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NOYAU
Caractéristique des cellules eucaryotes +++
- Limité par l’enveloppe nucléaire (2 membranes: interne et externe)
- Contient presque la totalité de l’information génétique (le génome nucléaire)
QCM 1
Mise en évidence en microscopie:
- fluorescence: agents intercalant de l’ADN (DAPI, BET…)
- colorants basiques : hématoxyline, bleu de méthylène…
- réaction de Feulgen : hydrolyse acide de l’ADN et révélation avec le réactif de Schiff (détecte les aldéhydes)
DAPI (Fluorescence)
FeulgenHématoxyline
NOYAU
L’ enveloppe nucléaire: délimite le noyau
Pollard TD, Earnshaw WC, Biologie Cellulaire , Ed Elsevier Microscopie électronique: 1ères études ∼1950
chromatine
QCM 1
QCM 1 L’enveloppe nucléaire
Description:
Enveloppe constituée de 2 membranes :- membrane externe: en continuité avec le RER- membrane interne- espace périnucléaire Membrane
externe
Membrane interne
Enveloppe nucléaire Réticulum
Endoplasmique
Lumière du RE
Espace périnucléaire
Lamina nucléaire
Pore nucléaire
ribosome
L’espace périnucléaire
Espace en continuité avec la lumière du RE:- contenu similaire- stockage du calcium
Percée par les pores nucléaires
Récepteur des lamines
La membrane nucléaire
Récepteur pour histones ou protéines associées
Membrane externe, cytosolique = région spécialisée de RER
Membrane interne nucléocytoplasmique
→→→→ composition ≠≠≠≠
Ca++
QCM 1
QCM 1
Cytosquelette
Nucléosquelette: pas de microtubules dans le nucléoplasme !
→ Continuité cytosquelette / nucléosquelette
Microtubules
Microfilaments
Filaments intermédiaires
Filaments intermédiaires (lamines)
Microfilaments d’actine
Exemple de syncytium: fibres musculaires
(muscles striés)
Coupe longitudinale
Coupe transversale
Myofibrille
Sarcoplasme
Noyauxpériphériques
Sarcolemme
Planche donnée pour information
Le muscle strié :la fibre musculaire
Le syncytium contient plusieurs noyaux dans un cytoplasme unique
Exemple de cellules multinuclééesQCM 1
- Position centrale en général
Relation avec centrosome (→ fuseau mitotique)
Structure du noyauQCM 2
- Nombre : en général, 1 par celluleExceptions - plusieurs : ex.fibres musculaires (syncitium)
- aucun : GR, plaquettes
- Forme : ronde ou ovaleExceptions : polynucléaires
-Taille : - 5 à 6 µm- 6% du volume cellulaire- rapport nucléo/protoplasmique selon activité / type cellulaire
N/P = Vol. Noyau / Vol. cellule
http://www.physique.univ-paris-diderot.fr/IMG/jpg/image4.jpg
Lamina: Face interne de l’enveloppe nucléaire
- Interagit avec les pores nucléaires
- Rôle dans la régulation de l’expression des gènes
lamina
QCM 2 Structure du noyau
Mutations de la lamine A :
observées dans le syndrome de Hutchinson-Gilford = progeria
Patient muté
Mère non
mutée
Eriksson et al; 2003, Nature 423: 293-298
QCM 2 Structure du noyau
Lamines A, B et C: → Filaments intermédiaires
→ spécifiques du noyau
→ formation de la lamina nucléaire
- Lamine B fixée à la face nucléocytoplasmique de l’enveloppe nucléaire par un groupement farnésyl ≠≠≠≠ Lamines A et C
- Lamines A et C: lamina + nucléoplasme
- Récepteurs des lamines: prot. transmembranaires
QCM 2 Structure du noyau
Protéines:
- Lamines A et C hors lamina
- Actine
- Particules ribonucléoprotéiques
- Enzymes du métabolisme ADN, ARN
QCM 2 Structure du noyau
L’enveloppe nucléaire se dissocie à chaque mitose, puis se reconstitue Rôle des complexes
cyclines / Cdks (voir cours sur le cycle cellulaire)
QCM 2
Les pores nucléaires
- Seule voie de communication entre le noyau et le cytoplasme
- Passage dans les 2 sens; notion de sélectivité
- Passage de petites molécules, ions
Protéines
ARNm, ARNt, ARNr
ribonucléoprotéines, particules ribosomales…
- Protéines constituant le pore nucléaire: les Nucléoporines (Nup)
Nucléoporines (Nup) : ~ 30 connues~ 450 protéines en tout (par pore)
Molécules de taille variable!
Remarque: Pore nucléaire → Asymétrique, déformable
Les pores nucléaires
16 bras radiaires (2x8)
16 filaments (8 cytosoliques et 8 filaments de cage)
Fahrenkrog and Aebi; Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4: 757
Structure 3D des pores nucléaires
Microscopie electronique, cryofracture
8 unités répétées
Les éléments du transport nucléo-cytoplasmique
- Signaux d’adressage sur la protéine (cargo) à transporter (NLS, NES, NRS)
- Importines, exportines: Récepteurs de transport
-Les Nucléoporines:
-Système Ran GTP / GDP → orientation du transport à travers le pore
Transport à travers le pore nucléaire dans les 2 sensÉlément transporté = cargo
Nucléoporines contenant des séquences répétées riches en phénylalanine / gly (30%):
Domaine FG ( Ex: motif FXFG)
Séquences de reconnaissance pour les Importines / ExportinesInterviennent dans le transport à travers le pore nucléaire → sélectivité du pore!
Signaux d’adressage:-NLS « classique » (Nuclear Localisation Signal), riche en aa basiques (K, R)-NES (Nuclear Exportation Signal)-NRS (Nuclear Retention Signal)
Translocation des protéines cargo sous forme repliées (≠≠≠≠ mitochondrie / peroxysome)
Masquage/démasquage des signaux d’adressage par par tenaires d’interaction
REM: 40% des protéines nucléaires n’ont pas de NLS classique
Les signaux d’adressage nucléaires
Extrémité amino-terminale de la nucléoporine Nup 153
Extrémité C-terminale de la nucléoporine Nup 153 contenant le domaine FG
Fahrenkrog and Aebi (october 2003) 4: 757
Les Nucléoporines avec domaine FG: exemple de Nup 1 53
Extrémité flexible
Fixe importine / exportine
GEF
GTPGDP
PiGAP
GDPGTP
RanRan
GAP: GTPase-Activating Protéin
GEF: Guanine –nucleotide
Exchange Factor
Le système Ran: orientation du transport NC
Ran = GTPase
Echange
Hydrolyse
• Disposition asymétrique des régulateurs GEF et GAP de part et d’autre de la membrane nucléaire:
GEF / GAP
noyau / cytosol
• Existence d’un gradient Ran.GTP / Ran. GDP entre le noyau et le cytoplasme
Le système Ran
Ran GDP Cytosol
Ran GTP
NoyauRan GDP
Ran GTP
Figure 1 : Représentation schématique du résultat des observations sur les lots de cellules. La membrane plasmique des cellules est représentée par un simple trait noir délimitant le cytosol, l’enveloppe nucléaire est représentée par un double trait délimitant le nucléoplasme. La fluorescence observée au microscope est représentée en gris.
1 2 3 4 5
Figure 2 : Représentation schématique du résultat des observations sur les lots de cellules exprimant P-YFPwt (contrôle) ou la protéine P-YFP-XX en présence ou non d’inhibiteur du transport nucléocytoplasmique. La fluorescence observée au microscope est représentée en gris.
1 2 3 4
Exemple de la localisation nucléo-cytoplasmique d’une protéine marquée GFP (FoxA1-GFP)
Kau TR et al. Cancer Cell 2003
QCM 3 Le nucléole
Région intranucléaire bien individualisée:
- Biogénèse des ribosomes- présent à l’interphase- contient des portions de chromosomes: régions NOR
Cellule eucaryote fabrique 2000-3000 ribosomes par minute
Le nucléole – Régions NORQCM 3
Remarque : les chromosomes acrocentriques peuvent être répartis sur plusieurs nucléoles
NOR = - Constrictions secondaires au niveau des chro mosomes acrocentriques
- Centre fibrillaire des nucléoles
ADNr ADNr ADNr ADNr
Organisation des gènes en tandem (environ 20 copies)
ARNr 45S
Grande sous-unité ribosomale (60S)
Petite sous-unité ribosomale (40S)
Clivage / maturation de l’ARN
(Polymérase III)
NOR (organisateur nucléolaire)
QCM 3
ARN Polymérase I
Cf cours sur la transcription (UE1)
Le nucléole – Régions NOR
+ protéines = Grande particule RNP
En Microscopie électronique (MET)
- Centre fibrillaire (1 ou pls) Localisation des NOR
- Composant fibrillaire dense (grande particule RNP)
- Région périphérique granulaire (pré-ribosomes)
Organisation de l’ADN dans le noyau:
génome haploïde = 3,2 x 109 pb => Noyau = 6,4 x 109 pb
23 paires de chromosomes: ADN réparti en 46 molécules
- 1 chromosome = 50.106 à 250. 106 pb
1,7 cm à 8.5 cm si l’ADN était déroulé
=> noyau cellule humaine ≈ 2 m d’ADN
=> nécessité d’un compactage
Exemple du génome humain:
QCM 8
Principaux niveaux de repliement de l’ADN
Facteur de compaction ∼ x50 000
Interphase
Chromatine dispersée (eu-) ou condensée
(hétéro-)
Mitose
Chromatine hypercondensée
Forme condenséeSpirale
interphasique
Double hélice d’ADN
Collier de perles
Fibre de 30 nm
Repliementen boucles
Chromosome mitotique:
Chromosome métaphasique
QCM 8
Interphase: chromosomes décondenséspas d’enchevêtrement aléatoire: Territoires chromosomiques
Territoires chromosomiques
QCM 8 Cellule en interphase
QCM 8 Cellule en interphase
Positionnement des fragments de chromosomes et activité transcriptionnelle
= Mosaïque physiologique
?Inactivation du chromosome X
• Respect du dosage génique entre homme (XY) / femme (XX) :Inactivation quasi-complète d’un chromosome X chez la femme
• X inactivé forme le corpuscule de Barr
• se met en place pendant l’embryogenèse mais réversible durantl’ovogenèse (hétérochromatine facultative )
• L’inactivation se fait au hasard puis se transmet aux cellules filles= Mosaïque de cellules
QCM 7
Accumulation de cellules
Synchronisation / blocage
Culture cellulaire: cellules somatiques
Prométaphase ou métaphase
Solution hypotonique
Obtention d’un caryotype
Dispersion chromosomique
Fixation, coloration
Division cellulaire
QCM 7
Colchicine
lymphocytes, cellules foetales (amniocentèse, biopsies trophoblaste)(Cellules tumorales)
Répétition 5’ TTAGGG 3’
sur 5-10 kpb
Se raccourcit à chaque division
Structure d’un chromosome métaphasiqueQCM 7
Observation après coloration
Classement des chromosomes ?
- Taille
- Position du centromère
Ic= p/(p+q)
- Bandes (G, R…)
Classement en 7 groupes (A à G)
Caryotypes:
A B
C
D E
F G C G
métacentriques
submétacentriques
acrocentriques
Classement d’après la longueur et l’index centromérique :7 groupes de A–>G
acrocentriques
13 14 15
21 22
Obtention d’un caryotypeQCM 7
Région pseudo-autosomique 1PAR 1
Crossing-over obligatoiredes chromatides non-sœurs
pendant la méïose
Région pseudo-autosomique 2PAR 2
Centre d’inactivation en Xq13
SRY
X Y
Les gonosomes
Y: Contient 10 fois moins de
gènes que le X
Coloration des chromosomes au Giemsa
Nombre de bandes variable selon le degré de condensation de la chromatine
- Bandes G: sombres, digestion enzymatique ménagée + Giemsa
- Bandes R: sombres, digestion thermique ménagée + Giemsa
• Bandes:
→ Caractéristiques d’une paire chromosomique
→ Reproductible d’une mitose à l’autre
→ Caractéristique d’une espèce donnée
• Métaphase: 200 – 500 bandes
résolution 5-10 Mpb
QCM 7
FISH: Hybridation In Situ Fluorescente
Hybridation moléculaire (sondes ADN/ARN)
+Ne nécessite pas de cellules en division (métaphase ou interphase)
Bonne résolution
Outil de recherche
-Etude ciblée (sonde spécifique)
Les différents types de sonde
- Constitutionnelle (l'ensemble de l'individu porte la même anomalie) ou acquise
- Équilibrée (il n'y a ni perte ni gain de matériel génétique) ou déséquilibrée
- Homogène (toutes les cellules ) ou en mosaïque (certaines cellules)
• Anomalies du degré de ploïdie Ex: 69, XXX
• Anomalies de nombre : 2n +/- 1,2,3
Exemple: 47, XY, +21
Les anomalies chromosomiquesQCM 7
Les anomalies chromosomiques
Translocation robertsonienne
Translocation réciproque équilibrée
Chromosomes acrocentriques (NOR):
13, 14, 15, 21 et 22
Ex: 45, XY, der(14,21)(q10; q10)
Ex: 46, XX, t(7,8)(q11.1; q21.2)
Nomenclature à connaître!
QCM 7
Les anomalies chromosomiquesAnomalies de structure
délétion inversion duplication isochromosome
QCM 7
Figure 4A- pcp 3q: sonde spécifique du bras long du chromosome 3 –
subtel 3q: sonde subtélomérique spécifique du bras long du chromosome 3
B- cen 12: sonde spécifique du centromère du chromosome 12 –
subtel 12p: sonde subtélomérique spécifique du bras court du chromosome 12
Exercice 2 Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization
Préparation de l’ADN
Hybridation sur support contenant les sondes (« puce »)
Acquisition des signaux d’hybridation
Analyse quantitative des données
Exercice 2
Aspect comparatif et « quantitatif » du CGH (Intensity Ratio):
- Normal:
2 allèles sujet analysé / 2 allèles témoin : ln(2/2) = ln (1) = 0
- Trisomie complète:
3 allèles sujet analysé / 2 allèles témoin: ln (3/2) = ln (1,5) = + 0,4
- Monosomie complète:
1 allèle sujet analysé / 2 allèles témoin: ln (1/2) = ln (0,5) = - 0,7
Mosaïcisme: entre les 2….
Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization
→ Plus résolutif qu’un caryotype classique : cf nombre de sondes sur le support
Mais on ne voit pas les chromosomes
anomalie équilibrée→ pas de différence quantitative
Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization