Techniques Speciales

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  • TECHNIQUES SPECIALESCULTURES CELLULAIRES

    CRIOFRACTURE

    CENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE)

    TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES TECHNIQUES LCTROPHORTIQUES

    DIFFRACTOMTRIE DE RAYONS X

  • CULTURES CELLULAIRESDefinition:La culture cellulaire dsigne un ensemble de techniques utilises pour faire crotre des cellules hors de leur organisme ("ex-vivo") ou de leur milieu d'origine, dans un but d'exprimentation scientifique ou de fcondation in vitro

    Les cellules mises en culture peuvent tre:

    1) des micro-organismes libres (bactries ou levures)

    2) des cellules "saines" prleves frachement d'un organisme (biopsie,...), on parle alors de "cultureprimaire". Ces cellules ne peuvent habituellement pas tre maintenues en culture indfiniment,notamment cause de leur nombre limit de divisions (limite de Hayflick).

    3) des cellules ayant une capacit de division non limite (on parle d'"immortalit en culture").

    4) des lignes cellulaires. Les lignes sont soit des cellules cancreuses, soit des cellules en voie decancrisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement. 5) des tranches d'organes (d'paisseur optimise selon le tissu)

  • Conditions de travailleoptimisation des conditions "atmosphriques" (ajout d'oxygne) optimisation de la composition des milieux nutritifs (ajout de certaines hormones) optimisation des supports (composition en biomolcules) culture sous agitation co-culture avec des cellules "nourricires" culture sur des tissus pralablement "tus" par un procd de conglation/dconglation inclusion dans des gouttelettes d'alginate Installation des instruments striles Transfert dans un nouveau milieu pour fragmentation de l'embryon Introduction dans le flacon de culture d'une suspension de cellules d'embryons l'aide d'une pipette strileMise l'tuve des flacons pendant 24 heures 37C Aplication pratiques:Letude des caracteres morphologiques et biologiquesLetude des biologie tissulaireLetude in vivo des cellule: les effects des hormones ou des facteurs de croissanceinteraction entre different types des cellule

  • Criofracture

  • CENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE)

    La centrifugation est une technique utilisant la force centrifuge pour sparer des fluides de densits diffrentes ou pour isoler des lments solides en suspension dans un fluide. Permet de sparer les lments d'un mlange en le faisant tourner grande vitesse.Rotors a angle fixe pour les sparations les plus simples entre culot (cellules, organites, membranes, protines plus ou moins agrges selon les cas) et le surnageant. Utilis surtout pour des sparations squentielles, des vitesses de rotation croissantes.

  • TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

    Chromatographie: est une mthode physique de sparation base sur les diffrences d'affinits des substances analyser l'gard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la sparation des composants entrans par la phase mobile, rsulte soit de leur adsorption et de leur dsorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilit diffrente dans chaque phase.

    Phase de cromatographie:Phase stationnaire: phase fixe soit sur la surface intrieure d'une colonne soit sur une surface plane.Phase mobile: phase qui se dplace travers la phase stationnaire, en entranant les analytes. La phase mobile ne doit pas interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes.Chromatogramme: graphique dune fonction de la concentration en analyte en fonction du temps (ou du volume) dlution.

    La chromatographie analytique est utilise pour identifier ou doser les composs chimiques d'un mlange et apprcier leur concentration.

    La chromatographie prparative est utilise pour purifier assez de produit pour d'autres utilisations. Son but est d'obtenir de la substance; c'est pourquoi, toute chelle, elle implique de collecter des fractions.

  • TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

    Classification:

    classification selon la nature de la phase mobile:la chromatographie en phase gazeuse (CPG) galement appele CPV (chromatographie en phase vapeur); la chromatographie en phase liquide (CPL); la chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP); la chromatographie en phase supercritique (CPS).

    classification selon les interactions dveloppes par la phase stationnaire:la chromatographie d'adsorption / d'affinit; la chromatographie de partage; la chromatographie change d'ions;

  • TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUESChromatographie en phase liquideLa chromatographie en phase liquide (CPL) ou liquid chromatography (LC) est une technique d'analyse quantitative, qualitative et sparative principalement utilise dans le domaine de la chimie analytique comme outil scientifique majeur mais aussi dans des domaines varis tels que la chimie organique et la biochimie. Elle recouvre la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie sur papier, la chromatographie en phase liquide en colonne ouverte ou basse pression, et la chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC). Ce type de chromatographie repose sur la sparation de composs entrans par un liquide (phase mobile) travers un solide divis (phase stationnaire) qui est soit plac dans un tube (colonne chromatographique), soit fix sur une surface inerte.

    Chromatographie en phase gazeuseLa chromatographie en phase gazeuse (CPG) est, une technique qui permet de sparer des molcules d'un mlange ventuellement trs complexe de nature trs diverses. Elle s'applique principalement aux composs gazeux ou susceptibles d'tre vaporiss par chauffage sans dcomposition. Elle est de plus en plus utilise dans les principaux domaines de la chimie.Le mlange analyser est vaporis l'entre d'une colonne, qui renferme une substance active solide ou liquide appele phase stationnaire, puis il est transport travers celle-ci l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les diffrentes molcules du mlange vont se sparer et sortir de la colonne les unes aprs les autres aprs un certain laps de temps qui est fonction de l'affinit de la phase stationnaire avec ces molcules.

  • TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES (APLICATION PRATIQUES)La chromatographie sur papier La chromatographie sur papier est une technique de chromatographie en phase liquide. Pour effectuer une telle sparation, une petite quantit de la ou des solutions analyser est dpose sur le bord d'une bande de papier de chromatographie. Cet chantillon est adsorb par le papier; ce qui signifie que les molcules interagissent avec ce dernier et qu'elles auront tendance rester au mme endroit.

    Le papier est ensuite tremp dans un solvant (luant) comme un mlange eau/thanol et plac dans un rcipient ferm. Pendant que le solvant (luant) monte le long du papier par capillarit, il rencontre l'chantillon et l'entrane.

    Les diffrentes substances constituant l'chantillon migrent diffrentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier.

    Le rsultat est appel chromatogramme. Le chromatogramme est utilis pour comparaison avec d'autres analyses effectues sur des substances connues et prises dans des conditions identiques, pour identifier les substances de l'chantillon.

    La chromatographie sur papier peut aussi constituer une technique micro-prparative: pour rcuprer les produits ainsi spars, les portions du papier o ils se situent sont dcoupes et redissoutes ensuite. Les quantits rcuprables sont de l'ordre du milligramme ou moins.

  • TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

    Application pratiques

    La chromatographie est utilise:

    dans les laboratoires d'analyses mdicales par exemple pour valuer la quantit de vitamines dans le sang

    dans le domaine sportif pour savoir si un athlte s'est dop

    pour analyser les substances (poudres, liquides...) prleves sur une scne de crime dans le cadre d'investigations en police scientifique.

  • TECHNIQUES LCTROPHORTIQUES

    La technique de l'lectrophorse est fonde sur le dplacement d'ions (molcules ayant perdu leur neutralit lectrique) sous l'effet d'un champ lectrique. Du fait de leurs caractristiques propres et en fonction des conditions de l'lectrophorse ces ions auront des vitesses de migration diffrentes, ils vont donc se sparer les uns des autres.

    Les molcules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molcules cationiques (+) se dplacent vers la cathode ().

    Les diffrents types d'lectrophorses de zones sont souvent nomms en fonction du type de support:lectrophorse sur papier; lectrophorse sur actate de cellulose; lectrophorse sur gel (amidon, agar, agarose, polyacrylamide).

  • TECHNIQUES LCTROPHORTIQUES

    Gel d'lectrophorse est utilise pour sparer les macromolcules biologiques en fonction de leur taille et de leur charge lectrique le gel est constitu d'une matrice de polymre baignant dans un tampon conducteur. deux principaux polymres sont utiliss: l'agarose et le polyacrylamide. On peut faire varier la concentration de polymre par rapport celle du tampon, ainsi que son taux de rticulation. Plus le polymre est concentr et rticul, et plus la taille des pores du gel est petite. On peut ainsi ajuster les proprits du gel la taille des molcules analyser.

    L'agarose est utilis des concentrations de 0,5% 2% (poids/volume) et permet de sparer des molcules de trs grande taille, principalement de l'ADN ou de l'ARN;

    Le polyacrylamide est utilis des concentrations de 4% 20% (poids/volume) et permet de sparer des molcules plus petites: protines, peptides et des fragments d'acides nucliques. On peut aussi faire varier sa rticulation (taux de ramification) lors de la polymrisation pour moduler les paramtres de sparation;

  • TECHNIQUES LCTROPHORTIQUESExtraction de l'ADN et sparation par lectrophorse Matriel ncessaire