Técnicas electroforéticas

Óscar Jodra

Técnicas instrumentales

Óscar Jodra – 1993 (rev.2019)

FUNDAMENTO

Muchas moléculas pueden ionizarse perdiendo o ganando hidrogeniones. En el proceso de ionización, seadquiere carga eléctrica: de signo positivo, si captan hidrogeniones, o de signo negativo si los pierden.

Si sobre esta partícula cargada, actúa un campo eléctrico externo, tenderá a moverse debido a las fuerzaselectrostáticas de atracción y repulsión, de forma que se ira acercando al polo que tenga signo opuesto a su carga.La velocidad de acercamiento será mayor cuanto mayor sea la carga total de la molécula. El parámetro quecaracteriza esta comportamiento se denomina movilidad electroforética.

El movimiento de partículas cargadas debido a un campo eléctrico externo se llama ELECTROFORESIS, y deeste hecho se deriva la posibilidad de separar diferentes moléculas si poseen diferentes velocidades de migración(movilidad electroforética) en un campo eléctrico, es decir que posean distinta carga. Por tanto la Electroforesises una técnica de separación o fraccionamiento molecular.

Los primeros experimentos de electroforesis se realizaron aplicando un campo eléctrico, creado mediante lacolocación de dos electrodos en los extremos de un recipiente, a una solución acuosa homogénea. Este tipo deelectroforesis, denominado electroforesis libre, no permite la separación con una mínima resolución por lo queno tiene ninguna utilidad, excepto su uso para obtener fracciones preenriquecidas en un determinado rango de pI(sistema rotofor de Bio-Rad)

La electroforesis de zona se realiza sobre un soporte solido, que permite evitar la falta de resolución debido alas fuerzas de convención y de difusión que se producen en un medio acuoso. Estos medios sobre los que serealiza la electroforesis de zona son estructuras con entramado molecular, formadas por polímeros. Lascaracterísticas que deban poseer estos medios son:

a) que sean compatibles con el agua (disolvente de la muestra).b) que no posean carga eléctrica propiac) el tamaño de los poros del entramado debe ser lo suficientemente grande para que quepan las

moléculas a separar.d) no deben adsorber las moléculas, porque detendría la migración.

Los más utilizados son los geles de polisacáridos (acetato de celulosa, geles de almidón, de agarosa) y los gelesde poliacrilamida.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ELECTROFORESIS

La base de este fenómeno de desplazamiento depende de la interacción de 2 factores: El voltaje externo aplicadoal campo eléctrico (V) y la carga de la partícula (Q). La fuerza eléctrica ejercida sobre la partícula es el productode ambos factores y es la que hace que la partícula se mueva:

F elect. = QV

pH del medio

La carga de la partícula va a estar vinculada a su estado de ionización, y este va a depender del pH del medio enel que está. Cada molécula tiene una constante de disociación (pK), que es característica de ella; el pK indica elvalor de pH en el que se produce la disociación. Existe un pKa, constante de disociación ácida, y un pKb,constante de disociación básica.

Cuando el pH del medio es superior al pKa, se produce la perdida de los hidrogeniones que puedan liberarse, ycuando es inferior al pKb, se produce la captura de los que puedan ser captados. En el caso de las proteínas, queson anfóteras y poseen por tanto ambas constantes de disociación, si se les pone en un medio de pH muy ácido,por debajo del pKa (y por tanto por debajo del pKb), los grupos que pueden perder hidrogeniones no lo hacen,por los que no se cargan negativamente; y los que pueden captarlos si lo hacen, por lo que adquieren cargapositiva. La carga neta de la molécula es por tanto muy positiva.

Si el pH del medio es intermedio entre el pKa y el pKb, todos los grupos ionizables estarán ionizados,contrarrestando la carga unos de otros, de forma que la carga neta será la diferencia entre las positivas y lasnegativas. Si son iguales, nos encontramos en el punto isoeléctrico (pI) y la molécula no estará cargada; si haymás positivas tendrá carga positiva, y si hay más negativas, carga negativa. A un pH por encima del pKb, la carga será muy negativa.

Carga total + Carga total nula Carga total -

A consecuencia de este hecho es que las soluciones de electroforesis deben tamponarse para tener su pHestabilizado. El pH se elige cuidadosamente para lograr una carga neta estable y una máxima separación. Paraproteínas, que es la molécula que más frecuentemente se estudia por electroforesis, normalmente se utiliza elintervalo de pH de 7 a 9, lo que significa que están cargadas negativamente y van a migración hacia el cátodo(polo positivo).

campo eléctrico

El campo eléctrico debe ser de corriente continua, si no, no se conseguiría movimiento de las moléculas. Ladiferencia de potencial que se le aplica varia dependiendo del tipo de electroforesis, entre 50 - 6.000 V.

Hay dos factores a considerar en una electroforesis: Diferencia de potencial (V) y Tiempo.

Si se aumenta la diferencia de potencial, se consigue que las moléculas sean atraídas con más fuerza, y por tantoal moverse más aprisa se acorta el tiempo. Sin embargo, se aumenta el calentamiento y se puede producir unadesnaturalización de las moléculas estudiadas, por lo que hay que evitar está situación. Una solución es realizarla electroforesis bajo refrigeración.

Como consecuencia del acortamiento del tiempo de desarrollo, se produce una disminución de la difusión radialde la muestra sobre el gel, con lo que se consiguen bandas más estrechas y mejor resolución en los resultados.

Respecto al tiempo, si es demasiado corto no se produce la separación de las distintas especies moleculares, perosi es demasiado largo, puede producirse la perdida de la más móvil, y además se aumenta el riesgo derecalentamiento. Es necesario calcular el tiempo óptimo de migración, para conseguir una separación adecuadade las bandas.

características del medio

Hay determinadas características del medio en el que se desarrolla la electroforesis, que afectan a esta de formaimportante.

En primer lugar está la conductividad, o fuerza iónica proporcionada por los iones presentes en el tampón. Eltampón debe poseer conductividad, para que se cree el campo eléctrico, si empleamos agua destilada, sin ningúnion, se produce un efecto aislante, no hay transmisión de la electricidad y por tanto no hay migración de lasmoléculas.

Si a un voltaje fijo se aumenta la fuerza iónica, aumenta la intensidad de corriente y por tanto el calentamientodel sistema. Para que no suceda esto, si se eleva la conductividad debe disminuirse el voltaje, lo que implica unaumento del tiempo requerido para la separación, dando lugar a una menor resolución. Lo ideal es mantener laconductividad, es decir la concentración iónica del medio en valores moderados.

También tenemos que tener en cuenta la resistencia debida a la viscosidad del disolvente: Cada partícula tieneun coeficiente de fricción que depende de la viscosidad de la solución y del tamaño y forma de la partícula. Amayor viscosidad y mayor tamaño e irregularidad de una partícula, más lento es el movimiento.

Otra importante característica del medio de electroforesis es la Electroendoósmosis. Cuando un disolventeiónico (el tampón) está en contacto con un sólido, aparecen en éste una serie de cargas negativas (potencial deHelmholtz), que produce la polarización de los iones del disolvente (adquieren cargas positivas).

El tampón cargado positivamente tiende a moverse electroforéticamente hacia el polo negativo (ánodo), en loque se denomina "flujo electroendoosmótico". Este flujo de tampón produce el arrastre de las partículas,produciendo una perdida de resolución.

En el caso de la electroforesis de proteínas, la fracción gamma posee poca carga negativa y sobre ella actúa unafuerza electroforética débil, por lo que el flujo electroendoosmótico puede contrarrestarla completamente y hacerque se mueva hacia el ánodo, a pesar de ser levemente aniónicas.

EF EN GELES DE POLISACÁRIDOS

elección del soporte

Cada soporte tiene unas características especiales que le hacen más adecuado para un determinado uso. Enprincipio hay que ver si queremos hacer una separación analítica o preparativa, y si son moléculas grandes opequeñas.

Las moléculas pequeñas, como aminoácidos, se separan en papel, que al ser un soporte muy fino permitedetectar con mayor facilidad las pequeñas manchas que se hayan producido.

Para macromoléculas, si la electroforesis es analítica se puede emplear cualquier soporte, el acetato de celulosaes uno de los más empleados por su facilidad de manejo y porque tienen la ventaja de hacerse transparentes aldeshidratarlos, de forma que podemos cuantificar por densitometría las bandas que aparezcan.

Si el fin es preparativo, conviene escoger un soporte en el que podamos controlar el grosor, ya que cuanto másgrueso sea, mayor cantidad de muestra podemos cargar.

preparación del soporte

En primer lugar, debe impregnarse el soporte en el tampón que se vaya a utilizar para la electroforesis. Para ellose sumerge el gel en un recipiente con tampón durante el tiempo necesario (aproximadamente 15').

Cuando está bien embebido hay que proceder a montarlo en la cámara de electroforesis. Las tiras de papel y deacetato de celulosa se montan sobre el puente, dejando sumergidos los extremos en los compartimientosrespectivos.

Para los geles de almidón y agarosa hay que hacerotro montaje, colocando el gel completamentesumergido en el tampón o bien estableciendo unospuentes de papel de filtro bien empapado en tampón,comunicando el gel con los compartimientos de lacubeta.

La superficie del soporte debe estar perfectamente equilibradasobre la superficie de apoyo, pues si un extremo está más alto queotro pueden crearse flujos contracorriente.

aplicación de la muestra

La muestra debe estar diluida en el mismo tampón en que se va a desarrollar la electroforesis. La resolución aumenta cuanto más estrecha sea la banda de aplicación. La muestra debe aplicarse alejada de losbordes, para evitar que se produzca el efecto de borde, debido a la interfase formada por el aire y el tampón,donde el campo eléctrico no es homogéneo y se producen distorsiones en la velocidad de migración.

Se puede realizar una aplicación en banda o puntual. La aplicación puntual o capilar se emplea en electroforesisanalítica, ya que se consume menos muestra y se aprovecha mejor el soporte, al permitir hacer dos o tresaplicaciones por tira. En el caso de que se hagan varias aplicaciones en la misma tira, éstas deben estar separadasentre si, ya que la proximidad produce un efecto similar al de borde.

En geles, sobre todo si se desea procesar una gran cantidad de muestra, esta se coloca en un pocillo o ranuraexcavado en el gel.

desarrollo de la electroforesis

Debe evitarse la evaporación del tampón, que haría aumentar la concentración salina, por tanto la cubeta debeestar provista de una tapa que permanecerá cerrada durante todo el proceso.

La EF puede realizarse a voltaje constante, intensidad constante, o potencia constante. La selección de cualquierade estas modalidades depende en general del tipo de fuente de alimentación disponible. Lo ideal es realizar la EFal máximo voltaje posible, para que el tiempo sea el menor.

El voltaje a emplear, no obstante, depende de la capacidad de enfriamiento del aparato, pues diferencias dedécimas de grado por distintas zonas de los geles conducen a distorsión de las macromoléculas.

Se conecta pues la cubeta a la fuente de alimentación, se seleccionan las condiciones de desarrollo y se conectala fuente de alimentación.

Una vez transcurrido el tiempo de desarrollo, se desconecta la corriente y se procede a la localización de lasbandas aparecidas. Se trata de "revelar" en que parte del soporte y en qué cantidad se encuentran las sustanciasque debían ser separadas y cuantificadas.

Esta determinación se puede hacer midiendo alguna propiedad física de la molécula como por ejemplo absorciónde la luz, o índice de refracción, o mediante una reacción química como una tinción o coloración.

Normalmente se realiza esto último porque no todas las sustancias de una misma familia, por ejemplo proteínas,presentan la máxima absorción a una determinada longitud de onda.

Las bandas, una vez detenida la EF, se ensanchan por difusión dentro del soporte. Para evitar esto, y como pasoprevio a la coloración se debe desecar el papel; cuando se trata de una EF de proteínas en gel debemos hacer queprecipiten con ác. acético o TCA, para evitar su difusión. A veces estos compuestos los pueden llevarincorporados los colorantes.

Existen multitud de colorantes y la elección va a depender del tipo de compuestos separados. Unas veces seemplean colorantes específicos de un grupo químico concreto, por ejemplo la ninhidrina que tiñe grupos amino,se emplea habitualmente para la separación de péptidos o aminoácidos en papel.

Muchos enzimas se identifican mediante el uso de sustratos coloreados o fluorescentes. Por ejemplo, la FosfatasaAlcalina hidroliza el p-nitrofenilfosfato a p-nitrofenol que a pH 8 es de color amarillo. Al sumergir el gel en estassoluciones se forman bandas coloreadas donde están los enzimas.

Las proteínas en general se suelen teñir utilizando el azul de Coomassie

En el caso de los ácidos nucleicos se emplean agentes intercalantes, como el Bromuro de Etidio o sus sustitutosmenos peligrosos (como p.e. el red safe) que proporcionan fluorescencia bajo la luz UV.

Tras el revelado, puede cuantificarse la cantidad de producto presente en cada banda, mediante densitometría omedición de la absorbancia del eluído.

tampones

Los tampones más empleados para la separación de ácidos nucleicos son el TAE (Tris-Acetato EDTA) y elTBE (Tris-Borato-EDTA).

El TAE tiene menos capacidad de tamponamiento, pero proporciona la mejor resolución en el caso de moléculasgrandes de DNA. Esto implica utilizar menor voltaje y más tiempo, pero el resultado final es mejor.

El tampón Litio-Borato (LB) no sirve para fragmentos grandes, pero presenta una gran capacidad de resoluciónen los pequeños. Tiene una conductividad muy baja que permite emplear voltajes muy grandes (hasta 35 V/cm)que permiten acortar los tiempos. Su capacidad de resolución permite estudiar fragmentos que se diferencian enun único par de bases (agarosa al 3% con tampón LB 1mM).

electroforesis en gel de agarosa - AGE

La agarosa es fácil de manipular, ya que la gelificación es un cambio físico y no químico como en el caso de lapoliacrilamida. Además es fácil recuperar las muestras después de la separación e incluso pueden guardarse losgeles refrigerados en una bolsa.

Es muy empleada para la separación de proteínas y de fragmentos de DNA a partir de 50 pb. Los gelespreparados al 0,7% son óptimos para la separación de fragmentos grandes de DNA 5-10 kpb, y para fragmentospequeños se emplea la agarosa en proporción de hasta el 3%, siendo lo más habitual prepararlos al 1% . Losgeles con baja proporción son muy frágiles y difíciles de manipular.

Para fragmentos pequeños de DNA es mejor la PAGE.

EF EN GEL DE POLIACRILAMIDA - PAGE

La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) tiene una gran resolución, mucho mayor que la EF en geles depolisacáridos, debido a que carece de flujo electroendoosmótico. Además se observa que la movilidadelectroforética no es solo función de la carga, sino que también es función del tamaño de la partícula.

preparación del soporte

El soporte (gel) se construye en el momento de su utilización mezclando dos monómeros: acrilamida ybisacrilamida. La acrilamida produce polímeros lineales que van formando una malla, y la bisacrilamida produceentrecruzamientos entre ellos, de modo que fija la estructura. Cuanto mayor sea la proporción de acrilamida,menor será el tamaño del poro, y cuanto mayor sea la concentración de bisacrilamida, mayor será la consistenciadel gel. Normalmente, la concentración de bisacrilamida es mucho menor que la de acrilamida,aproximadamente el 2% de ésta. La concentración de acrilamida se escoge en función del tamaño de laspartículas que vayamos a separar.

Se colocan dos placas de vidrio, separadas mediante espaciadores de 1 ó 2 mm de ancho, y se deposita entreellas la mezcla de acrilamida y bisacrilamida, a la que se añade un iniciador de la polimerización. Se obtiene deesta manera el gel de separación.

Se añade ahora sobre este gel, otra cantidad de monómeros, pero con baja concentración de acrilamida (3%),para obtener un gel concentrante de amplio tamaño de poro, que va a aumentar la capacidad de resolución.

Antes de que se polimerice este gel, se cierra la parte superior con una pieza dentada (peine) y se pone apolimerizar. Puede favorecerse la polimerización mediante radiación UV.

aplicación de la muestra

La muestra suele ir disuelta en sacarosa al 40% o en glicerol, para hacer que la solución sea densa, y la difusiónmenor.

Se deposita la cantidad adecuada (10-100 l) en uno de los pocillos creados por el peine, y se comienza laelectroforesis.

desarrollo de la electroforesis

La diferencia de potencial aplicada a la electroforesis, va a depender del tamaño del gel, por lo que hay quereferirlo a Voltios/cm.

Para calcular el tiempo de desarrollo, se recurre a un marcador, que consiste en una sustancia coloreada, de altavelocidad electroforética, que va disuelta con la muestra. Cuando el marcador abandona el gel separador, setermina con la electroforesis. El tiempo aproximado es de 1-2 horas y para localizar la muestra, se recurretambién a la tinción, de forma similar a como se hace en la AGE.

aplicaciones

La PAGE tiene grandes aplicaciones, pero no tienen un excesivo interés en el campo de los análisis clínicos, sonmás de investigación.. En primer lugar, el hecho de que la separación dependa del tamaño, y no solo de la carga,permite separar moléculas que de otra forma sería imposible, como los ácidos nucleicos.

También es útil para la separación de proteínas en función de su tamaño, por ejemplo los distintos Ag de unmicroorganismo.

Para conseguir que la separación electroforética se realice sólo en función del tamaño (o longitud) y de larelación masa/carga, hay que hacer la electroforesis en condiciones desnaturalizantes. Para ello se añade altampón determinadas sustancias como la urea para los ácidos nucléicos, el SDS y el 2-ME para las proteínas...

ISOELECTROENFOQUE - IEF

Es una variante de PAGE en la que la el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en suestructura. Esto se consigue incluyendo en su preparación moléculas ionizables con valores de pK diferentes.

Como consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornosde pH diferente, y eventualmente alcanzan una región en la cual el pH local es igual al punto isoeléctrico dela molécula muestra y ésta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la separación delos componentes de la muestra de acuerdo con su punto isoeléctrico, que además se puede medir, pues seconoce la geometría del gradiente de pH fijado al gel. Habitualmente es empleado para la separación deproteínas.

EF BIDIMENSIONAL

Tras realizar una primera separación, su resultado se somete a otra de diferente mecanismo en direcciónperpendicular. Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel estrecho que luego se coloca comomuestra para una SDS-PAGE.

EF DE CAMPO PULSANTE - PFGE

Las moléculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40 kb no se pueden resolver empleando laelectroforesis convencional en gel de agarosa.

Esto se debe a la dificultad de manejo de los geles preparados con las bajas concentraciones de agarosa querequerirían (inferior al 0,4%) y a que las moléculas de DNA poseen un tamaño excesivamente grande paraatravesar los poros del gel y no se separan en función de su tamaño. Para solventar este problema se haideado una modificación de la técnica, conocida como electroforesis de campo pulsante (pulsed-field gelelectrophoresis).

Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera periódicamente la orientación del campo eléctricoaplicado, activando alternativamente dos pares de electrodos. El frecuente cambio de dirección del campoeléctrico consigue que las moléculas se desplieguen y avancen a través de los poros en conformaciónextendida. A mayor tamaño, se reorientan con más dificultad, por lo que avanzan más despacio. Así seconsigue separar fragmentos de DNA de hasta varias megabases.

Se utiliza para genotipado y es muy empleado en estudios epidemiologicos.

INMUNOELECTROFORESIS - IEF

Combina la separación electroforética con la reacción Ag-Ab.

Algunas de sus variantes son:

IEF unidimensional cuantitativa o “rocket IEF”. Serealiza una electroforesis en un gel impregnado de Ab.Los Ag van precipitando hasta que se agotan. Elelectroforetograma tiene aspecto de cohete.

IEF bidimensional cuantitativa o EF cruzada. Serealiza una primera separación de las proteínas en unadimensión y después, en una segunda dimensión, enun gel con Ab.

Contrainmunoelectroforesis (CIEF). Similar a una inmunodifusión, pero la migración es aceleradapor la aplicación de un campo eléctrico.

Inmunofijación electroforética (IFE). Tras realizar la migración electroforética en distintoscampos, se pone sobre el gel una “máscara” y se aplica en cada campo un anticuerpo para fijar losAg que se correspondan. A continuación se eluyen las proteínas no fijadas y se tiñen para obserbarlas bandas.