TECHNIQUES SPECIALES

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TECHNIQUES SPECIALES. CULTURES CELLULAIRES CRIODECAPAGE CENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE) TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES DIFFRACTOMÉTRIE DE RAYONS X. CULTURES CELLULAIRES. Definition: - PowerPoint PPT Presentation

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  • TECHNIQUES SPECIALESCULTURES CELLULAIRES

    CRIODECAPAGE

    CENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE)

    TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES TECHNIQUES LCTROPHORTIQUES

    DIFFRACTOMTRIE DE RAYONS X

  • CULTURES CELLULAIRESDefinition:La culture cellulaire dsigne un ensemble de techniques utilises pour faire crotre des cellules hors de leur organisme ("ex-vivo") ou de leur milieu d'origine, dans un but d'exprimentation scientifique ou de fcondation in vitro Les cellules mises en culture peuvent tre:1) des micro-organismes libres (bactries ou levures ex. collects avec une boulette de coton les dpts crmeuse des candida albicans et effectuer une culture cellulaire; rsultats positive - plus de dix colonies myclium ) 2) des cellules "saines" prleves frachement d'un organisme (biopsie,...), on parle alors de "culture primaire". Ces cellules ne peuvent habituellement pas tre maintenues en culture indfiniment, notamment cause de leur nombre limit de divisions.3) des cellules ayant une capacit de division non limite (on parle d'"immortalit en culture"). 4) des lignes cellulaires. Les lignes sont soit des cellules cancreuses, soit des cellules en voie de cancrisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement. 5) des tranches d'organes (d'paisseur optimise selon le tissu)

  • Conditions de travailleoptimisation des conditions "atmosphriques" (ajout d'oxygne...) optimisation de la composition des milieux nutritifs (ajout de certaines hormones,...) optimisation des supports (composition en biomolcules,...) culture sous agitation co-culture avec des cellules "nourricires" culture sur des tissus pralablement "tus" par un procd de conglation/dconglation inclusion dans des gouttelettes d'alginate Installation des instruments striles Transfert dans un nouveau milieu pour fragmentation de l'embryon Introduction dans le flacon de culture d'une suspension de cellules d'embryons l'aide d'une pipette strileMise l'tuve des flacons pendant 24 heures 37C Aplication pratiques:Letude des caracteres morphologiques et biologiquesLetude des biologie tissulaireLetude in vivo des cellule: les effects des hormones ou des facteurs de croissanceinteraction entre different types des cellule

  • LA TECHNIQUE DE CRYODCAPAGE Definition:

    La technique de cryodcapage consiste en cassant part (fracturant) un chantillon biologique congel; le dtail structurel expos par le plan de la fracture est alors envisag par la dposition en vide de platine carbone pour faire un rplica (copie exacte) pour l'examen dans le microscope lectronique de transmission (obtenir une image miroir de la surface fracture).

    tapes:

    la conglation rapidela fractureproduire le rplica le nettoyage de la rplique

  • LA TECHNIQUE DE CRYODCAPAGELe protocole de travail: La conglation rapide - dans les protocoles de routine, une tape de prtraitement est excut avant congeler, comprenant typiquement la fixation dans glutaraldehyde suivi par la cryoprotection avec glycrol. - pour congeler le tissu on doit plonger rapidement un chantillon convenablement mont dans un agent de refroidissement liquide (par ex., azote liquide sousrafrachi). -pour viter la formation des cristaux de glace, on appelle a ltape de prtraitement; le cryoprotectant le plus utilis est le glycrol; comme l'exposition au glycrol (ou d'autre cryoprotectants) peut causer des dfets dans la structure de la membrane cellulaire, la pratique standard doit raliser la fixation chimique avec glutaraldehyde d'abord.La fracture- la fracture de l'exemplaire congel est d'habitude ralis sous le vide en utilisant une lame de microtome rafrachie de d'azote liquide ou en cassant l'exemplaire congel part dans un dispositif articul; la fracture se fait avec une lame de rasoir sous l'azote liquide la pression atmosphrique; la fracture par la lame de microtome rafrachie suppose le placement de lchantillon sur un support rafrachi. 3.Le nettoyage de la rplique- aprs raliser la rplique, l'chantillon est apport la pression atmosphrique et la temprature environnementale; la matire biologique est enleve de la rplique en utilisant la solution du sodium hypochlorite, l'acide chromique ou d'autres agents de nettoyage; aprs le lavage dans l'eau distill, les morceaux de rplique sont monts sur les grilles pour l'examen dans la microscopie lectronique de transmission.Rsultats- un petit morceau du rplica est montait sur une grille, vue aux grossissements successifs; la premire image dans la srie montre le rplica comme vu sous le microscope binoculaire; les deux images suivantes sont de trs bas grossissement en MET (microscopie lectronique de transmission); pour reflter des dtails, le grossissement dans le microscope lectronique est augment davantage.

  • LA TECHNIQUE DE CRYODCAPAGE

    Dtails sur le protocole de travailEtapes de la technique de cryodcapage(une image miroir de la surface fracture)

  • LA TECHNIQUE DE CRYODCAPAGEAplication pratiques:

    le cryodcapage est unique parmi les techniques microscopiques car il fournit des vues planaires de l'organisation interne des membranes;

    la corrosion profonde des chantillons rapidement congels permettent la visualisation de la structure de surface de cellules et leurs composants;

    les images fournies par le cryodcapage et les techniques collatrales ont chang profondment notre comprhension de la morphologie fonctionnelle de la cellule.

  • CENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE)

    La centrifugation est une technique utilisant la force centrifuge pour sparer des fluides de densits diffrentes ou pour isoler des lments solides en suspension dans un fluide. Permet de sparer les lments d'un mlange en le faisant tourner grande vitesse.Rotors a angle fixe pour les sparations les plus simples entre culot (cellules, organites, membranes, protines plus ou moins agrges selon les cas) et le surnageant. Utilis surtout pour des sparations squentielles, des vitesses de rotation croissantes.

  • TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

    Chromatographie: est une mthode physique de sparation base sur les diffrences d'affinits des substances analyser l'gard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la sparation des composants entrans par la phase mobile, rsulte soit de leur adsorption et de leur dsorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilit diffrente dans chaque phase.

    Phase de cromatographie:Phase stationnaire: phase fixe sur la surface intrieure d'une colonne soit sur une surface plane.Phase mobile: phase qui se dplace travers la phase stationnaire, en entranant les analytes. La phase mobile ne doit pas interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes.Chromatogramme: graphique dune fonction de la concentration en analyte en fonction du temps (ou du volume) dlution.

    La chromatographie analytique est utilise pour identifier ou doser les composs chimiques d'un mlange et apprcier leur concentration.

    La chromatographie prparative est utilise pour purifier assez de produit pour d'autres utilisations. Son but est d'obtenir de la substance; c'est pourquoi, toute chelle, elle implique de collecter des fractions.

  • TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

    Classification:classification selon la nature de la phase mobile:la chromatographie en phase gazeuse (CPG) galement appele CPV (chromatographie en phase vapeur); la chromatographie en phase liquide (CPL); la chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP); la chromatographie en phase supercritique (CPS).

    classification selon les interactions dveloppes par la phase stationnaire:la chromatographie d'adsorption / d'affinit; la chromatographie de partage; la chromatographie change d'ions;

  • TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUESChromatographie en phase liquideLa chromatographie en phase liquide (CPL) ou liquid chromatography (LC) est une technique d'analyse quantitative, qualitative et sparative principalement utilise dans le domaine de la chimie analytique comme outil scientifique majeur mais aussi dans des domaines varis tels que la chimie organique et la biochimie. Elle recouvre la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie sur papier, la chromatographie en phase liquide en colonne ouverte ou basse pression, et la chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC). Ce type de chromatographie repose sur la sparation de composs entrans par un liquide (phase mobile) travers un solide divis (phase stationnaire) qui est soit plac dans un tube (colonne chromatographique), soit fix sur une surface inerte.

  • TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUESChromatographie en phase gazeuseLa chromatographie en phase gazeuse (CPG) est, une technique qui permet de sparer des molcules d'un mlange ventuellement trs complexe de nature trs diverses. Elle s'applique principalement aux composs gazeux ou susceptibles d'tre vaporiss par chauffage sans dcomposition. Elle est de plus en plus utilise dans les principaux domaines de la chimie.Le mlange analyser est vaporis l'entre d'une colonne, qui renferme une substance active solide ou liquide appele phase stationnaire, puis il est transport travers celle-ci l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les diffrentes molcules du mlange vont se sparer et sortir de la colonne les unes aprs les autres aprs un certain laps de temps qui est fonction de l'affinit de phase stationnaire avec ces molcules.

  • La chromatographie sur papier La chromatographie sur papier est une technique de chromatographie en phase liquide. Pour effectuer une telle sparation, une petite quantit de la ou des solutions analyser est dpose sur le bord d'une bande de papier de chromatographie. Cet chantillon est adsorb par le papier; ce qui signifie que les molcules interagissent avec ce dernier et qu'elles auront