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TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE : DE LA FISH AUX PUCES A ADN. KARINE CORDIER-COUREL XXème colloque ATC Aix-en-Provence - 2010. Prolonger votre offre de soins, jour après jour. LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE. Cytogénétique conventionnelle. Cytogénétique moléculaire. - PowerPoint PPT Presentation
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TECHNIQUES DE
CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE :
DE LA FISH AUX PUCES A ADN
KARINE CORDIER-COURELXXème colloque ATCAix-en-Provence - 2010 Prolonger votre offre de soins, jour après jour
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LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE
Cytogénétique conventionnelle
Biologie moléculaire
Cytogénétique moléculaire
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DE LA FISH AUX PUCES A ADN
FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence)• Principe• Différents types de sondes• Applications• Avantages et inconvénients
CGH (Hybridation Génomique Comparative)• Principe• Sensibilité
FISH et CGH : Limites des techniques Puces à ADN
• Définitions• Différents types de puces• CGH-array• Puces à SNP• Intérêts, applications, inconvénients
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FISH : Principe
FISH = Fluorescence In Situ Hybridization
Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un génome entier : centromères, régions sub-télomériques, loci spécifiques et peintures
Détection de délétions, identification de translocations ou d’autres réarrangements chromosomiques
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FISH : Principe
CIBLESONDE
ADN double brin (mitoses ou
noyaux interphasiques)
ADN double brin marqué
T A A G G A T A A T T C C T A T
Dénaturation thermique
Hybridation complémentaire
37°C O/N
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FISH : Principe
LavagesElimination des
sondes non spécifiquement fixées
La sonde moléculaire se fixe sur sa cible
Pas de sonde fixée = délétion
Analyse au microscope en épifluorescence (filtres adaptés aux différents fluorochromes)
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FISH : Différents types de sondes
Peintures chromosomiques
M-FISHSondes centromériques
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FISH : Différents types de sondes
Sondes télomériques
Loci spécifiques (Tuple1 / N85A3)
Sondes de BACsRP11-335E8 2p12
RP11-356H17 2p13.3
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FISH : Sondes de BAC
Bacterial Artificial Chromosome = ADN circulaire bactérien dans lequel un fragment d’ADN (du génome humain) a été inséré
Sonde de BAC = sonde fabriquée à partir d’une séquence d’ ADN connue insérée dans un vecteur de clonage bactérien
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FISH : Choix des BACs
Sélection des BACs selon leur localisation chromosomique (en fonction du réarrangement à étudier) ou la séquence d’un gène d’intérêt
Séquençage du génome humain
=> Cartographie des chromosomes => bases de données
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FISH : Choix des BACs
National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=9606
University of California Santa Cruz http://genome.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway
Ensembl Genome Browserhttp://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html
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NCBIFISH : Choix des BACs
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NCBIFISH : Choix des BACs
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FISH : Fabrication de sondes de BAC
Sonde prête à l’emploi pour
la FISH
BAC
Culture bactérienne
Extraction de l’ADN bactérien
Marquage par nick-translation (DNaseI, ADN pol,
dNTP, dUTP*)
Technique « lourde » 6 à 8 jours
Amplification par PCR (dNTP, amorces,
ADN pol)
Extraction et fragmentation
de l’ADN bactérien
Marquage par nick-translation (DNaseI, ADN pol,
dNTP, dUTP*)
Technique rapide 3 à 5 jours
cot 1, AcNa, EtOH
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FISH : Applications
Confirmation d’anomalies suspectées par le caryotype Précision de points de cassure Origine des marqueurs, dm, hsr Détection des aneuploïdies Détermination du sexe Microdélétions Suivi de traitements, recherche de maladie résiduelle Suivi d’allogreffe (avec sexe opposé) de moelle
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FISH : Avantages et Inconvénients
Avantages
Technique sensible (noyaux et métaphases)
Grand choix de sondes (commerciales ou « maison »)
Inconvénients Technique lourde nécessitant des
traitements différents selon la nature de l’échantillon à analyser (métaphases, noyaux, tissus)
Analyse ciblée : Nécessité d’avoir une idée préalable de la région chromosomique ou du gène à étudier
3 cibles maximum par test
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CGH : Principe
ADN à tester
Co-hybridation
ADN de référence
nb copies ADN test > nb copies ADN de référence => amplification
nb copies ADN de référence > nb copies ADN test => délétion
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FISH et CGH : Limites des techniques
FISH
Etude cibléeRésolution = 100-300Kb
CaryotypeCGH
Analyse globale du génomeRésolution = 5-10 Mb
Comment réaliser une analyse globale du génome et augmenter la résolution?
Þ Hybrider de nombreuses sondes sur un échantillon?
Þ Hybrider un échantillon sur de nombreuses sondes?
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PUCES A ADN : Définitions
Petites surfaces solides sur lesquelles un grand nombre de sondes ont été fixées
Puces à ADN = DNA arrays, DNA chips, DNA micro-arrays ou micro-
arrays
BAC-array = sondes de BACs
DNA-array = faible densité (quelques centaines à quelques milliers de sondes)
DNA micro-array = haute densité (plusieurs milliers de sondes)
puces « pangénomiques » = ensemble du génome
puces « à façon » = ciblant une fonction biologique ou une pathologie
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PUCES A ADN : Différents types de puces
Il existe trois types de technologies :
CGH-array proprement dite ( hybridation génomique comparative par rapport à un ADN de référence)
Bac-array (Array 300 Abbott, Cyto Chip Blue Gnome, …) : résolution limitée (50-200Kb)
Puces à oligo (Agilent) : meilleure résolution (oligonucléotides de 60-mer)
Puces à SNP ne nécessitant pas d’ADN de référence ( Illumina, Affymetrix) : haute résolution (oligonucléotides de 25 à 80-mer) + recherche de régions de perte d’hétérozygotie
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Extraction de l’ADN => quantification (A260nm)
=> pureté (A260nm / A280nm)
=> intégrité (migration sur gel d’agarose)
Digestion par des enzymes de restriction / Amplification par PCR
Marquage et Fragmentation
Hybridation
Lavages
Quantification du signal d’hybridation pour chaque sonde (lecture par un scanner)
Numérisation par un logiciel spécifique
PUCES A ADN : Etapes techniques
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CGH-array : Principe
Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN (ou ARN/ARN)
Co-Hybridation compétitive de séquences d’ADN (ou ARN) test et témoin marqués par fluorescence sur un grand nombre de loci spécifiques présents sur un support solide (lame de verre)
Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau de loci spécifiques et connus sur un génome entier
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ADN test marqué en CYA3
ADN de référence marqué en CYA5
Dénaturation et hybridation sur puce à ADN
Loci spécifiques (BAC / PAC / oligonucléotides de synthèse)
SCANNER
Défaut d’ADN test
Excès d’ADN test
Lame de verre
CGH-array : Principe
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CGH-array : Capture et Analyse des résultats
Ex : BAC-array / Array-300 Abbott®
DAPI IV (sondes) Cy3 (ADN Test) Cy5 (ADN Référence)
ratio T/R calculé
3 spots / clone
• 0.8 < T/R < 1.2 => pas de déséquilibre
• T/R < 0,8 => délétion
• T/R > 1,2 => amplification
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CGH-array: Exemple d’application
Dysmorphie faciale => caryotype t(5;9) + dup(9)(q?)
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Confirmation par FISH (peintures des chromosomes 5 et 9)
Peinture du chromosome 5Peinture du chromosome 9
CGH-array: Exemple d’application
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Résultats analyse sur puce Array-300 Abbott®
9p21 - CDKN2A(p16),MTAP 1,13 9p11.2 - AFM137XA11 1,35 9q21 - D9S166 1,51 9q22.3 - PTCH 1,41 9q33.2 - DBCCR1 1,08
CGH-array: Exemple d’application
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Résultats analyse sur puce IntegraGen®
CGH-array: Exemple d’application
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Puces à SNP: Principe
Les oligonucléotides spécifiques sont synthétisés directement sur la puce
Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN (ou ARN/ARN)
L’ADN à tester s’hybride avec sa séquence complémentaire fixée sur la puce
Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau des marqueurs spécifiques et connus sur un génome entier
Identification de pertes d’hétérozygotie (LOH)
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Puce SNP6.0 / Affymetrix ®
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Puces à SNP: Analyse des résultats
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Puces à SNP: Analyse des résultats
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Puces à SNP: Analyse des résultatsPuce SNP6.0 / Genotyping Console / Affymetrix ®
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Allèle Différence
Copy Number state
Segments
Fishclones (BACs)
Genomic variants (polymorphismes)
Refseq (gènes)Idéogramme / règle
Log2Ratio
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Puces à SNP: Analyse des résultats
FISH CLONES (BAC)
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Refseq (gènes)
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Puces à SNP: Analyse des résultats
Genomic Variants
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Puces à SNP: Analyse des résultats
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Puces à SNP : Résolution
SNP6.0 (Affymetrix)
Cytogenetics Array
(Affymetrix)
Copy Number Marker 1 878 785 2 761 979
SNP 945 806 400 103
RefSeq genes 12 093 (64,7%) 18 270 (97,7%)
Cancer genes 233 (73,3%) 318 (100%)
OMIM genes 8 068 (43,1%) 12 046 (97,6%)Average marker spacing
(bp) 1,629 1,086
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Puces à ADN : Intérêts
Pas de mise en culture des cellules à analyser
Analyse l’ADN de tout type de tissus
Technique hautement résolutive (< 150 Kb)
Analyse pangénomique qui ne nécessite pas d’avoir une idée préalable de chromosomes impliqués (# FISH)
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Puces à ADN : Applications
Corrélations nombre de copies / conséquences biologiques
Compréhension de maladies (Couplée à une puce à ARN )
Comparaison tumeur/tissu sain
Etude du génome des patients atteints d’une même pathologie et compréhension des mécanismes géniques
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Puces à ADN : Inconvénients
Anomalies chromosomiques équilibrées non détectables Polymorphismes (encore beaucoup d’interrogations à ce sujet) Seuil de sensibilité, mosaïques faibles? Plateau technique onéreux
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CONCLUSION
C I B L E S S U P P O R T I N T E R E T S L I M I T E S
CARYOTYPE
5-10 Mb Génome entier MétaphasesRecherche d’
Anomalies chromosomiques
Technique longue
Peu sensible pour les anomalies cryptiques (mais technique de référence en cytogénétique)
FISH
5 Mb à100-300 Kb
Chromosomes entiers
Régions spécifiques
(sub-télomèriques, centromériques, loci,…)
Métaphases
Noyaux interphasiques
Coupes de tissus
Micro-remaniements
Points de cassuresMarqueursAneuploïdieSexeSuivi de maladie
TK lourde et peu automatisable3 cibles / test
Recherche ciblée
CGH-ARRAY / PUCES ADN
10-300 Kb
Loci spécifiques
(BACs ou oligonucléotides de synthèse)
Génome entier
ADN ou ARN
Analyse detout type d’échantillon (sang, moelle, tissu sain, tumeur)
Détection de déséquilibres cryptiques non détectable par les autres techniques
Ne détecte pas les anomalies chromosomiques équilibrées
PolymorphismesMosaïques faibles
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Remerciements
Département Génétique du Laboratoire
Equipe de R&D: Azarnouche Ardalan, Anne Bazin, Catherine Destigny, Hossein Mossafa
Françoise Allamy et son équipe de FISH
Sophie Pedronno et son équipe de Biologie moléculaire