T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ

BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU

Partikül Bombardımanı (Biyolistik) Yöntemi ile Tritikaleye (x Triticosecale Wittmack) Markör Gen Aktarımı

Proje Yürütücüsü Prof. Dr. A. Murat ÖZGEN

Proje Numarası : 2005 0711 001 HPD Başlama Tarihi : 15.05.2005 Bitiş Tarihi : 15.05.2006

Rapor Tarihi : 03.07.2006

Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri

Ankara - 2006

2

I. ÖZET

Partikül Bombardımanı (Biyolistik) Yöntemi ile Tritikaleye (x Triticosecale Wittmack) Markör Gen Aktarımı

Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarla Bitkileri Bölümü biyoteknoloji

laboratuvarında yürütülen bu çalışmanın amacı; tritikale ((x Triticosecale

Wittmack)’nin olgun embriyolarına ve kotiledon yapraklarına partikül bombardımanı

tekniği ile gen aktarmada kullanılabilecek en uygun parametreleri belirlemektir.

Tritikele (x Triticosecale Wittmack)’den elde edilen olgun embriyolar ve kotiledon

yapraklar, β-glucuronidase (GUS) genini içeren plasmidlerle kaplanmış hızlandırılmış

altın ve tungsten partikülleri ile bombardıman edildi. Hedef eksplantlara olan farklı

uzaklıklar (6, 9, 12, cm) ve farklı basınçlar (900, 1100, 1550 psi) fiziksel parametreler

olarak kullanıldı. Gen geçişlerinin olduğu mavi hücreler histokimyasal analiz ile

belirlendi. Mavi noktalara ilişkin veriler, gen geçişlerinin etkinliğinin belirlenmesinde

ölçüt olarak kullanıldı.

Tritikalede, partikül bombardımanı tekniği ile doğrudan DNA aktarmada olgun

embriyoların yapraklara oranla, altının ise tungstene oranla daha kullanışlı olduğu

belirlendi. Denemede en iyi sonucu veren olgun embriyolarda bombardıman uzaklığının

6 cm, bombardıman basıncının ise 1100 psi olduğu saptandı.

Anahtar Kelimeler: Biyolistik, GUS, Markör gen, Partikül bombardımanı Tritikale, Triticosecale

3

ABSTRACT

Transfer of Marker Gene to Triticale ( x Triticosecale Wittmack) by Particle Bombardment (Biolistic) Method

Present study was carried out at the biotechnology laboratory of Department of Field

Crops, Ankara University to determine suitable transformation parameters and

investigate marker gene transfer possibities to triticale (x Triticosecale Wittmack) by

particle bombardment technique.

Mature embryos and cotyledone explants from triticale were bombardment with

accelerated tungsten particles coated with plasmids containing β-glucuronidase

(GUS) gene. Different distances (6, 9, 12, cm) from stopping plate to target explants

and different pressures (900, 1100, 1550 psi) of rupture disk were used as physical

parameters. Blue transformed cells were detected in a histochemical assay. The

number of blue spots was used as a convenient criterion to determine the gene

transfer efficiency.

The mature embryos of tritikale were more amenable than cotyledone to direct

delivery of foreign DNA by the particle bombardment technique. On the other hand,

gold particles were more suitable than tungsten particles. The optimal bombardment

distance from stopping plate to target mature embryos and rupture disk pressure was

6 cm and 1100 psi, respectively.

Key Words: Biolistic, GUS, Marker gen, Particle bombardment Triticale, Triticosecale

4

II. AMAÇ VE KAPSAM

Bilindiği gibi, tritikale, buğday (T. durum Desf. ya da T. aestivum L.) ile çavdarın (S.

cereale L.) melezlenmesinden elde edilen yapay bir tahıldır. Poliploidi yöntemi ile fertil

hale getirilen melezlerin, anaçlarına bağlı olarak, yazlık ve kışlık varyeteleri

bulunmaktadır. Uzun yetiştirme döneminin geçerli olduğu bölgelerde yazlık

tritikalelerin en önemli avantajı, diğer yazlık tahıllara oranla, kurağa dayanıklı olmaları

ve bu bölgelerde yemlik arpa ve yulafa alternatif oluşturmalarıdır. Kurak alanlarda

yazlık tritikale, yazlık buğdaya oranla, %5-20 arasında daha yüksek verim

verebilmektedir (Salmon ve ark., 2001). Ayrıca, yazlık tritikale yüksek slaj verimi

bakımından da arpa ve yulafa önemli bir alternatif oluşturmaktadır. Kısa yetiştirme

döneminin geçerli olduğu bölgelerde ise kışlık tritikale yazlık tritikalenin yerini

almaktadır. Kışa dayanıklılığı kışlık buğday ile kışlık çavdar arasındadır. Kışlık buğday

ve çavdara göre daha geç olgunlaşan kışlık tritikalenin verimi ise kışlık buğdaydan

%10-20 arasında daha yüksektir (Salmon ve ark., 2001).

Kıraç alanlara adaptasyon özelliğini ve yüksek verim potansiyelini ABD genomlarına

sahip buğdaydan; soğuk, asitli, tuzlu topraklarda yetişebilme özelliğini ise R genomuna

sahip çavdardan alan tritikale; tuzlu, toksisitesi yüksek, demir, molibden, çinko gibi

mikro besin maddeleri bakımından eksik olan topraklarda kolaylıkla yetişebilmekte ve

yaprak hastalıklarına karşı tarla koşullarında anaçlarına göre daha toleranslı olmaktadır.

Hayvancılıkta otlatmanın yanında dane ve kaba yem üretiminde büyük potansiyele

sahip olan tritikalenin özellikle kurağa dayanıklılığı, günümüzde küresel ısınma

beklentileri nedeniyle, ayrı bir önem taşımaktadır. Bu nedenle, tritikale ekiminin

yaygınlaştırılması için, başta kalite olmak üzere, bazı özelliklerin artırılması

kaçınılmazdır.

Tritikale, dünyada 1950’li yıllardan beri ekilmekle birlikte, özellikle son yıllarda küresel

anlamda kuraklık ve tuzluluk kaygılarının artmasıyla yeniden gündeme gelmiştir. Daha

çok hayvan beslenmesinde kullanılan tritikalenin, buğday gibi yaygın olarak

kullanılabilmesi için, kalite özelliklerini yöneten yeni genlerle desteklenmesi

gerekmektedir. Bu nedenle, özellikle biyoteknolojik yöntemlerin uygulanabilmesi için,

son yıllarda yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Bu çalışmalar genellikle tritikale

eksplantlarından bitki elde edilebilmesi için gerekli olan rejenerasyon yöntemlerine

5

yöneliktir (Padmaja ve ark., 1992; Sirkka ve Immonen, 1993; Ainsley ve ark., 1998;

Vikrant ve Rashid, 2001; Bohorova ve ark., 2001; Birsin ve Özgen, 2004).

Tritikaleye biyoteknolojik yöntemlerle gen aktarma çalışmaları ise oldukça sınırlıdır.

Becker ve ark. (1995), tritikale mikrosporlarından elde ettikleri skutellum dokularına

partikül bombardımanı tekniği ile “bar” markör genini aktarmışlar ve R1 kuşağında gen

geçişlerini izlemişlerdir. Zimny ve ark., (1995) da skutellum dokularına “uidA” ve “bar”

genlerini partikül bombardımanı tekniği ile aktarmışlar, 465 bombardıman sonucunda

4000 bitki rejenere etmişlerdir. Bunlardan 300 tanesi canlı kalabilmiştir. Bunların ise 25

tanesi “gus” aktivitesi göstermiştir. Zimny ve ark., (2000), parikül bombardımanı

tekniği ile “uidA” ve “bar” genleri aktarılmış transgenik tritikaleleri 10 kuşak boyunca

incelemişler ve tümünün tohum bağladığını belirlemişlerdir. Ancak bazı hatlarda

transgenik özelliğin stabil olmadığı görülmüştür. Rubio ve ark., (2004) ise, “Toreto x

Presto” melezlerinden elde edilen melez tritikale haploidlerinin kalluslarına

bombardıman uygulayarak “uidA” geni aktarmışlar ve 6 cm mesafeden 1100 psi’lik

basınç altıda yapılan çalışmaların en iyi sonucu verdiğini belirlemişlerdir. Türkiye’de

ise, partikül bombardımanı yöntemi ile ilk gen aktarma çalışması Özgen ve ark., (1998)

tarafından buğdayda yapılmış olup, bu teknik tritikaleye ilk kez uygulanacaktır.

Kaynak özetlerinden de anlaşılabileceği gibi, tritikalede partikül bombardımanı tekniği

genellikle mikrosporlara uygulanmaktadır. Bu nedenle, araştırmada kullanacağımız

olgun embriyolar ve kotiledon yapraklar bu tip çalışmalarda ilk kez uygulanacağından,

kullanılan eksplant açısından araştırmanın uluslararası alanda orijinal bir çalışma olduğu

söylenebilir.

Tritikale farklı cinsleri içeren bir yapıya sahip olduğundan, istenilen özelliklerin

kazandırılması amacıyla yeni bir genin klasik ıslah yöntemleri ile aktarılmasında hem

kısırlık hem de bozulan özelliklerin düzeltilmesi için gerekli olan gerimelezleme

çalışmalarında önemli sorunlar ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle, klasik melezleme ile

yeni bir özelliğin ilave edilmesi yerine, biyoteknolojik yöntemlerle özelliği sağlayan

tek gen geçişinin sağlanması büyük önem taşımaktadır.

Bu çalışmanın amacı, genetik mühendisliği teknikleri içerisinde yaygın olarak

kullanılan ve son yıllarda bir çok transgenik çeşidin elde edildiği partikül bombardımanı

(biyolistik) tekniğinin kullanılmasıyla tritikaleye gen aktarımında yararlanılabilecek

6

uygun fiziksel ve biyolojik parametrelerin belirlenmesidir. Böylelikle, ileride

aktarılması düşünülen yeni özellikleri belirleyen genlerin izole edilmesiyle, zaman

kaybedilmeden bu teknikten yararlanılarak, transgenik tritikale çeşitleri elde etme

çalışmalarına başlanabilecektir.

III. MATERYAL VE YÖNTEM

1. Materyal

Bitkisel Materyal

Bitki materyali olarak, Türkiye’de tescilli olarak yetiştirilen bir kaç çeşitten biri olan

“Mikham 2002” çeşidi kullanılmıştır. Bu çeşidin kullanılmasının nedeni, daha önce

yapılan rejenerasyon çalışmasında (Birsin ve Özgen, 2004) tüm çeşitler içerisinde en

yüksek rejenerasyon kapasitesi ve en yüksek rejeneratif bitki sayısı değerlerini

vermesidir. Bilindiği gibi, biyoteknolojik yöntemlerle gen aktarılmış eksplantlarda

(transgenik) üretimin yapılmasında rejenerasyon büyük önem taşımaktadır. Denemede

eksplant olarak ise olgun embriyolardan ve kotiledon yapraklarından yararlanılmıştır.

Bombardıman Sistemi ve Parametreler

Denemede partikül olarak altın ve tungsten kullanılmş olup, bombardıman 900, 1100

ve 1550 psi basınçlarında 6, 9 ve 12 cm mesafelerden yapılmıştır. Partikül

bombardımanında, Sanford ve ark. (1993), Özgen ve ark., (1999), Önde ve ark. (2001)

ile Birsin ve ark., (2003)’den yararlanılarak orijinal PDS 1000/He sistemi kullanılmıştır

(Şekil 1).

Bu yöntemle bitkilerin tüm doku ve hücrelerine gen aktarımı mümkündür.

Hızlandırılmış partiküllerden yararlanarak özellikle tek çenekli bitkilere kolaylıkla gen

aktarılabilmektedir. Bu yöntemin temel ilkesi; DNA taşıyan 1-2 µm çapındaki altın ya

da tungsten parçacıklarına çok yüksek hız kazandırıp, bitki hücrelerine girmelerinin

7

Şekil 1. Orijinal PDS 1000/He gen aktarma sistemi

sağlanmasıdır. Parçacıklar hücre içerisine girdikten sonra DNA’lar bitki genomuyla

birleşebilmektedir (McCabe vd 1988, Klein vd 1987).

Parçacık hızının sürtünme nedeniyle azalmasının önlenmesi için, işlem vakum altında

yapılmıştır (Önde ve ark. 2001).

Plazmid vektörü

Çalışmada pBI1221.23 plazmidi (Lonsdale vd, 1990) aracılığı ile raportör GUS geni

aktarılmıştır. pBI221.23 plazmidi çift CaMV35S promotörü (1000 bp) kontrolünde

β-glukuronidaz (GUS) geni (2000) ve hygromisin antibiyotiğine duyarlı hpt geninden

(1300 bp) oluşmaktadır (Şekil 2). Bu gen ODTÜ Biyoloji Bölümü öğretim üyesi Doç.

Dr. Sertaç ÖNDE’den sağlanmıştır.

8

Şekil 2. Bombardımanda kullanılan pBI221.23 plazmidinin şematik görünümü

2. Yöntem

Eksplant Yüzey Sterilizasyonu

Olgun embriyo bombardımanında kullanılacak tohumlar ile, bitkilerin yetiştirilerek

steril yaprakların elde edileceği tohumların sterilizasyonunda Özgen ve ark. (1998) ile

Birsin ve Özgen, 2004’den den yararlanılmıştır. Buna göre, tohumlara etanol ve sodyum

hipoklorit ile yüzey sterilizasyonu uygulanarak sukroz ve agar içeren MS

(Murashige ve Skoog, 1962) ortamında çimlenmeleri sağlanmıştır.

Kullanılan ekipmanların sterilizasyonu

In vitro çalışmalarda, çalışılan laboratuvarın ve kullanılan tüm ekipmanların steril

olması bulaşma (kontaminasyon) olmadan başarılı sonuçlar elde etmek için büyük önem

taşımaktadır. Bu nedenle her çalışma öncesinde ekipmanların özelliklerine göre steril

edilmeleri sağlanmıştır.

Tohumların yüzey sterilizasyonunda kullanılan jarlar, içine ortam dökülen ve diğer

amaçlarla kullanılan petri kutuları gibi cam kaplar, yüksek ısı derecelerine dayanıklı

kalın kağıtlara sarılarak 200oC’de 2 saat bekletilmiştir.

Denemelerde kullanılan 200 µl’lik sarı uçlar, 1000 µl’lik mavi uçlar, büyük ependorf

tüpler, 5 ve 10 ml’lik cam pipetler otoklavda steril edilmiş ve düşük sıcaklıktaki fırında

kurumaları sağlanmıştır.

NOS GUS CaMV CaMV hpt NOS pUC 19 pUC 19

HindII

I NcoI

Bam

HI

Bam

HI

EcoRI

EcoRI

9

Steril kabin içerisinde kullanılan pens ve bistüri gibi metal ekipmanların steril

edilmesinde ise %70’lik (v/v) etil alkol ve doğal gaz alevi kullanılmıştır. Eksplantların

kesiminde kullanılan bistüri ucu gerekli görüldükçe özel koruması içindeki yeni steril uç

takılarak değiştirilmiştir.

Besin ortamı ve kültür koşulları

Denemelerde MS mineral tuz ve vitaminleri (Murashige ve Skoog 1962) (Çizelge 1) ile

%3 sukroz içeren ve %0.7’lik agar (Type A) ile katılaştırılan temel besin ortamı (MS0)

kullanılmıştır. Ortam hazırlığında çift distile saf su kullanılmış olup, besin ortamının

pH’sı 1 N NaOH ya da 1 N HCl kullanılarak 5.8’e ayarlandıktan sonra 1.2 atm. basınç

altında ve 120°C’de 20′ tutularak sterilizasyon sağlanmıştır. Tüm kültürler beyaz

floresan ışığı altında 16 saat ışık ve 8 saatlik karanlık fotoperiyotta 25°C’de

tutulmuşlardır. Her muamele, içerisinde 10 adet eksplantın bulunduğu 3 tekrarlamalı

100x10 mm’lik Petri kutularından oluşmuştur.

Çizelge 1. MS (Murashige ve Skoog) ortamında bulunan maddeler ve yoğunlukları

Ortamda Bulunan Maddeler Konsantrasyonu (mg/l)

Makro Elementler NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4

1650 1900 440 370 170

Mikro Elementler Kl H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O

0.83 6.2

22.3 8.6

0.25 0.025 0.025 27.8 37.3

Vitaminler

Inisitol Nicotinic Acid Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl Glycine

100 0.5 0.5 0.1 2

10

Mikroprojektillerin hazırlanması

Çalışmanın planlanmasında mikroprojektil olarak daha ekonomik olduğundan

eksplantları yaralamak için tungsten, bombardımanla gen aktarımı için tungsten ve altın

partikülleri kullanıldı. Partiküllerin plazmid DNA’sına bağlanmasında Sanford vd

(1987) yönteminden yararlanılmıştır.

� 30 mg partikül (1.6 µm çapında altın partikülleri) 500 µl %100 (v/v) etanol ile 1-2

dakika karıştırıldı.

� Ependorf içerisinde bulunan süspansiyon mikrosantrifüjde 1′ boyunca 10 000

devirde santrifüj edildi ve dibe çöken partiküller üzerindeki süpernatant

mikropipet yardımıyla dışarı alındı.

� Ependorfa aynı miktarda etanol eklenerek işlem üç kez tekrarlandı.

� Ortamdan etanolü uzaklaştırmak için ependorfa 500 µl steril distile su eklenerek

süspansiyon santrifüj edildi ve bu işlem iki kez tekrarlandı.

� Ependorfa son hacim olan 500 µl %50 (v/v) filtre sterilizasyon edilmiş gliserol

eklenerek mikroprojektillerin yüzeyleri DNA ile kaplanmaya uygun hale getirildi.

Mikroprojektillerin DNA ile kaplanması

Mikroprojektil olarak kullanılan altın ve tungsten partiküllerinin uniform yapıda olması

ve yıkama işlemleri sonrasında yüzeylerinin DNA ile kaplanmaya uygun hale gelmesi,

makroprojektil birim alanına düşen mikroprojektil/DNA miktarı ve dolayısı ile

bombardıman sonucunda oluşabilecek varyasyonlar açısından büyük önem

taşımaktadır.

Bunun için;

� Yeni bir ependorfa altın süspansiyonundan 50 µl alındı.

� Süspansiyon sürekli karıştırılırken sırasıyla;

- 5 µl DNA,

- 50 µl 2.5 M CaCl2 ve

- 20 µl 0.1 M spermidin (sigma) eklendi.

11

Bu aşamada tüm kimyasalların sırasıyla ve belirtilen konsantrasyonlarda kullanılması

partiküllerin DNA ile birleşmesini ve çalışmanın sonucunda belirlenen gen geçişi

miktarını önemli ölçüde etkilemektedir.

Daha sonra;

� Ependorf kapatılarak 3 dakika karıştırılır.

� Altın partiküllerine DNA kaplanması işlemi ependorfun mikrosantrifüjde 10 000

devir /dakika’da 10′′ süre ile tutulmasıyla tamamlandı.

� Süpernatant kısım mikropipet ile alındıktan sonra ortamda kalmış olabilecek

kimyasalları uzaklaştırmak için mikroprojektiller 250 µl %100 (v/v) etanol ile

karıştırılıp, 10 000 devir/dakika’da 10′′ süre ile tekrar santrifüj edildi.

� Süpernatant kısım alındıktan sonra DNA ile kaplanmış altın partikülleri 60 µl %100

(v/v) etanol içerisinde süspanse edildi.

Makroprojektillerin hazırlanması

Bombardımanda kullanılacak makroprojektillerin hazırlanması için;

� % 70’lik (v/v) etanol ile temizlenen steril kabin içerisinde büyük boy iki petri

kutusuna %100 (v/v) etanol ve izopropanol konuldu.

� Etanol bulunan petriye makroprojektiller, içine makroprojektillerin yerleştirildiği

metal diskler ve koruyucu elekler yerleştirildi.

� İzopropanol bulunan petriye kırılıcı diskler, bombardıman süresince basınç miktarı

değiştikçe gerekli sayıda konuldu.

� Deneyde atışlar altılı gruplar halinde gerçekleştirildi. Kağıt havlu üzerinde el

değmeden steril pens yardımıyla kurulanan metal disklere makroprojektiller

yerleştirilerek özel bir parça yardımıyla tamamen oturmaları sağlandı.

� Petri kutusuna yerleştirilen, makroprojektilleri taşıyan beş metal disk altın

partikülleri yüklenmeye hazır hale getirildi.

� Altın/DNA süspansiyonu devamlı karıştırılırken mikropipet yardımı ile 6 µl alınarak

her bir makroprojektilin ortasına dikkatlice dağıtıldı.

12

� Petri kutusu içindeki makroprojektiller birkaç dakika vakum altında tutularak daha

hızlı kurumaları sağlandı ve nemden dolayı birbirlerine yapışarak kümeleşmeleri

önlendi.

Makroprojektillerin hazırlanması sırasında steril kabin ve cihaz deney için hazırlandı.

Cihazın hazırlanması ve atışın yapılması

Makroprojektillerin hazırlanmasından sonra atışların yapılmasına başlanılmıştır.

Bunun için;

� Önce cihazın bütün parçaları %70’lik (v/v) alkol ve havlu kağıt yardımıyla

temizlendi.

� Helyum tüpü açıldı ve istenilen atış basıncına ayarlandı. Cihazın güvenli

çalışması çin her atış basıncından 200 psi fazlası ayarlandı.

� Uygun kırılıcı disk steril pens ile izopropanol içeren petriden alınarak kağıt havlu

üzerinde yavaşça kurulanıp koruma kabına yerleştirilerek özel aleti ile sabitlendi.

� Mikroprojektil fırlatma düzeneğine ilk önce koruyucu elek kağıt havlu üzerinde

kurulanarak yerleştirildi ve üzerine makroprojektili taşıyan metal disk konarak elle

sabitlendi.

� Mikroprojektil fırlatma grubu cihaz içindeki yerine yerleştirildi.

� 24 saat önceden hazırlanan, ortasına kotiledonların yerleştirildiği petriler uygun

mesafedeki rafa yerleştirilerek bombardıman odasının kapısı kapatılıldı.

� Vakum düğmesine basıldı ve vakum cihazı da açılarak vakum göstergesi 26 mm Hg

düzeyine gelene kadar beklendi.

� Düğme “vac” konumundan “hold” konumuna getirilerek alınan vakumun odada

korunması sağlandı.

� Daha sonra ateşleme düğmesine sürekli olarak basılarak gaz hızlandırma tüpü ile

alınan helyum gazı miktarı helyum basınç ölçeğinden izlenerek atışlar yapıldı.

� Vakum düğmesi “vent” konumuna getirilerek odada bulunan vakumun boşaltılması

sağlandı.

13

� Vakum göstergesi sıfıra geldiğinde odanın kapısı açılarak petri dışarı alındı, kırılıcı

disk ve makroprojektil çıkarılarak yenileri yerleştirildi.

Bombardıman edilen eksplantlar 26oC’deki inkübatörde 48 saat süre ile karanlıkta

bekletilerek, bu süre sonunda gen geçişlerinin belirlenmesi amacıyla X-Gluc

solüsyonuna alındı.

Gen Geçişlerinin Belirlenmesi

Araştırmada markör gen olarak E. coli "β-Glucuronidase (GUS)" geni kullanılmıştır.

Gen geçişlerinin belirlenmesinde, Jefferson (1987) tarafından bildirilen histokimyasal

GUS analizinden yararlanılmıştır. Buna göre, bitki dokuları 100 mM sodyum fosfat

(pH=7.0), 10 mM EDTA, %0.1 Triton X-100 ve 1 mM 5-bromo-4-cloro-3-indolyl

glucuronide (X-GLUC) içeren solüsyonda 37°C’de gece boyu inkübe edilmiştir. Daha

sonra dokular %70’lik alkolde yıkanarak, gen geçişlerinin göstergesi olarak kabul

edilen, mavi noktalar sayılmıştır.

Gen aktarımını takiben, kullanılan gene bağlı olarak (ilk planda “hygromycin

phosphotranferase” geni) seçici ortamda bitki rejenerasyonu çalışmaları yapılmıştır. Bu

amaçla, gerek sürekli seleksiyon, gerekse aralıklı seleksiyon teknikleri araştırılarak

rejenerasyonun başlamasını takiben bitkilerin seyreltilmesi, toprağa aktarımı,

aklimitizasyonu gibi standart uygulamalar kullanılarak tüm bitki oluşumu sağlanmıştır

(Özgen ve ark., 1998).

Bombardımandan 48 saat sonra gen geçişlerinin belirlenmesi amacıyla eksplantlar

Jefferson (1987) yönteminden yararlanılarak X-GLUC solüsyonuna alınmıştır.

50 ml X-Gluc solüsyonu hazırlamak için bir behere sırası ile,

� 5 ml EDTA,

� 5 ml potasyum ferrisiyanid,

� 5 ml potasyum ferrosiyanid,

� 25 ml Buffer,

0,2 M Na2HPO4 = 15,25 ml

0,2 M NaH2PO4 = 9,75 ml

14

� 500 µl Triton X-100

� 25 mg X-Gluc (tartılarak 500 µl DMF içinde çözüldü.)

� 9 ml steril distile su eklendi.

� Petri kutuları steril kabin içerisinde açılarak kotiledonlar 10 ml’lik cam tüplere

alındı.

� Kotiledonların yüzeyini örtecek şekilde her tüpe solüsyon eklendi.

� Tüpler vakum cihazına yerleştirilerek 10′′ süre ile hava kabarcıklarının dışarı

alınması ve böylece kotiledonların yüzeyi ile solüsyon temasının daha iyi olması

sağlandı.

� Tüpler, ağızları kapatılarak ışık almayacak şekilde bir kutuya yerleştirildi.

� 24 saat süre ile 37 oC’de inkübatörde bekletildi.

� Bu süre sonunda tüpler açılarak X-Gluc solüsyonu mikropipet yardımıyla dışarı

alındı ve bir defa steril distile su ile yıkama sonrası % 70 (v/v) etanol eklendi.

� Kotiledonlar mikroskop altında birer birer incelenerek gözlenen mavi nokta sayıları

kaydedildi.

Fotoğraf çekimleri

Mavi nokta gözlenen kotiledonların fotoğraflarının çekimi için dijital fotoğraf makinası

(Nikon D100) kullanıldı ve görüntüler bilgisayara aktarıldı.

Verilerin değerlendirilmesi

Çalışmanın sonuçları, elde edilen mavi nokta sayıları temel alınarak değerlendirildi

(Ritala vd 1994). X-Gluc solüsyonuna alınan embriyolardan ve yapraklardan yalnızca

gen aktarımı gerçekleşenlerde mavi nokta oluşumu gözlenebilmektedir. Bu embriyolar

ve yapraklar mikroskop altında incelenerek mavi nokta sayıları kaydedildi. Deneyler

için ayrı ayrı tablolar oluşturularak her petride bulunan 50 embriyo ve 14 yaprak başına

yapılan atışlardan elde edilen sonuçlarla mavi noktalı embriyo ve yaprak sayısı ve

yüzdesi, mavi nokta sayısı ve embriyo ve yaprak başına düşen mavi nokta sayıları

hesaplanmıştır. Bombardıman başarısı mavi noktalı embriyo sayısı ve bundan

hesaplanan mavi noktalı embriyo ve yaprak yüzdesi olarak değerlendirilmiştir. Atış

15

yapılan basınç ve mesafeler arasındaki farklılıkların belirlenmesinde Ki-kare

bağımsızlık testinden yararlanıldı.

IV. ANALİZ VE BULGULAR

Bitkisel materyalde genellikle en çok kullanılan basınçlar olan 900, 1100 ve 1550 psi

basınçları ile tahıllarda en çok kullanılan 6, 9, 12 cm mesafelerinden atış yapılarak

olgunlaşmış tritikale embriyolarına ve yapraklarına partikül bombardımanı yöntemi ile,

gen aktarımında kullanılabilecek en uygun basınç ve mesafenin bulunmasına

çalışılmıştır.

Bu denemede altınla, 1350 embriyoya atış yapılmış olup, toplam 538 embriyoda 8243

mavi nokta; 378 yaprağa atış yapılmış olup toplam 348 yaprakta ise 6994 mavi nokta

sayılmıştır. Tungstenle yapılan denemende ise, 1350 emriyoya atış yapılmış olup,

toplam 626 embriyoda 6900 mavi nokta, 378 yaprağa atış yapılmış olup toplam 319

yaprakta 3405 mavi nokta sayılmıştır.

50 embriyo başına yapılan atışlardan elde edilen sonuçlar, mavi noktalı embriyo sayısı

ve yüzdesi, mavi nokta sayısı ve embriyo başına düşen mavi nokta sayıları olarak

hesaplanmıştır. Bombardıman başarısı, mavi noktalı embriyo sayısı ve bundan

hesaplanan mavi noktalı embriyo yüzdesi olarak değerlendirilmiştir.

a) Embriyolarda gen geçişleri

Embriyolara altın ile yapılan atışlarda, Çizelge 2’de de görüldüğü gibi, değerlendirme

parametreleri bakımından en iyi sonucu 1100 psi – 6 cm kombinasyonu vermiştir (Şekil

3). En düşük sonuçların ise, 900 psi’lik basınçlarda alındığı belirlenmiştir (Şekil 4).

16

Çizelge 2. Olgun tritikale embriyolarına altın partikülleri ile üç farklı basınç ve uzaklıkta yapılan atışlarda elde edilen mavi nokta değerlerine ait Duncan testi sonuçları

Mavi Nokta / Embriyo Basınç-uzaklık (psi-cm)

Mavi Noktalı Embriyo Sayısı (Adet)

Mavi Noktalı Embriyo Oranı (%)

Mavi Nokta Sayısı (Adet)

Tüm Kültüre Alınan Embriyolarda

Mavi Noktalı Embriyolarda

900-6 15.0 bc 30.0 bc 122.3 c 2.4 b 9.1 c 900-9 16.0 bc 32.0 bc 202.3 bc 3.3 b 10.5 bc 900-12 11.6 c 23.3 c 152.0 bc 3.0 b 12.9 abc 1100-6 30.3 a 60.6 a 581.0 a 11.6 a 17.7 ab 1100-9 16.0 bc 32.0 bc 292.0 abc 5.8 ab 18.2 a 1100-12 15.0 bc 30.0 bc 185. 0 bc 3.7 b 12.6 abc 1550-6 26.0 ab 53.0 ab 364.0 abc 5.6 ab 14.0 abc 1550-9 26.0 ab 52.3 ab 450.3 ab 8.9 ab 16.9 ab 1550-12 23.3 abc 46.6 abc 432.0 ab 8.6 ab 18.5 a

Şekil 3. Embriyolara 1100 psi basınç ve 6cm mesafeden altın partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri

17

Şekil 4. Embriyolara 900 psi basınç ve 6cm mesafeden altın partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri

Aynı eksplantlarda tungsten kullanılması durumunda atış parametreleri bakımından

fazla değişiklik olmamış, 1100 psi – 9 cm kombinasyonunun (Çizelge 3, Şekil 5) en

yüksek değeri vermesine karşın 900 psi’lik basınçların da uygun olmadığı görülmüştür.

Çizelge 3. Olgun tritikale embriyolarına tungsten partikülleri ile üç farklı basınç ve uzaklıkta yapılan atışlarda elde edilen mavi nokta değerlerine ait Duncan testi sonuçları

Mavi Nokta / Embriyo Basınç-uzaklık (psi-cm)

Mavi Noktalı Embriyo Sayısı (Adet)

Mavi Noktalı Embriyo Oranı (%)

Mavi Nokta Sayısı (Adet)

Tüm Kültüre Alınan Embriyolarda

Mavi Noktalı Embriyolarda

900-6 25.0 bc 50.0 bcd 208.3 bcd 4.1 bcd 8.0 bcd 900-9 20.3 cd 40.6 cd 125.0 d 2.5 d 5.9 cd 900-12 16.0 d 32.0 d 92.0 d 1.8 d 5.7 cd 1100-6 18.3 cd 36.6 d 226.0 bcd 4.5 bcd 12.5 ab 1100-9 34.3 a 68.6 a 535.0 a 10.7a 15.0 a 1100-12 18.0 cd 36.0 d 191.3 cd 3.8 cd 10.9 abc 1550-6 28.3 ab 56.6 abc 392.0 abc 7.8 abc 13.3 ab 1550-9 31.0 ab 65.3 ab 429.0 ab 8.5 ab 13.8 ab 1550-12 17.3 cd 34.6 d 101.3 d 2.0 d 5.8 d

18

Şekil 5. Embriyolara 1100 psi basınç ve 9cm mesafeden tungsten partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri

Embriyolarda altın ve tungsten partikülleri, gen geçişlerindeki etkisi bakımından

karşılaştırıldığında (Çizelge 4), altında en iyi sonucu veren 1100psi-6cm

kombinasyonunda altının tungstene oranla önemli düzeyde (χ2 = 10.58**) farklı olduğu;

tungstenin en iyi sonucu verdiği 1100psi-9cm kombinasyonunda ise, tungstenin altına

göre önemli (χ2 = 25.32**) düzeyde farklı olduğu belirlenmiştir.

Çizelge 4. Embriyolarda gen geçişleri bakımından altın ve tungsten partiküllerinin karşılaştırılması Basınç-mesafe Psi-cm

Mavi Noktalı Embriyo Oranı (%)

Altın

Mavi Noktalı Embriyo Oranı (%)

Tungsten

Ki-Kare

900-6 30.0 50.0 7.50**

900-9 32.0 40.6 1.22

900-12 23.3 32.0 1.48

1100-6 60.6 36.6 10.58**

1100-9 32.0 68.6 25.32**

1100-12 30.0 36.0 0.564

1550-6 53.0 56.6 0.134

1550-9 52.3 65.3 2.97

1550-12 46.6 34.6 2.508

19

b) Yapraklarda gen geçişleri Yapraklara altın ile yapılan atışlarda, Çizelge 5’de de görüldüğü gibi, değerlendirme

parametreleri bakımından en iyi sonuçları 1550psi-12cm, 1100psi-9cm ve 1100psi-

12cm kombinasyonları vermiştir (Şekil 6). En düşük sonuçların ise, 1550psi-6cm

kombinasyonundan alındığı belirlenmiştir (Şekil 7).

Çizelge 5. Tritikalede yaprak eksplantlarına altın partikülleri ile üç farklı basınç ve uzaklıkta yapılan atışlarda elde edilen mavi nokta değerlerine ait Duncan testi sonuçları

Mavi Nokta / Yaprak Basınç-uzaklık (psi-cm)

Mavi Noktalı Yaprak Sayısı (Adet)

Mavi Noktalı Yaprak Oranı (%)

Mavi Nokta Sayısı (Adet)

Tüm Kültüre Alınan Yapraklarda

Mavi Noktalı Yapraklarda

900-6 13.0 a 92.8 a 189.0 ab 13.4 ab 14.5 a 900-9 13.0 a 92.8 a 266.3 ab 19.0 ab 20.4 a 900-12 13.0 a 92.8 a 268.3 ab 19.1 ab 20.5 a 1100-6 13.6 a 97.6 a 282.6 ab 20.1 ab 20.7 a 1100-9 13.3 a 95.2 a 313.6 ab 22.4 ab 23.4 a 1100-12 13.3 a 95.2 a 329.0 ab 23.4 ab 24.6 a 1550-6 11.3 b 80.9 b 161.6 b 11.5 b 14.3 a 1550-9 11.3 b 80.9 b 184.6 ab 13.1 ab 17.1 a 1550-12 14.0 a 100.0 a 336.0 a 23.9 a 23.9 a

Şekil 6. Yapraklara 1550 psi basınç ve 12cm mesafeden altın partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri

20

Şekil 7. Yapraklara 1550 psi basınç ve 6cm mesafeden altın partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri

Yaprak eksplantlarda tungsten kullanılması durumunda bu kez, atış parametreleri

bakımından, 1550 psi – 9 cm kombinasyonunun (Çizelge 6, Şekil 8) en yüksek değeri

vermesine karşın 900 psi-12cm’lik kombinasyonun en düşük değerleri verdiği

gözlenmiştir (Şekil 9).

21

Çizelge 6. Tritikalede yaprak eksplantlarına tungsten partikülleri ile üç farklı basınç ve uzaklıkta yapılan atışlarda elde edilen mavi nokta değerlerine ait Duncan testi sonuçları

Mavi Nokta / Yaprak Basınç-uzaklık (psi-cm)

Mavi Noktalı Yaprak Sayısı (Adet)

Mavi Noktalı Yaprak Oranı (%)

Mavi Nokta Sayısı (Adet)

Tüm Kültüre Alınan Yapraklarda

Mavi Noktalı Yapraklarda

900-6 11.6 ab 83.3 ab 113.0 ab 8.0 ab 10.5 a 900-9 12.3 a 88.0 a 69.3 ab 4.9 ab 5.5 a 900-12 8.6 b 61.8 b 36.3 b 2.5 b 4.0 a 1100-6 12.3 a 88.0 a 188.6 ab 13.4 ab 15.2 a 1100-9 11.3 ab 80.9 ab 112.3 ab 8.0 ab 10.4 a 1100-12 11.3 ab 80.9 ab 101.3 ab 7.2 ab 8.9 a 1550-6 12.3 a 88.0 a 170.6 ab 12.1 ab 13.4 a 1550-9 13.3 a 95.2 a 223.3 a 15.9 a 16.9 a 1550-12 13.0 a 92.8 a 120.0 ab 8.5 ab 9.2 a

Şekil 8. Yapraklara 1550 psi basınçta ve 9cm mesafeden tungsten partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri

22

Şekil 9. Yapraklara 900 psi basınçta ve 12cm mesafeden tungsten partikülleri kullanılarak yapılan atışlarda gen geçişleri

Yapraklarda altın ve tungsten partikülleri, gen geçişlerindeki etkisi bakımından

karşılaştırıldığında (Çizelge 7), altında en iyi sonucu veren 1100psi-9cm ve 1100psi-

12cm kombinasyonlarında kombinasyonunda altının tungstene oranla önemli düzeyde

(χ2 = 8.40**) farklı olduğu; tungstenin en iyi sonucu verdiği 1550psi-9cm

kombinasyonunda ise, tungstenin altına göre önemli (χ2 = 8.40**) düzeyde farklı

olduğu belirlenmiştir.

Çizelge 7. Yapraklarda gen geçişleri bakımından altın ve tungsten partiküllerinin önemi Basınç-mesafe Psi-cm

Mavi Noktalı Yaprak Oranı (%)

Altın

Mavi Noktalı Yaprak Oranı (%)

Tungsten

Ki-Kare

900-6 92.8 83.3 3.432

900-9 92.8 88.0 0.83

900-12 92.8 61.8 25.642**

1100-6 97.6 88.0 5.534*

1100-9 95.2 80.9 8.404**

1100-12 95.2 80.9 8.404**

1550-6 80.9 88.0 1.416

1550-9 80.9 95.2 8.404**

1550-12 100.0 92.8 2.866

23

V. SONUÇ VE ÖNERİLER

Tritikale (x Triticosecale Wittmack)’nin olgun embriyolarına ve kotiledon yapraklarına

partikül bombardımanı tekniği ile gen aktarmada kullanılabilecek en uygun

parametreleri belirlemek amacıyla yürütülen bu çalışmada, olgun embriyolar ve

kotiledon yapraklar, β-glucuronidase (GUS) genini içeren plasmidlerle kaplanmış

hızlandırılmış altın ve tungsten partikülleri ile bombardıman edildi. Hedef eksplantlara

olan farklı uzaklıklar (6, 9, 12, cm) ve farklı basınçlar (900, 1100, 1550 psi) fiziksel

parametreler olarak kullanıldı. Gen geçişlerinin olduğu mavi hücreler histokimyasal

analiz ile belirlenerek, mavi noktalara ilişkin verilerden, gen geçişlerinin etkinliğinin

belirlenmesinde uygun bir ölçüt olarak yararlanıldı. Yapılan istatistiksel analizler

sonucunda;

• Tritikaleye partikül bombardımanı yöntemi ile gen aktarmada olgun embriyo ile

kotiledon yaprakların her ikisinin de başarıyla kullanılabileceği,

• Olgun embriyoların eksplant olarak kolay elde edilebilmesi, rejenerasyonunun daha

başarılı olması ve gen geçişleri (mavi nokta oluşturma) bakımından biraz daha

avantajlı olması nedenleriyle tercih edilebileceği,

• Altın ve tungsten partiküllerinin her ikisinin de gen geçişlerinde başarıyla

kullanılmasına karşın, altının dokulara toksik etki yapmama özelliğinin olduğu;

buna karşın pahalıya mal olduğu; tungstenin ise ucuz fakat ileri dönemlerde toksik

etki yapabileceği düşünülerek kullanımda karar verilmesi gerektiği,

• Olgun embriyoların ve altın partiküllerinin kullanılması durumunda, atış

parametreleri olarak, 1100 psi – 6 cm kombinasyonunun en uygun olduğu,

• Olgun embriyoların ve tungsten partiküllerinin kullanılması durumunda, atış

parametreleri olarak, 1100 psi – 9 cm kombinasyonunun en uygun olduğu,

• Yaprakların ve altın partiküllerinin kullanılması durumunda, atış parametreleri

olarak, 1550 psi – 12 cm kombinasyonunun en uygun olduğu,

• Yaprakların ve tungsten partiküllerinin kullanılması durumunda ise, atış

parametreleri olarak, 1550 psi – 9 cm kombinasyonunun en uygun olduğu,

sonucuna varılmıştır.

24

VI. KAYNAKLAR

AINSLEY, P.J. and ARYAN, A.P., 1998. Efficient plant regeneration system for

immature embryos of triticale (x Triticosecale Wittmack). Plant Growth Regul.

24: 23-30.

BECKER, D., JAHNE, A., ZIMNY, J., LUTTICKE, Z. and LÖRZ, H., 1995.

Production of transgenic cereal crops., Current Issues in Plant Molecullar and

Cellular Biology Proceed. 8. Int. Cong. on Plant Tiss. and Cell Cult., Florence,

Italy, 12-17 June, 1994, pp. 263-269.

BİRSİN, M. and ÖZGEN, M., 2004. A comparasion of callus induction and plant

regeneration from different embryo explants of triticale (x Triticosecale

Wittmacks). Cell. Mol. Biol. Lett., 9 (2): 353-361.

BOHOROVA, N.E., PFEIFFER, W.H., MERGOUM, M., CROSSA, J., PACHECO, M

and ESTANOL, P., 2001. Regeneration potential of CIMMYT durum wheat and

triticale varieties from immature embryos. Plant. Breed., 120 (4): 291-295.

JEFFERSON, R.A., 1987. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion

system. Plant Mol. Biol. Reptr., 5: 387- 405.

KLEIN, T.M., WOLF E.D., WU R. and SANFORD J.C., 1987. High-velocity

microprojectile for delivering nucleic acids into living cells. Nature, 327: 70-73.

LONSDALE, D., ÖNDE, S., AND CUMING, A., 1990. Transient expression of

exogenous DNA in intact, viable wheat embryos following particle

bombardment. Journal of Experimental Botany, 41(230); 1161-1165.

MCCABE, D.E., SWAIN, W.F., MARTINELL, B.J. and CHRISTOU P., 1988. Stable

information of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Bio/Technology,

6: 923-926.

MURASHIGE, T. and SKOOG, F., 1962. A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant., 15:473-497.

25

ÖNDE, S., SANCAK, C., ALTINOK, S., BİRSİN, M. And ÖZGEN, M., 2001.

Transient expression of β-glucuronidase in sainfoin (Onobrychis viciifolia

Scop.) via microprojectile bombardment. Tr. J. Biology., 25: 171-176.

ÖZGEN, M., TÜRET, M., ALTINOK, S. and SANCAK, C., 1998. Efficient callus

induction and plant regeneration from mature embryo culture of winter wheat

(Triticum aestivum L.) genotypes. Plant Cell Reports, 118: 331-335.

ÖZGEN, M., ÖNDE, S., TÜRET, M., SANCAK, C., ALTINOK, S., AVCI, M.,

YILDIZ, M., ve DRAPER, J., 1998. Bakterilerden (Agrobacterium tumefaciens)

ve hızlandırılmış partiküllerden yararlanılarak bazı tarla bitkilerine gen

aktarılması üzerine araştırmalar. Basılmış Proje Raporu, Ankara, Proje No:

TOGTAG / 1285.

PADMAJA, G., REDDY, V.D. AND REDY, G.M., 1992. Somatic embryogenesis and

plant regeneration from mature embryo callus cultures of triticale. Indian J. Exp.

Biol. 30: 181-184.

RITALA, A., ASPEGREN K., KURTEN, U., SALMENKALLIO-MARTTILA, M.,

MANNONEN, L., HANNUS, R., KAUPPINEN, V., TEERI, T. H. and ENAR,

T. M., 1994. Fertile transgenic barley by particle bombardment of immature

embryos. Plant Molecular Biology, 24: 317-325.

RUBIO, S., JOUVE, N. and GONZALES, J.M., 2004. Biolistic transfer of the gene

uidA and its expression in haploid embryo-like structures of triticale (x

Triticosecale Wittmack). Plant Cell, Tiss. and Org. Cul., 77: 203-209.

SALMON, D.E., 2001. Triticale. Agri – Facts, Agdex 118/20-1: 1-4.

SANFORD, J.C., SMITH, F.D., and RUSSELL, J.A., 1993. Optimising the biolistic

process for different biological applications. Meth. Enzymol. 217: 483-509.

SANFORD, J.C., KLEIN, T.M., WOLF, E.D. AND ALLEN, N., 1987. Delivery of

substance into cells and tissues using a particle bombardment process. J. Part.

Sci. Tech., 5;27-37.

SIRKKA, A. and IMMONEN, T., 1993. Comparison of callus culture with embryo

culture at different times of embryo rescue for primary triticale production.

Euphytica, 70: 185-190.

26

STEELE, R.G.D. and TORRIE, J.H., 1960. Principles and procedures of statistics.

McGraw-Hill Publishing Company, New York.

VIKRANT, and RASHID, A., 2001. Comparative study of somatic embryogenesis from

immature and mature embryos and organogenesis from leaf-base of Triticale.

Plant Cell Tiss. Org. Cul. 64: 33-38.

ZIMNY, J. and LÖRZ, H., 2000. Transgenic Triticale (Triticum durum x Secale

cereale). Biotec. Agric. Forest. 46: 109-126.

ZIMNY, J., BECKER, D., BRETTSCHNEIDER, R. and LORZ, H., 1995. Fertile

transgenic triticale (x Triticosecale Wittmack). Molecular Breeding, 1 (2): 155-

164.

ZIMNY, J., SOWA, S., MENKE, I., CZPLICKI, A. and OLESZCSUK, S., 2000. Ten

generations of transgenic triticale. Use of Agricuturally Important Genes in

Biotechnology Proceed. NATO Advanced Res. Workshop, Szeged, Hungary,

17-21 Oct., 1999, NATO Science Series A, 319: 103-106.

27

VII. EKLER

a) Mali Bilanço ve Açıklamaları

Malzeme Kodu (Sıra No)

Malzeme Malzeme Miktarı

Ölçü Birimi Tahmini Bedel

Analitik Bütçe Kodu

1 Mini Yatay Elektroforez Seti

1 Adet 220 Sterlin 06-1

2 Scalpel handle 10 Adet 190 €

06-1

3 Scalpel blades 10 Paket 190 € 06-1

4 Forceps 10 Adet 220 € 06-1

5 MS Bitki büyütme ortamı 10 50 L 460 € 06-2

6 6-Benzylaminopurine (BAP)

2 5 g 96 € 06-2

7 Indole-3- acetic acid (IAA) 5g x 2

2 5 g 42 € 06-2

8 Indole-3- butyric acid (IBA)

2 5 g 84 € 06-2

9 1-Naphtalene acetic acid 2 25 g 38 € 06-2

10 Sucrose 6 5 kg 408 € 06-2

11 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

2 100 g 28 € 06-2

12 X - gluc 2 100 mg 212 € 06-2

13 Pcloram 2 5 g 74 € 06-2

14 Thidiazuron 1 250 mg 152 € 06-2

15 Rifampicin 1 1 g 35 € 06-2

16 Kanamycin monosulhate 1 1 g 9 € 06-2

17 Streptomycin sulphate 1 50 g 28 € 06-2

18 Hygromycin B 1 250 mg 189 € 06-2

GENEL TOPLAM

220 Sterlin + 2455 € =

4.480 YTL

Yapılan Harcamalar : 4.480 YTL

Destek Miktarı : 4.480 YTL

28

b) Makina ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar

Proje kapsamında alınan bir adet “Mini Elektroforez Seti”, biyoteknoloji

laboratuvarında halen kullanılmakta olup, bundan sonraki çalışmalarda da kullanılmaya

devam edilecektir.

c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar

Bu kısımla ilgili açıklamalar Materyal ve Yöntem bölümünde verilmiştir.

d) Sunumlar

Bu çalışma aynı zamanda “Yüksek Lisans” tez çalışmasıdır. Tez kabul edildikten sonra

sunulması planlanmaktadır.

e) Yayınlar ve Tezler

Yüksek Lisans tezi olarak hazırlanmaktadır. Tez kabul edildikten sonra yayın

çalışmalarına başlanılacaktır.