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I) Plateforme TALGENE :
Production de TALENs et premiers exemples d’utilisation
TALEN
-TAGAATTACGGGGCTTAA------------TTAAGCCCCGTAATTCTA- -ATCTTAATGCCCCGAATT------------AATTCGGGGCATTAAGAT-
FokI FokI
Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris jean‐[email protected]
TALENs : des nucléases pour modifier le génome
- étudier la fonction de gènes (KO, KI)
- créer des modèles de maladies - corriger des mutations responsables de maladies
- des applications biotechnologiques (production de protéines, de lignées cellulaires, …)
- …
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
TALEN, Transcription Activator-Like Effector Nuclease
NI NINI NI HDNGNG NGNGNNNN NN HD NINNNN NI
Répé..ons Ac.va.on
TALE1LTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHG34
Codedeliaisonàl’ADNdécouvertchezleseffecteursTALEdesbactériesdugenreXanthomonas(UBonasetal,Science,2009)
NIA HDC NNG NGT
TALE
TALEN
-TAGAATTACGGGGCTTAA------------TTAAGCCCCGTAATTCTA- -ATCTTAATGCCCCGAATT------------AATTCGGGGCATTAAGAT-
FokI FokI
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
Rec.Homologue
NHEJ
Principe de la modification du génome par les TALENs
TALEN TALEN
0‐100%Inac.va.ondegène(KO)
0‐10%Modifica.oncontrôlée(KI)
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
Modification du génome à l’aide de TALENs
‐ rat Juillet2011,NatureBiotechnol
‐ zebrafish Juillet2011,NatureBiotechnol‐ Celegans‐ riz Mai2012,NatureBiotechnol
•modifica.ondegèneparKIdansdescellulesenculture ‐dansdeslignées Février2011,NatureBiotechnol
‐dansdesESetiPS Juillet2011,NatureBiotechnol
•Inac.va.ondegènesinvivo
TALEN -TAGAATTACGGGGCTTAA------------TTAAGCCCCGTAATTCTA- -ATCTTAATGCCCCGAATT------------AATTCGGGGCATTAAGAT-
FokI FokI
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
TALENs vs ZFNs : séquencesciblespoten.elles
TN17‐‐x14‐19—N17A
≈partout(presque!)
(Reyonetal,NatureBiotechnol,2012)
NNCNNCNNC‐‐x5‐7—GNNGNNGNN
≈tousles1000pb
(reviewMIsalan,NatureMethods,2012)
ZFN
>TALEN
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
CriblagedebanquesdedoigtsdezincContextdependentAssembly(CoDA)àfaçonSigma‐Aldrich
GoldenGatecloning(Addgene)liga.onssuccesives(Addgene,TALGENE)àfaçonCellecFs,Invitrogen,plateformeTALGENE
TALENs vs ZFNs : méthodesdesynthèse
NNCNNCNNC‐‐x5‐7—GNNGNNGNNTN17‐‐x14‐19—N17A
ZFN
>TALEN
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
Plateforme TALGENE
ObjecBfs
‐ ConcevoirlesnucléasesTALENsenfoncBondesprojets‐ Produirelesnucléases
‐TesterleuracBvité
⇒ MeQreàdisposiBonlesplasmidescodantlesTALENsoulesprotéinesTALENspurifiées⇒ Développerlesdomainesd’applicaBondecesnouveauxouBls
DéterminaBondelaséquence
cible
AssemblagedesrépéBBons
TALE
ConstrucBonduplasmide
TALENTestsinvitroetinvivo
GèneetobjecBf
PlasmidesTALENetefficacité
Contrôleparséquençage
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
NI NINI NI HDNGNG NGNGNNNN NN HD NINNNN
NI NINI NI HDNGNG NGNGNNNN NN HD NINNNN
NI NINI NI HDNGNG NGNGNNNN NN HD NINNNN
NI NINI NI HDNG NG NG NGNNNN NN HD NINNNN
Assemblage de TALEN par Golden Gate cloning
Etape de ligation 1
Etape de ligation 2
Etape de ligation 3
1 2 3 4 5 6 7 8
Zhang et al, Nat. Biotechnol, 2011 Cermak et, Nucleic Acids Res, 2011 Weber E et al, PLoS ONE, 2011Geissler R et al, PLoS ONE, 2011 Sanjana N et al, Nat Protoc, 2012
NI
HD
NN
NG
NI
HD
NN
NG
NI
HD
NN
NG
NI
HD
NN
NG
NI
HD
NN
NG
NI
HD
NN
NG
NI
HD
NN
NG
NI
HD
NN
NG
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
Collection de plasmides de départ
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
NI NINI NI HDNGNG NGNGNNNN NN HD NINNNN
NI NINI NI HDNGNG NGNGNNNN NN HD NINNNN
NI NINI NI HDNGNG NGNGNNNN NN HD NINNNN
NI NINI NI HDNGNG NGNGNNNN NN HD NINNNN
NI NINI NI HDNGNG NG NGNNNN NN HD NINNNN
NI NINI NI HDNG NG NG NGNNNN NN HD NINNNN
Assemblage de TALEN par ligations successives
Etape de ligation 1
Etape de ligation 2
Etape de ligation 3
Etape de ligation 4
Etape de ligation 5
Sanders et al, Nat. Biotechnol, 2011 Huang et al, Nat. Biotechnol, 2011
NI HD NN NG 4 plasmides de départ
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
Produc.on MéthodeTALEUnitassembly2.0 Banquede256modules => 140plasmidesTALEN MarineCharpenIer, Jean‐PaulConcordet,InsItutCochin,Paris
Testsd’ac.vité‐Invitro 40/44testésavecplusde20%decoupure 91%
‐encellules32/36testésavec5‐40%InserBonDéléBons89%
AnneDecian,CharloMeBoix,Jean‐BapIsteRenaud, CarineGiovannangeli,MNHN,Paris
Plateforme TALGENE
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
Modifygenesinlivingorganisms
Targetgene
KOmutant
DeleBonduringDSBrepairbyNHEJ
TALEN‐directedgeneinac.va.oninrat,xenopus,zebrafishandmedaka:efficiency0‐100%ExperimentsinprogressinmouseandDrosophila…
TALEN
TALENsàfaçon:lesapplica.ons
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
Applica.onsdesTALEs
FokI
VP16 act.
KRAB rep.
ADN methyl transferase
GFP
transposase SB
Contrôler la transcription
Induire une cassure ADN et modifier le gène cible
Suivre les mouvements de séquences spécifiques d’ADN ?
Ciblage de la transposition ?
Modifier le statut épigénétique ?
TALE
TALE
TALE
TALE
TALE
TALE
Zhang F et al, Nat Biotechnol, 2011 Cong et al, Nat Commun, 2012 Tremblay JP et al, Hum Gene Ther, 2012
Miller JC et al, Nat Biotechnol, 2011 Christian M at al, Genetics, 2010
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
«Genomeengineeringandtarge.ngwithar.ficialTALEs»
Phasethéorique:Bordeaux,24‐25Avril2013
UBonas,MJasin,BStoddard,KJJoung,TCathomen,ZIvics,BZhang,DCarroll,…IAnegon,PDuchateau,JPouysségur,BLopez,…
Phasepra.que:Paris,Juin2013
AssemblagedeTALENscontregènesciblesdesparFcipants,TestsfoncFonnels,ciblagedegènes
Contactpourrenseignementsetinscrip.ons:[email protected]
AtelierINSERM
Présentation de la plateforme TALGENE, Jean-Paul Concordet, Institut Cochin, Paris
PlateformeTALGENE:
ProducFondenucléasesTALENsetapplicaFons
pourlamodificaFoncontrôléedugénome
MarineCharpenBer,MarieGuilbaud,FlavieMascarell,Jean‐PaulConcordetInsItutCochin,DptGénéIqueetDéveloppement,CNRSUMR8104,InsermU1016,UniversitéParisDescartes
AnnedeCian,CharloQeBoix,Jean‐BapBsteRenaud,OlivierRené,CarineGiovannangeliMuséumNaIonald’HistoireNaturelle,CNRSUMR7196,InsermU565
jean‐[email protected]