TECHNICKÁ ZPRÁVA PILOTNÍHO PROJEKTUeagri.cz/public/web/file/289659/Vvyuziti_kyseliny...Marchand, Pierre-Andre; Thuy-My Phan; Straus, David L.; et al. 2012: Reduction of in vitro

1

EVROPSKÝ RYBÁŘSKÝ FOND

INVESTOVÁNÍ DO UDRŽITELNÉHO RYBOLOVU

FAKULTA RYBÁŘSTVÍ A OCHRANY

VODJIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH

BUDĚJOVICÍCH

TECHNICKÁ ZPRÁVA PILOTNÍHO PROJEKTU

Název pilotního projektu:

VYUŽITÍ KYSELINY PEROCTOVÉ V TECHNOLOGII CHOVU KAPRA

OBECNÉHO (CYPRINUS CARPIO L.)

Registrační číslo pilotního projektu: CZ.1.25/3.4.00/11.00389

2





BUDĚJOVICÍCH

Příjemce dotace:

Název nebo obchodní jméno:Rybářství Třeboň a.s.

Adresa: Rybářská 801, Třeboň 379 01

IČ: 60826851

Registrační číslo pp: CZ.1.25/3.4.00/11.00389

Název pilotního projektu: VYUŽITÍ KYSELINY PEROCTOVÉ V TECHNOLOGII CHOVU KAPRA OBECNÉHO (CYPRINUS CARPIO L.)

Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna příjemce dotace zastupovat:

Ing. Josef Malecha,

Vědecký subjekt:

Název nebo obchodní jméno:Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Fakulta rybářství a ochrany vod

Adresa: Zátiší 728/II, 389 25 Vodňany

IČ: 60076658

Místo a datum zpracování technické zprávy: Vodňany, 28. 2. 2013

Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna vědecký subjekt zastupovat:

prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc.

Zpracovatel technické zprávy pilotního projektu:

Název nebo obchodní jméno:Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Fakulta rybářství a ochrany vod

Adresa: Zátiší 728/II, 389 25 Vodňany

IČ: 60076658

Místo a datum zpracování technické zprávy: Vodňany, 28. 2. 2013

Jména a příjmení osob, které zpracovaly technickou zprávu:

MVDr. Eliška Zusková, Ph.D.

Jméno a příjmení osoby, která je oprávněna zpracovatele technické zprávy zastupovat:


3





BUDĚJOVICÍCH

Souhlas s publikací technické zprávy:Souhlasím se zveřejněním této technické zprávy pilotního projektu v rámci opatření

3.4. Pilotní projekty z Operačního programu Rybářství 2007 – 2013 na internetových stránkách Ministerstva zemědělství a s využíváním výsledků této technické zprávy všemi subjekty z odvětví rybářství.

Podpis osoby oprávněné zastupovat:

1. Příjemce dotace:

Ing. Josef Malecha

2. Partnera projektu (vědecký subjekt):


3. Zpracovatele technické zprávy:


4





BUDĚJOVICÍCH

Obsah:1. CÍL ......................................................................................................................................... 5

1.1. Co je cílem pilotního projektu......................................................................................... 51.2. V čem tkví inovativnost testované technologie............................................................... 51.3. Proč je nutná inovace, která je předmětem testování ...................................................... 5

2. ÚVOD .................................................................................................................................... 73. METODIKA A VÝSLEDKY ................................................................................................ 84. ZÁVĚR................................................................................................................................. 175. PŘÍLOHY............................................................................................................................. 18

5





BUDĚJOVICÍCH

1. Cíl

1.1. Co je cílem pilotního projektu

Cílem projektu je začlenit inovativní technologii preventivně - terapeutických opatření

do chovu kapra obecného. Navržené inovativní technologie mají snížit ztráty vzniklé

napadením ryb a jiker patogenními činiteli, mezi které řadíme plísně, bakterie, parazity a viry,

a tím zvýšit efektivitu chovného procesu. Technologie musí splňovat parametry dlouhodobé

udržitelnosti spolu s minimálním zatížením vodního prostředí a ryb. V případě úspěšné

realizace záměru projektu budou nové technologie aplikovatelné pro všechny chovy, které se

každoročně potýkají se zvýšenými ztrátami ryb způsobenými vybranými infekčními agens.

Technologie tedy může sloužit jako modelová při řešení obdobných problémů spojených se

zvýšenými ztrátami ryb z infekčních důvodů.

1.2. V čem tkví inovativnost testované technologie

Inovativnost projektu spočívá v ověření univerzálně platných postupů, které budou

lépe chránit jikry, juvenilní, remontní, generační a tržní ryby před působením patogenních

agens. Takto inovované chovatelské postupy mají za cíl vytvořit stabilní preventivně –

terapeutickou technologii odchovu kapra obecného. Pilotním projektem ověřená technologie

může následně sloužit jako modelová pro další chovy.

1.3. Proč je nutná inovace, která je předmětem testování

Dostupná léčiva pro ryby mají často nejasné složení a nedefinované nebo neúplné

aplikační schéma, které je v praxi těžko využitelné. V důsledku zavedení preventivních

léčebných postupů s kyselinou peroctovou dojde ke snížení ekologického zatížení životního

prostředí zejména následnou aplikací antibiotik a léčiv, která se z prostředí a organismů

odbourávají dlouhou dobu. Dále předpokládáme snížení ekonomických nákladů vydaných za

dosud užívaná terapeutika, která mnohdy nemají proti danému patogennímu agens ani

ověřenou účinnost. Zavedením testované inovativní technologie dojde k poklesu ztrát

zejména u mladších věkových kategorií ryb, a tím následně ke zvýšení stávající produkce

6





BUDĚJOVICÍCH

kapra obecného. Zároveň ověřená technologie pilotním projektem může následně sloužit jako

modelová při řešení obdobných problémů v jiných odchovnách. Zavedením systému s

důslednější prevencí dojde k zlepšení podmínek pro odchov a produkci kapra obecného.

7





BUDĚJOVICÍCH

2. Úvod

V rámci pilotního projektu byla testována technologie chovu kapra obecného

s využitím postupu založeného na preventivní aplikaci kyseliny peroctové do vodního

prostředí za účelem snížení ztrát jiker a ryb v průběhu chovného procesu. Z dosavadních

výsledků se kyselina peroctová jeví jako vhodný preventivně terapeutický prostředek pro

ošetření jiker a ryb v boji proti ektoparazitům, bakteriím a plísním. Technologie byla

přizpůsobena konkrétním podmínkám daného chovného zařízení s možnou aplikovatelností

v dalších podobně zaměřených odchovnách ryb.

Sudova, E; Straus, DL; Wienke, A; Meinelt, T. 2010. Evaluation of continuous 4-day exposure to peracetic acid as a treatment for Ichthyophthirius multifiliis. PARASITOLOGY RESEARCH 106 (2): 539-542..

Meinelt, T; Matzke, S; Stuber, A; Pietrock, M; Wienke, A; Mitchell, AJ; Straus, DL. 2009. Toxicity of peracetic acid (PAA) to tomonts of Ichthyophthirius multifiliis. DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS 86 (1): 51-56..

Verner-Jeffreys, DW; Joiner, CL; Bagwell, NJ; Reese, RA; Husby, A; Dixon, PF. 2009. Development of bactericidal and virucidal testing standards for aquaculture disinfectants. AQUACULTURE 286 (3-4): 190-197..

Meinelt, T; Staaks, J; Staaks, G; Stueber, A; Braunig, I. 2007. Anti-parasitic effects of peracetic acid (PAA) to free infective stages (Theronts) of the white spot disease, Ichthyophthirius multifiliis in vitro. DEUTSCHE TIERARZTLICHE WOCHENSCHRIFT 114 (10): 384-387.

Yi, Yang-Lei; Lu, Cheng; Hu, Xue-Gang; et al. 2012: Antiprotozoal activity of medicinal plants against Ichthyophthirius multifiliis in goldfish (Carassius auratus) PARASITOLOGY RESEARCH, 111 (4), 1771- 1778.

Marchand, Pierre-Andre; Thuy-My Phan; Straus, David L.; et al. 2012: Reduction of in vitro growth in Flavobacterium columnare and Saprolegnia parasitica by products containing AQUACULTURE RESEARCH, 43 (12), 1861-1866.

Zusková, E., Máchová, J., Velíšek, J., Gela, D., 2011. Možnosti využití kyseliny peroctové v rybářské praxi. FROV JU Vodňany, Edice Metodik, č. 109, 26 s.

8





BUDĚJOVICÍCH

3. Metodika a výsledky

V laboratorních podmínkách výzkumného subjektu FROV VÚRH Vodňany byly provedeny

následující testy:

1) testy toxicity

Metodika: Byly provedeny testy akutní toxicity na vodních organismech (Cyprinus carpio) –

standartní a modifikovaná verze (použití larválního stadia kapra obecného). Dále byl

proveden modifikovaný embryolarvální test na kapru obecném. Jako testovaná látka byl

použit přípravek Persteril 36%, který obsahuje kyselinu peroctovou (CH3CO3H), peroxid

vodíku (H2O2) a kys. octovou (CH3CO2H). Testy byly prováděny dle směrnic OECD

v laboratoři akreditované Českým institutem pro akreditaci o.p.s. pro testy akutní toxicity

na vodních organismech. Metodicky bylo postupováno podle standardního operačního

postupu, který vychází z norem:

ČSN EN ISO 7346-2 Jakost vod - Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní

ryby - OECD 203

ČSN EN ISO 12890 (75 7763) - Jakost vod - Stanovení toxicity pro embryonální a larvální

stadia sladkovodních ryb - OECD 210 (modifikce – viz níže)

Podmínky modifikovaného embryolarválního testu – teplota vody 18-20°C, nasycení vody

kyslíkem – 65-98%. Jikry byly po dobu 4 dnů vystaveny koncentraci odpovídající 1, 2 a

3mg/l KPO. V dalším průběhu byla již vývojová stadia ponechána na čisté vodě. Test

probíhal 34 dní. V průběhu testu (den 9, 19, 25, 31 a 34) byly embrya a larvy odebírány a

fixovány ve formalínu za účelem přesného zkoumání fáze ontogenetického vývoje a

popisu růstových a morfologických změn.

Výsledky: Na podkladě výsledků modifikovaného embryolarválního testu nebyl u žádné

z testovaných koncentrací zaznamenán negativní vliv KPO na líhnivost a životaschopnost

embryí. Sledované parametry ontogeneze byly u všech skupin srovnatelné s kontrolou.

Výsledky testů akutní toxicity jsou uvedeny v tabulce 11.

Na podkladě provedených testů a z hlediska speciálních rizik lze Persteril dle zákona č.

356/2003 Sb., o chemických látkách a přípravcích ve znění pozdějších předpisů a jeho

prováděcí vyhlášky č. 389/2008 Sb. označit větou R51: toxický pro vodní organismy 1

mg.l-1 < LC50 (EC50, ErC50) ≤ 10 mg.l-1 .

9





BUDĚJOVICÍCH

Z výsledku testů vyplívá, že larvy kapra jsou vůči persterilu vysoce citlivé a aplikovaná

koncentrace k tomuto vývojovému stadiu by neměla překročit 1 mg/l KPO (tj. 2,5 mg/l

Persterilu). Persteril má nízký terapeutický index vyjadřující měřítko bezpečnosti léčiva -

je to poměr dávky léčebného přípravku, která vyvolává léčebný účinek, k dávce

způsobující úhyn. Nízký terapeutický index Persterilu tedy znamená, že práh toxicity je

blízko účinné léčebné dávce a při nedůsledné aplikaci zde hrozí riziko předávkování.

Z těchto důvodů je třeba dbát na zvýšenou opatrnost při práci s léčivem a před každou

aplikací Persterilu se raději poradit s odborníkem. Při aplikaci KPO je také nutné

přihlédnout k možné přítomnosti zooplanktonu, který je vůči této látce nejcitlivější –

v období přechodu larev na přirozenou potravu tedy aplikaci KPO v terapeutických

koncentracích nedoporučujeme.

Tab.1: Výsledky provedených testů toxicity (doplněné i o další důležité organismy testované

v předchozích letech)

Název testu Použitý organismus Výsledek (mg/l Persterilu)

Inhibiční test Desmodesmus subspicatus 72hIC50 = 4

Akutní imobilizační test Daphnia magna Straus 48hEC50 = 2

Test akutní toxicity Poecilia reticulata 96hLC50 = 7

Test akutní toxicity Cyprinus carpio 96hLC50 = 4

Test akutní toxicity larvy Cyprinus carpio 48hLC5 = 2,9

Příloha 1: Protokol testu toxicity k provedeným testům toxicity, fotodokumentace a grafické

znázornění výsledků embryolarválního testu toxicity.

2) testy účinnosti KPO na jikrách kapra obecného

Metodika: Pokus na jikrách probíhal v povýtěrovém období. Do čtyř kolébek o objemu vody

50 l bylo nasazeno vždy 5 skupin jiker v plastových kelímcích s otevřenou horní částí

(nasazené jikry nebyly zpočátku z důvodů prevence manipulačního poškození přesně

počítány, až při vyhodnocování byly výsledné přeživší a odumřelé počty jiker pro účely

porovnání převedeny na procenta). Do kolébek byla aplikována KPO v den 1 a den 3,

v koncentracích uvedených podle následujícího schématu:

kolébka 1: kontrola (bez aplikace KPO)

10





BUDĚJOVICÍCH

kolébka 2: aplikace 1 mg/l KPO



Během testu byla denně měřena teplota vody, která se pohybovala v rozmezí 12,5-16,5°C.

Kolébky byly dostatečně vzduchovány. Každý druhý den byla obměňována polovina lázně

(25l vody). V průběhu dní 6, 7 a 8 byly odstraňovány a počítány odumřelé jikry. Na závěr

testu v den 9 byli spočítáni vykulení jedinci. Výsledky byly statisticky vyhodnoceny

analýzou variance (ANOVA) a multiple range testem (Statgraphics v. 5.0).

Výsledky: Statisticky významné rozdíly (P<0.01) byly zaznamenány po aplikaci 3 mg/l KPO

jak v počtu živých jiker, tak i v počtu vykulených jedinců (tabulka 2). Na konci testu se po

dvakrát provedené aplikaci 3 mg/l KPO (den 1 a 3) snížil počet odumřelých jiker o 32%.

Z výsledků vyplývá, že aplikace KPO v koncentraci 3 mg/l statisticky významně snižuje

napadení jiker plísní. Tato použitá koncentrace se na podkladě testů toxicity jeví jako

bezpečná pro aplikaci k jikrám – zvýšenou opatrnost při aplikaci je však třeba dát na

přirozený zooplankton.

Tab.2: Mortalita a % vykulených jedinců v jednotlivých koncentracích

SKUPINA MORTALITA ± SD (%) VYKULENÍ JEDINCI (%)

kolébka 1(kontrola)

70,4 ± 4,1 2,5

kolébka 2(1mg/l KPO) 91,6 ± 6,6 1,2

kolébka 3(2mg/l KPO)

95 ± 4,7 2,8

kolébka 4(3mg/l KPO) 38,7± 7,3 17

Příloha 2: Fotodokumentace

3) testy vyhodnocování vlivu KPO na plůdku kapra obecného (šupinaté a lysé formy) pomocí

hematologických a biochemických ukazatelů a na podkladě histopatologického vyšetření kůže

Metodika: Celkem 18 šupináčů (průměrná hmotnost - 244±58g) a 18 lysců (průměrná

hmotnost - 114±29g) bylo rozděleno do šesti skupin po 6ti rybách a umístěno do 100l

akvárií (3 akvária lysci a 3 akvária šupináči). Ryby byly jeden den ponechány na čisté

11





BUDĚJOVICÍCH

vodě, v průběhu dalších třech dnů byla vždy bezprostředně po výměně poloviny objemu

vody do pokusných akvárií (skupiny S1, S2, L1, L2) aplikována kyselina peroctová (ve

formě 36% Persterilu) dle následujícího schématu:

skupina KS (kontrola šupináč): 0 mg/l KPO

skupina S1 (šupináč): 1 mg/l

skupina S2 (šupináč): 2 mg/l

skupina KL (kontrola lysec): 0 mg/l KPO

skupina L1 (lysec): 1 mg/l

skupina L2 (lysec): 2 mg/l

V průběhu testu byla denně (před výměnou vody) odebrána voda z akvárií pro stanovení

vybraných hydrochemických ukazatelů kvality vody (CHSKMn, pH a NH4+). Po 3 dnech

aplikace byla rybám z ocasní cévy odebrána krev a ryby byly následně usmrceny. Dále byl

vždy třem rybám z každé skupiny odebrán kus kůže se svalovinou, který byl bezprostředně

po odběru fixován ve formalínu a odeslán na histopatologické vyšetření na VFU Brno.

Odebraná krev byla heparinizována a dále použita na stanovení vybraných biochemických

a hematologických ukazatelů.

Biochemický profil krve byl stanoven z krevní plazmy získané odstředěním krve na

biochemickém analyzátoru VETTEST 8008 (IDEXX Laboratories Inc. U.S.A.) firmy

Medisoft. Přístroj pracuje na principu suché chemické a kolorimetrické analýzy.

Vyhodnocení probíhá na selektivních testovacích discích (Multi – laier film slides, Kodak),

laserovým čtením bar kódů. Stanoveny byly následující parametry: glukóza (GLU),

celkové bílkoviny (TP), albuminy (ALB), celkové globuliny (GLOB), alanin

aminotransferáza (ALT), kreatinkináza (CK), laktát dehydrogenáza (LDH), vápník (Ca2+),

hořčík (Mg2+), anorganický fosfát (PHOS).

Hematologické rozbory – počet erytrocytů (RBC), koncentrace hemoglobinu (Hb),

hematokrit (PCV), střední barevná koncentrace (MCHC), hemoglobin erytrocytu (MCH) a

střední objem erytrocytu (MCV) - byly prováděny podle Jednotných metod

hematologického vyšetřování ryb (Svobodová et al., 1991). Výsledky byly vyhodnoceny a

porovnány statistickým programem STATISTICA (verze 8.0 pro Windows, StatSoft) za

použití dvoucestného ANOVA testu a byly zde vyhodnoceny statisticky významné rozdíly

na hranici významnosti (P<0,05 a P<0,01)

12





BUDĚJOVICÍCH

Výsledky: Po aplikaci KPO u šupinaté formy kapra obecného došlo ve skupině S2

k statisticky významnému poklesu hematokritu (P<0,05). Další měřené hematologické a

biochemické parametry se u šupinaté formy kapra nelišily.

U kapra lysce došlo ke změnám pouze u některých biochemických ukazatelů. Po aplikaci

KPO se snížila aktivita laktátdehydrogenázy a lehce se změnilo množství celkových

bílkovin a hladiny iontů vápníku a hořčíku v plazmě. Změnu aktivity LDH lze přičítat

spíše menšímu množství naměřených jedinců, kde se ve skupině KL a L1 podařilo naměřit

jen 4 plazmy ze 6ti. Hydrochemické ukazatele vody se u žádné z testovaných skupin

statisticky významně nelišily. Histologickým vyšetřením byla po aplikaci obou koncentrací

KPO u lysé i šupinaté formy zjištěna myodystrofie v individuálně různém rozsahu a

zmnožení pohárkových buněk v kůži. Zjištěné patologické změny jsou mírné a dá se

předpokládat, že po ukončení léčby se změněné struktury navrátí do fyziologického stavu.

Na podkladě změn se lysá forma kapra jeví jako citlivější k aplikaci KPO. Veškeré zjištěné

změny hematologických a biochemických ukazatelů se však stále pohybovaly ve

fyziologickém rozmezí a lze tedy konstatovat, že testované aplikační schéma KPO nemá

výraznější negativní vliv na zdravotní stav žádné z testovaných forem kapra obecného.

Příloha 3: Výsledková tabulka a grafy změn hematologických a biochemických ukazatelů

Technologie preventivního dávkování KPO byla v provozních podmínkách Třeboňského

rybářství testována na 3 vývojových kategoriích ryb (jikry, plůdek, remontní ryby).

1) Testování KPO na jikrách kapra obecného

Metodika: Jikry kapra obecného byly umístěny do 10ti inkubačních lahví – 2 řady po pěti

lahvích. U pokusných jiker (1 celá řada) byla k jikrám 2x denně aplikována KPO

v koncentraci 2 mg/l po dobu 3 dnů (do vykulení). Kontrolní skupiny byly ponechány na

čisté vodě. Koncentrace KPO pro jikry byla zvolena na podkladě testů provedených v

laboratorních podmínkách výzkumného subjektu FROV, VÚRH Vodňany – přihlédnuto

bylo k teplotě vody 20°C. Na konci pokusu byla hodnocena míra oplozenosti jiker v

jednotlivých skupinách. Test byl proveden na jikrách lysé formy kapra obecného (M2 x

M72) a na jikrách formy šupinaté (Tš x Tš)

13





BUDĚJOVICÍCH

Výsledky: Míra oplozenosti jiker byla posuzována na podkladě manuálního odstraňování

uhynulých jiker (objem odstraněných jiker/objemu nasazených) z aplikované a kontrolní

skupiny a následného procentuálního zhodnocení.

Tab.3: Přehled účinnosti testovaných antimykotik

% odstraněných jiker kontrola pokus

(M2 x M72) 12% 5%

(Tš x Tš) 14% 8%

Koupele jiker v kyselině peroctové nebyly náročné. Jikry dobře snášely KPO, a tudíž

nebylo nutné zasahovat do procesu inkubace. V pokusné skupině byl pozorován větší počet

zdravých jiker, přesto i zde docházelo k mírným ztrátám – několik chomáčů zaplísněných

jiker. Embryo z ošetřených jiker vykazovalo vysokou kvalitu bez známek malformací. Na

podkladě výsledků se kyselina peroctová jeví jako vhodný prostředek k ošetřování jiker

kapra obecného.


2) Testování KPO na plůdku kapra obecného se zaměřením na monitoring kvality vody

Metodika: Pokus probíhal v 6ti akváriích s objemem vody 60 litrů, kam bylo umístěno vždy

5 ks kapra K2 o průměrné hmotnosti 392g. Voda do akvárií byla dovezena z chovného

zařízení Mokřiny – běžně používaná pro odchov jiker. Každé akvárium bylo dostatečně

provzdušňováno. V průběhu čtyřdenního testu byla do pokusných akvárií denně

aplikována KPO v koncentraci 1 mg/l, a to 1x (skupina 1) a 2x (skupina 2) denně.

Kontrolní skupiny (K1 a K2) byly ponechány bez aplikace KPO. Každý den před aplikací

KPO byla odebrána voda pro stanovení následujících parametrů: amoniak, dusitany,

CHSK Mn, BSK5.

Výsledky: Neprokázal se žádný výrazný nebo jednoznačný efekt aplikace KPO na

nejsledovanější hydrochemické parametry vody. Došlo zde k mírnému zvýšení CHSKMn

ve všech aplikovaných pokusných akváriích, což je důsledek vnosu organické látky

(kyseliny peroctové) do nádrže. O rychlém rozkladu a minimálnímu zatížení prostředí po

14





BUDĚJOVICÍCH

aplikaci KPO však svědčí fakt, že ve skupině 2 (oproti skupině 1) nedošlo k výrazně

vyššímu navýšení z důvodů dvoufázové aplikace. Ze všech skupin se poněkud vymyká K1,

kde pravděpodobně došlo k zanesení bakterií schopných nitrifikace (zřejmě

prostřednictvích vzduchovacího zařízení po předchozím testu, kde byla zapojena

recirkulace) - byl zde celou dobu pokusu nižší amoniak a nejvyšší dusitany a vysoká

hodnota BSK5. Z důvodů kvalitní reprodukce testu tuto paralelní skupinu v některých

grafech neuvádíme – viz příloha 5.

3) Testování KPO na tržních rybách kapra obecného

Metodika: Testování probíhalo opakovaně 3x v období červen - září 2012. V období červen-

červenec probíhal test na kv lysec, v srpnu na kv šupináč a v září na K3 lysec. Každý test

trval 14 dní. Dospělé ryby, vážící 1700±420g, byly po odlovu rozděleny do 2 žlabů

(rozměry 2,2 x 6 x 1 m) a aklimatizovány po dobu jednoho týdne. Před aplikací bylo 5 ryb

z každé skupiny parazitologicky vyšetřeno a byl zhodnocen jejich zdravotní stav. Druhý

týden testu byla k pokusné skupině 2 x denně aplikována KPO v koncentraci 1 mg/l. Po

dobu aplikace byl minimálně na 2 hodiny zastaven přítok vody do systému, aby se zde

udržela aplikovaná koncentrace KPO. V průběhu testu pokusu byly odstraňovány

odumřelé kusy. Na konci testu byla zhodnocena mortalita v kontrolní a pokusné skupině a

byla zhodnocena parazitární prevalence u obou skupin.

Výsledky:

Pokus 1 - kv lysec

Mortalita v obou skupinách dosahovala 10%. Teplota vody byla 21,5 °C. Vylehčení ryb

po pokusu 17,5%. U pokusných a kontrolních ryb bylo u některých jedinců patrné mírné

zaplísnění zejména v místech mechanického poškození po manipulaci – po vytažení

z vody nebyla zaplísněná místa patrná. Po sedmidenní aplikaci KPO nebyly již u pokusné

skupiny viditelné klasické plísňové nárosty, ale na některých místech byla jasně

ohraničená červená ložiska – předpokládáme, že tato ložiska zůstala na místech

předchozího napadení plísní. Parazitologické vyšetření je uvedeno v tabulce 4.

Pokus 2 – kv šupináč

Mortalita u kontrolní skupiny dosáhla 25%, u pokusné skupiny 5%. Teplota vody byla

23,5°C. Vylehčení ryb po pokusu 19,5%. Parazitologické vyšetření je uvedeno v tab. 4.

15




VODJIHOČESKÁ UNIVERZITAV ČESKÝCH

BUDĚJOVICÍCH

Pokus 3 – K3 lysec

Mortalita u kontrolní skupiny dosáhla 12%, u pokusné skupiny 4%. Teplota vody byla

19°C. Vylehčení ryb po pokusu 8%. Parazitologické vyšetření je uvedeno v tab. 4.

Tab. 4: Parazitologické vyšetření kůže a žaber před aplikací a po aplikaci KPO

pokus skupina před aplikací po aplikaci

Pokus 1

kv lyseckontrola 3ks Dactylogyrus spp ++

4ks Trichodina spp. ++

3ks Dactylogyrus spp. +

3ks Trichodina ++

pokus 4ks Dactylogyrus spp +

Pokus 2

kv šupináčkontrola

4ks Gyrodactylus ssp. ++

2ks Diplozoon paradoxum +

2ks Trichodina spp. +

5 ks Gyrodactylus spp. ++

1ks Diplozoon paradoxum +

pokus -

Pokus 3

K3 lyseckontrola 2ks Gyrodactylus spp. ++

4ks Trichodina spp. +

3ks Gyrodactylus spp. +

3ks Trichodina +

pokus 1ks Gyrodactylus spp. +

Z výsledků je patrné, že aplikace KPO ve dvou testech významně snížila mortalitu

ošetřených ryb (graf 1). Vliv aplikace taktéž znatelně snížil parazitární prevalenci.

Graf 1: Grafické znázornění mortality u kontrolních a pokusných skupin


16





BUDĚJOVICÍCH

4) Testování KPO na tržních rybách kapra obecného v povánočním období (prosinec 2012)

Metodika: V povánočním období byly kapři z prodeje vráceny na sádky a po dobu 1 týdne

byla k pokusným rybám aplikována KPO v koncentraci 1 mg/l. Kontrolní ryby byly

ponechány bez aplikované KPO. Po dobu aplikace byl minimálně na 2 hodiny zastaven

přítok vody do sádky, aby se zde udržela aplikovaná koncentrace KPO. Před a po aplikaci

byl posouzen zdravotní stav ryb.

Výsledky:

Mortalita v obou skupinách dosahovala 6%. Teplota vody byla 4°C. Hmotnost ryb

2480±640g Na počátku testu bylo u pokusných a kontrolních ryb patrné poškození

povrchu kůže v různém stupni (dáno manipulací ryb). Po týdenní aplikaci bylo u kontrolní

skupiny viditelné zaplísnění, avšak po vytažení z vody nebyla zaplísněná místa pro

fotografické vyhodnocení pomocí softwaru dobře identifikovatelná. Po sedmidenní

aplikaci KPO k pokusné skupině byla na rybách viditelná ohraničená ložiska bez

plísňových nárostů - narušení povrchu kůže však bylo stále patrné. Pro kvalitnější

vyhodnocení by bylo zapotřebí tento test prodloužit alespoň o měsíc a aplikaci vyhodnotit

na podkladě rozdílné mortality. Neméně zajímavé by bylo další sledování změn na kůži –

po jak dlouhé době od aplikace dojde k opětovnému zaplísnění nebo vyhojení ran.


17





BUDĚJOVICÍCH

4. ZávěrZávěrečné zhodnocení aplikace KPO k jednotlivým u kapra obecného lze shrnout

takto:

1) Aplikace KPO k jikrám se osvědčila jako vhodná ke snížení ztrát způsobených zejména

plísněmi rodu Saprolegnia. Při aplikaci je vždy nutné zohlednit hydrochemické parametry

vody (zejména teplotu), na které jsou jikry inkubovány a podle toho upravit dávku KPO.

Obecně lze říci, že čím je voda teplejší, tím účinnější bude aplikovaná koncentrace KPO –

při vyšších teplotách je tedy pro ošetření jiker zapotřebí nižší koncentrace KPO (do 2 mg/l

KPO). Dále se prokázala závislost KPO na organickém znečištění vody – při vyšším

organickém zatížení je vhodné zvýšit aplikované dávky KPO (z důvodů jejich rychlé

degradace) nebo lépe (z bezpečnostních důvodů) nižší doporučenou koncentraci KPO

opakovat v kratších intervalech..

2) Aplikace KPO k plůdku kapra šupináče a lysce poukázala na vyšší citlivost lysé formy

kapra obecného ke kyselině peroctové – v tomto případě půjde zřejmě o snazší narušení

hlenové vrstvy kožního povrchu oproti rezistentnějšímu hlenovito - šupinatému povrchu

kůže. Tato hypotéza by pro přesnější definování probíhajících procesů potřebovala

provedení dalších pokusů s následnými podrobnějšími histologickými analýzami.

3) Aplikace KPO k tržním rybám je velice účinné preventivní opatření vhodné ke

snížení celé škály parazitárních onemocnění u ryb. Rovněž se v testech průměrně o

polovinu snížila mortalita ryb, která bývá způsobena infekcemi smíšenými (bakterie,

parazité, viry, plísně) uplatňujícími se zejména při silném oslabení organismu. Této

preventivně-aplikační technologie lze využít ve všech chovech ryb, kde se v určitém

období pravidelně potýkají se zvýšenými ztrátami ryb v důsledku kombinovaných infekcí.

V rámci parazitární účinnosti lze KPO použít zejména na parazity nevytvářející

rezistentnější vývojové formy, jako jsou vajíčka a cysty. Zde je pak nutné aplikaci podpořit

„agresivnější“ terapií. Obecně lze říci, že preventivní aplikací KPO lze celou řadu

onemocnění potlačit nebo minimálně zpomalit jejich rychlý průběh a poskytnout tak

rybářům cenný čas k nastavení další strategie zlepšení zdravotního stavu ryb.

18





BUDĚJOVICÍCH

5. PřílohyProtokol k provedenému testu toxicity

Tabulka průběhu testu toxicity na kapru obecném

Koncentrace persterilu 40%(konc. KPO)

Mortalita do 24 hodin

Mortalita

48 hodin

Mortalita

72 hodin

Mortalita+96 hodin

Celková mortalita

(%)

1 (0,4) 0 0 0 0 0

2 (0,8) 0 0 0 0 0

3 (1,2) 0 0 0 0 0

4 (1,6) 0 0 1 3 40

5 (2,0) 0 2 5 3 100

7 (2,8) 2 3 5 - 100

10 5 5 - - 100

15 10 - - - 100

19





BUDĚJOVICÍCH

Grafy mortality, růstu a hmotnosti kapra obecného v průběhu embryolarválního testu

Fotodokumentace

20





BUDĚJOVICÍCH

Příloha 2

Aplikace KPO do kolébek s jikrami kapra obecného uložených v plastových nádobách

Příloha 3

Výsledková tabulka naměřených hodnot biochemických a hematologických ukazatelů –

šupinatá forma kapra

KS S1 S2PCV l/l 0,27 ± 0,03a 0,26± 0,02ab 0,22 ± 0,04b P < 0,05Hb g/l 62,96 ± 8,20a 61,35 ± 6,95a 52,82 ± 6,13a

Ery T/l 1,27 ± 0,38a 1,34 ± 0,15a 1,09 ± 0,16a

MCV fl 225,35 ± 48,35a 198,26 ± 20,99a 199,86 ± 33,42a

MCH pg 52,08 ± 10,44a 46,26± 5,46a 49,39 ± 9,44a

MCHC l/l 0,23± 0,02a 0,23 ± 0,01a 0,25 ± 0,04a

TP g/l 23,33 ± 3,61a 23,33 ± 2,34a 25,33 ± 5,05a

ALB g/l 1,00 ± 1,10a 1,33 ± 1,03a 2,33 ± 2,34a

GLOB g/l 22,17 ± 2,48a 22,00 ± 1,41a 23,00 ± 2,76a

Ca mmol/l 2,20 ± 0,13a 2,16 ± 0,11a 2,32 ± 0,18a

PHOS mmol/l 1,69 ± 0,27a 1,64 ± 0,11a 1,52 ± 0,21a

Mg mmol/l 0,88 ± 0,29a 0,84 ± 0,04a 0,90 ± 0,07a

GLU mmol/l 4,95 ± 1,26a 6,84 ± 1,33a 5,90 ± 1,53a

ALT μkat/l 0,21 ± 0,1a 0,19 ± 0,11a 0,29 ± 0,49a

CK μkat/l 27,93± 5,84a 25,27 ± 3,31a 28,02 ± 1,81a

LDH μkat/l 7,42 ± 2,55a 8,01 ± 5,38a 5,67 ± 4,15a

21





BUDĚJOVICÍCH

Výsledková tabulka naměřených hodnot biochemických a hematologických ukazatelů – lysá

forma kapra

KL L1 L2PCV l/l 0,29 ± 0,03a 0,29± 0,02a 0,30 ± 0,05a

Hb g/l 67,26 ± 8,80a 66,07 ± 6,28a 69,47 ± 8,42a

Ery T/l 1,22 ± 0,36a 1,31 ± 0,35a 1,22 ± 0,20a

MCV fl 266,68 ± 106,72a 231,74 ± 54,21a 242,33 ± 44,79a

MCH pg 58,69 ± 15,37a 52,41± 10,27a 58,20 ± 6,88a

MCHC l/l 0,23± 0,03a 0,23 ± 0,01a 0,23 ± 0,02a

TP g/l 20,67 ± 2,50ab 17,50 ± 2,74a 22,40 ± 3,58b P < 0,05ALB g/l 0,33 ± 1,52a 0,00 ± 0,00a 1,40 ± 1,52a

GLOB g/l 20,33 ± 2,16a 17,50 ± 2,74a 21,00± 2,12a

Ca mmol/l 2,18 ± 0,16ab 2,00 ± 0,04a 2,32 ± 0,29b P < 0,05PHOS mmol/l 1,81 ± 0,33a 1,66 ± 0,16a 2,21 ± 0,82a

Mg mmol/l 0,93 ± 0,09a 0,79 ± 0,05b 0,93 ± 0,12a P < 0,05GLU mmol/l 5,99 ± 1,51a 5,20 ± 1,26a 5,65 ± 0,54a

ALT μkat/l 0,35 ± 0,33a 0,99 ± 1,96a 1,11 ± 2,17a

CK μkat/l 27,69± 4,04a 27,50 ± 2,83a 25,00 ± 2,12a

LDH μkat/l 15,67 ± 5,74a 12,41 ± 6,75b 6,62 ± 2,66ab P < 0,05

Grafické zpracování nejvýznamnějších změn hematologických a biochemických ukazatelů

22





BUDĚJOVICÍCH

Příloha 4

Aplikace KPO k jikrám kapra obecného

23





BUDĚJOVICÍCH

Příloha 5

Grafy sledovaných hydrochemických parametrů

AMONIAK

DUSITANY

BSK5

CHSKMn

24





BUDĚJOVICÍCH

Příloha 6

Fotodokumentace testu na kv lysec

Fotodokumentace testu na kv šupináč

25





BUDĚJOVICÍCH

Fotodokumentace testu na K3 lysec

26





BUDĚJOVICÍCH

Kontrola zdravotního stavu ryb

Měření kyslíku a teploty

27





BUDĚJOVICÍCH

Příloha 7Fotodokumentace

Zdravotní prohlídka ryb před pokusem

Pokusné a kontrolní sádky

Documents

TECHNICKÁ ZPRÁVA PILOTNÍHO PROJEKTUeagri.cz/public/web/file/289659/Vvyuziti_kyseliny...Marchand, Pierre-Andre; Thuy-My Phan; Straus, David L.; et al. 2012: Reduction of in vitro