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Técnicas de inmunomarcaje a nivel ultraestructural
Immunolabeling techniques at the ultrastructural level
Judith García Cabrero
Departamento de Morfología y Biología Celular
Julio 2015
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Resumen
La necesidad de los investigadores por encontrar el método más adecuado para observar la estructura celular y tisular no ha dejado de aumentar desde la invención del primer microscopio óptico a principios del siglo XVII. Además, el interés por marcar una zona concreta de la muestra ha sido el origen de las técnicas actuales de inmunomarcaje. Por otro lado, las limitaciones del microscopio óptico condujeron a la invención de la microscopía electrónica.
En este trabajo se recogen las características, ventajas e inconvenientes de un conjunto de técnicas que son compatibles con el inmunomarcaje y permiten la observación ultraestructural de las muestras biológicas con el microscopio electrónico. Aunque el orden de las etapas es distinto en cada uno de los métodos, todos ellos incluyen la fijación, el marcaje, el seccionamiento y la visualización del tejido.
Por un lado, los principales métodos convencionales son preinclusión y postinclusión, mientras que por el otro, se comentan un conjunto de alternativas basadas en la congelación de la muestra. Entre estas últimas estrategias existe una gran variedad de combinaciones en las que se relacionan diferentes técnicas. Así, en algunas se lleva a cabo la criofijación de la muestra, mientras que en otras se incluye la misma en resina.
Para el inmunomarcaje a nivel ultraestructural es aconsejable utilizar partículas de oro como marcador, ya que son muy electrodensas y pueden adaptarse a diferentes condiciones según el tipo de estudio. El inmunomarcaje con oro también puede ser aplicado a microscopía óptica, de manera que se pueden aprovechar las ventajas de ambos tipos de microscopios para facilitar el estudio de las muestras.
Abstract
The need of researchers to find out the better method to examine the tissue and cellular structure has not stopped growing since the first light microscope discovery in the early 17th century. Furthermore, the interest to stain a specific region of the specimen has been the origin of current immunolabeling techniques. Light microscope limitations led to the invention of electron microscopy.
This work collects the features, advantages and pitfalls of several techniques that are compatible with immunolabeling and allow observing the sample at ultrastructural level under the electron microscope. Although the order of steps varies with each method, all of them include tissue fixation, labeling, sectioning and analysis. Nevertheless, embedding in resin is only performed in basic methods due to artefacts generated by this step, which will affect the quality of the final image.
On one hand, the main basic techniques are pre-embedding and post-embedding, while on the other hand, there are a group of alternatives methods based on freezing of the sample. Among these strategies there is a broad variety of combinations that related different techniques. In this way, some of them involve the cryofixation of the sample, while in others the sample is included in resin.
It is recommended to use gold particles as markers for immunolabeling at ultrastructural level because they are sufficiently electron-dense and can adapt to different requirements according to the type of study. Immunogold labeling can also use for light microscopy. In this way, researchers can take advantage of both type of microscopes to make easier the study of samples.
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Índice
1. Introducción.............................................................................................................................. 4
2. Objetivos................................................................................................................................... 5
3. Fijación química......................................................................................................................... 6
4. Medio de inclusión.................................................................................................................... 8
5. Soluciones de bloqueo.............................................................................................................. 9
6. Método de postinclusión........................................................................................................... 9
7. Método de preinclusión............................................................................................................ 9
8. Alternativas a las técnicas básicas........................................................................................... 10
8.1. Criofijación..................................................................................................................... 11
8.1.1. Congelación por inmersión................................................................................... 11
8.1.2. Congelación a alta presión.................................................................................... 12
8.1.3. Congelación rápida autopresurizada..................................................................... 12
8.2. Criosustitución............................................................................................................... 13
8.3. Método de Tokuyasu...................................................................................................... 13
8.4. Técnicas híbridas............................................................................................................ 14
8.4.1. Método de rehidratación...................................................................................... 14
8.4.2. Secciones congeladas vitrificadas......................................................................... 15
8.4.3. Fijación química de secciones vitrificadas............................................................. 15
8.4.4. Inmunomarcaje mejorado para microscopía electrónica integrada...................... 16
8.5. Criofractura.................................................................................................................... 16
9. Inmunomarcaje con partículas de oro..................................................................................... 17
9.1. Oro coloidal.................................................................................................................... 17
9.2. “Clústeres” de oro.......................................................................................................... 19
9.3. Intensificación con sales de plata................................................................................... 20
9.4. Marcaje doble................................................................................................................ 21
10. Observación a microscopía electrónica..................................................................................21
11. Microscopía óptica y electrónica............................................................................................22
12. Discusión............................................................................................................................... 23
12.1. Métodos básicos y alternativas…………………………………………………………………………………24
12.2. Inmunomarcaje………………………………………………………………………………………………………..26
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12.3. Conclusiones…………………………………………………………………………………………………………….26
13. Referencias bibliográficas......................................................................................................27
Abreviaturas de uso frecuente
Ac Anticuerpo (s)
Ag Antígeno (s)
Ig Inmunoglobulina
CLEM Microscopía óptico-electrónica
EM Microscopía electrónica
FM Microscopio de fluorescencia
FRIL Inmunomarcaje con oro para réplicas de superficies criofracturadas
FS Criosustitución
HPF Congelación a alta presión
IEM Inmunomarcaje a microscopía electrónica
iLEM Microscopía electrónica integrada
LM Microscopía óptica
PBS Tampón fosfato salino
PF Congelación por inmersión
ROI Región de interés
SPRF Congelación rápida autopresurizada
TEM Microscopía electrónica de transmisión
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1. Introducción
La inmunocitoquímica es una técnica cuyo principio se centra en la identificación de un
constituyente celular o tisular por medio de reacciones antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), que
pueden visualizarse tanto a LM (del inglés light microscopy, microscopía óptica) como a EM (del
inglés electron microscopy, microscopía electrónica). Para ello, esos Ac se conjugan, directa o
indirectamente, con uno o varios marcadores con el fin de localizar con la mayor precisión
posible el epítopo diana. El éxito de esta técnica depende del mantenimiento de la
antigenicidad, la capacidad de los Ac de penetrar en la célula y, finalmente, del reconocimiento
específico entre los Ag y los Ac primarios. Además, se requiere una adecuada manipulación de
las muestras, la cual incluye la fijación, la selección apropiada de una resina de inclusión y la
disponibilidad de los Ac específicos para las moléculas que se quieren localizar. Finalmente, se
debe tener en cuenta que es necesario conseguir un equilibrio entre la preservación antigénica
y la observación morfológica adecuada (Griffiths, 1993).
La introducción de la EM en los años 70 ha facilitado el estudio, tanto estructural como
funcional, de las células y tejidos a un nivel de resolución totalmente novedoso. Así, se presentan
dos estrategias generales compatibles con el inmunomarcaje a nivel ultraestructural (Fig. 1). En
primer lugar, para buscar Ag intracelulares se pueden aplicar tres protocolos distintos:
postinclusión tras la inclusión en resinas acrílicas, crioultramicrotomía y, por último,
preinclusión. En segundo lugar, para localizar proteínas de superficie celular, el protocolo de
marcaje más conveniente se basa en la preinclusión, ya que los Ag y la ultraestructura se
preservan correctamente (De Paul et ál., 2012).
La preparación básica del material biológico para su observación a EM implica,
independientemente del orden, la fijación química, la deshidratación, la inclusión en resinas, el
inmunomarcaje, el seccionamiento, el montaje en un soporte adecuado y la observación
(Hurbain y Sachse, 2011). Algunas de etapas pueden introducir diferentes artefactos que afecten
a la ultraestructura de la muestra y limiten su resolución (Studer et ál., 2008). Por esta razón, se
han desarrollado diferentes alternativas basadas en la congelación de la muestra.
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Fig. 1. Diferentes métodos de inmunomarcaje para detectar Ag intracelulares y superficiales (modificado de De Paul
et ál., 2012).
Para el marcaje a EM se requieren partículas electrodensas, tales como ferritina, hierro-
dextrano, uranio y oro. De entre todas las opciones disponibles, el inmunomarcaje con oro ha
sido la elección más extendida (Amiry-Moghaddam y Ottersen, 2013) debido a que, mientras
que la EM convencional no aporta información sobre moléculas concretas, el uso del primero
proporciona una estructura visible con una localización y distribución in situ de las partículas en
estudio a alta resolución. El oro en estado coloidal ha sido el marcador de preferencia durante
mucho tiempo, pero actualmente se han desarrollado agrupaciones de átomos de oro más
pequeñas llamadas “clústeres” (Hainfeld y Furuya, 1992). Además, se han diseñado varios
métodos para intensificar la señal de oro, siendo las sales de plata las más utilizadas. Esa
intensificación es necesaria sobre todo en el caso de usar partículas de oro de tamaños muy
pequeños, ya que sin esta mejora serían indistinguibles a EM (Chen et ál., 2008).
2. Objetivos
Los objetivos del presente Trabajo Fin de Grado son los siguientes:
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1) Llevar a cabo una búsqueda exhaustiva en la literatura científica sobre las técnicas
existentes en cuanto a marcaje con Ac en microscopía electrónica.
2) Presentar las características generales de las técnicas, así como los fundamentos y las
utilidades de las mismas.
3) Analizar y comparar los protocolos existentes con el fin de aportar una visión crítica de
estas técnicas.
4) Finalmente, analizar y comentar detalladamente las ventajas y limitaciones de cada una
de ellas en el contexto del análisis ultraestructural y también con respecto a las técnicas
de inmunomarcaje a microscopía óptica.
3. Fijación química
La fijación es un tratamiento que induce el cese de la actividad biológica, así como la
inmovilización de las estructuras celulares y tisulares causando la mínima alteración posible, ya
que se busca el máximo parecido con el estado vivo. Para llevar a cabo los estudios posteriores
de inmunomarcaje, la fijación debe cumplir varios objetivos: la conservación y retención del Ag,
la preservación tanto de la morfología tisular como de la inmunorreactividad del primero y el
mantenimiento de una permeabilidad tisular apropiada tras la actuación de los reactivos. Por
tanto, hay que tener en cuenta varios factores determinantes en el éxito de este procedimiento
(Del Brío León y Riera Rovira, 1995):
− La rapidez de penetración del fijador.
− La inmunorreactividad en el tejido depende del mantenimiento de la estructura
proteica, por lo que cualquier alteración en esta hará que disminuya la primera.
− La reactividad antigénica será mayor cuanto menos tiempo tarde el fijador en actuar.
− La temperatura de fijación.
− La preservación será mejor cuanto más próximo esté el pH del fijador al punto
isoeléctrico de la molécula.
− Puede haber Ag secuestrados en compartimentos, los cuales son más resistentes que
los citosólicos, ya que estos difunden fácilmente.
− Si la osmolaridad del fijador es baja, los enzimas lisosomales difunden provocando el
hinchamiento del tejido, mientras que si es alta se produce su recogimiento.
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Aunque hay muchos tipos de fijadores, la combinación más aceptada para microscopía
inmunoelectrónica se basa en el uso de formaldehído y una baja concentración de
glutaraldehído (Fig. 2). Las moléculas pequeñas, como el formaldehído, penetran con mayor
rapidez que las grandes, como el glutaraldehído, pero concretamente este último tiene un
mayor número de sitios de reacción. Así, el glutaraldehído produce más enlaces cruzados y
estabiliza mejor los componentes celulares, aunque da lugar a una gran pérdida de
inmunorreactividad. (Eldred et ál., 1983).
Fig. 2. Micrografías electrónicas de la capa plexiforme interna de la retina de tortuga preparada para la localización
de la inmunorreactividad del péptido encefalina. En estas figuras el tejido fue tratado con una técnica de congelación-
descongelación para mejorar la penetración, y ninguna fue teñida con metales pesados para permitir una correcta
evaluación del mantenimiento de la inmunorreactividad en los dos tipos de fijación. Procesos de células amacrinas
marcados (A). Contacto sináptico (flecha). (1) Retina fijada en 4% de paraformaldehído a pH 7,4 durante 24 h. Las
membranas celulares están pobremente preservadas y se observan vacuolas u orgánulos dañados. (2) Retina fijada
en 0,1% de glutaraldehído y 4% de paraformaldehído durante 60 min a pH 7,4 seguido de paraformaldehído al 4% pH
7,4 durante 24 h. Después de la fijación la muestra fue tratada con 1% NaBH4 durante 30 min. El tejido está bien
preservado con membranas y estructuras sinápticas claramente definidas. La inmunorreactividad es excelente y está
bien localizada (modificado de Eldred et ál., 1983).
El tetróxido de osmio (Fig. 3) es un fijador muy fuerte que puede desnaturalizar y
enmascarar los epítopos, por lo que al evitar su uso se mantiene la preservación antigénica. Sin
embargo, si se desea obtener un buen contraste en la muestra es esencial el uso de este
compuesto y, además, se aconseja emplearlo cuando la cantidad de Ag es grande. Si se desea
usar el osmio, primero se deben desenmascarar las moléculas antigénicas mediante la
incubación con un oxidante fuerte, como peróxido de hidrógeno, ácido peryódico y
metaperyodato de sodio, para disolver el depósito de ese metal pesado (Hayat, 1991).
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Fig. 3. Sección fina de la aurícula de rata preparada
según el método de postinclusión: fijada con
formaldehído y glutaraldehído, postfijada con
tetróxido de osmio, incluida en resina LR-White, y
grabada con peróxido de hidrógeno. Finalmente,
inmunomarcaje del tejido con oro para identificar el
ANP (del inglés atrial natriuretic peptide, péptido
natriurético atrial) en los gránulos de secreción de
los miocardiocitos (extraído de Maldonado et ál.,
1986).
4. Medio de inclusión
Las resinas epoxi se utilizan como medio de inclusión en la EM convencional, pero no son
apropiadas para el inmunomarcaje a nivel ultraestructural porque son hidrofóbicas y para
polimerizar necesitan altas temperaturas y una deshidratación extrema. Por esta razón, se
desarrollaron las resinas acrílicas, más hidrofílicas y que reaccionan más rápido con la tinción
acuosa básica, lo que las hace más adecuadas para esta técnica. Actualmente, las resinas
acrílicas LR-White (Fig. 3) y Lowicryl son las más frecuentes porque conservan la reactividad
bioquímica en las muestras aunque la estructura final es más pobre que la producida por la
técnica de las resinas epoxi (Zuber et ál., 2005).
En primer lugar, Lowicryl polimeriza a bajas temperaturas, una ventaja ya que favorece la
preservación antigénica, aunque para ello se necesita una cámara especial bajo luz ultravioleta
a -30ºC, condición que es muy tóxica. Por ello, se aconseja emplear esta resina cuando la
concentración de Ag es baja (Maldonado y Aoki, 1986). En segundo lugar, LR-White también
mantiene una buena antigenicidad, pero polimeriza a 50ºC, no necesita equipamiento adicional
y es mucho menos tóxica que la primera. Además, la resina LR-White es estable a los rayos, fácil
de seccionar y tolera la deshidratación parcial aceptando tejidos hasta con un 70% de etanol (De
Paul et ál., 2012).
Por un lado, las resinas acrílicas son más estables y se tiñen con mayor rapidez que las
epoxi. Por otro lado, no van a polimerizar adecuadamente si se contaminan con acetona o son
expuestas al aire. Por esta razón, se aconseja llevar a cabo la deshidratación en concentraciones
crecientes de etanol, la infiltración posterior y la polimerización en cápsulas de gelatina (en
condiciones anaeróbicas) (De Paul et ál., 2012).
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5. Soluciones de bloqueo
A la hora de interpretar las inmunorreacciones a EM, el hecho de controlar los diferentes
sitios que pueden dar lugar a una reacción inespecífica pasa a ser decisivo. Una tinción
inespecífica o de fondo consiste en el resultado positivo de una muestra que no se debe a la
unión Ag-Ac (Del Brío León y Riera Rovira, 1995).
Para evitar este problema, se debe emplear una solución de bloqueo justo antes de la
incubación con el Ac primario. Una solución adecuada es capaz de unirse a todos los sitios con
posibilidad de producir interacciones inespecíficas, de eliminar totalmente el fondo sin alterar
el Ag para la posterior unión del Ac y, además, tiene que interactuar con propiedades tanto
hidrofílicas como hidrofóbicas. Generalmente, se utiliza la combinación de tres proteínas para
obtener un bloqueante apropiado: albúmina de suero bovino (BSA), suero normal de la misma
especie que el Ac secundario y gelatina de pescado al 0,1% (De Paul et ál., 2012).
6. Método de postinclusión
En la técnica de postinclusión (véase protocolo I en Anexos), los Ac primario y secundario
se aplican a las secciones ultrafinas del tejido a estudiar (Fig. 3). Por tanto, solo se pueden
detectar las moléculas antigénicas expuestas en la superficie de la sección porque la resina
restringe su difusión. Esto limita la proporción de Ag disponibles para el marcaje, inconveniente
que se ve compensado por las ventajas del método: conservación de la ultraestructura y
oportunidades de cuantificación excelentes (Amiry-Moghaddam y Ottersen, 2013).
7. Método de preinclusión
Puede ocurrir que las técnicas utilizadas para la inclusión de los tejidos alteren la
antigenicidad de los mismos, por lo que en estos casos se recurre al procedimiento de
preinclusión (véase protocolo II en Anexos) (Del Brío León y Riera Rovira, 1995).
Por un lado, el método permite la inmunodetección de Ag tanto de superficie celular
como de extensiones de membrana, en cuyo caso el inmunomarcaje con oro se realiza antes de
la fijación, lo que proporciona una buena preservación antigénica. Por otro lado, también
permite detectar Ag intracelulares, para lo que es necesario realizar una fijación débil antes del
marcaje. Este último debe llevarse a cabo con partículas de oro ultrapequeñas para que los Ac
puedan penetrar al interior celular. Además, para detectar esas partículas minúsculas al EM, se
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puede realizar una intensificación con plata. El paso siguiente es la inmersión de la muestra en
resinas epoxi, ya que el inmunomarcaje se ha realizado previamente a la inclusión y esta no lo
afecta, independientemente de que lo que se quiera detectar sean Ag celulares externos o
internos (De Paul et ál., 2012).
Se debe tener en cuenta que en todos los procedimientos de preinclusión cuyo fin es
observar Ag intracelulares, el uso de oro como marcador requiere una permeabilización
adecuada que suele reducir la calidad de la ultraestructura. Sin embargo, este método también
tiene ventajas, ya que ofrece una sensibilidad muy alta (Amiry-Moghaddam y Ottersen, 2013)
como se observa en la Fig. 4.
Fig. 4. Micrografía electrónica en la que se observa una preinclusión en el estrato dorsal de un ratón. Se ha realizado
un doble inmunomarcaje con oro para marcar GFAP (del inglés glial fibrillary acidic protein, proteína fibrilar acídica
de la glia) y sinaptofisina y, posteriormente, una intensificación con plata en ambos conjugados. GFAP es marcado
con partículas pequeñas observándose en las células gliales (Gp). Los contornos de las dendritas adyacentes (D) no
presentan partículas inmunomarcadas con oro y plata. Las partículas grandes, que marcan sinaptofisina, se
encuentran entre las vesículas sinápticas de los terminales axónicos (asterisco) (extraído de Yi et ál., 2001).
8. Alternativas a las técnicas básicas
Dentro de este apartado se recogen un conjunto de técnicas en las que la preparación de
la muestra es distinta a los métodos convencionales comentados. Así, en algunas de ellas se lleva
a cabo la reacción inmune sobre cortes que no fueron sometidos a ningún tipo de inclusión, lo
que permite evitar las alteraciones antigénicas generadas durante esta etapa, mientras que en
otras la muestra es fijada (químicamente o por criofijación). Un paso común a todas es la
congelación del tejido, lo que permite endurecerlo sin extraer el agua y obtener cortes
ultrafinos. El inmunomarcaje se realiza en las criosecciones resultantes del uso del
crioultramicrotomo sobre la muestra. Finalmente, se lleva a cabo el contraste y la observación
en el microscopio correspondiente (Martín-Lacave y García-Caballero, 2012).
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En el caso de las muestras que son criofijadas, estas son tratadas según la técnica FS (del
inglés freeze substitution, criosustitución) antes de ser observadas a EM. Por otro lado, el
material biológico puede someterse al método de Tokuyasu o a la criofractura.
8.1. Criofijación
Una alternativa a la fijación química es la criofijación, una técnica de preservación física
cuyo objetivo es vitrificar las células y tejidos mediante una congelación rápida. La vitrificación
es el proceso de transformación de un líquido a su estado amorfo con el fin de evitar la
nucleación y cristalización del agua. Para ello, la muestra se infiltra en sacarosa y, a continuación,
se solidifica en presencia de nitrógeno líquido, cuya temperatura de ebullición es de -196ºC. El
hielo vítreo ocupa el mismo espacio que el agua y tiene un impacto mínimo sobre la
ultraestructura celular (Van Weering et ál., 2010).
El proceso de vitrificación depende de la tasa de refrigeración, la crioprotección y la
presión. La probabilidad de que tenga lugar una vitrificación adecuada aumenta en presencia de
crioprotectores, ya que inmovilizan las moléculas de agua. Aunque las muestras biológicas están
formadas por un 80% de este líquido, las células pueden vitrificarse directamente porque los
componentes intracelulares (proteínas, lípidos, etc.) actúan como crioprotectores naturales que
reducen la tasa de enfriamiento (Mielanczyk et ál., 2014).
Tres tipos de técnicas de este tipo son PF (del inglés plunge freezing, congelación por
inmersión), HPF (del inglés high pressure freezing, congelación a alta presión) y SPRF (del inglés
self-pressurized rapid freezing, congelación rápida autopresurizada).
8.1.1. Congelación por inmersión
Es un método simple que puede utilizarse con muestras de un rango de grosor amplio:
desde macromoléculas y complejos hasta células completas de 10 µm. La PF trabaja bajo
condiciones atmosféricas y permite obtener tasas de enfriamiento suficientemente altas. La
muestra preparada se introduce en un líquido criogénico, como etano, propano o una mezcla
de ambos (Gan y Jensen, 2012). Cualquiera de estos líquidos solidifica cuando entra en contacto
con el nitrógeno líquido, mientras que la mezcla presenta un punto de congelación muy bajo
que la hace más conveniente (Tivol et ál., 2008). Tras la vitrificación, la muestra puede
observarse a -180ºC bajo el crio-EM.
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La evaporación es un factor importante durante la preparación de la muestra, ya que si
no se controla puede modificar la presión osmótica y consecuentemente debilitar la muestra
(Dubochet et ál., 1988).
8.1.2. Congelación a alta presión
El método HPF (Fig. 5) se aprovecha de que la nucleación de los cristales de hielo depende
de la presión y la temperatura (Studer et ál., 2008). Durante el proceso de cristalización, el
volumen de agua se expande. Este aumento del volumen de hielo se puede evitar aplicando una
presión elevada que actúe como crioprotector en contra de la expansión. La presión alta reduce
considerablemente el crecimiento de los cristales y la tasa de nucleación del hielo, por lo que
esta técnica se puede aplicar para congelar por vitrificación muestras de hasta 250 µm de grosor.
Posteriormente, se debe llevar a cabo un enfriamiento utilizando nitrógeno líquido (Gilkey y
Staehelin, 1986).
Fig. 5. Micrografías electrónicas. (A) Músculo esquelético de ratón tras HPF y FS en acetona/tetróxido de osmio e
introducido en resina epoxi. Las características de los filamentos musculares y la mitocondria están claramente
definidos por el uso de alto contraste. (B) Célula de cáncer de mama de la línea PMC42. Tras HPF, las células fueron
FS durante 18 h en metanol e incluidas en Lowicryl HM20. La sección se marcó con un Ac que reconoce la proteína
vimentina del filamento intermedio. El conjugado de oro coloidal fue mejorado con plata durante 12 min (modificado
de Monaghan et ál., 1998).
8.1.3. Congelación rápida autopresurizada
La SPRF es un método nuevo en el que el material es cargado en capilares estándar de
cobre, los cuales se sellan por ambos extremos y son introducidos en nitrógeno, propano o etano
líquidos. Por tanto, este proceso se produce a volumen constante y se basa en el aumento de la
presión cuando el volumen de agua también se eleva durante la solidificación dentro del capilar
cerrado (Leunissen y Yi, 2009).
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8.2. Criosustitución
En la FS (Fig. 5), tras la criofijación del material biológico, se llevan a cabo dos procesos de
manera rápida: congelación y deshidratación a temperaturas bajas (-80ºC). Posteriormente, la
muestra es incluida con fijadores químicos que son inactivos en las condiciones a las que se
encuentra. Tras la difusión de la solución fijadora a lo largo de la muestra, se eleva la
temperatura de manera controlada. Mientras que la temperatura aumenta, los fijadores pasan
a ser químicamente activos y estabilizan los componentes celulares con los que reaccionan
(Dykstra y Reuss, 2003). Finalmente, tras la FS las muestras son incluidas en resina.
8.3. Método de Tokuyasu
El método de Tokuyasu (véase protocolo III en Anexos) permite prevenir la formación de
cristales de hielo infundiendo una fijación química de las células en presencia de sacarosa
(Tokuyasu, 1973), una molécula altamente hidrofílica que a altas concentraciones se une a
suficientes moléculas de agua para evitar que esta adopte su organización cristalina. Por tanto,
como en el caso de la criofijación, también se produce vitrificación (Van Weering et ál., 2010).
En la figura 6 se observan algunos resultados de Loussert Fonta et ál. (2015), quienes aplican
este método en el estudio de las sinapsis asimétricas cerebrales, utilizando para localizarlas el
Ag anti-VGLUT1 (Fig. 6B y 6C) (del inglés vesicular glutamate transporter 1, transportador
vesicular de glutamato 1).
Fig. 6. Micrografías de TEM de cerebro
preparadas con el método de Tokuyasu. (A)
Resumen de tres sinapsis asimétricas (flechas)
en el tejido cerebral. Todas las células presentan
un citoplasma denso y varios orgánulos, como
mitocondrias (cabeza de flecha) y vesículas
(asterisco). (B) El botón presináptico,
enriquecido con vesículas sinápticas (cabezas de
flecha), está separado de la célula postsináptica
por el espacio sináptico (asterisco). Además, se
distingue claramente la densidad postsináptica
(flechas). (C) Micrografía inclinada 0º (espesor
de la sección 100 nm) (modificado de Loussert
Fonta et ál., 2015).
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Esta técnica de congelación favorece la localización de la zona de interés a una resolución
alta. Sus ventajas principales son que los Ag permanecen en un ambiente hidratado antes del
inmunomarcaje y que la accesibilidad antigénica es mejor que en los métodos de pre y
postinclusión, en los que la muestra es incluida en resina (Tokuyasu, 1973).
Por supuesto, también presenta desventajas, considerándose como la más importante la
necesidad de fijar químicamente el material biológico a temperatura ambiente. La fijación
química introduce varios artefactos, lo cual puede afectar a los resultados (Brown et ál., 2009).
8.4. Técnicas híbridas
Las técnicas híbridas han sido desarrolladas en respuesta a las dificultades que se
presentan durante el proceso de preparación de la muestra. Por esta razón, incluyen las ventajas
de dos o más criotécnicas, proporcionando nuevos métodos de gran potencial en investigación
(Mielanczyk et ál., 2014).
A continuación, se detallan un conjunto de técnicas híbridas (Fig. 7) que pueden
combinarse con el inmunomarcaje: RHM (del inglés rehydration method, método de
rehidratación), VFS (del inglés vitrified frozen sections, secciones congeladas vitrificadas),
VIS2FIX (del inglés chemical fixation of vitreous sections, fijación química de secciones
vitrificadas) y AOIL (del inglés an optimized immuno-labeling for integrated laser and electron
microscopy, inmunomarcaje mejorado para microscopía electrónica integrada). El método SFM
(del inglés section fixation method, método de fijación sección) también puede emplearse para
este fin, pero no se comentará por su escasa aplicación.
Fig. 7. Diagrama que muestra los pasos correspondientes a las distintas técnicas híbridas (modificado de Mielanczyk
et ál., 2014).
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8.4.1. Método de rehidratación
El RHM permite la aplicación de diferentes fijadores así como sus combinaciones. Tras la
criofijación, la muestra es sometida a FS y rehidratación. Posteriormente, es crioseccionada
según el método de Tokuyasu e inmunomarcada con oro (Mielanczyk et ál., 2014).
8.4.2. Secciones congeladas vitrificadas
La técnica basada en VFS combina el método de Tokuyasu junto con la revitrificación en
etano líquido de las secciones montadas en las rejillas para EM. El inmunomarcaje se desarrolla
tras aclarar las secciones y previamente a su inclusión en hielo. Esta técnica evita los artefactos
asociados con otros métodos debidos al espesor y descongelamiento de las secciones en la rejilla
antes del proceso de vitrificación (Sabanay et ál., 1991).
8.4.3. Fijación química de secciones vitrificadas
El método VIS2FIX (Fig. 8) incluye dos técnicas de fijación a alta velocidad que ofrecen
nuevas posibilidades tanto para IEM (del inglés immuno-electron microscopy, inmunomarcaje a
microscopía electrónica) como para iLEM (del inglés integrated laser and electron microscopy,
microscopía electrónica integrada). Una vez que las secciones están organizadas en la rejilla, se
van a fijar de mediante dos técnicas: VIS2FIXFS y VIS2FIXH. Por un lado, VIS2FIXFS se basa en la
criosustitución y posterior rehidratación de las secciones. Por el otro lado, en la técnica
VIS2FIXH, las rejillas que contienen las secciones se colocan en un fijador congelado, el cual es
descongelado y fijado en líquido fijador. VIS2FIX reduce el tiempo requerido para la preparación
de las muestras y permite el uso de una amplia variedad de fijadores que amplían las
posibilidades en investigación (Karreman et ál., 2011).
Fig. 8. Inmunomarcaje con oro de la proteína caveolina en secciones VIS2FIX de HUVECs (del inglés Human Umbilical
Vein Endothelial Cells, células endoteliales de la vena umbilical humana). Las secciones HUVECs de HPF fueron fijadas
de acuerdo a los métodos VIS2FIXH (A) y VIS2FIXFS (B) y, a continuación, inmunomarcadas con oro de 10 nm para que
la caveolina localice las caveolas. Las caveolas son invaginaciones de la membrana plasmática y también se producen
en la célula pareciéndose a pequeñas vesículas (50-100 nm) (modificado de Karreman et ál., 2011).
16
La iLEM es un tipo de CLEM (del inglés correlative light and electron microscopy,
microscopía óptico-electrónica) que combina la FM (del inglés fluorescence microscopy,
microscopía de fluorescencia) y la EM en un solo equipo. La captación de imágenes a nivel óptico
se utiliza para identificar los marcadores fluorescentes, y entonces se observa la ROI (del inglés
region of interest, región de interés) a TEM (del inglés transmission electron microscopy,
microscopía electrónica de transmisión). De esta manera, se evita el tiempo de recolocación de
la ROI en los microscopios como ocurre al utilizar dos equipos convencionales, así como los
procedimientos que se requerirían para relacionar los resultados de ambos (Jahn et ál., 2012).
8.4.4. Inmunomarcaje mejorado para microscopía electrónica integrada
El método AOIL ofrece, antes de la inclusión en resina, un marcaje en bloque del material
biológico con el fin de prevenir el debilitamiento de la fluorescencia. La muestra puede
analizarse tanto a IEM como a iLEM (Karreman et ál., 2012).
8.5. Criofractura
La técnica FRIL (del inglés freeze-fracture replica immunogold labeling, inmunomarcaje
con oro para réplicas de superficies criofracturadas) se utiliza principalmente para detectar
proteínas de membrana. Este método está basado en cuatro pasos básicos (Fig. 9) previos al
inmunomarcaje con oro de la réplica resultante, que se coloca en una rejilla para visualizar la
ultraestructura celular a TEM (Robenek y Severs, 2008). En la Fig. 10 se observa el resultado del
proceso de criofractura realizado por Hoge et ál. (2011) para estudiar la extensión y fuerza del
acoplamiento eléctrico entre las neuronas de la oliva inferior (del inglés inferior olive, oliva
inferior).
Fig. 9. Pasos clave en FRIL. La muestra es
rápidamente congelada (1) y criofracturada,
proceso que rompe la bicapa lipídica quedando
expuesta la cara fragmentada (2). Se realiza
una réplica de esa muestra fracturada con
platino y carbón (3). Finalmente, la réplica se
trata con SDS para eliminar el material
biológico excesivo (4). El inmunomarcaje con
oro se lleva a cabo sobre las proteínas que se
mantengan unidas a la réplica (modificado de
Robenek y Severs, 2008).
17
Fig. 10. Sistema nervioso central. Proximidad del NMDAR (del inglés N-methyl-D-aspartate receptor, receptor N-metil-
D-aspartato) contenido en las PSDs (del inglés postsynaptic densities, densidades postsinápticas) a la proteína Cx36
(del inglés connexin 36, conexina 36) contenida en las uniones de hendidura de los glomérulos de la IO. (A) FRIL
muestra la presencia de Cx35 y NMDARs en una sinapsis mixta en el pez dorado. Cx35 en una unión de hendidura
(zona rosa) es marcada con partículas de oro de 10 nm. Un agregado de partículas de la cara E (amarillo),
representando una membrana subsináptica PSD de una sinapsis glutamatérgica, tiene una partícula de oro de 6 nm
(flecha) y una de 18 nm, e independientemente ambas indican la presencia de las subunidades NR1 de los NMDARs.
(B) FRIL muestra una sinapsis doblemente marcada en una rata, con las subunidades NR1 en la PSD por una partícula
de oro de 10 nm (flecha) y una unión de hendidura marcada para Cx36 por partículas de oro de 20 nm (modificado
de Hoge et ál., 2011).
9. Inmunomarcaje con partículas de oro
Con el fin de encontrar la mayor resolución posible a nivel subcelular, las partículas de oro
han sustituido de forma definitiva a los marcadores enzimáticos. El oro coloidal ha sido el
marcador de elección para EM durante mucho tiempo, aunque actualmente, también los
“clústeres” de oro se utilizan para determinadas aplicaciones (Hainfeld y Powell, 2000).
9.1. Oro coloidal
El oro en estado coloidal es una partícula electrodensa que se puede unir a diferentes
tipos de proteínas empleadas como detectores de Ag en las reacciones inmunocitoquímicas,
como la proteína A o la inmunoglobulina G (IgG) (Del Brío León y Riera Rovira, 1995). En el caso
de que los Ag se expongan en la superficie de secciones ultrafinas, el diámetro más común de
las partículas de oro se encuentra entre 5 y 25 nm. Más recientemente, se han desarrollado
partículas menores de 1 nm (ultrapequeñas), las cuales tienen un poder de penetración mayor
y proporcionan un sistema de marcadores con una sensibilidad más alta (Hainfeld y Furuya,
1992).
La capacidad de producir partículas de oro coloidal con diferentes tamaños permite llevar
a cabo un marcaje múltiple de los Ag en la misma sección. Esta aplicación mejora
18
significantemente la validez del método (Griffiths, 1993). Además, tienen facilidad para
adherirse a diferentes proteínas, presentan un color rojo intenso al depositarse en los tejidos y
no interfieren con pigmentos o enzimas endógenos (Kharazia y Weinberg, 1999).
Una de las ventajas principales del oro coloidal es la precisión de localización que
proporciona, ya que se puede unir a Ac primarios o secundarios con el fin de detectar la posición
del epítopo con una exactitud definida solamente por el tamaño de las moléculas de Ac
(Griffiths, 1993). En la mayoría de los procedimientos en los que se utiliza el oro coloidal, este
se une a una IgG secundaria, de forma que la distancia entre el epítopo y el centro de la molécula
de oro coloidal equivale a dos veces el diámetro de la IgG (8 nm) más el radio de la partícula de
oro (Fig. 11). Esta distancia puede reducirse con el uso de Ac más pequeños, como los
fragmentos Fab’ de Ac, cuyo diámetro es de 4 nm (Amiry-Moghaddam y Ottersen, 2013).
Fig. 11. Procedimiento de inmunomarcaje. Los triángulos
sobre la superficie ultrafina (azul) representan el Ag contra
el que se une el Ac primario (A). El Ac secundario se asocia
con una partícula de oro coloidal (Au), que en este caso tiene
un radio (r) de 7,5 nm. Como el diámetro de la IgG es de 8
nm, la máxima distancia entre el epítopo y la partícula de
oro será de unos 23 nm (modificado de Amiry-Moghaddam
y Ottersen, 2013).
En segundo lugar, el oro coloidal es un marcador de fácil cuantificación. Las partículas
presentan una electrodensidad suficientemente elevada como para que sean identificadas de
forma inequívoca con a EM, contadas fácilmente y analizadas mediante un programa específico
(Blackstad et ál., 1990).
Finalmente, la técnica de inmunomarcaje con oro se caracteriza por la alta especificidad
de la molécula de Ac. Ya que comprobar la especificidad es prácticamente imposible, para
minimizar el riesgo de confusión entre las partículas se deben emplear controles positivos y
negativos apropiados. Además, esa especificidad se debe confirmar bajo condiciones de
inmunocitoquímica, las cuales no se suelen tener en cuenta (Lorincz y Nusser, 2008).
19
9.2. “Clústeres” de oro
Los “clústeres” de oro constituyen una tecnología novedosa y están basados en un núcleo
formado por múltiples átomos de este elemento. Tienen propiedades tipo molécula y un tamaño
más pequeño que las partículas de oro coloidal. De entre todos los “clústeres” que se
comercializan, Nanogold es el elegido para inmunocitoquímica porque presenta un tamaño
medio y una mejor visibilidad frente a otras agrupaciones menores, como Undecagold, lo que
permite que se pueda observar directamente a TEM. Además, tiene un diámetro de 1,4 nm y los
átomos de su superficie pueden unirse covalentemente a grupos orgánicos (Hainfeld y Furuya,
1992).
Nanogold se puede unir covalentemente al fragmento Fab’ de los Ac con el fin de
conseguir las inmunosondas más pequeñas para una mejor penetración y electrodensidad.
Además, preserva muy bien la inmunorreactividad porque esta fracción del Ac se corresponde
con un tercio del tamaño de una molécula de IgG completa, y el “clúster” de oro se puede colocar
unido específicamente al extremo opuesto a la región que combina con el Ag. Los “clústeres”
presentan ciertas ventajas sobre las partículas de oro coloidal:
− Se unen covalentemente al Ac, por lo que son más estables que el oro coloidal, el cual
simplemente adsorbe la proteína. Además, estos “clústeres” no disminuyen su actividad
con el paso del tiempo mientras que el oro coloidal sufre una separación de los Ac
(Kramarcy y Sealock, 1991).
− El “clúster” Nanogold de 1,4 nm unido a fragmentos Fab’ (4 nm) es más pequeño que
una IgG (8 nm), por lo que penetra de manera excelente en los tejidos (Takizawa y
Robinson, 1994).
− Proporcionan un mejor marcaje antigénico porque cuanto más pequeñas sean las
partículas de oro, difunden mejor y más sitios marcan. Además, una partícula pequeña
no obstaculiza los Ag adyacentes (Takizawa y Robinson, 1994).
− Presentan mejor resolución, de manera que se han utilizado para marcar sitios
específicos en biomoléculas únicas (Luo et ál., 1999).
− Gracias a su tamaño se pueden unir covalentemente a casi cualquier molécula pequeña,
incluyendo péptidos, ATP, ácidos nucleicos, lípidos y carbohidratos. Muchos de estos
conjugados no son posibles con el oro coloidal, ya que no los adsorbe de manera estable
(Hainfeld y Powell, 2000).
20
− Los “clústeres” tienen un tamaño uniforme y específico, mientras que las partículas de
oro coloidal menores de 3 nm o ultrapequeñas son muy irregulares (Hainfeld, 1990).
− No se agregan con el tiempo, mientras que el oro coloidal tiende a ser pegajoso y a
adsorber múltiples moléculas, sobre todo en el caso de las partículas ultrapequeñas
(Hainfeld, 1990).
− Se pueden purificar cromatográficamente utilizando la filtración por gel. Es posible
separar un solo fragmento Fab’ conjugado con Nanogold y eliminar tanto el exceso de
este átomo como de otros (Hainfeld y Powell, 2000).
9.3. Intensificación con sales de plata
La autometalografía, o intensificación con sales de plata, es un proceso mediante el cual
este metal es depositado en la superficie de una molécula de oro pequeña (Danscher et ál.,
1995). Además, la envoltura es específica ya que la plata actúa como catalizador. La combinación
con plata, tanto de las partículas de oro coloidal ultrapequeñas como de los “clústeres”, ha
aumentado la capacidad de detección ultraestructural de los Ag intracelulares (De Paul et ál.,
2012). Una molécula de oro pequeña puede aumentar de tamaño hasta ser visible a EM (10-20
nm), incluso a LM (Fig. 12) o directamente a la vista (Hainfeld y Powell, 2000).
Fig. 12. Esquema del proceso de autometalografía
(modificado de Hainfeld y Powell, 2000).
En la Fig. 13 se puede evaluar el resultado del marcaje con oro coloidal (Fig. 13A) y con
Nanogold (Fig. 13B).
21
Fig. 13. Micrografías electrónicas. (A) Sección del miocardio atrial de rata donde los Ac secundarios se conjugan con
partículas de oro coloidal de 15 nm para localizar el ANP-28 (extraído de Skepper, 2000). (B) Marcaje con Nanogold-
Fab’ mejorado con plata, alcanzando partículas de 10 nm. Se observan terminales que contienen GABA (del inglés γ-
aminobutyric acid, ácido γ-aminobutírico) (asterisco) formando especializaciones sinápticas simétricas (flechas) con
las dendritas (D) en la médula espinal torácica de la rata (extraído de Hainfeld y Powell, 2000).
9.4. Marcaje doble
El método de postinclusión permite la localización simultánea de dos Ag en la rejilla con
dos complejos de partículas de oro de diferentes tamaños (Fig. 14). Cada Ag puede ser detectado
por dos marcadores independientes en cada lado de esa rejilla, sobre todo si los Ac disponibles
son preparados en la misma especie. Sino, los Ac se pueden mezclar y la reacción ocurrirá en un
solo paso en un lado de la superficie (De Paul et ál., 2012).
Fig. 14. Micrografía electrónica de la glándula pituitaria en la
que se observa un doble marcaje para reconocer dos células
de diferente tipo en la misma sección: células somatotropas
conteniendo la hormona de crecimiento (partículas de oro de
15 nm) y células lactotropas expresando prolactina (partículas
de oro de 5 nm) (extraído de Orgnero de Gaisán et ál., 1997).
10. Observación a microscopía electrónica
Tras la obtención de cortes mediante ultramicrotomía, ya sea con un equipo básico o
especializado para seccionar muestras congeladas, se lleva a cabo la preparación del material
biológico para su observación al microscopio. En el caso de la SEM (del inglés scanning electron
22
microscopy, microscopía electrónica de barrido) las muestras se montan sobre portaobjetos y
los cortes suelen ser algo más gruesos que los ultrafinos utilizados a TEM.
Por tanto, para ser observadas a TEM, las muestras se montan sobre rejillas (Fig. 15A),
unos soportes especiales que pueden ser de distintos materiales, pero solamente las de oro y
níquel son aptas para el inmunomarcaje. Todas tienen un tamaño standard y un borde sólido
para poder cogerlas con las pinzas adecuadas. Además, las rejillas pueden utilizarse
directamente o con una película fina, ya sea de carbón o de formvar. Monaghan et ál. (1998)
llevan a cabo un estudio sobre HPF para inmunocitoquímica en el que las secciones son
inmunomarcadas, introducidas en gotas con una solución de bloqueo (Fig. 15B), incubadas con
Ac y contrastadas con acetato de uranilo y acetato de plomo.
Fig. 15. (A) Rejilla de TEM vista a LM (modificado de
Loussert Fonta et ál. 2015). (B) Procedimiento llevado a
cabo en las rejillas, que se encuentran flotando en las
cuatro primeras gotas, para marcar secciones ultrafinas
con Ac (extraído de Wilson y Bacic, 2012).
11. Microscopía óptica y electrónica
Durante el siglo XIX, el uso de la LM estaba muy extendido entre los científicos para la
observación celular. Sin embargo, rápidamente se dieron cuenta de las limitaciones que este
presentaba debido a su bajo poder de resolución. Por ello, se buscó un microscopio con una
longitud de onda menor que el óptico y que, por tanto, permitiera alcanzar una resolución
mayor. En el siglo XX se desarrolló la EM, un microscopio basado en el uso de lentes
electromagnéticas que cumplía los objetivos buscados (Toole y Toole, 2004).
Una de las principales ventajas que aporta la EM es que permite detectar la localización
subcelular de un Ag, esto es, en qué parte de la célula se encuentra: el núcleo, la membrana
plasmática o el retículo endoplásmico, entre otras zonas. Sin embargo, cuando solo se requiere
conocer qué células presentan un Ag determinado, es adecuado el uso de la LM, ya que para
ello no es necesaria toda la resolución que ofrece la EM y, además, la preparación de la muestra
es más sencilla y rápida.
Las muestras seccionadas para EM se preparan de manera similar a las utilizadas a LM,
pero en el primer caso se requieren secciones ultrafinas en las que solo se observa una pequeña
zona de la célula. Con el fin de facilitar la búsqueda de esa zona en una muestra, es posible
23
utilizar las ventajas que ofrecen ambas técnicas. Para ello, se lleva a cabo el inmunomarcaje con
partículas de oro, ya que puede realizarse tanto en secciones que serán observadas a EM, como
en semifinas a nivel de LM.
En primer lugar, se puede utilizar la LM para examinar la muestra y localizar la ROI, donde
se encuentran los Ac marcados con oro (Van Weering et ál., 2010). Para el marcaje, se aconseja
utilizar partículas de oro de 1 nm de diámetro intensificadas con plata para su correcta
visualización a LM. Posteriormente, se prepara la muestra para EM y se observa solamente la
ROI a mayor resolución (De Paul et ál., 2012). Watanabe et ál. (2014) han llevado a cabo un
estudio de este tipo sobre muestras del íleon distal del pollo. Como se observa en la Fig. 16, se
ha realizado un proceso de preinclusión sobre cortes de 5 µm de espesor de una muestra que
previamente ha sido incluida en parafina e inmunomarcada con oro. Esto permite observarla
tanto a LM como a EM.
Fig. 16. Resumen del procedimiento: desde un bloque de parafina hasta la observación a EM. (A) La muestra es
embebida en parafina y las secciones correspondientes colocadas en un portaobjetos de cristal. (B) Una sección teñida
con inmunomarcaje se examina a LM sin el cubreobjetos. La flecha señala una célula marcada y observada en la
imagen D. (C) Las secciones diseccionadas que incluyen las células marcadas son incluidas en una resina epoxi. (D)
Micrografía electrónica de una célula marcada. La célula rodeada por una línea discontinua es la misma que se indica
en la imagen B con una flecha. Se observan los gránulos secretores en el citoplasma basal (asterisco) (modificado de
Watanabe et ál., 2014).
12. Discusión
El inmunomarcaje a nivel ultraestructural abarca una serie de herramientas de gran
utilidad en el campo de la Biología Celular, ya que pueden revelar detalles y caracterizar muchos
24
de los procesos que tienen lugar en las células. Estas técnicas permiten evaluar, por ejemplo,
cambios en el citoesqueleto, productos de secreción o localización de receptores. No obstante,
no tiene sentido utilizar la EM para observar una muestra que puedes resolver suficientemente
a LM. Por otro lado, en muchas ocasiones se puede utilizar ambas estrategias cuando se quiere
obtener información concreta sobre una célula marcada o un Ag subcelular.
12.1. Métodos básicos y alternativas
En primer lugar, el proceso de fijación introduce varios artefactos que afectan a la
ultraestructura de la muestra. El problema es que no existe ningún fijador ideal para
inmunohistoquímica. Por tanto, la elección dependerá de lo que se desee preservar mejor: la
morfología o la inmunorreactividad, aunque lo ideal es buscar un equilibrio (Watanabe et ál.,
2014).
En segundo lugar, los medios de inclusión más utilizados son las resinas epoxi y las
acrílicas. Por un lado, las resinas epoxi están destinadas a preservar una buena ultraestructura
celular, aportan gran estabilidad bajo el haz de electrones y facilitan el seccionamiento. Por otro
lado, las resinas acrílicas se usan para inmunocitoquímica por sus propiedades como
impregnación y polimerización con luz ultravioleta a bajas temperaturas, que no generan
enlaces cruzados en la muestra y favorecen una rugosidad alta en la superficie de la sección
(Monaghan et ál., 1998).
En el caso del procedimiento de preinclusión, aunque el inmunomarcaje se lleva a cabo
antes de la inclusión de la muestra, es una técnica que requiere procedimientos de
permeabilización que suelen desmejorar la calidad de la ultraestructura (Griffiths, 1993). La
técnica de postinclusión combinada con el inmunomarcaje con oro proporciona una
cuantificación y preservación ultraestructural excelentes, características que hacen que sea un
método de aplicación muy amplio (Del Brío León y Riera Rovira, 1995). Es más, ha llegado a ser
conocida, literalmente, como el “modelo de referencia” para la localización precisa y
semicuantitativa de Ag unidos a la membrana o al citosol en el sistema nervioso central. Sin
embargo, la técnica de preinclusión ofrece una sensibilidad muy alta (Amiry-Moghaddam y
Ottersen, 2013) y, además, permite marcar células vivas antes de la fijación, ventaja que
proporciona una mejor preservación y no es posible en el método de postinclusión (De Paul et
ál., 2012).
25
Las alternativas a los métodos convencionales incluyen varias criotécnicas aptas para
cuando la preservación de la antigenicidad se considera más importante que el mantenimiento
de los detalles ultraestructurales (Griffiths, 1993). Además, el hecho de que la muestra tenga
que ser incluida en resina limita mucho la accesibilidad antigénica en los métodos de pre y
postinclusión. Por esta razón, la criotécnica de Tokuyasu (Fig. 5) es considerada el método de
localización más eficiente para llevar a cabo el inmunomarcaje a nivel ultraestructural, ya que
combina la fijación química con la vitrificación de la muestra, evitando su inclusión (Mielanczyk
et ál., 2014). Sin embargo, su principal desventaja es la fijación química, ya que introduce varios
artefactos que pueden afectar a la ultraestructura de la muestra (Brown et ál., 2009).
Ante el problema que acarrea la fijación química, se desarrolló la criofijación, un proceso
que generalmente se reserva para muestras de tamaño más pequeño que las que se emplean
en la primera (Dykstra y Reuss, 2003). En el caso de la criofijación PF, las muestras mayores de
10 µm son muy gruesas como para asegurar una vitrificación adecuada sin que cristalice el hielo,
por lo que no pueden ser observadas directamente con el crio-EM. Este problema se solucionó
con una nueva técnica: HPF. Actualmente, varios estudios en los que se combina la criofijación
HPF con FS y la inclusión en resinas (Fig. 4), demuestran que se ha encontrado un método con
gran potencial en investigación, ya que se mantienen significativamente la ultraestructura y la
antigenicidad (Stradalova et ál., 2008).
La penetración y calidad de las muestras vitrificadas con el método SPRF se pueden
comparar con las muestras preparadas por HPF. Sin embargo, durante el proceso de vitrificación
de la primera criotécnica, alrededor del 50% de la masa original de agua sufre un cambio a hielo
cristalino, por lo que parte de la muestra es dañada por la formación de ese hielo (Mielanczyk
et ál., 2014).
Finalmente, las criotécnicas híbridas comentadas incluyen las ventajas de dos o más
métodos basados en la vitrificación del tejido. En general, las aplicaciones de estas estrategias
se pueden resumir en:
− Pueden actuar sobre materiales diferentes, así como sobre los que son difíciles de fijar.
− Permiten utilizarse cuando el resultado de la fijación convencional a temperatura
ambiente no es bueno o no sirve debido a la inactivación de los Ag y la presencia de
artefactos causados por la difusión lenta del fijador.
− Se pueden aplicar cuando se requiere la criofijación y accesibilidad de los Ag.
26
La técnica de tipo híbrido más utilizada es VIS2FIX, ya que es poco propensa a la aparición
de artefactos y reduce el tiempo de preparación de la muestra, el cual es muy amplio en las
criotécnicas comentadas, como la HPF, la FS o el método de Tokuyasu (Karreman et ál., 2011).
12.2. Inmunomarcaje
Los Ac conjugados tienen muchas utilidades actualmente, son aplicados en
inmunocitoquímica, inmunoensayos, así como para usos médicos como inmunoterapia. Los
marcadores con los que se obtienen mejores resultados están basados en partículas de oro. Por
un lado, la IgG combinada con oro coloidal es la inmunosonda que más se utiliza hoy en día a
EM gracias a todas las ventajas que favorecen que sea una molécula con alta precisión,
especificidad y de fácil cuantificación (Hainfeld y Furuya, 1992).
Sin embargo, con la intención de construir la inmunosonda más pequeña visible a TEM,
se desarrollaron los “clústeres”. De entre todos ellos, Nanogold combinado con el fragmento
Fab’ de los Ac es la partícula de oro más pequeña que puede ser observada directamente a EM
convencional. Es más, incluso las partículas de oro coloidal ultrapequeñas presentan desventajas
en comparación con los “clústeres” debido a que las primeras son de mayor tamaño, menos
estables y se agregan a los Ac (Hainfeld, 1990).
A pesar de que los “clústeres” presentan mayores ventajas que el oro coloidal, se ha
podido comprobar que este último sigue siendo el marcador más utilizado. Así, la evaluación de
100 artículos publicados entre los años 2008 y 2015 conduce a la conclusión de que en un 60%
se llevan a cabo estudios con partículas de oro coloidal de entre 10 y 15 nm conjugadas con IgG.
En el resto de artículos, los estudios se realizan con partículas de oro coloidal ultrapequeñas o
con Nanogold, siendo mayor el porcentaje de las primeras. Esto puede deberse a que los
“clústeres” constituyen todavía una tecnología muy novedosa.
En cuanto a la intensificación con plata de las partículas de oro de menor tamaño con el
fin de que se visualicen mejor al microscopio, está comprobado que la distribución de los
tamaños de esas moléculas después de la intensificación es peor que la que se origina de una
buena preparación de oro coloidal de unos 10 nm (Hainfeld y Powell, 2000).
12.3. Conclusiones
Actualmente, el enorme potencial del inmunomarcaje es una herramienta indispensable
tanto para el estudio de la ultraestructura celular, de las distintas moléculas implicadas en los
27
procesos que tienen lugar en las células, como de las relaciones entre la estructura y la función
de las mismas. Sin embargo, a partir de la valoración de las diferentes técnicas comentadas, se
puede concluir que todas ellas tienen sus ventajas e inconvenientes, los cuales deben ser
analizados para elegir el método que mejor se adapte a las condiciones requeridas para el
estudio.
13. Referencias bibliográficas
Amiry-Moghaddam, M.; Ottersen, O. P. (2013). Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat
Neurosci, 16: 798-803.
Blackstad, T. W.; Karagulle, T.; Ottersen, O. P. (1990). MORFOREL, a computer program for two-
dimensional analysis of micrographs of biological specimens, with emphasis on immunogold
preparations. Comput Biol Med, 20: 15-34.
Brown, E.; Mantell, J.; Carter, D. A.; Tilly, G.; Verkade, P. (2009). Studying intracellular transport
using high-pressure freezing and Correlative Light Electron Microscopy. Semin Cell Dev Biol, 20:
910-919.
Chen, X.; Winters, C.; Azzam, R.; Li, X.; Galbraith, J. A.; Leapman, R. D.; Reese, T. S. (2008).
Organization of the core structure of the postsynaptic density. Proc Natl Acad Sci USA, 105:
4453-4458.
Danscher, G.; Hacker, G. W.; Hauser–Kronberger, C.; Grimelius, L. (1995). Trends in
autometallographic silver amplification of colloidal gold particles. En: Hayat, M. A., ed.
Immunogold Silver Staining: Principles, Methods and Applications. New York: CRC Press, 11-18.
De Paul, A. L.; Mukdsi, J. H.; Petiti, J. P.; Gutiérrez, S.; Quintar, A. A.; Maldonado, C. A.; Torres, A.
I. (2012). Immunoelectron Microscopy: A Reliable Tool for the Analysis of Cellular Processes. En:
Dehghani, H., ed. Applications of Immunocytochemistry. Rijeka, Croatia: InTech, 66-96.
Del Brío León, M. A.; Riera Rovira, P. (1995). Manual de Bases Teórico-Prácticas de
Inmunocitoquímica. Oviedo: Servicio de publicaciones de la Universidad de Oviedo.
Dubochet, J.; Adrian, M.; Chang, J. J.; Homo, J. C.; Lepault, J.; McDowall, A. W.; Schultz, P. (1988).
Cryoelectron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys, 21: 129:228.
Dykstra, M. J.; Reuss, L. E. (2003). Biological Electron Microscopy. Theory, Techniques and
Troubleshooting. Nueva York: Springer.
28
Eldred, W. D.; Zucker, C.; Karten, H. J.; Yazulla, S. (1983). Comparison of fixation and penetration
enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J Histochem
Cytochem, 31: 285-292.
Gan, L.; Jensen, G. J. (2012). Electron tomography of cells. Q Rev Biophys, 45: 27-56.
Gilkey, J. C.; Staehelin, L. A. (1986). Advances in ultrarapid freezing for the preservation of
cellular ultrastructure. J Electron Microsc Tech, 3: 177-210.
Griffiths, G. (1993). Fine Structure Immunocytochemistry. Springer.
Hainfeld, J. (1990). TSEM analysis of Janssen Aurooprobe One. En G. Bailey, ed. Proc XIIth Int
Congr Electron Microsc. San Francisco: San Francisco Press, 954-955.
Hainfeld, J.; Furuya, F. (1992). A 1.4-nm gold cluster covalently attached to antibodies improves
immunolabeling. J Histochem Cytochem, 40: 177-184.
Hainfeld, J.; Powell, R. D. (2000). New Frontiers in Gold Labeling. J Histochem Cytochem, 48: 471-
480.
Hayat, M. A. (1991). Colloidal Gold. Principles, Methods, and Applications. 3. San Diego,
California: Academic Press.
Hoge, G. J.; Davidson, K. G.; Yasumura, T.; Castillo, P. E.; Rash, J. E.; Pereda, A. E. (2011). The
extent and strength of electrical coupling between inferior olivary neurons is heterogeneous. J
Neurophysiol, 105: 1089-1101.
Hurbain, I.; Sachse, M. (2011). The future is cold: cryopreparation methods for transmission
electron microscopy of cells. Biol Cell, 103: 405-420.
Jahn, K. A.; Barton, D. A.; Kobayashi, K.; Ratinac, K. R.; Overall, R. L.; Braet, F. (2012). Correlative
microscopy: providing new understanding in the biomedical and plant science. Micron, 43: 565-
582.
Karreman, M. A.; Agronskaia, A. V.; van Donselaar, E. G.; Vocking, K.; Fereidouni, F.; Humbel, B.
M.; Verrips, C. T.; Verkleij, A. J.; Gerritsen, H. C. (2012). Optimizing immuno-labeling for
correlative fluorescence and electron microscopy on a single specimen. J Struct Biol, 180: 382-
6.
Karreman, M. A.; Van Donselaar, E. G.; Gerritsen, H. C.; Verrips, C. T.; Verkleij, A. J. (2011).
VIS2FIX: a high-speed fixation method for immuno-electron microscopy. Traffic, 12: 806-814.
29
Kharazia, V. N.; Weinberg, R. J. (1999). Immunogold localization of AMPA and NMDA receptors
in somatic sensory cortex of albino rat. J. Comp. Neurol, 412: 292-302.
Kramarcy, N. R.; Sealock, R. (1991). Commercial preparations of colloidal gold-antibody
complexes frequently contain free active antibody. J Histochem Cytochem, 39: 37-39.
Leunissen, J. L.; Yi, H. (2009). Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method
for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc, 235: 25-35.
Lorincz, A.; Nusser, Z. (2008). Specificity of Immunoreactions: The Importance of Testing. J
Neurosci, 28: 9083-9086.
Loussert Fonta, C.; Leis, A.; Mathisen, C.; Bouvier, D. S.; Blanchard, W.; Volterra, A.; Lich, B.;
Humbel, B. M. (2015). Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-
electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryosectioning. J Struct Biol, 189: 53-61.
Luo, R. Z.; Beniac, D. R.; Fernandes, A.; Yip, C. C.; Ottensmeyer, F. P. (1999). Quaternary structure
of the insulin-insulin receptor complex. Science, 285: 1077-1080.
Maldonado, C.; Aoki, A. (1986). Influence of embedding media in prolactin labelling with
immunogold techniques. Histochem J, 18: 429-433.
Maldonado, C.; Saggau, W.; Forssmann, W. (1986). Cardiodilatin-immunoreactivity in specific
atrial granules of human heart revealed by the immunogold stain. Anat. Anat Embryol (Berl),
173: 295-298.
Martín-Lacave, I.; García-Caballero, T. (2012). Atlas de Inmunohistoquímica. Caracterización de
células, tejidos y órganos normales. Díaz Santos.
Mielanczyk, L.; Matysiak, N.; Michalski, M.; Buldak, R.; Wojnicz, R. (2014). Closer to the native
state. Critical evaluation of cryotechniques for Transmission Electron Microscopy: preparation
of biological samples. Folia Histochem Cytobiol, 52: 1-17.
Monaghan, P.; Perusinghe, N.; Müller, M. (1998). High-pressure freezing for
immunocytochemistry. J Microsc, 192: 248-258.
Orgnero de Gaisán, E.; Maldonado, C.; Díaz Gavier, M.; Aoki, A. (1997). Diversity of pituitary cells
in primary cell culture. An immunocytochemical study. Ann Anat, 179: 453-460.
Robenek, H.; Severs, N. J. (2008). Recent advances in freeze-fracture electron microscopy: the
replica immunolabeling technique. Biological Procedures Online, 10: 9-19.
30
Sabanay, I.; Arad, T.; Weiner, S.; Geiger, B. (1991). Study of vitrified, unstained frozen tissue
sections by cryoimmunoelectron microscopy. J Cell Sci, 100: 227-236.
Skepper, J. N. (2000). Immunocytochemical strategies for electron microscopy: choice or
compromise. J Microsc, 199: 1-36.
Stradalova, V.; Gaplovska-Kysela, K.; Hozak, P. (2008). Ultrastructural and nuclear antigen
preservation after High Pressure freezing/freeze-substitution and low-temperature LR White
embedding of HeLa cells. Histochem Cell Biol, 130: 1047-1052.
Studer, D.; Humbel, B. M.; Chiquet, M. (2008). Electron microscopy of high pressure frozen
samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell
Biol, 130: 877-889.
Takizawa, T.; Robinson, J. M. (1994). Use of 1.4-nm immunogold particles for
immunocytochemistry on ultra-thin cryosections. J Histochem Cytochem, 42: 1615-1623.
Tivol, W. F.; Briegel, A.; Jensen, G. J. (2008). An Improved Cryogen for Plunge Freezing. Microsc
Microanal, 14: 375-379.
Tokuyasu, K. (1973). A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol,
57: 551-565.
Toole, G.; Toole, S. (2004). Essential AS Biology for OCR. Croatia: Nelson Thornes.
Van Weering, J. R.; Brown, E.; Sharp, T. R.; Mantell, J.; Cullen, P. J.; Verkade, P. (2010).
Intracellular membrane traffic at high resolution. Methods Cell Biol, 96: 619-648.
Watanabe, T.; Nishimura, K.; Monir, M. M.; Takemoto, C.; Hiramatsu, K. (2014). Immunoelectron
Microscopic Observation of Chicken Glucagon-Like Peptide (GLP)-1-Containing Cells in Tissues
Derived from Thin Section, Paraffin Block and Conventional Method. J Vet Med Sci, 76: 389-394.
Wilson, S. M.; Bacic, A. (2012). Preparation of plant cells for transmission electron microscopy
to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nat Protoc, 7: 1716-
1727.
Yi, H.; Leunissen, J. L.; Shi, G.; Gutekunst, C.; Hersch, S. M. (2001). A Novel Procedure for Pre-
embedding Double Immunogold–Silver Labeling at the Ultrastructural Level. J Histochem
Cytochem, 49: 279–283.
Zuber, C.; Fan, J.; Guhl, B.; Roth, J. (2005). Applications of Immunogold Labeling in Ultrastructural
Pathology. Ultrastructural Pathology, 29: 319–330.
i
Anexos
Protocolo I. Método de postinclusión (De Paul et ál., 2012)
1. Fijación.
− Sumergir las muestras en una mezcla de glutaraldehído 1,5% (v/v) y formaldehído 4%
(w/v) en tampón cacodilato 0,1 M, pH 7,3, a temperatura ambiente durante 5-6 horas.
Se debe omitir la postfijación con osmio.
− Eliminar el fijador y lavar tres veces en tampón de lavado fosfato de sodio 0,1 M, PBS
(tampón fosfato salino) y pH 7,4.
2. Deshidratación e inclusión.
− Deshidratar los trozos de tejido o los precipitados celulares en una sucesión de
concentraciones crecientes de etanol: 50%, 70% y 90%, durante 15 min cada una.
− Eliminar el 90% de etanol e impregnar con una mezcla de LR-White y etanol al 90% (1:1).
Agitar suavemente en un rotor durante 2 h.
− Eliminar la mezcla y reemplazar por una inclusión 100% en LR-White, dejar toda la noche
a 4ºC. Garantizar que las piezas de tejido permanecen completamente cubiertas en la
resina de inclusión.
− Transferir las muestras a cápsulas de gelatina rellenas con LR-White, tapar y polimerizar
en un horno a 55ºC durante 24 h.
3. Seccionamiento con el vibratomo.
− Cortar los bloques de LR-White para formar una pirámide y obtener secciones semifinas
(150-200 nm) que pueden ser examinadas a LM después de ser teñidas con una solución
de azul de toluidina (30 s es suficiente).
− Cortar los bloques para el inmunomarcaje a EM, formando una pirámide pequeña con
la región que contiene la muestra seleccionada de las secciones semifinas.
− Obtener secciones ultrafinas (60-90 nm) con un cuchillo de diamante y montar las
secciones en una rejilla de níquel (250 aperturas). Guárdala en un estuche para rejillas
a temperatura ambiente.
− Para inactivar los grupos aldehído residuales, incubar las rejillas en gotas de glicina 0,05
M en tampón PBS durante 10-20 min.
4. Procedimiento de inmunomarcaje.
ii
− Transferir las rejillas a gotas de PBS-BSA al 1% (tampón de bloqueo) localizadas en un
trozo de Parafilm, e incubar dentro de una cámara húmeda en una placa Petri durante
30 min a temperatura ambiente con el fin de bloquear sitios inespecíficos.
− Incubar las rejillas en 50 µL de Ac primario específico diluido con tampón de bloqueo,
seguido por una incubación durante toda la noche en una cámara húmeda a 4ºC.
− Lavar las rejillas con PBS bajo un chorro utilizando un bote de lavado durante 2 min.
− Incubar las rejillas en una gota de 50 µL de proteína A/complejo de oro coloidal (16 nm)
o complejo oro coloidal-IgG (disponible en 6, 10 o 15 nm) diluido en tampón de bloqueo
(1:20), durante 30 min a 37ºC.
− Lavar las rejillas con PBS bajo un chorro utilizando un bote de lavado y entonces con
agua destilada.
5. Marcaje de contraste para EM.
− Incubar las rejillas con una gota de solución acuosa saturada de acetato de uranilo
durante 1 min, y entonces lavar con agua destilada.
− Utilizar citrato de plomo si se necesita mayor contraste.
− Examinar las secciones ultrafinas inmunomarcadas a TEM.
Protocolo II. Método de preinclusión (De Paul et ál., 2012)
El inmunomarcaje con oro correspondiente a este protocolo se realiza en células de la pituitaria,
vivas e intactas, para localizar Ag en las superficies celulares.
1. Procedimiento de inmunomarcaje.
− Eliminar el medio de cultivo de una placa de 35 mm con una confluencia celular del 70-
80% y aclarar ligeramente con una solución salina tamponada de Hank, pH 7,0 (HBSS).
− Bloquear los Ag inespecíficos utilizando PBS-BSA al 1% (tampón de bloqueo), pH 7,4,
durante 15 min a 37ºC.
− Incubar las monocapas celulares con Ac primarios adecuados diluidos en HBSS, pH 7,0
durante 1 h a 37ºC.
− Lavar tres veces con HBSS.
− Bloquear los sitios inespecíficos incubando con tampón de bloqueo durante 15 min a
37ºC.
− Incubar las monocapas celulares con un Ac secundario adecuado conjugado con
partículas de oro (16 nm) diluido en tampón de bloqueo (1:20), durante 60 min a 37ºC.
iii
− Lavar tres veces con HBSS.
− Elevar las células aplicando una rozadura suave con el fin de minimizar el golpe.
− Centrifugar la suspensión celular a 1.000 rpm (revoluciones por minuto) durante 5 min
para precipitar.
2. Fijación.
− Fijar el precipitado celular con una mezcla de formaldehído al 4%, 1,5% de
glutaraldehído en 0,1 M de tampón cacodilato, pH 7,0 más 7% de sacarosa durante 2 h
a temperatura ambiente.
− Lavar tres veces en tampón cacodilato 0,1 M, pH 7,4 conteniendo 7% de sacarosa, 5 min
cada lavado.
− Postfijar con tetróxido de osmio al 1% en tampón cacodilato durante 1 h, en un rotor a
temperatura ambiente.
− Aclarar el precipitado celular dos veces en tampón acetato 0,1 M, pH 5,2.
− Teñir con 1% de acetato de uranilo en tampón acetato 0,1 M, pH 5,2, durante 20 min
(tinción de bloqueo).
3. Deshidratación y seccionamiento por inclusión.
− Deshidratar con una serie graduada de acetonas frías (4ºC): 50%, 70%, 90%, 10 min cada
una; seguido por acetona al 100% (tres veces, 15 min cada paso).
− Llevar a cabo la preinclusión en araldita pura/acetona al 100% (1:1), dejar toda la noche
cubierto en un rotor.
− Realizar la preinclusión en 100% araldita fresca, 60 min en un rotor.
− Incrustar en 100% araldita fresca utilizando moldes planos para inclusión (poner
etiquetas escritas a máquina o con lápiz con el fin de identificar la muestra). Colocar en
un horno a 60ºC durante 24-48 h.
− Obtener secciones ultrafinas (60-90 nm) con un cuchillo de diamante y montar las
secciones en una rejilla de níquel (250 aperturas). Guárdala en un estuche para rejillas
a temperatura ambiente.
4. Marcaje de contraste para EM.
− Teñir las secciones ultrafinas con acetato de uranilo alcohólico/citrato de plomo.
− Examinar las secciones ultrafinas inmunomarcadas a TEM.
Protocolo III. Método de Tokuyasu (Van Weering et ál., 2010)
iv
1. Fijación química.
− Combinaciones de paraformaldehído y glutaraldehído en tampón fosfato de Sorensen
(más fuerte que el PBS). Se aconseja probar con diferentes concentraciones de ambos
compuestos.
2. Inclusión en gelatina para estabilizar la muestra.
3. Corte de los bloques.
4. Inclusión de la muestra en una solución de sacarosa 2,3 M.
5. Montaje en chinchetas para muestras biológicas.
6. Congelación en nitrógeno líquido (LN2).
7. Recorte de la superficie de la sección.
8. Crioseccionamiento con un crioultramicrotomo.
− Las secciones ultrafinas son mantenidas a temperaturas bajas, generalmente de entre
-100ºC a -120ºC.
9. Recoger las secciones ultrafinas de la solución de sacarosa.
− Normalmente, se sustituye solución por metilcelulosa para aportar soporte adicional.
10. Descongelación.
11. Almacenamiento de las secciones en rejillas revestidas con una película de carbón/Formvar,
a 4ºC.
12. Eliminación de la gelatina.
13. Inmunomarcaje.
− Uso de Ac unidos a marcadores electrodensos, como el oro coloidal.
14. Colorante de contraste.
− Uso de acetato de uranilo para mejorar el contraste a TEM.
15. Análisis a TEM.
