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1
Técnicas Físicas aplicadas ao Estudo de
Sistemas Biologicamente Relevantes
Leandro R. S. Barbosa
M. Teresa Lamy
Thais A. Enoki
Curso de Verão
IFUSP
2011
2
Introdução à Fluorescência
M. Teresa Lamy
Grupo de Biofísica
IFUSP
Curso de Verão
IFUSP
2011
estrutura e
dinâmica
função
Técnicas espectroscópicas
Interação da radiação eletromagnética com a matéria
Absorção
Absorção/Emissão
Espalhamento
Em biomoléculas:
Luminescência Emissão de fótons de estados eletrônicos excitados
UV e visível
fluorescência singleto singleto
10-8 s
fosforescência tripleto singleto
10-3 - 100 s
Cromóforos - moléculas que absorvem luz
Fluoróforos - moléculas que fluorescem Geralmente possuem elétrons delocalizados/duplas
ligações/anéis
S0
S1
T0
Diagrama de Jablonski
cruzamento inter-sistema (fluor ~ 10
-9s)
fluorescência
absorção
(10-15s)
S2
conversão interna (~10-12s)
kNR
(fosf ~ 10-3s)
fosforescência
luz branca
sulfato de quinina, fluoresceína, rodamina, brometo de etídio
Fluorescência
espectros de emissão
luz UV
Fluorescência: primeiras observações
1565 infusão da madeira Lignum Nephriticum
(N. Monardes)
Herschel 1845 observação de fluorescência em uma
solução de quinino
água tônica
(Wikipedia)
Fluorescência: primeira observação rigorosa
Absorve luz no ultra-violeta: abs= 350 nm
Emite no visível: em= 450 nm Quinino
Stokes (1852)
9
Excitado
Fundamental em
Coordenada
Ene
rgia
abs
Fluoróforos naturais
(Lakowicz, 1999)
11
Green Fluorescent Protein (GFP)
Água-viva bioluminescente Aequorea victoria.
Cromóforo formado espontaneamente por enovelamento da cadeia
polipeptídica, e ciclização (Ser-65, Tyr-66, Gly-67)
Fluoróforos naturais em Proteínas
Inserção do gen para GFP em células e uso da proteína como sonda.
12
modelo semi-clássico radiação: onda EM matéria: estados quantizados de energia
Interação da radiação eletromagnética com a matéria
Interação de partícula com carga q e massa m com OEM
t
AE
AxB
gauge de Coulomb, no vácuo 0
0A.
]cce[)w(A)t,r,w(A
)wwtr.ksin()xk)(w(A2)t,r,w(B
)wwtr.ksin()w(wA2)t,r,w(E
)wwtr.kcos()w(A)t,r,w(A
)wwtr.k(i
o
o
o
o
onda plana monocromática
2Aqpm2
1 Η'
para um átomo hidrogenoide
r4
ZeAei
m2
1
o
22
e
Η
para campos fracos, desprezando termos em A2
.A
m
ei
r4
Ze
m2 eo
22
e
2
Η
Ho H’
perturbação
- Sistema de dois níveis
- Teoria de Perturbação em 1a ordem
- Em t = 0, sistema no estado a
a
b Pba Pab
baab
abab
2
a
r.ki
b
2
aboabab
WW
EE
.em
)(eA2
dt
dPW
w
w
Regra de Ouro de Fermi
emissão
estimulada
absorção
taxa de absorção
de radiação
)(A2)(I 2
o
2
o www
2
a
r.ki
b2
ba
ba
o
2
2
2
ba .e)(I
4
e
cm
4W
w
w
densidade de energia
Aproximação de dipolo elétrico
)wtr.k(i
o e)(A)t,r,(A www
2
baba
o
2
2
2
ba r)(I4
e
c3
4W
w
baab
2
abba
o
2
2
2
ba
rere
r.)(I4
e
c
4W
w
bababa
abba
1
ab
o
1
aba
r.ki
b
rimp
r)EE()i(r
],r[)i(r
rim
..e
w
H
aba
rki
b
rki
pi
e
e
rrr
krk
..
1
1211.
.
.
momento de dipolo elétrico de transição
para OEM não polarizada
abba
2
baba
bababa
BB
rB
)(IBW
w
coeficientes de Einstein para absorção e emissão estimulada de
radiação
bap
bar
Lei de Lambert-Beer
Espectroscopia óptica de absorção
Io It
y
y
dy
yCAI
Ilog
t
o
dy'C)y(I
)y(dI
concentração de moléculas
característica da molécula
yC'
ot eII
Absorbância =
taxa com que a energia é removida da radiação (absorvida)
dyBc
hN
)(I
)(dIaba
C
2
ab r
medidas de modelos
Wab
)(IBhNdt
)(dI
0NeN
N
)(IBhN)(IBhNdt
)(dI
aba
b
kT/)EE(
b
a
bababa
ba
Wba
Coeficiente de Einstein para a emissão espontânea
2
ba
2
2
2
ba
bababa
ro4
e
c3
4B
)(IBW
w
Taxa de transição induzida por unidade de densidade de
radiação incidente
A emissão espontânea pode ser deduzida da QED, ou da
elegante discussão feita for Einstein em 1916
Na
Nb Bab Bba Aba
Se existissem somente Bab e Bba,
no equilíbrio termodinâmico:
Na Bab I() = Nb Bba I()
Na = Nb
mas, kT/hkT/)EE(
b
a eeN
Nba
Postulou, portanto, a existência de Aba,
independente de I(), tal que:
Na Bab I() = Nb Bba I() + NbAba
Espectroscopia óptica de emissão
dt
dNAN b
bab
fluorescência
)(IB
A1
N
N
ba
ba
b
a
Considerando que as moléculas estão em equilíbrio com a radiação à temperatura T: I() = distribuição de Planck para o corpo negro
kT/h
33
ba
kT/h
ba
b
a ech8B
1eA1
N
N
33
baba ch8BA
Espectroscopia óptica de emissão
dt
dNAN b
bab
2
baba rB
baab rr
lembrando:
Aba kR
19
lâmpada
fotomultiplicadora
monocromador de emissão
monocromador de excitação
Fluorímetro de estado estacionário
375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 6500.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
cm
-1)
15.416.016.717.418.219.120.021.022.223.525.0
Água
DLPC 20 oC
Inte
nsi
dad
e N
orm
ali
zad
a
nm)
26.7
C
O
N
CH3
CH3
Prodan
água DLPC 20 oC
amostra
Grande sensibilidade da fluorescência ao meio onde encontra-se o fluoróforo
375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 6500.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
cm-1)
15.416.016.717.418.219.120.021.022.223.525.0
Água
Metanol
Acetonitrila
Diclorometano
Clorofórmio
Ciclohexano
Inte
nsid
ade
Nor
mal
izad
anm)
26.7
300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 4500.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 Água Metanol Acetonitrila Diclorometano Clorofórmio Ciclohexano
Ab
so
rbâ
ncia
No
rma
liza
da
nm)
Prodan
absorção emissão
Nome Fórmula m(D) n (g/cm3) f *
Ciclohexano C6H12 2.0 ~0 1.43 0.779 0.00
Clorofórmimo CHCl3 4.8 1.0 1.45 1.210 0.15
Diclorometano CH2Cl2 8.9 1.6 1.42 1.330 0.22
Acenonitrila C2H3N 36.6 3.9 1.34 0.786 0.30
Metanol CH3OH 33.0 1.7 1.33 0.790 0.31
Água H2O 78.9 2.7 1.00 1.000 0.32
12
1
12
12
2
n
nf
Longo tempo de vida do estado excitado
( ~ 10-9 s)
o espectro de fluorescência é muito
mais sensível ao meio do que o espectro de
absorção
(Lakowicz, 1999)
Grande sensibilidade da fluorescência ao meio onde encontra-se o fluoróforo
Por que estudar o efeito do solvente?
2
2
2
3emabs )(1n2
1n
12
1
ha
2)( mm
Usa o modelo de Clausius-Mosotti para molécula esférica
(r = a), polar, em dielétrico: = polarizabilidade eletrônica
e molecular n = polarizabilidade eletrônica
Modelo de Lippert - fluoróforo esférico
- solvente meio contínuo - não são consideradas interações moleculares
específicas
Auxiliar o estudo da estrutura do fluoróforo no
estado fundamental e excitado
Conhecer o microambiente onde se encontra o
fluoróforo - Trp em uma proteína:
exposto ao meio aquoso ou no seu interior?
- penetração de moléculas na
membrana lipídica
Modelos de membranas biológicas
vesículas unilamelares vesículas multilamelares
Sondas fluorescentes incorporam-se à bicamada lipídica
Estudo das interações: peptídeo/membrana proteína/membrana fármacos/membrana
DNA/membrana
400 420 440 460 480 500 520 540 560 5800.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.070
oC
60oC
50oC
40oC
30oC
no
rma
lize
d f
luo
resce
nce
in
ten
sity
(nm)
Fluoróforo em membranas lipídicas
DPPG
(Vequi-Suplicy, Benatti, Lamy , JF 2006)
exc = 340 nm
Tm ~ 41 oC
5-PCSL
DMPG
O
O
O
O
O
P
O
O
HO
O
HO
_
.
_ O
O
O
O
O
P
O
O
OONO
N(CH3)3+
16-MESLO
O
CH3
NO O
O_ N O
O
O
12- SASLH
HO COLESTEROL
5-PCSL
DMPG
O
O
O
O
O
P
O
O
HO
O
HO
_
.
_ O
O
O
O
O
P
O
O
OONO
N(CH3)3+
16-MESLO
O
CH3
NO O
O_ N O
O
O
12- SASLH
HO COLESTEROL
5-PCSL
DMPG
O
O
O
O
O
P
O
O
HO
O
HO
_
.
_ O
O
O
O
O
P
O
O
OONO
N(CH3)3+
16-MESLO
O
CH3
NO O
O_ N O
O
O
12- SASLH
HO COLESTEROL
Laurdan
C
O
N
CH3
CH3
Tm
300 330 360 390 420 450
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
a) Aqueous solution
I em (
no
rma
lized
)
(nm)
300 330 360 390 420 450
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
b) DMPG dispersion
I em (
no
rma
lize
d)
(nm)
exc = 296 nm 357 nm 342 nm
Estudo da interação peptídeo/membrana
3 C
C
CCH
NH
C
NH
O O
O
O
NN NH H H H
CH
OH
C C
2
H
H
H
CH
CH22
C CHH
OH
OO O
NNNH
H
HC
C
C
2
2CH
3
CCCH H
CH
CH
COO
2
2 CH2
N
C
OH HH
CC CNN
CH CH2 2
OO
H
H
CH
CH
N
NH
C
HHHCC
2
2
NN
NH
CCH H
OOH
C N
H
C
CH
CH
CH
CH
NH
H H
2
2
2
3
2
C
C C
OO
NNHH
CH
C
CH
2
2
3
C
O
NH
CH
Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val
S
22
C
H3
(Fernandez et al., 2003)
-MSH
Y
Z
I ׀׀
I
X
Radiação polarizada
Absorção de foton: momento de dipolo é criado no fluoróforo (momento de dipolo de transição)
Anisotropia de fluorescência
Momento de Dipolo de Absorção
Momento de Dipolo de
Emissão
baab rere
Excitação é foto-seletiva
não ocorre absorção
absorção máxima
absorção cos2A
Campo Elétrico da luz
incidente
dipolo elétrico de absorção
abba rere
Anisotropia de fluorescência (experimento)
vhvv
vhvv
GII
GIIA
2
hh
hv
I
IG
II
IIA
2//
//anisotropia
experimental
Sensibilidade do detector à polarização
Anisotropia de fluorescência
Momento de Dipolo de Absorção
Momento de Dipolo de
Emissão
2
1cos3
5
2 2
0
A
Se a molécula está parada:
Ao anisotropia
fundamental
Se a molécula gira durante o tempo de vida do estado excitado:
Fornece informações acerca da mobilidade da molécula no meio.
Anisotropia de fluorescência
Dipolo de absorção
Dipolo de emissão t = 0
Dipolo de emissão t > 0
Despolarização da emissão:
mede movimento do fluoróforo
Emissão: tem componente perpendicular à absorção
II
IIA
2//
//anisotropia
Fluoróforo pode girar durante o tempo de vida do estado excitado
10 20 30 40 50 60 700.04
0.08
0.12
0.16
0.20
0.24
0.28 DLPC
DPPG
Em
=480 nm
an
iso
tro
py
Temperature (oC)
Anisotropia de fluorescência
Tm Laurdan em bicamadas lipídicas
DPPG
Tm ~ 41 oC
DLPG
Tm ~ 0 oC
34 0 20 40 60 80 100
1
10
100
1000
10000
c
ba
Co
nta
ge
ns
tempo (ns)
a - KKA-0
b - RKK3-0
c - RKK3-30
fotomultiplicadora
fotomultiplicadora
monocromador
amostra
Semi-espelho
Conversor tempo-amplitude
partida chegada
Fluorímetro com resolução temporal
Laser pulsado
35
0 500 1000 1500 2000
1
10
100
1000
10000
cont
agen
s
tempo (ns)
Cinética do decaimento do estado excitado
I(t) : função de decaimento, após excitação por um
pulso de luz
Fluorímetro com resolução temporal
Fluorescência resolvida no tempo
- kR decaimento radiativo
- kCI conversão interna
- kis cruzamento intersistemas
- kq (Q) supressão (quenching)
... outros processos
bqISCIR
b Nkkkkdt
dN
kT
Texp k/1
exp/t
bb e)0(N)t(N
0 10 20 30 40 50
100
101
102
103
104
Cou
nts
Time (ns)
-MSH
in water
Na
Nb kR
exp)(
t
etI
kNR
Aba kR
...)( 21
21
tt
eeAtI
0 20 40 60 80 100
10
100
1000
10000
Co
nta
gen
sTempo (ns)
Critério de ajuste: 2
Decaimentos complexos: multiexponencial
Fluorescência resolvida no tempo
0 10 20 30 40 50
100
101
102
103
104
Co
un
ts
Time (ns)
in DMPG
-MSH
in water
Interação Trp/membrana também pode ser monitorada pelo
aumento do tempo de vida do estado excitado do fluoróforo
i
ι)(
t
ietI
Texp k/1 qISCIRT kkkkk
Maior taxa de desexcitação não radiativa do fluoróforo
(conversão interna, kCI) por interação com moléculas de H2O
1
(ns) 2
(ns) 3
(ns)
em H2O 3.68 2.28 0.54
em DMPG 5.34 2.45 0.62
Em DMPG, maior exp e maior rendimento quântico
F = Iem/Iabs = kR/kT = exp/ R
fluorescência resolvida no tempo
Supressão de Fluorescência
Supressão Estática
Formação de complexos não fluorescentes
Supressão Dinâmica (ou colisional)
Colisões durante o tempo de
vida do estado excitado
F Q
F Q
F Q
F Q
F
Mede acessibilidade/distância do fluoróforo às moléculas supressoras
40
Supressão Colisional
Fluoróforo excitado interage (curto alcance) com átomo ou molécula supressora
F* Q F
Aumenta taxa de transições não-radiativas para o estado fundamental.
Diminui intensidade
Diminui tempo de vida
41
Supressão Colisional
F*
F* Q F
Stern-Volmer
Intensidade:
Fo = kR / (kR + kNR)
Tempo de vida:
o = 1/ (kR + kNR)
Intensidade:
F = kR / (kR + kNR+kq[Q])
Tempo de vida:
= 1/ (kR + kNR+kq [Q])
][10 Qkk
k
F
F
NRR
qo
42
][10 QKd
280 320 360 400 440
0
500
1000
1500
2000
2500
Em
issio
n Inte
nsity
Wavelenght (nm)
0 10 20 30 40 50
1
10
100
1000
10000
Counts
Time / ns
][10 QKF
FSV
oq
NRR
q
dSV kkk
kKK
Supressão Colisional
43
))((10
430 qfqf DDRRN
k
][10 QKd
oq
NRR
q
d kkk
kK
Supressão Colisional
Processo difusão
Taxa de colisões
o
dqo
Kkk
44
Supressão Colisional
- MSH em agregados micelares
Supressão por alquilpiridinio
6
5
4
3
2
1 N
CH2
CH3
( )n
n = 1,2,3,5,8 e 9
-MSH kq (108 M-1 s-1)
NEP+ NHP+ NDP+
tampão 117 88 50
SDS 7. 5 8.3 5.1
SDS-PEO 4.1 8.4 4.6
LUTROL 1.3 1.7 1.2
(A.P.Romani and A.S.Ito, Biophys Chem 2009)
agregados: menor difusão da sonda e do supressor
Fluorescência
Deslocamento espectral
Anisotropia de fluorescência
Intensidade de fluorescência
Tempos de vida de fluorescência
Tempos de correlação rotacional
Efeitos de solventes
Supressão de fluorescência
Transferência de energia
Excitação multi-fótons
Microscopia de fluorescência
Correlação de fluorescência
Detecção de Molécula Única
...
46
Agradecimentos especiais:
Amando S. Ito (FFCL-RP-USP)
Cássia Marquezin (IF-UFG)
Cintia C. Vequi-Suplicy (IFUSP)
47
Bibliografia
“Physics of Atoms and Molecules” B.H. Bransden, C.J. Joachain
“Principles of Fluorescence Spectroscopy”
J.R. Lakowicz
“Molecular Fluorescence: Principles and Applications” B. Valeur
- . Série dos livros de “Topics in Fluorescence Spectroscopy”
Ed. J.R. Lakowicz
