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Hemólisis:
Formación de hemicromos Los hemicromos se unen a banda 3, banda
4,1,anquirina y Espectrina y catalizan su oxidación.
Hay una disminución de afinidad con la anquirina y liberación del citoesqueleto (espectrina/actina).
Agrupación y Aumenta la movilidad lateral en la bicapa (clustering) de Banda 3.
Formación de agregados. Progresiva vesiculación. Perdida de la membrana plasmática y LISIS
celular
Formación Hemicromos
especies tóxicas de Fe especies reactivas al oxigeno (radicales libres)
Lipoperoxidación
Ca2+ Activación Canales Gardos Exposición Fosfatidilserina (FT)
Activación complejo ProtrombinaActivación de las Plaquetas
Apoptosis de precursores
Normalmente: Hipoxia Eritropoyetina (EPO), EPO la expresión de Bcl-XL, un gen antiapoptótico.
- EPO inhibe la expresión del canal Gardos (K+,Ca2+). Precursores eritroides con -talasemia: - Los precursores eritroides inmaduros tienen de la expresión de
Bcl-XL y expresan el receptor de membrana, Fas. - Los precursores eritroides más maduros expresan Fas-ligando. TEORIA: Se ha propuesto que en islas de eritroides en medula ósea, la
interacción Fas con Fas-ligando puede producir una retroalimentación negativa sobre la eritropoyesis y EPO. Activación de caspasa 3, 7, y 8 los que luego degradan factor de trascripción GATA,(factor requerido para la diferenciación eritroide) APOPTOSIS CELULAR
Biología molecular
Talasemias
Estructura molecular de los genes globina duplicados
Entrecruzamiento hacia la derecha
Entrecruzamiento hacia la izquierda
Clasificación Relación Fenotipo/ Mutación:
• Beta +: La mutación no impide que el gen sintetice algo de globinas beta.
• Beta 0: La mutación impide totalmente la síntesis de globinas beta, bien porque no se produce RNAm o bien porque se produzca pero no sea traducible.
-talasemia
Consiste de estructuras exon e intrones. Se refieren al ADN codificante y no codificante, respectivamente, del gen.
INTRONES
Los genes de las globinas:
•Inicia con un sitio dador consenso (G100U100A62A68G84U63..)
•Tiene un punto de ramificación cercano al sitio 3’ del intron (no es un sitio consenso muy conservado UACUAAC)
•Finaliza con un sitio aceptor consenso (12Py..NC65A100G100)
AGUACUAAC
EnhancerCaja GC
-90
Caja CAAT
-75 -30
TATA5’ UTR
+1
3’ UTRGT AG GT AG
TGA
5’ 3’FTII
RNA pol II
-200-500
FT
+Transcripción
RNA Transcripto PrimarioGU GU5’ UTR AG AG 3’ UTR AAUAAA
UGA
Señal de clivaje y poliadenilación20-30nt
Capping y Poliadenilación
GU GU
UGA
AG AG 3’ UTR5’ UTRCAP
7-metilguanosina
AAAAAAAAA
SplicingSpliceosoma
5’ UTRCAP
GU
AG
UGA
AAAAAAAAA
GU
AG
GU
AG
Lazo o LARIAT
5’ UTRCAP AAAAAAAAA
3’ UTR
3’ UTRRNA mensajero MADURO
NUCLEO
CITOPLASMA
RNA nuclear pequeño (snRNA)
UACUAAC
Mutaciones:tipos
PCR+ ER
87,5%
Estrategias: Se produce una perdida o ganancia
sitio de corte ER: PCR+ ER (algunos la refieren como RFLP-PCR).
No hay cambio: Análisis con Dot Blot + Sondas ASO (Oligonucleótidos Alelo Especificas), ARMS
726 pb
WT
WT
Otro ejemplo:Hb S: La mutación de Hb S en el
codon 6, destruye el sitio de reconocimiento de la enzima Dde I.
Se usa para la detección de Mutaciones puntuales (que no afectan sitios de cortes de una Enzima de restricción)
Análisis con Dot Blot + Sondas ASO (Oligonucleótidos Alelo Especificas)
Una vez que tenemos los dot blot revelados, identificamos cada una de las muestras sembradas y observamos el resultado correspondiente a cada sonda.
1 2 3 4 5 6 7 8
7: control negativo de la PCR
8: control negativo de hibridación (gen de tiroglobulina)
1: portador de la mutación 1 –1
2: portador de la mutación 1 –1
3: portador de la mutación 1 - 110
4: portador de la mutación 39
5: portador de la mutación 39
6: normal
Alfa Talasemias
MUTACIONES
+
0
Southern Blot y análisis de la secuencia de ADN
Gap-PCR Otro método es el MLPA (Amplificación
de Sondas dependiente de Ligamiento Múltiple
- Talasemias:
Gap- PCR
Variante de una PCR-multiplex
Se utiliza gap-PCR para diagnóstico de:
GAP-PCR Una gran deleción reune a los primers AC y se
produce la amplificación
Usada en la identificación de deleciones en el gen de - globina.
A
B C
C
Normal: A and B da un producto; A y C están demasiados apartados no hay producto PCR
Deleción: A y C ahora dan un producto, el cual es diferente en tamaño al producto A y B.
A
Delecion African
HPFH-2
N
M
- Talasemias:
Amplificación de Sondas
dependiente de Ligamiento
Múltiple (MLPA)
• Característica General
La amplificación es de las sondas de MLPA, no de las muestra de ADN.
El pattern de los picos son generadas sobre la muestras de un paciente y una muestra de ADN de referencia. Se compara la altura relativa de los picos. Las diferencias reflejan los cambios en el número de copias detectados por las probes de MLPA.
Mas de 50 probes están presentes en una reacción de MLPA
Deleciones
Bibliografía general: LEHNINGER ALBERT L., COX MICHAEL M., NELSON DAVID L. “Principios de Bioquímica”. Editorial OMEGA 4º Edición. 2006. Diapositivas en Power Point (formato ppt) (Manual para docentes)
LEHNINGER ALBERT L., COX MICHAEL M., NELSON DAVID L. “Principios de Bioquímica” Web: http://bcs.whfreeman.com/lehninger/ The Journal of Biological Chemistry: Classic Articles Web: www.jbc.org
VOET DONALD, VOET JUDITH G. “Bioquímica” Editorial MÉDICA PANAMERICANA.
3º Edición, en Español. 2006
WATSON, BAKER, BELL, GANN, LEVINE, LOSICK “Biología Molecular del Gen”Editorial MÉDICA PANAMERICANA. 5º Edición, en Español. 2006
STRYER LUBERT, BERG JEREMY M., TYMOCZKO JOHN L.”Bioquímica”Editorial REVERTE. Edición 5º Edición, en Español. 2003
MATHEWS CHRISTOPHER K., AHERN KEVIN G., VAN HOLDE K. E.”Bioquímica” Editorial PEARSON EDUCACION. 3º Edición en Español. 2003
Diapositivas (formato ppt), Problemas (Manual para docentes) y Casos Clínicos de Aplicación
VOET DONALD, VOET JUDITH G. and PRATT CHARLOTTE W. “Fundamentals of Biochemistry”Second Edition.Copyright © 2006 by John Wiley & Sons, IncWeb: www. medicapanamericana.com/voet/
Bibliografía especifica: Alvarez SM, Varas SM, Meloni AM, Giménez AI y
Giménez MS. 2000. Incidencia de la beta -talasemia en San Luis, Argentina. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana: 35 (1) 75-82
Alvarez, Silvina M. (1999). Trabajo Final de Tesina en Biología Molecular ‘’ Rastreo de pacientes - talasémicos: estudio bioquímico y molecular. UNSL. Biblioteca Central.
Weatherall DJ y col. Chapter 93: The hemoglobinopathies. Book II. The metabolic and molecular basis of inherited disease. Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS & Valle D. 7º Edition. 1995. New York Mc Graw-Hill.
Fundación Argentina de Talasemia "FUNDATAL" http://www.fundatal.org.ar Ronald J A Trent. Diagnosis of the Haemoglobinopathies. Clin. Biochem. Rev. Vol 27 February 2006
Bibliografía especifica: Charles R. Scriver, Arthur L. Beaudet, William
S. Sly and David Valle: THE METABOLIC AND MOLECULAR BASES OF INHERITED DISEASE. Volume I,II and III. Seventh Edition.Mc Graw-Hill Editors
Trabajos publicados en revistas de la especialidad.
BLOG: http://qbpatologica.wordpress.com/
