Técnicas de interacción secundaria: fundamentos y aplicaciones.

Comisión 4 Julieta Fernández Lynch

mjfernandezlynch@gmail.com

Técnicas Inmunológicas

Se basan en la reacción de interacción Antígeno- Anticuerpo (alta afinidad y especificidad )

Antígeno

Cualquier molécula o fragmento molecular que puede ser reconocido por receptores de células de la Respuesta Inmune.

Determinantes antigénicos o epitopes

Región del antígeno que se combina con el sitio de unión

de los receptores linfocitarios.

Epitopes discontinuos ó conformacionales

Epitopes contínuos

Estructura de los anticuerpos

El isotipo viene determinado exclusivamente por la cadena pesada de la molécula

de Ig.

Hay 5 isotipos fundamentales o clases (IgG, IgM, IgD, IgA, IgE))

Hay isotipos menores (o subclases): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y IgA1 e IgA2

Los individuos normales producen todos los isotipos.

Bloquean la capacidad infectiva de microorganismos

Neutralizan toxinas y enzimas.

Favorecen la eliminación del microorganismo (fagocitosis, activación de

complemento, ADCC).

Clases de Ig - determinados por el tipo de cadena pesada

FUNCIONES

Policlonalidad

Producción de Ac:

Colaboración T-B

INMUNOGLOBULINAS:

ISOTIPOS

Clasificación de los antígenos en función de las células

involucradas en la generación de anticuerpos

T dependientes

-B, Th

ej. proteínas

T independientes

-B, no Th

ej. polisacáridos,

LPS

Características de la respuesta de Acs a Ags T-dependientes

Respuesta Primaria

Se desarrolla en 1 - 2 semanas (7-10 días)

Incluye respuesta celular y de anticuerpos

Los anticuerpos predominantes son de

isotipo IgM

Los niveles de anticuerpos declinan

rápidamente

Respuesta Secundaria (“memoria”)

Se desarrolla mucho más rápido y persiste

por más tiempo

Incluye respuesta celular y de anticuerpos

El anticuerpo predominante es de isotipo

IgG (“switch de isotipo”)

Aumenta la calidad de los anticuerpos

(madurez de la afinidad)

Niv

el d

e A

cs

Semanas

Unión no covalente

Unión Antígeno- Anticuerpo

Unión Antígeno- Anticuerpo

La interacción antígeno-anticuerpo es un equilibrio químico que puede ser explicado aplicando la Ley de acción de masas.

Las constantes de afinidad son del orden de 1010 M-1

AFINIDAD

Es la sumatoria de las fuerzas atractivas y repulsivas entre el paratope y el

epitope específico. Se define por una constante de equilibrio (Ka), según la

ley de acción de masas.

AVIDEZ

Es la fuerza con la que un anticuerpo multivalente se une a un antígeno

multivalente. Su valor es mayor que la suma de las afinidades.

Interacción Antígeno-Anticuerpo

Valencia-Afinidad/Avidez

Anticuerpo

Fab

IgG/(Fab’)2

IgG/Fab’)2

IgM

valencia efectiva

1

1

2

5

valencia Ag

1

1

n

n

K equilibrio

104

104

107

1011

Afinidad/avidez

Afinidad

Afinidad

Avidez

Avidez

Afinidad intrínseca

Afinidad funcional

Ag • Determinación de

grupo sanguíneo

• Control de calidad de Anticuerpos monoclonales

• PCR

Ac • HAI CHAGAS

• Anticuerpos anti D

• Anticuerpos anti-desoxirribonucleoprot.

USOS

Aplicación

Registro de productos de

diagnóstico in vitro

Control de calidad

Historia clínica de pacientes,

terapeutica y/o efectos

adversos.

Caracterización de Anticuerpos Terápeuticos.

Si los anticuerpos son un reactivo….

¿Cómo los obtengo?

¿Qué característica tienen que presentar?

Proliferan distintos clones de LB que reconocen al Ag

Inmunógeno

A

SUERO POLICLONAL

En un suero policlonal hay distintas Ig, provenientes de diferentes

clones, que reconocen distintos epitopes del inmunógeno o el

mismo epitope pero con distintas afinidades

Tanto el Ac naranja como el rojo reconocen al

epitope naranja aunque con distinta afinidad

Hapteno

Molécula pequeña que puede actuar

como epitope, pero es incapaz de

provocar por sí misma una respuesta.

Ejemplos: Dinitrofenol (DNP), Vit B12, Hormonas T3 y T4.

Anticuerpos derivados de un sólo clon de células B, son de carácter

homogéneo . Reconocen un sólo epitope idénticamente (con

igual afinidad)

Anticuerpos

monoclonales

Las Ig como antígenos

Inoculo con IgG humana

IgGh

Suero anti-IgGh

+ suero anti-IgGh

Reconoce IgG y cadenas

L de todos los isotipos

monoespecificidad

A

¿¿Los Ac monoclonales son

monoespecíficos??

¿¿Monoclonal = monoespecífico??

Ac monoclonal anti- proveniente del Ag A

B

Frente a B se comporta

como monoespecífico

C Reconoce a C, por lo tanto

no es monoespecífico

Interacción

Primaria

Interacción

secundaria

EPITOPE - PARATOPE

NO VISUALIZABLE

Técnicas Inmunológicas

VISUALIZABLE

Resultado

cualitativo

positivo negativo

cuantitativo

concentración

semicuantitativo

tÍtulo

Interacción primaria

• Reacción dada por un paratope y un epítope • Se deben mantener condiciones fisiológicas • No se visualiza directamente • Ag y/o Ac monovalente • Bajas concentraciones de Ag y/o Ac (pg/ml)

Radionucleído RIA

Enzima EIA

Fluorocromo IFI, IFD

Interacción Secundaria

Condiciones

Ag y Ac por lo menos bivalente

Alta concentración de Ag y de Ac (mg/ml)

Se ve influenciada por factores ambientales (Temperatura,

fuerza iónica, pH) y necesita tiempo

Es la interacción Ag-Ac que se visualiza fácilmente

Los Ac monoclonales, ¿dan interacción secundaria?

Complejos

solubles

El Ag debe comportarse como bivalente o polivalente frente al suero inmune utilizado

para que así se forme la red que permite la precipitación o aglutinación. En otras palabras

cada molécula antigénica debe tener al menos dos epitopes que puedan ser

reconocidos por los distintos Ac del suero.

¿Qué valencia tienen los haptenos (Hp)?

Son

monovalentes

Por sí solos no dan

reacciones de

interacción secundaria

Reacciones de Interacción Secundaria

Precipitación (Ag Soluble)

Aglutinación (Ag particulado)

Técnica de Interacción Secundaria:

Precipitación

Prozona Zona equivalencia

Exceso de antígeno

PRECIPITACIÓN EN MEDIO GELOSADO

• Inmunodifusión radial (IDR)

• Doble Inmuno Difusión (DID)

* La mayoría de las proteínas difunden libremente a través de poros de un gel. * Al contactarse antígenos y anticuerpos específicos se forma una banda de precipitación en el punto en que ambos alcanzan equivalencia. * Sirven para determinar la concentración de Ags (cuantitativos) o para comparar Ags y evaluar su pureza o para determinar isotipo de Ig específica (cualitativos).

ti

em

po

Y Y

Y

Y Y

Y

Y

Y Y Y

Y Y

Y Y

Y

Y Y

Y

Y

Y

Y Y

Y

Y

Y Y

Y

Y Y

Y

Y

Y

Y Y

Y

Y

Y Y

Y

Y

Y

Y Y

Y

Y

Y

Y Y

Doble Inmuno Difusión

Identidad No Identidad Identidad

Parcial

Técnica Cualitativa

En los pocillos del agar se enfrentan los antígenos y el suero. Si existen

anticuerpos que reconocen a alguno de los antígenos se forma una banda

de precipitación en la zona de equivalencia para ese sistema.

La posición de las bandas permite evidenciar similitudes y diferencias entre

los antígenos según el antisuero al que se enfrentan.

1

3

4

2

8

7 6

5

Si Golimumab fuera un monoclonal IgG κ, cómo demostraría por DID esto? (Suponga que siembra en 1 el Golimumab)

1: Golimumab 2: 3: 4: 5: 6: 7: 8:

Inmunodifusión radial - IDR

Técnica Cuantitativa

Utilidad: determinación de la conc. de inmunoglobulinas y otras proteínas séricas

En el agar se encuentra el suero monoespecífico para

la proteína que se desea medir. Se realiza la

incubación y se determina el tamaño del halo de

precipitación que se interpola en la curva de

calibración.

TP Cuantificación de Golimumab

AGLUTINACIÓN

Requisitos para que se produzca la reacción

de aglutinación

* Ag particulado multivalente

* multivalencia del Ac

* especificidad del Ac

* Tº fisiológica

* pH fisiológico

* Concentración salina fisológica

Clasificación de las reacciones de

aglutinación

Semicuantitativa Cualitativa

• Antígenos naturalmente particulados. Ej: GR, Bacterias DIRECTA

• Antígenos “ artificialmente " particulados. Ej: Partículas de látex, GR

INDIRECTA

• Anticuerpos unidos a partículas. Ej: Partículas de látex, GR REVERSA

AGLUTINACIÓN DIRECTA

Sistema ABO

• Descubiertos en 1901 por Karl Landsteiner

• 4 fenotipos principales (A, B, AB, O)

Utilidad Aglutinación Directa

Tipificación de GR: Sistema ABO

GENOTIPO FENOTIPO (grupo) Ac Presentes

(isoaglutininas)

AA/A0 A anti B

BB/B0 B anti A

AB AB Ninguno

0 0 anti A y B

Bombay Ninguno anti A, B y H

TP

Tipificación

Título: Valor relativo que indica cuántas veces puedo diluir el suero

para que siga dando reacción positiva, en este caso con

capacidad de aglutinar

AGLUTINACIÓN DIRECTA

SEMICUANTITATIVA

TP Titular un suero anti D de formulación comercial (GR Rh +)

+ GR

Latex Antígeno

+

Anticuerpo

20 ul Control (-)

20 ul Control (+)

20 ul GR no sensib.

20 ul 20 ul 20 ul GR sensib.

20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul Diluyente

20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul Suero (1/4)

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

CONTROLES MUESTRAS

Indirecta o Pasiva Antígenos “artificialmente " particulados.

TP Control de calidad de Kit de HAI para la detección de anticuerpos anti T. cruzi

20 ul Control (-)

20 ul Control (+)

20 ul GR no sensib.

20 ul 20 ul 20 ul GR sensib.

20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul Diluyente

20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul Suero (1/4)

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

CONTROLES MUESTRAS

muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1

2

3

4

AGLUTINACIÓN REVERSA

TP AI: Detección de Ac anti desoxirribonucleoproteínas, AR: Detección PCR

AGLUTINACIÓN REVERSA

+

Anticuerpos Específicos

Partículas LATEX o GR

Partículas sensibilizadas

+ Muestra incógnita

(Antígeno Soluble?)

Malla de Aglutinación

1° Sensibilización de GR

2° Reacción de Aglutinación

Y Y

Utilidad Detección de Ag soluble multivalentes

Ej: Detección de hCG en orina , HBsAg en suero,

Cryptococcus neoformans, E.coli enteropatógena en LCR

Sistema Rh

• Comprende más de 40 Ag. que se ubican en:

la superficie de GR y sus precursores en M.O.

pero no en otras células, secreciones o fluídos orgánicos.

• Estos Ag. son proteínas, de todos ellas, 5 son los más importantes: D,E,e,C,c

– El orden de su poder inmunológico en forma decreciente es: D, c, E, e, C. Las variantes más débiles del D se llaman Du.

ACTIVIDAD ANTIGÉNICA INTENSA SÓLO EL Ag D

Rh+: INDIVIDUO CON aglutinógeno D

Rh-: INDIVIDUO SIN aglutinógeno D-SIN aglutinina anti-D

(diferencia con el sistema ABO)

TIPIFICACIÓN SE REALIZA CON SUERO ANTI-D

Diferencias entre Ac de los sistemas ABO y Rh

SISTEMA ABO SISTEMA Rh

IgM IgG

Naturales Inmunes

Aglutinantes No aglutinantes

Completos INCOMPLETOS

Carbohidratos Polipéptidos

No pueden difundir y carecen de Receptores en placenta

SEGUIMIENTO DE LA MADRE PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA

1° Fase

2° Fase

+

Suero Materno (tiene Ac āAgD?)

GR

Rh +

+

GR sensibilizados con Ac maternos āAgD

SUERO DE COOMBS Malla de aglutinación

ANÁLISIS DEL BEBÉ PRUEBA DE COOMBS DIRECTA

GR bebé (están sensibilizados

con Ac āAgD maternos?)

+

Anticuerpos anti inmunoglobulinas humanas

- SUERO DE COOMBS -

Malla de aglutinación

Se puede prevenir casi completamente con el

uso de Inmunoglobulina anti-Rho (D)

¿Cómo puede prevenirse la

Isosensibilización Rh materno-fetal?

1 dosis en hemorragia fetal (aborto, amniocentesis,

muestreo vellosidades coriónicas)

1 dosis preparto (300mcg), semana 28. Seguimiento

con Prueba Coombs Indirecta

(Positiva: indica dosis adecuada)

1 dosis posparto, dentro de las 72 hs

Detección de Anticuerpos generados por Drogas

Efecto adverso (poco frecuente): - Antibioticos (penicilina, cefalosporinas) - Antiinflamatorios

no esteroideos (diclofenac)

- Quinina - Oxalplatino

Anemia hemolítica autoinmune inducida por

drogas (DIIHA)

¿Cómo podríamos determinarlo?

Droga Suero paciente

Coombs directa La muestra son los GR del paciente