Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Citometria de Fluxo: Aplicações

Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Técnicas de Imunologia

Citometria de Fluxo:Citometria de Fluxo:

AplicaçõesAplicações

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Identificação Celular por Dispersão FS e SS

GranulócitosGranulócitos

LinfócitosLinfócitos

MonócitosMonócitos


Imunofenotipagem


IOTest 3 Combinations List 2424 Relevant Tubes Relevant Tubes

2 2 ControlsControls

One tube is for intra-cellular testingOne tube is for intra-cellular testing

Kappa & Lambda polyclonals from DakoKappa & Lambda polyclonals from Dako

FITC- and PE-conjugations performed at IOTFITC- and PE-conjugations performed at IOT


IOTest 3 Combinations List + Target DiseasesPN FITC PE ECD TARGET DISEASE

IM3464 cMPO cCD79a cCD3 ACUTE CLASSIFICATION

IM3465 Kappa Lambda CD19 B-CLL,

IM3466 CD5 CD10 CD19 B-ALL, B-CLL Vs. FCCL, HEMATOGONES

IM3467 CD20 CD10 CD19 B-ALL, B-CLL Vs. FCCL, HEMATOGONES

IM3468 FMC7 CD23 CD19 B-CLL, MANTLE CELL

IM3469 CD5 CD23 CD19 T vs. B CLL, Mantle Cell

IM3470 CD25 CD11c CD19 HCL

IM3471 CD103 CD11c CD19 HCL

IM3472 CD19 CD10 CD45 B-ALL

IM3473 CD38 CD56 CD45 MM, Plasma Cells

IM3474 CD14 CD16 CD45MYELOID CLASSIFICATION INCLUDING IMMATURE GRANULOCYTES

(CD16dim)

IM3475 CD71 CD33 CD45 MYELOID, ERYTHROID, DIFF

IM3476 CD34 CD33 CD45 AML

IM3477 CD34 CD117 CD45 IMMATURE MYELOID

IM3478 HLA-DR CD34 CD45 AML vs ALL

IM3479 HLA-DR CD13 CD45 AML


PN FITC PE ECD TARGET DISEASE

IM3480 CD15 CD33 CD45 AML, APL, CML

IM3481 CD14 CD13 CD45 AMML

IM3482 CD41 Glyco A CD45ACUTE MEGALO, DIFF, M7,

MYELODISPLASIA

IM3483 HLA-DR CD7 CD45 T-ALL

IM3484 CD5 CD7 CD3 T-CLL

IM3485 CD8 CD4 CD3 T-CLL

IM3486 CD25 CD4 CD3 HTLV, SEZARY SYNDROME

IM3487 CD16 CD56 CD3 LGLL

IM3488 Neg. Ctrl. Neg. Ctrl. Neg. Ctrl.

IM3489 Neg. Ctrl. Neg. Ctrl. CD45

IOTest 3 Combinations List + Target Diseases


Quantificação antigénica

Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Quantificação de antigénios emQuantificação de antigénios emCitometria de FluxoCitometria de Fluxo


BioCytex MARQUIS TECHNIQUE

Beads contain calibrated amounts of anti-Beads contain calibrated amounts of anti-mouse IgG molecules.mouse IgG molecules.

Size mimics size of target molecule/receptor.Size mimics size of target molecule/receptor. Amount of molecules on beads reflects Amount of molecules on beads reflects

expression level of target molecule/receptor.expression level of target molecule/receptor.


CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit-Flow Analysis Procedure-Flow Analysis Procedure

Calibration BeadsCalibration Beads


CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Flow Analysis Procedure-Flow Analysis Procedure

Negative ControlNegative Control


CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit -Flow Analysis Procedure-Flow Analysis Procedure

CD38 Positive SampleCD38 Positive Sample


CELLQUANT CD38/CD8-PE Kit

-Data Analysis Procedure-Data Analysis Procedure

100

1.000

10.000

100.000

0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0

MFI

MA

b m

ole

cu

les

1.8 80.0

610

29,777

Fig. 7


Pesquisa de populações raras


Time (Seconds)0 36 72 108 144 180

RAT

IO [s

hort

/long

]0

200

400

600

800

1000

StimulationStimulation

Calcium Flux - Indo-1

Estudos Cinéticos


Análise de Ciclo Celular

GG22

MM

GG00

GG11

SS

Count

0 200 400 600 800 1000

GG00 /G/G11

SSGG22 /M/M

DNA content

2N2N 4N4N


Apoptose


Separação Celular Separação Celular

Formação de gotículasFormação de gotículas

Tempo Tempo

Coincidência - Pureza Coincidência - Pureza

e Eficiênciae Eficiência

488 nm laser Sensor FsSensor Fs

Detectores de Detectores de FluorescênciasFluorescências

+Placas CarregadasPlacas Carregadas

Tubos para Recolha do Produto Tubos para Recolha do Produto SeparadoSeparado

-


QC Workflow

Alignment Check

Basic Elements of Daily QC

Fluorescent Standard

Color Compensation

Process/ Method Control

Run Patient

Obtain Results

Generate Report

Patient Analysis

TroubleshootMaintenance

FAIL

PASS

Call Service

Fix Problem

Test Reimbursement


AUTOMATIZAÇÃO

TQ-Prep™ PrepPlusQ-Prep™


TQ-Prep / ImmunoPrep Reagent

Sistema automático de lisis de Sistema automático de lisis de eritrocitoseritrocitos

No requiere lavadoNo requiere lavado Preserva la morfologíaPreserva la morfología Utiliza carruseles compatibles Utiliza carruseles compatibles

con XL-MCL, FC500, PrepPlus con XL-MCL, FC500, PrepPlus y CellPrepy CellPrep

TQ-PREP


PrepPlus – TQ-Prep Sistema automático de Sistema automático de

carga de muestra y carga de muestra y reactivos para citometría reactivos para citometría de flujode flujo

Utiliza tubos primarios Utiliza tubos primarios de cualquier marcade cualquier marca

Rack de hasta 24 tubos Rack de hasta 24 tubos primarios con agitación primarios con agitación para homogeneizar la para homogeneizar la muestramuestra

Controlado por el TQ-Controlado por el TQ-PrepPrep


PrepPlus – TQ-Prep Posibilidad de carga desde Posibilidad de carga desde

tubo abiertotubo abierto 3 soportes diferentes para 3 soportes diferentes para

reactivosreactivos Puede cargar anticuepos Puede cargar anticuepos

monoclonales, FlowCount y monoclonales, FlowCount y reactivos de control de calidadreactivos de control de calidad


CellPrep

Sistema de lavado celular por Sistema de lavado celular por fibra huecafibra hueca

Sustituye a la centrifugaciónSustituye a la centrifugación Mantiene la viabilidad celularMantiene la viabilidad celular Mantiene la morfología y Mantiene la morfología y

preserva células lábilespreserva células lábiles No activa ni destruye plaquetasNo activa ni destruye plaquetas Utiliza sangre entera, sangre Utiliza sangre entera, sangre

lisada y cualquier suspensión lisada y cualquier suspensión celularcelular


CellPrep

Fibras huecas con poros de Fibras huecas con poros de 0.650.65 µmµm, que permiten la salida , que permiten la salida de moléculas y líquido de la de moléculas y líquido de la suspensión originalsuspensión original

Permite la concentración final Permite la concentración final de la muestrade la muestra

Diferentes programas Diferentes programas pregrabados, así como pregrabados, así como posibilidad de crear programas posibilidad de crear programas propiospropios


Citometria de Imagem:Citometria de Imagem:Uma nova Tecnologia no apoio à Anatomia Uma nova Tecnologia no apoio à Anatomia

PatológicaPatológica


Tipos de amostras possiveis de analisar Tipos de amostras possiveis de analisar por Citometria de Imagem:por Citometria de Imagem:

EtanolEtanol Glutaraldeido

Glutaraldeido

Tecido fixadoTecido fixadoTecido a “fresco”Tecido a “fresco”

Tecido “criopreservado

”

Tecido “criopreservado

”

Tecido sólidoTecido sólido Tecido líquidoTecido líquido

Sem preservação

Sem preservação

Com preservaçãoCom preservação

Tecido a “fresco” congelado

Tecido a “fresco” congelado

Paraformaldeido

Paraformaldeido

FormaldeidoFormaldeido

e incluído em parafinae incluído em parafina

AmostraAmostra


Parâmetros possíveis de analisar Parâmetros possíveis de analisar por Citometria de Imagem:por Citometria de Imagem:

• Total de partículas• Forma• Tamanho• Área• Diâmetro• Perímetro• “Perfeição”• Irregularidade


Requisitos Básicos num Requisitos Básicos num Citómetro de Imagem:Citómetro de Imagem:


Captação dos Parâmetros de Captação dos Parâmetros de Análise:Análise:

0

20

40

60

80

100

Tamanho

DOI

0

20

40

60

80

100

Tamanho

DOI

0

20

40

60

80

100

Tamanho

DOI

NúcleoMarcado

Branco

Preto


Citometria de Citometria de Imagem:Imagem:


Protocolo para Protocolo para Citometria de Imagem:Citometria de Imagem:

Partindo de um fragmento de tecido sólido, fixado em formol, Partindo de um fragmento de tecido sólido, fixado em formol, processado e incluído em parafina.processado e incluído em parafina.

Corte a 8Corte a 8m, extensão em lâminas de gelatinam, extensão em lâminas de gelatina Desparafinar Desparafinar Pós fixar com fixador de BohmPós fixar com fixador de Bohm Hidratar Hidratar Efectuar uma Hidrólise ÁcidaEfectuar uma Hidrólise Ácida Marcar as células com reagente de ShiffMarcar as células com reagente de Shiff Lavar com SO2Lavar com SO2 Desidratar Desidratar MontarMontar Quantificar o conteúdo em ADN e o ciclo celular no Citómetro de Quantificar o conteúdo em ADN e o ciclo celular no Citómetro de

ImagemImagem


MetaCyte - conceptMetaCyte - conceptMetaCyte - conceptMetaCyte - concept

• microscope slide is scanned field by field at lowest possible magnification without gaps

• objects of interest are automatically identified; gallery images, object features and positions are recorded

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• on screen review of on screen review of analyzed cellsanalyzed cells

• false positives can be false positives can be rejectedrejected

• cells suitable for analysis cells suitable for analysis are preselected with a are preselected with a mouse clickmouse click

• preselected objects can preselected objects can be automatically be automatically relocated atrelocated at100x to capture high100x to capture highresolution images for resolution images for analysisanalysis

• on screen review of on screen review of analyzed cellsanalyzed cells

• false positives can be false positives can be rejectedrejected

• cells suitable for analysis cells suitable for analysis are preselected with a are preselected with a mouse clickmouse click

• preselected objects can preselected objects can be automatically be automatically relocated atrelocated at100x to capture high100x to capture highresolution images for resolution images for analysisanalysis



• histogram or scatter histogram or scatter plot display of plot display of measured featuresmeasured features

• gating for selection of gating for selection of subpopulationssubpopulations

• relocation of cells relocation of cells detected in a previous detected in a previous scan after re-stainingscan after re-staining

• histogram or scatter histogram or scatter plot display of plot display of measured featuresmeasured features

• gating for selection of gating for selection of subpopulationssubpopulations

• relocation of cells relocation of cells detected in a previous detected in a previous scan after re-stainingscan after re-staining

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9



Motorized microscope (z)Motorized microscope (z)

MotorizedMotorizedstage (x,y)stage (x,y)

CCD CameraCCD Camera

MetaCyte

PC Win 9x/NTPC Win 9x/NT

image analysisimage analysismicroscope controlmicroscope control

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