester et al., 2006). Las bajas temperaturas tambin
pueden inducir cambios en enzimas hidrolticas de la pared celular.
El almacenamiento a bajas temperaturas (7C) retras la maduracin del
aguacate (Persea americana Mill cv. Hass) y retard la acumulacin de
mRNAs que codifican enzimas relacionadas con el metabolismo de la
pared celular como celulasa, poligalacturonasa y enzima formadora
de etileno (Dopico et al., 1993). Asimismo, se han descrito cambios
en las actividades de las enzimas pectinolticas en melocotones
almacenados a bajas temperaturas, observndose un incremento en la
actividad de la pectinesterasa as como una inhibicin de la
actividad poligalacturonasa (Ben-Arie y Sonego, 1980). La
pectinesterasa es muy estable a bajas temperaturas y, en nectarinas
conservadas en aire a 0C, su actividad se mantuvo en un nivel basal
de manera que el grado de esterificacin de las pectinas
continuamente disminuy durante el almacenamiento (Lurie et al.,
1994); mientras que la actividad de la poligalacturonasa fue
14
Introduccin
baja en estas condiciones. Estos cambios en las actividades de
las enzimas hidrolticas de pared podran explicar parte de los
cambios en la textura de los frutos durante su conservacin a bajas
temperaturas (Zhou et al., 2000).
C) Regulacin Hormonal
C.1) Etileno El incremento en etileno es una respuesta comn de
las plantas frente a distintos tipos de estrs, tales como las bajas
temperaturas, sequa, heridas, irradiaciones, ozono y el ataque por
patgenos (Yang y Hoffman, 1984). El hecho de que algunas de estas
respuestas puedan ser inducidas por la aplicacin exgena de etileno,
sugiere que esta hormona pueda actuar como una seal que coordina
las distintas respuestas de las plantas ante situaciones adversas
(Wang et al., 1990). Se ha observado una estimulacin considerable
en la sntesis de etileno en frutos almacenados entre 0 y 5C tales
como meln (Lipton y Wang, 1987), tomate (Lurie y Klein, 1991), pera
(Blankenship y Richardson, 1985) y mandarina (Zacarias et al.,
2003). En uva, Chervin et al. (2004) estudiaron la relacin entre el
etileno, el desarrollo y la maduracin de los frutos, observando
que, aunque la uva est clasificada como un fruto no climatrico,
presenta un incremento transitorio de produccin endgena de etileno
justo antes de la averizacin. Por otro lado, Grimplet et al. (2007)
analizaron la expresin de mRNAs que codifican protenas implicadas
en el metabolismo del etileno en piel de uva procedente de vides
con dficit de agua y observaron una sobreexpresin significativa de
los transcritos. Sin embargo, no existen, hasta el momento, datos
en cuanto al papel de esta hormona en uvas almacenadas a bajas
temperaturas.
15
Introduccin
C.2) cido abcsico y cido giberlico La exposicin de los vegetales
a bajas temperaturas puede afectar al estado hdrico de los mismos
y, en consecuencia, a la produccin de ABA (Walton, 1980), pero
tambin puede afectar directamente a los niveles de esta hormona
(Daie et al., 1981). El estrs por sequa incrementa la produccin de
ABA y produce el cierre de estomas e induce la expresin de genes
asociados a estrs por sequa (Seki et al., 2007). Se ha observado
que entre las respuestas de las plantas para habituarse o
aclimatarse al fro est el aumento del contenido de ABA y que este
incremento es mayor en los tejidos que toleran mejor las bajas
temperaturas (Ryu y Li, 1994). Asimismo, la aplicacin exgena de ABA
incrementa la tolerancia a las bajas temperaturas en distintas
especies vegetales (Wang, 1990). El ABA endgeno producido por
manzanas almacenadas a bajas temperaturas podra estar asociado con
la tolerancia de las mismas al estrs por bajas temperaturas
(Yoshikawa et al., 2007). Sin embargo, en mandarinas Fortune
almacenadas en fro, se ha observado que los niveles de ABA pueden
incluso disminuir tanto en las variedades tolerantes como en las
variedades sensibles al fro (Lafuente et al., 1997; Lafuente y
Sala, 2002). Adems de los reguladores mencionados anteriormente, el
aumento en la tolerancia a las bajas temperaturas se ha asociado
con variaciones en cido giberlico. En uva de mesa almacenada en fro
y tratada con 100 ppm de cido giberlico, se ha observado que los
frutos mantuvieron una mayor integridad de la membrana y que se
redujo notablemente la cada de fruto, el pardeamiento del raquis y
la podredumbre. Adems, se observ una disminucin en el contenido de
slidos solubles y vitamina C, as como una mejora en la firmeza de
la uva respecto a los frutos control (Deng et al., 2006).
16
Introduccin
D) Mecanismos moleculares Se han identificado un gran nmero de
genes regulados por las bajas temperaturas, algunos con una posible
funcin reguladora y otros de funcin desconocida hasta el momento
(Lee et al., 2005). Sin embargo, debido a que la mayora de los
estudios realizados se han hecho a nivel de planta, se sabe poco de
los cambios moleculares que ocurren en los frutos durante su
almacenamiento a bajas temperaturas. Estudios comparativos han
podido relacionar el aumento en los niveles de expresin de mRNAs
homlogos a genes inducidos por las bajas temperaturas con las
diferencias en tolerancia al fro de algunos cultivares. Estos
incluyen genes COR (del ingls cold-regulated), que codifican un
conjunto de pequeas protenas hidroflicas denominadas dehidrinas o
LEAs (del ingls late embryogenesis abundant) (Close, 1997); genes
implicados en la biosntesis de protenas con funcin crioprotectora
y/o anticongelante (AFPs, del ingls Antifreeze Proteins) (Hon et
al., 1994) y genes relacionados con la defensa de las plantas
frente al estrs oxidativo (Sung et al., 2003). Adems se ha
identificado y caracterizado un activador transcripcional de
elementos promotores de varios genes COR (CBF1) (Jaglo-Ottosen et
al., 1998) y genes implicados en la desaturacin de cidos grasos,
relacionados con la adquisicin de la tolerancia al fro en plantas
de tabaco (Kodama et al., 1995). Las LEA fueron las primeras
protenas relacionadas con la respuesta a la deshidratacin en
plantas (Baker et al., 1988). Desde entonces, se ha descrito en
numerosos tejidos vegetales la posible relacin entre la acumulacin
de este tipo de protenas y la aclimatacin de las plantas al estrs
por fro (Bray 1993). La expresin de genes que codifican protenas
del tipo dehidrina (grupo 2 de las LEA), a menudo se induce en los
tejidos vegetales como respuesta a la deshidratacin, al estrs por
bajas temperaturas o a la aplicacin de ABA. Por ello se ha sugerido
que podran interactuar y estabilizar
17
Introduccin
membranas y macromolculas, previniendo daos estructurales y
manteniendo la actividad de enzimas esenciales (Svensson et al.,
2002). Aunque las dehidrinas estn ampliamente distribuidas y se han
encontrado en plantas vasculares, helechos, musgos, lquenes y
algas, sus funciones moleculares no son bien comprendidas ya que no
catalizan ninguna reaccin metablica (Beck et al., 2007). Dehidrinas
de ctricos (Hara et al., 2001; Sanchez-Ballesta et al., 2004),
melocotn (Winiewski et al., 1999), trigo (Houde at al., 1995),
cebada (Bravo et al., 2003) y espinaca (Kazuoka y Oeda, 1994)
presentan actividad crioprotectora, as como actividad
anticongelante en el caso de la dehidrina de melocotn (Winiewski et
al., 1999). En hojas de Vitis riparia y Vitis vinifera, la
deshidratacin, las bajas temperaturas y el tratamiento con ABA
indujeron la expresin de dos dehidrinas (Xiao y Nassuth, 2006).
Estudios realizados in vitro con cereales tolerantes a las bajas
temperaturas como centeno, trigo y cebada han demostrado una
acumulacin de protenas AFPs (Antikainen y Griffith, 1997). Este
tipo de protenas presentan un porcentaje de homologa muy alto con
PRs, en concreto con endoquitinasas de clase I, -1,3-glucanasas y
taumatina (Hon et al., 1994). En Arabidopsis, se ha observado que
los factores de transcripcin CBF/DREB1 son reguladores crticos de
la expresin gnica en la seal de transduccin de aclimatacin al fro.
Estos factores de transcripcin han sido los primeros activadores
transcripcionales en los que se ha demostrado su papel controlando
la expresin de genes regulados por las bajas temperaturas
(Thomashow, 1999; Van Buskirk y Thomashow, 2006). Sin embargo,
Haake et al., (2002) aislaron un homlogo de las protenas CBF/DREB1
(CBF4), que juega un papel similar durante la adaptacin a la sequa,
pero su expresin gnica no est regulada por las bajas temperaturas.
En uva (Vitis vinifera y Vitis riparia) la expresin de tres genes
que cofican CBFs fue baja a temperatura ambiente y aument durante
el tratamiento con bajas temperaturas (4C) en hojas jvenes, cabezas
apicales, yemas y tallos
18
Introduccin
jvenes. Los transcritos de VvCBF1, 2 y 3 que tambin se
acumularon en respuesta a sequa y tratamientos con ABA exgeno,
podran indicar que la uva contiene genes CBF nicos (Xiao et al.,
2006). Otros genes cuya expresin se induce por las bajas
temperaturas codifican polipptidos que presentan homologa con
protenas transportadoras de lpidos (nsLTP) (del ingls non-specific
lipid transfer). Experimentos con gramneas demostraron una
acumulacin de estas protenas cuando las plantas fueron expuestas a
condiciones de estrs hdrico, salino o por fro (Hughes et al., 1992;
White et al., 1994). Tambin se ha identificado una espermidina
sintasa (OsSPDS2) implicada en la sntesis de poliaminas en races de
plantas de arroz asociada a la respuesta a las bajas temperaturas
(Kim et al., 2004). Dicha implicacin se ha confirmado en plantas
transgnicas de A. thaliana que sobreexpresaban un gen de SPDS y que
resultaron ser ms tolerantes al fro (Kasukabe at al., 2004).
E) Otros compuestos endgenos
E.1) Poliaminas Las poliaminas son pequeos policationes que
pueden participar en distintos procesos como la regulacin de la
replicacin del DNA, transcripcin de genes, divisin celular, el
desarrollo de rganos, maduracin, senescencia y en respuesta a
diferentes estreses biticos y abiticos (Bouchereau et al., 1999).
Putrescina (Put), espermidina (Spd) y espermina (Spm) son las
poliaminas ms abundantes en bacterias, plantas y animales. La
hiptesis de que la sntesis de poliaminas puede estar relacionada
con la defensa de los tejidos vegetales al fro, est basada en la
capacidad de estos compuestos para estabilizar las membranas
celulares (Wang, 1987). Asimismo, se piensa que su modo de accin
frente
19
Introduccin
al estrs y la senescencia puede ser debido a la capacidad para
secuestrar radicales libres que se forman en la peroxidacin de
lpidos (Drolet et al., 1986). Los niveles de las poliaminas en los
tejidos vegetales varan en respuesta al estrs hdrico (Wang y
Steffens, 1985), osmtico (Tiburcio et al., 1990) y a las bajas
temperaturas (Wang, 1987; Escribano y Merodio, 2000). En general,
durante la exposicin de frutos a bajas temperaturas, disminuyen los
niveles de Spd y Spm y aumentan los niveles de Put (Serrano et al.,
1996), al igual que en otros tipos de estrs (Bouchereau et al.,
1999). La sntesis de ciertas poliaminas endgenas se puede ver
incrementada por la aplicacin exgena de las mismas, as como por el
empleo de algunos tratamientos de acondicionamiento, lo que aumenta
la tolerancia de los productos vegetales al fro. As, en melocotones
tratados con Put y almacenados a 2C, se vio que aumentaba la
firmeza de los frutos y se redujo la susceptibilidad del fruto a
ser daado mecnicamente (MartnezRomero et al., 2000). En uvas, los
estudios se han centrado en el anlisis de las distintas poliaminas
(libres, conjugadas y ligadas a pared) en rganos de la variedad
Cabernet Sauvignon en diferentes estados del desarrollo. Se han
observado diferencias en la distribucin de las poliaminas en funcin
de los rganos estudiados, y del estado de desarrollo en que se
encontraban; pero, en general, se han encontrado niveles bajos de
poliaminas en todos los rganos de la fruta en etapa de maduracin
(Geny et al., 1997). Tambin se han estudiado las poliaminas como
respuesta al ataque por hongo en distintos rganos (yemas florales,
flores y bayas pequeas) de vides Cabernet Sauvignon; y se ha
descrito un aumento de las poliaminas ligadas a pared y una
disminucin de las libres en los rganos daados (particularmente Put
y diaminopropano) (Rifai et al., 2004). Hasta el momento se
desconoce el papel de las poliaminas en el mecanismo de respuesta
de las uvas a las bajas temperaturas.
20
Introduccin
E.2) Betana glicina La betana glicina es una amina anfotrica
cuaternaria que parece proteger las plantas manteniendo el balance
de agua entre las clulas y el ambiente, y mediante la estabilizacin
de la estructura y actividad de las macromolculas (Sakamoto y
Murata, 2002). Algunas plantas como la espinaca y la cebada,
acumulan un nivel relativamente alto de betana glicina en sus
cloroplastos, mientras que otras, tales como Arabidopsis y tabaco,
no sintetizan este compuesto (Sakamoto y Murata, 2002). Plantas de
Arabidopsis transgnicas que expresaron genes de glicina sarcosina
metiltransferasa (ApGSMT) y dimetilglicina metiltransferasa (ApDMT)
procedentes de cianobacterias halotolerantes, acumularon altos
niveles de betana glicina e incrementaron su tolerancia a estreses
de sequa, alta salinidad y bajas temperaturas (Waditee et al.,
2005).
E.3) cido saliclico y cido jasmnico Recientemente, tambin se ha
centrado la atencin en el SA debido a su habilidad para inducir
termotolerancia en plantas de mostaza (Dat et al., 1998, a,b), o
proteger contra el estrs por bajas temperaturas en plantas de maz
(Janda et al., 1999), tomate (Ding et al., 2002) y trigo (Tasgin et
al., 2003). El SA podra estar relacionado con el estrs oxidativo
jugando un papel esencial en prever el dao oxidativo (Bowler et
al., 1994). Uno de los modos de accin propuestos para el SA es la
inhibicin de la CAT, una de las enzimas eliminadoras de H2O2, de
manera que las concentraciones celulares de H2O2 aumentaran y
actuaran como mensajero secundario activando genes asociados a
defensa (Chen et al., 1993). Shulaev et al. (1997) demostraron que
el metil salicilato (MeSA) podra actuar como una seal area, la cual
activara la resistencia al dao y la expresin de genes asociados a
defensa en plantas vecinas y en tejidos sanos de plantas
infectadas. En manzanas almacenadas a bajas temperaturas (-2C), se
observaron mayores
21
Introduccin
concentraciones endgenas de JA que en las manzanas control
mantenidas a 20C (Yoshikawa et al., 2007). Esto sugiere que el JA
podra estar asociado con la tolerancia de las manzanas al estrs por
bajas temperaturas.
E.4) Azcares y polialcoholes La desecacin que puede ocasionar el
almacenamiento a bajas temperaturas se ha correlacionado con la
acumulacin de ciertos azcares (tipo galactinol, trehalosa y
fructano) y polialcoholes (como manitol y D-ononitol) (Bartels y
Sunkar, 2005). Plantas de Arabidopsis transgnicas que
sobreexpresaron CBF3/DREB1A fueron tolerantes a estreses de sequa y
fro (Avonce et al., 2004), y acumularon ms galactinol y rafinosa
que las plantas de tipo salvaje (Valliyodan y Nguyen, 2006).
4. TECNOLOGAS PARA LA CONSERVACIN DE UVA DE MESA. TRATAMIENTOS
GASEOSOS. Para evitar el uso de fungicidas sintticos y cubrir la
demanda del consumidor, surge la necesidad de disponer de
tratamientos alternativos no qumicos que preserven la calidad
postcosecha de frutos.
4.1. Generadores de dixido de azufre El dixido de azufre (SO2)
se emplea en frutos mnimamente procesados para evitar procesos
fermentativos, la aparicin de mohos y pardeamientos (Jiang et al.,
2002). El tratamiento con SO2 y bajas temperaturas utilizado para
la conservacin de litchis (Litchi chinensis Sonn), aument el
periodo de vida til y disminuy el pardeamiento de los mismos (Ray
et al., 2005).
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Introduccin
La fumigacin con SO2 es el mtodo ms comnmente utilizado para
controlar podredumbres durante la conservacin en fro de racimos de
uva (Harvey y Uota, 1978; Crisosto et al., 1994). Al principio, el
SO2 se aplic a uva de mesa en altas concentraciones en exposiciones
cortas de tiempo o en bajas concentraciones y exposiciones
prolongadas. A mediados de los aos sesenta, la exposicin continua
de uvas a SO2 por largos periodos de tiempo se consigui gracias al
desarrollo de generadores qumicos de fase doble (rpido y lento)
(Nelson y Ahmedullah, 1972, 1976). Estos generadores pueden
producir SO2 durante varias semanas en ambientes refrigerados y con
alta humedad (Lagunas-Solar et al., 1992). El almacenamiento de
cultivares de uva de mesa a 2C con generadores de SO2 previno la
podredumbre de la uva sin tener ningn efecto sobre la acidez,
slidos solubles o color, aunque su eficacia fue variable
dependiendo del cultivar (Morris et al., 1992). Sin embargo,
Crisosto et al. (2002) mostraron que la concentracin de SO2
necesaria para eliminar esporas y evitar el crecimiento del micelio
induca daos en la baya y el raquis. El nivel de SO2 por encima del
cual se han observado prdidas en la calidad de uvas de mesa es de
10 mg/kg (Crisosto y Mitchell, 2002). Concentraciones elevadas de
SO2 producen blanqueamientos en la superficie de las bayas durante
su almacenamiento y son especialmente visibles en variedades de uva
de mesa tintas (Winkler et al., 1974). Adems, los residuos de SO2
son dainos para la poblacin alrgica a sulfitos, siendo 10 L/L el
umbral mximo tolerado para estos residuos presentes en frutos segn
la Administracin de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos
(Crisosto et al., 1994); mientras que la Unin Europea ha prohibido
su uso (EU Directive95/2/CE). Por otro lado, no se puede emplear
SO2 en uvas certificadas de obtencin orgnica (Gabler y Smilanick,
2001).
23
Introduccin
4.2. Atmsferas controladas Las atmsferas controladas (CA, del
ingls Controlled Atmospheres) contribuyen a mantener la calidad y
prolongar el periodo de la conservacin de productos vegetales
(Beaudry, 1999). Niveles reducidos de O2 y/o enriquecidos de CO2
pueden reducir la respiracin, retrasar la maduracin, disminuir la
produccin de etileno, retardar el ablandamiento y ralentizar los
cambios en la composicin debido a la maduracin, resultando todo
esto en un aumento de la vida til (Farber, 1991). Adems de ser una
tecnologa postcosecha competitiva, el empleo de CA es una
alternativa a la fumigacin qumica (Yahia y Vazquez-Moreno, 1993).
En los ltimos aos los progresos en su desarrollo tecnolgico se han
centrado en el empleo de fluidos criognicos como el nitrgeno lquido
que, adems de favorecer el establecimiento de bajos niveles de O2,
actan como medio de enfriamiento rpido (Mahajan y Goswami, 2007).
Los efectos de las CA con alto CO2 en la calidad y fisiologa de la
uva han sido evaluados en distintas variedades (Arts-Hernndez, et
al., 2004; Crisosto et al., 2002). Estos resultados han mostrado
que las CA pueden retardar la senescencia, reducir la respiracin de
la baya y del raquis, mantener la firmeza de la baya, disminuir el
oscurecimiento del raquis y reducir, as como retrasar, la
podredumbre. Sin embargo, las limitaciones del empleo del
almacenamiento en CA son principalmente el metabolismo fermentativo
y el estrs fisiolgico que pueden dar como resultado el desarrollo
de sabores y aromas anmalos, el oscurecimiento del raquis y la
induccin de podredumbre por hongo despus del paso a aire durante el
periodo de vida til (Grierson et al., 1966; Kader, 2002). Mtodos
combinados de conservacin tales como CA y generadores de SO2
aumentaron el periodo de almacenamiento de los frutos, disminuyeron
las prdidas de peso, textura y color, y retrasaron tanto el ataque
fngico como el marchitamiento del
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Introduccin
raquis (Pretel et al., 2006). Sin embargo, los niveles de cido
tartrico y ctrico mostraron un brusco incremento. En uvas cv.
Kyoho, el tratamiento con altas concentraciones de CO2 y bajo O2
suprimi las actividades de las enzimas celulasa, poligalacturonasa
y peroxidasa; y como resultado se redujo la abscisin de las bayas
de uva durante el almacenamiento (Deng et al., 2007). Las uvas cv.
Thompson Seedles toleraron altos niveles de CO2 durante ms de 2
semanas a 0C (Ahumada et al., 1996) y se consigui un control
adecuado de la infeccin por Botrytis usando altos niveles de CO2
(Berry y Aked, 1997; Crisosto et al., 2002,b). En este mismo
cultivar y en Red Globe se estudi la eficacia de atmsferas ricas en
CO2 sobre el control de podredumbre durante el almacenamiento de la
uva a 0C y se compar con los generadores de SO2. Se observ que
concentraciones de 15% y superiores de CO2 resultaron tan buenas
como los generadores de SO2 para controlar al hongo Botrytis; sin
embargo, los tallos y pedicelos fueron ms verdes cuando las uvas se
almacenaron con generadores de SO2 (Retamales et al., 2003).
4.3. Atmsferas modificadas Las atmsferas modificadas (MAP, del
ingls packaging modified atmospheres) pasivas o activas se
presentan como una tecnologa alternativa para la conservacin de
productos enteros o mnimamente procesados que presentan
sensibilidad a distintos factores abiticos como las bajas
temperaturas, altas o bajas HRs, etc. En estos casos, el
almacenamiento en condiciones variables de composicin gaseosa y
humedad relativa de la atmsfera, permite aumentar el periodo de
vida til y mantener la calidad del producto vegetal. Generalmente,
porcentajes de 38% CO2 y 25% O2 son recomendados para la
conservacin de frutas y verduras mediante MAP (Farber, 1991).
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Introduccin
En cerezas, frutos no climatricos altamente perecederos, se ha
observado que la refrigeracin de las mismas en MAP mejora ciertos
parmetros de calidad del fruto (Apel et al., 1982), reduciendo las
podredumbres causadas por desarrollo fngico (De VriesPatterson et
al., 1991), inhibiendo el desarrollo del color de los frutos (Arts
et al., 2001) y prolongando la vida postcosecha de los mismos
(Remon et al., 2000). El empleo de MAP se ha comprobado que
mantiene la calidad organolptica de uvas durante su almacenamiento.
Sin embargo, la baja intensidad de respiracin de la uva de mesa y
por consiguiente las concentraciones de CO2 alcanzadas dentro de
los paquetes, no fueron lo suficientemente elevadas para actuar
como fungicida (Martnez-Romero et al., 2003). Sin embargo,
concentraciones de 15 kPa de O2 y 10 kPa de CO2 fueron eficaces
para evitar el marchitamiento del raquis y el ablandamiento de los
granos, as como para mantener la calidad visual, sabor y textura,
controlando el desarrollo de podredumbres (Arts-Hernndez et al.,
2004). Otros estudios mostraron que el empleo de MAP en combinacin
con cido actico (Moyls et al., 1996), clorina (Zoffoli et al.,
1999), eugenol (Valero et al., 2006) o generadores de SO2 comercial
(Arts-Hernndez et al., 2004) en la conservacin de uvas de mesa
redujeron significativamente el dao provocado por B. cinerea; sin
embargo, en estos estudios, el problema de los residuos
persisti.
4.4. Ozono La aplicacin exgena de ozono permite el control del
crecimiento y desarrollo microbiolgico de los frutos as como de las
instalaciones. Asimismo, retrasa la maduracin de los frutos, lo que
permite prolongar considerablemente el tiempo de conservacin de los
mismos. Adems, la exposicin a niveles de ozono por debajo de los
crticos puede resultar en la induccin de compuestos de defensa,
tales como estilbenos,
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Introduccin
contra el estrs oxidativo (Roseman, 1991). Se ha observado que
la aplicacin de ozono, a lo largo de la conservacin a bajas
temperaturas de la uva de mesa, aumenta su contenido de fenoles
totales (Arts-Hernnadez et al., 2007). Sin embargo, experimentos
sobre fumigacin con cantidades controladas de ozono revelaron que
niveles bajos (
