TECHNIQUES SPECIALESEN ANATOMIE

PATHOLOGIQUE

ED n°2, DCEM1 Purpan, 2011-2012

Techniques spéciales

• Microscopie électronique

• Histoenzymologie

• Immunohistochimie

• Biologie moléculaire

• Cytométrie en flux

• Télépathologie

Immunohistochimie

• Techniques – Matériel

• coupes en paraffine ou coupes en congélation

– Mode de visualisation• Immunofluorescence (UV)• Immunoenzymatique (peroxydase ou

phosphatase alcaline- lumière blanche)

• Interprétation– batterie d’anticorps– témoins intrinsèques, réactivité croisée

Immunohistochimie

1 = Antigène2 = Anticorps primaire3 = Anticorps secondaire couplé au complexe avidine-biotine péroxydase 4 = Révélation par substrat de la peroxydase

Immunohistochimie

• Applications– pathologie hémolymphatique

– Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels

– classification des lymphomes

– pathologie tumorale– identification des tumeurs malignes

indifférenciées– substance spécifique de certaines tumeurs– expression des R hormonaux– évaluation de la croissance tumorale– recherche cibles thérapeutiques

– pathologie non tumorale– pathologie rénale : glomérulopathies– pathologie cutanée bulleuse– pathologie inflammatoire (ex: agent

pathogène)

Immunohistochimie

• Applications– pathologie hémolymphatique

– Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels

– classification des lymphomes

– pathologie tumorale– identification des tumeurs malignes

indifférenciées– substance spécifique de certaines tumeurs– expression des R hormonaux– évaluation de la croissance tumorale– recherche cibles thérapeutiques

– pathologie non tumorale– pathologie rénale : glomérulopathies– pathologie cutanée bulleuse– pathologie inflammatoire

Ag HbS

Immunohistochimie

• Applications– pathologie hémolymphatique

– Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels– classification des lymphomes

– pathologie tumorale– identification des tumeurs malignes

indifférenciées– substance spécifique de certaines tumeurs– expression des R hormonaux– évaluation de la croissance tumorale– recherche cibles thérapeutiques

– pathologie non tumorale– pathologie rénale : glomérulopathies– pathologie cutanée bulleuse– pathologie inflammatoire

Immunohistochimie Exemple utilisation des anticorps monoclonaux dans le diagnostic

des tumeurs malignes sur coupes en paraffine

Tumeurs KL1 Anti-LCA (CD45)

Anti-PS100

HMB45

Carcinome + - - -

Lymphome

- + - -

Sarcome - - +/- -

Mélanome - - + +

Immunohistochimie

• applications

Ganglion médiastinal HE

Ganglion médiastinal HE

Ganglion médiastinal IHC anti-CD45

Ganglion médiastinal IHC KL1

• KL1+• Anti-CD45-

Métastase ganglionnaire d’un carcinome

Tumeur cutanée indifférenciée

Tumeur cutanée indifférenciée: IHC KL1

Tumeur cutanée indifférenciée:IHC HMB45

Tumeur cutanée indifférenciée:IHC anti-protéine S100

• KL1-• HBM45+• Anti-PS100+

Mélanome

Immunohistochimie

• Applications– pathologie hémolymphatique

– Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes réactionnels

– classification des lymphomes

– pathologie tumorale– identification des tumeurs malignes

indifférenciées

– substance spécifique de certaines tumeurs

– expression des R hormonaux– évaluation de la croissance tumorale– recherche cibles thérapeutiques

– pathologie non tumorale– pathologie rénale : glomérulopathies– pathologie cutanée bulleuse– pathologie inflammatoire

Ganglion cervical métastatique, HE

Ganglion cervical métastatique: IHC anti-thyroglobuline

Métastase d’un adénocarcinome

thyroïdien

Immunohistochimie • Applications

– pathologie hémolymphatique– Dg lymphomes/ infiltrats lymphoïdes

réactionnels– classification des lymphomes

– pathologie tumorale– identification des tumeurs malignes

indifférenciées– substance spécifique de certaines tumeurs– expression des R hormonaux– évaluation de la croissance tumorale

– recherche micrométastases

– pathologie non tumorale– pathologie rénale : glomérulopathies– pathologie cutanée bulleuse– pathologie inflammatoire

Mélanome et ganglion sentinelle: recherche de micrométastase par immunohistochimie avec HMB45,

non décelable sur H&E

Ganglion sentinelle + = Curage ganglionnaire

Techniques spéciales

• Microscopie électronique

• Histoenzymologie• Immunohistochimie

• Biologie moléculaire hybridation in situ PCR

• Cytométrie en flux

• Télépathologie

Biologie moléculaire• Hybridation in situ

– Techniques• Coupes en paraffine ou coupes en

congélation• Sondes froides (= non radio-actives)

• Chromogéniques (CISH)• Fluorescentes (FISH)

– Applications • Détection du génome de certains virus• Détection de translocations

chromosomiques, d’amplification génique

HPV

Détection par FISH d’une fusion

entre les chromosomes 17 et 22 dans une lésion cutanée

Utilité diagnostique:

Sarcome de Darier-Ferrand

Détection par FISH d’une amplification du gène HER2 dans un carcinome mammaire

Utilité thérapeutiquePrescription d’un inhibiteur de Erb-2

Non amplifié

Amplifié

DuoCISH™, Dako

HER2 / Cen17

DuoCISH™, Dako

HER2 / Cen17

Biologie moléculaire• PCR (Polymerase Chain Reaction)

– Rappel de son principe

– Technique

– Applications

élongation (72°C)

Taq polymérase

placement des amorces (40 à 60°C)

amorce

séparation des brins (94°C)

fragment à amplifier5’ 3’

3’ 5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’ 5’

3’

5’

3’ 5’

3’

1/ Principe de la PCR

3 étapes: - dénaturation thermique: 94°C, 30s à 1 mn - hybridation des amorces (annealing): 40 à 70°C,1 min - élongation: 72°C, durée variable selon le fragment à amplifier

Dénaturation + Hybridation + Elongation = 1 cycle au cours duquel quantité ADN cible x 2.Au bout de n cycles: 2n molécules ADN cible.

2/ Principales étapes de la technique

Anomalies géniques

-Mutation

-Translocations chromosomiques

3/ Applications en anatomie pathologique

Mise en évidence de la clonalité lymphoide

Mutation

Ex: mutation du gène BRAF dans le mélanome métastatique

Intéret thérapeutique (prescription d’un inhibiteur de BRAF)

Séquençage du produit PCR

correspondant à l’amplification de la zone du gène

où se situe la mutation

Translocation chromosomique

Détection par PCR à l’aide de deux amorces encadrant la zone réarrangée

CHR 2 CHR 5

Amorce A

Amorce B

Gène A Gène B

Intérêt diagnostique (translocation spécifique de tumeur)Intérêt pronostique (ex: recherche de la maladie résiduelle après traitement d’un lymphome porteur de cette translocation)

Polyclonalité et monoclonalité lymphoide

Prolifération polyclonale bénigne

Comment établir le caractère clonal ou polyclonal ?Identité ou non-identité du récepteur à l’Ag qui caractérise un lymphocyte donné

Prolifération monoclonale maligne

Ig pour lymphocyte B TCR pour lymphocyte T

Intérêt diagnostique

Polyclonal

V D J V D J

Monoclonal

Etablissement de clonalité par

PCR

Contraintes

a- ADN de bonne qualité * délai de congélation * qualité et temps de fixation (Formol)

b- Contaminations - lors des coupes (changer de lames, de gants entre chaque cas, nettoyer le support de lames) - lors de toutes les phases d’extraction d’ADN, d’amplification et d’électrophorèse.

c- Contrôles : Témoin négatif (eau) Témoin positif

Les immunoglobulines (Ig): récepteurs à l’antigène des lymphocytes B

CH3

CH2

CH1

VH

VL

CL

CH3

CH2

CH1

VH

VL

CL

Partie variable des Ig: carte d’identité d’un lymphocyte B

La diversité combinatoire

La diversité jonctionnelle

V N J C2

Zone jonctionnelle

ND

1/ Délétion de nucléotides en aval de V, en amont de J ou de part et d’autre de D

2/ Addition aléatoire de nucléotides (TdT)

PCR1- BREF RAPPEL

double hélice ADN– 2 brins antiparallèles

– enchaînement de bases reliées entre elles par des liaisons hydrogènes faibles et thermolabiles :

A T T G C

T A A C G

A T T G C

T A A C G

A T T G C

T A A C G

molécule double brin 2 molécules simple brin

dénaturation thermique

Maladies infectieuses :Virus (HPV : non cultivable,CMV: rejet de greffe rénale, VIH...), bactéries (à croissance lente : mycobactéries)…

Anomalies géniques - Mutation- Translocation chromosomique

détection de la t(14;18) par PCR: amplification de la zone jonctionnelle, variable d’un clone à l’autre.

t(2 ;5) et lymphomes anaplasiques à grandes cellules

- Etablissement de la clonalité lymphoïde

Applications

CHR 2 CHR 5

amorce amorce