Técnicas de Biología

Molecular: PCR

Ricardo Molina Gasset

Hospital Virgen de los Lirios

P.C.RP.C.R..""PolymerasePolymerase ChainChain ReactionReaction""

"Reacción en Cadena de la

Polimerasa"

Organización General IndividuoOrganización General Individuo

NúcleoCromosomas (DNA)

CitoplasmaDiferentes orgánulos

Células

Individuo

Órganos

Tejido

Código GenéticoCódigo Genético

DNA RNAProteína

(enzimas, hormonas,

HLA y otros)

A G C T TA G AT A A

A1

A2

A3

Proteína

A1-A2-A3-.......

BasesAminoácidos

Severo Ochoa

Extensión DNA genómico(3.000.000.000 bases)

Extensión DNA genómico(3.000.000.000 bases)

7.500 vol/ 200 páginas

CCATACCCCTAGGTAC

ATGGACCCCTAGGTACATACCCCTAGGTAC

ATACTCCCTAGGTAC

ATACCGGTCCTAGGTAC

CCATACCCCTAGGTAC

ATGGACCCCTAGGTAC

ATACGCCCTAGGTAC

AGTACCCCTAGGTAC

ATTTACCCCTAGGTAC

ATTTACCCCTAGGTAC

ATTTACCCCTAGGTAC

ATTTACCCCTAGGTAC 2.000 caracteres/página

Transmisión deTransmisión de la información genéticaTransmisión de la información genética

ADN

ARN

ARN mensajero

ARN mensajero

Proteína

Núcleo

Citoplasma

Transcripción

Procesamiento

Transporte

Traducción

Síntesis de ADN complementarioSíntesis de ADN complementario

ADN

ARN mensajero

Transcripción Retrotranscripción

A G C T T A T G A T A AA G C T T A G CA T A A T G A

Pares de bases

Adenosina-Timidina Guanosina-Citidina

Enlaces entre basesEnlaces entre bases

Análisis genéticoAnálisis genético

Sangre Leucocitos

Técnica

PCR

DNA

DetecciDeteccióónn

del ADNdel ADN

SecueciacSecueciacííonon

RFLPRFLP

SouthernSouthern

• Medicina·Virología, Bacteriología·Genética, Oncogenes·Tipaje HLA y Paternidad·Medicina Forense

• Farmacología, Biología, Veterinaria...

• Antropología, Arqueología...

• Análisis Medioambiental

Usos de la P.C.R.Usos de la P.C.R.

• EspecificidadSólo se amplifica lo determinado por los "primers“

• SensibilidadDetecta 1 molécula amplificándola hasta obtener millones de copias

• RapidezObtención de Resultados en pocas horas

Ventajas de la P.C.R.Ventajas de la P.C.R.

• Paso 1: Obtención del DNA• Paso 2: Desnaturalización del DNA• Paso 3: Amplificación DNA• Paso 4: Terminación ciclo• Paso 5: Detección

PCR

“Sistemática de trabajo con DNA“:PCR

“Sistemática de trabajo con DNA“:PCR

• Procedencia

• Calidad

• Métodos

• Conservación del DNA

Extracción de DNAExtracción de DNA

Sangre entera (EDTA)

Plasma (EDTA) o suero generalmente en virología

Células aisladas (Mononucleares, en cultivo)

Tejidos (Congelar en nítrógeno líquido lo más rápido posible para evitar la

degradación del RNA o DNA)

Líquidos biológicos

Orina o exudado cervical (C. trachomatis o N. gonorrhorae)

Líquido amniótico para diagnóstico prenatal

LCR

Líquido pleural – para el diagnóstico de metástasis cancerosas o

enfermedades linfoproliferativas

Tipos de muestrasTipos de muestras

Muestras de la pared bucal – para obtener muestras de DNA

Médula ósea – para dg de enf. Linfoproliferativas o la detección

de metástasis cancerosas.

Esputo – para la detección de Mycobacterium tuberculosis

Pus – estudio de bacterias

Tejidos parafinados o fijados.

Muestras de sangre en papel Guthrie

Tipos de muestrasTipos de muestras

Sangre entera

Tejidos – procesar rápidamente , si no se puede lo mejor es sumergirlo 15-

20s seg en nitrógeno líquido y después conservar a –70ºC hasta la

extracción de DNA. Si no tengo –70, lo corto en pedacitos pequeños para

asegurarme una rápida congelación

Plasma o suero – congelar a –70 o –20 en alícuotas

Orina – estable para C. trachomatis y N. gonorreae por 4 días a 4ºC y 60

días si se congela

Exudado cervical - en medio de transporte se conserva igual que orina.

Conservación de las muestrasConservación de las muestras

Bucal . En general estable a Tª ambiente, pero es conveniente realizar la

extracción lo antes posible por las bacterias contaminantes

Líquido amniótico. Se procesa enseguida. Si no es posible,congelar el

pellet celular .

Médula ósea y líquido pleural. No debe congelarse (x hemo) se puede

refrigerar a 4ºC por menos de 72 horas pero lo ideal es procesarla

enseguida

Esputo – guardar a 2-8 ºC hasta ser procesada pero debe hacerse

dentro de las 24 horas de la recolección (decontaminación y

concentración) .

Pus, se puede refrigerar o congelar si no tiene hematies.

Tejido fijado . Especímen de último recurso.

Conservación de las muestrasConservación de las muestras

Es Importante Diferenciar dos Conceptos

• Extracción: sacar los componentes desde un compartimento celular. Involucra:

– Lisis de las células que contienen a los AN

– Inactivación de nucleasas

– Clarificación: separación de los AN de los restos celulares (debris).

• Purificación: Separación de AN:– De proteínas solubles

– De otros AN no deseados

– De Lípidos, carbohidratos

– De sales y otros compuestos orgánicos

EL PROBLEMA

Para muchas aplicaciones que involucran manipulación de ADN

es necesario disponer de éstos en estado puro.

• Por qué purificar?

Nucleasas que se liberan al lisar las células degradan los ácidos

nucléicos.

Interferentes que inhiben a las enzimas que se usan en

ingeniería genética.

El desafío es separar los ácidos nucléicos deseados desde una

mezcla compleja, manteniendo la integridad de los mismos

Contaminantes: Proteínas, lípidos y carbohidratos, sales del

medio, iones, etc.

Disgregación o fragmentación del tejido

Lisis celular

Clarificación

Purificación

AnálisisCualitativo:

electroforesis

Cuantitativo:

espectrofotometría

UV

Etapas bEtapas báásicas de un procedimiento general para sicas de un procedimiento general para

ExtracciExtraccióón y Purificacin y Purificacióón de ANn de AN

Estas etapas

deben ir

acompañadas de

medidas o

agentes que

inactiven

nucleasas

celulares

Durante todo el

procedimiento se

debe usar

soluciones y

material estéril, ademas

de guantes

1. M1. Méétodos de fragmentacitodos de fragmentacióón y lisis celular n y lisis celular para la extraccipara la extraccióón de ADNn de ADNEl procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria pEl procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para ara

romper el material de inicio (cromper el material de inicio (céélulas o tejido) y la delicadeza requerida lulas o tejido) y la delicadeza requerida

para preservar las molpara preservar las molééculas de interculas de interéés (ADN o ARN). s (ADN o ARN).

• Métodos físicos– Homogenización mecánica,

– Homogenización en solución

– Molienda manual en mortero

– Bolitas de vidrio

– Sonicación

• Métodos químicos- Detergentes

• Métodos enzimáticos– Lysozima: rompe enlaces β-1.4- entre N-acetil murámico y N-acetil glucosamina de peptidoglicánde la pared celular de bacterias

– Lyticasa: rompe enlaces β-1.3 de glucano de levaduras

– Proteasas: rompe enlaces peptídicos de prot. de pared y membrana plasmática e interacciones célula-célula.

Ruptura de células por medios físicosTable 1. Techniques used for the physical disruption of cells.

Lysis Method Description Apparatus

Mechanical Waring Blender Polytron

Rotating blades grind and disperse cells and tissues

Liquid Homogenization

Dounce Homogenizer Potter-Elvehjem Homogenizer French Press

Cell or tissue suspensions are sheared by forcing them through a narrow space

Sonication Sonicator High frequency sound waves shear cells

Freeze/Thaw Freezer or dry ice/ethanol

Repeated cycles of freezing and thawing disrupt cells through ice crystal formation

Manual grinding Mortar and pestle Grinding plant tissue, frozen in liquid nitrogen

Homogenizador

Dounce

Homogenizador

mecánico - polytron

Sonicador

MMéétodos para todos para lisarlisar ccéélulaslulas

Otros componentes de una soluciOtros componentes de una solucióón de lisisn de lisis

Debe Incluir

•Etilen diamino tetracetico (EDTA).

•Quelante de iones Mg2+, baja la concentación

efectiva de este ión.

•Por lo tanto, EDTA inhibe nucleasas y minimiza

la degradacion de AN durante la

extración/purificación.

• Amortiguador de pH (7-8).

2. Clarificaci2. Clarificacióón. Eliminacin. Eliminacióón de restos n de restos celulares (celulares (debrisdebris))

– Centifugación

– Filtración

–Método mixto: enzimas + centrifugación

3. Purificaci3. Purificacióónn• Desproteinización con fenol, que al desnaturalizar lasproteínas causa su precipitación.

• Precipitación de proteínas con sales (“salting out”)

• Cromatografía

– De intercambio iónico

– De adsorción a sílica

– De filtración

• Extracción de DNA desde un gel

de agarosa

ExtracciExtraccióónn FenFenóólicalica de de proteproteíínasnas

fenol

CromatografCromatografíía de intercambio ania de intercambio anióóniconico

CromatografCromatografíía de intercambio ania de intercambio anióóniconico

CromatografCromatografíía de intercambio ania de intercambio anióóniconico

CromatografCromatografíía de adsorcia de adsorcióónn

CromatografCromatografíía de a de adsorcionadsorcion

DNA eluye de

la sílica en

agua

DNA se une

a la sílica

en NaI

MetodosMetodos magnmagnééticosticos

DNA es insoluble en solución alcohólica

Longitud de onda

•Razón Abs230/Abs260 debe ser menor de 0.5 (> sugiere

contaminación con fenol/CHCl o carbohidratos).

•Razón Abs260/Abs280 debe ser ~1.8 (< sugiere contaminación con

proteínas,

•Abs320 se debe a difracción de la luz por material particulado en la

muestra. Debería ser baja.

Análisis espectrofotométrico de ADNAnAnáálisislisis espectrofotomespectrofotoméétricotrico de ADNde ADN

• Cantidad de material de partida

– Número de copias de las moléculas de AN

– Cantidad de tejido

• Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado)

• Contaminantes e interferentes en el material biológico

• Hay un compromiso entre rendimiento/calidad/pureza

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificadosFactores que afectan el rendimiento, Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificadoscalidad y pureza de los AN purificados

El DNA purificado es relativamente estable si se encuentra en

un buffer libre de DNAsas.

Se ha visto que es estable a 4ºC por 3 años.

Los ciclos de congelado-descongelado dañan el DNA por lo

cualse recomienda alicuotar las muestras.

Tips de punta estrecha pueden cortar hebras de DNA cuando se

trabaja en solución.

Conservación de las muestras de ADNConservación de las muestras de ADN

• ADN polimerasa termoestable

• Oligonucleotidos iniciadores (“primers”)

• Desoxiribonucleótidos trifosfatados(dNTPs)

• Cationes divalentes

• Buffer (para mantener el pH)

• ADN molde (Templado)

Componentes de la PCRComponentes de la PCR

• Llevan a cabo la síntesis de ADN

dependiente del templado.

• Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C,

Pwo >2 hr a 100°C

• Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta

• Cantidad usada = 5 x 1012 moleculas (0.5 unidades)

• La más comunmente usada = Taq ADN polimerasa

PolimerasasPolimerasas

PolimerasasPolimerasas

> 50+-Maritima de

ThermotogaTma

400 +-Litoris de

ThermusTli

20 -+Themus

thermophilusrTth

--Thermas

flavusTfl

N/AN/AN/A+-Woesei de

PyrococcusPwo

1 en 1.3 x 10^6 60120 +-Furiosus de

PyrococcusPfu

1 en 10^3 7540 -+Thermus

AquaticusTaq

Error

Velocidad

extensión

(nucleosides/s)

período

95°C

(minuto)

3' -- 5 '

Exonuclease

Actividad

5' -- 3 '

Exonuclease

Actividad

Fuente

Biológica

Polimerasa

de la DNA

• Se conoce su secuencia

• Factor más importante para la eficiencia y la especificidad del proceso

• Deben estar presentes en exceso

• Requieren de un cuidadoso diseño:(a) longitud = 18-25

(b) Contenido de G+C entre 40-60%

(c) Evitar las secuencias repetidas

(d) Valores de Tm de no más de 5°C uno del otro

OligonucleótidosOligonucleótidos

• Puede ser cadena simple o doble

• ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal

• Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg of plasmídico

• Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

ADN molde (templado)ADN molde (templado)