TAXONOMIA MOLECULAR

Bibliografía:

- Brock.10ma edición. Capítulos 10, 11.- Rodicio cap. 11.

Taxonomía de procariotas: clásica

morfología

movilidad

nutrición y fisiología

estructuras celulares particulares

contenido de ácidos grasos.

• Muchas son características altamente variables, de bajo valor taxonómico.• Frecuencia de convergencia evolutiva o paralelismo.

Se basa en el fenotipo, incluye:

Análisis de ácidos grasos (FAME: fatty acid methyl ester)

Caracterización de ácidos grasos de la membrana plasmática y pared celular. Perfil de ácidos grasos es particular de cada bacteria. Los ácidos grasos son extraídos, tratados e identificados por cromatografía gaseosa. Resultado: cromatograma con tipo y cantidad de ácidos grasos. Comparación con bases de datos. Uso rutinario

• Requiere estandarización: ácidos grasos varían en distintas condiciones.• Imposible para algunos organismos.• Variabilidad intraespecífica.

Desventajas:

Taxonomía molecular

1- Contenido de G+C Porcentaje de guaninas y citosinas en el DNA genómico. Valores entre 20-80% en Bacteria y Archaea.

DNA con mayor porcentaje de G+C se desnaturaliza a mayor temperatura.

DNA absorbe mayor radiación UV cuando se desnaturaliza.

Tm: melting temperature

La temperatura de desnaturalización es proporcional al contenido de G+C.

1- Contenido de G+C

1- Contenido de G+C

• Si 2 organismos difieren en mas del 5%, entonces no estarían estrechamente relacionados.

• Sin embargo, 2 organismos con igual G+C content pueden ser muy distintos.

Taxonomía molecular

2- Hibridación genómica: reasociación DNA:DNA

Comparación de secuencias de DNA (total).

Complementario al analisis de secuenciación de SSU rRNA.

Dos DNA se hibridan en proporción a su similitud.

El grado de similitud podrá determinar los organismos estrechamente

relacionados.

útil en organismos relacionados y similares.

Técnica

3- Ribotipado: Análisis de RNA ribosómico (fingerprinting)

Taxonomía molecular

Digestión de DNA total con enzimas de restricción Separación en gel por electroforesis Transferencia de DNA a membrana Hibridación con sonda de rRNA Los sitios de corte en el rRNA son particulares de cada bacteria. Comparación con trabajos anteriores.

Movie

http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_5.html

Taxonomía molecular

4- Secuenciación de rRNA u otro gen

Filogenia es la historia evolutiva de una especie.

Arbol filogenético es la historia evolutiva, representado por un diagrama de lineas que se bifurcan y que reflejan las relaciones evolutivas.

PCR movie:http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_6.htmlSanger sequencing:http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter15/animation_quiz_1.html

Taxonomía de procariotas

Ribosomas: complejo ribonucleoproteico para la síntesis de proteínas.

Ribosoma bacteriano + 21 rps

+ 31 rpl

Operón de rRNA

ProcariotasSSU rRNA = 16S rRNA

EucariotasSSU rRNA = 18S rRNA

Aprox. 1500 nt. de longitud

Cantidad de copias del operón de rRNA: 1-15.

Existe cierta variabilidad intraindividuo o intragenoma.

Obtención de la secuencia de SSU rRNA

Concepto de especie en microbiología

Taxonomía polifásica: combinación de diversas técnicas para la determinación de especies: fenotipo, genotipo y filogenias.

Normalmente incluye: secuenciación de la SSU rRNA e hibridación genómica.

• La especiación y taxonomía bacteriana está afectada por la transferencia horizontal de genes entre especies distintas.

Se propuso: procariotas que difieren en >3% en secuencia de rRNA son especies diferentes. Mayor resolución en la hibridación genómica u otros genes (gyrB) para identificar nuevas especies. Por arriba del nivel de especie, secuenciación de rRNA es una herramienta poderosa. Diferencias > 5-7% en secuencia del 16S rRNA determina un nuevo género.

Dos bacterias que difieren en más del 3% en la secuencia de 16S rRNA, hibridizan en menos del 70% y son especies distintas.

Pros y contras del uso de SSU rRNA en sistemática?

- distribución universal- secuencia suficientemente conservada- largo de la molécula suficiente.

- insuficiente variabilidad para distinguir especies de bacterias.- posible error por transferencia horizontal.

+ -

Preguntas

Imagine que le han entregado varios cultivos de bacterias de diferentes países y todas causan una enfermedad gastrointestinal. Luego de realizar análisis de ribotipado, identifica 4 cepas. Cómo haría para testear si dichas cepas pertenecen a la misma especie?

Imaginen que han descubierto una nueva forma de vida microbiana que parece representar un cuarto dominio de vida. Cómo lo caracterizaría y cómo determinaría si es evolutivamente distinto que Bacteria, Archaea y Eukarya?

Luego de realizar un análisis de lípidos en dos cultivos, observan que uno contiene abundantes ácidos grasos insaturados y el otro contiene fitanil con uniones éter. A qué dominio pertenecen?

Qué tipo de caracteres utilizan los feneticistas y los cladistas?

LEER Y TRAER:Para próxima clase teórica (miércoles) el siguiente artículo: McInerney et al 2008.