Tecnicas histológicas

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LABORATRIO DE BIOLOGIA

Prof. Doutora Maria Lusa Valdeira

Faculdade de Farmcia, Universidade de Lisboa

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Programa do Laboratrio de BiologiaNeste Curso de Cincias Farmacuticas na disciplina Laboratrio de Biologia procuraremos ensinar os alunos a reconhecer e aplicar os conhecimentos da Biologia Celular Animal e Vegetal aprendidos nas aulas tericas e prticas das diversas unidades programticas, pretendendo que os estudantes interpretem os resultados duma forma crtica para assim poderem observar e ficar com um bom conhecimento das clulas procariotas e eucariotas animais e vegetais. Tambm vale a pena referir a utilidade da aplicao de princpios quantitativos da matemtica e da fsica aos sistemas biolgicos que deles necessitem. A natureza do trabalho laboratorial deve ser definida como sendo a prtica da manipulao, percia mental e estudo das diferentes metodologias para o estudo das diferentes clulas atravs da observao e da experincia de maneira que as hipteses possam ser construdas e avaliadas sistematicamente para serem incorporadas nos princpios gerais. Assim, devem ser explicadas ao aluno uma variedade de experincias apropriadas ao seu background e desenvolvimento, nas reas da cincia da Biologia Celular e Botnica Farmacutica que lhes foram ministradas. A metodologia a usar no decorrer destas aulas ser feita de acordo com os princpios enumerados a seguir: A importncia do grupo de trabalho na investigao da biologia Vantagens e inconvenientes das tcnicas usadas O uso de protocolo nos ensaios Organizao do trabalho laboratorial Como trabalhar num laboratrio de biologia Necessidade de controlos A importncia de duplicados Abordagem dos mtodos de apresentao dos resultados Bibliografia e relatrio

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1 MICROSCOPIA Microscpio ptico fotnico vulgar Modo de utilizao. Iluminao de Khler. Observao da diversidade celular comparando as clulas procariotas (bacilos e cocos) com as eucariotas (fungos, protozorios, tecidos animais e vegetais). Interpretao das imagens em microscopia fotnica Microscpio ptico invertido Observao de cultura de clulas animais e interpretao das imagens. Microscpio ptico de contraste de fase Modo de utilizao. Observao de clulas animais vivas no coradas assim como, de clulas vegetais destacando a epiderme da pgina inferior de uma folha. Interpretao das imagens nesta microscopia. Colorao vital Realizao de preparaes de clulas vivas e sua observao antes e depois da colorao com diferentes corantes vitais tais como, azul de metileno, vermelho neutro e lugol entre outos. As clulas no coradas sero observadas no microscpio fotnico e no de contraste de fase e as coradas no microscpio fotnico vulgar. Preparaes definitivas Realizao de incluses em parafina. Obteno de cortes no micrtomo e sua colagem em lminas. Colorao dos cortes com vrios corantes tais como, hematoxilina - eosina e sua montagem definitiva.

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Micrometria e Cariometria Medio de clulas com uma ocular micromtrica utilizando primeiro um micrmetro objectivo. Cariometria: Determinao de reas de ncleos celulares. Microscpio de fluorescncia Modo de utilizao. Observao de auto-fluorescncia de componentes das clulas vegetais. Observao de ncleos, citoplasmas e RNA com colorao de laranja da acridina. Imunocitoqumica. Estudo dos componentes do citoesqueleto. Observao de microtbulos com anticorpos anti-tubulina marcados com fluorescena. Observao de microfilamentos com anticorpos anti-actina marcados com rodamina. Interpretao de imagens nesta microscopia. Microscpio Digital Demonstrao da utilizao. Observao em campo claro, contraste de fase, fluorescncia, polarizao, contraste interdiferencial e confocal de clulas animais e vegetais. Citoqumica dos diferentes componentes qumicos celulares cidos nucleicos DNA em cortes histolgicos pela reaco de Feulgen. DNA e RNA pela colorao do verde - metil - pironina. Lpidos Lpidos totais com os corantes Sudan III, tetrxido de smio e Sudan Black B. Lpidos no cidos com o corante azul de nilo em clulas vivas e cortes histolgicos.

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Polissacridos Corantes: Lugol, azul de alcio e cido peridico de Schiff (PAS) em cortes celulares e esfregaos de sangue fixados. Protenas Protenas totais com o fast green cido, segundo Deitch Protenas histnicas com o corante fast green alcalino, segundo Alfert e Geschwind modificado por Deitch. Peroxidases pelo mtodo da benzidina, segundo Prenant. Clcio e Ferro Clcio com a colorao de Alizaran. Ferro com a colorao azul de Turnbull. Citoqumica de organitos celulares nas clulas animais Lisosssomas com marcao da fosfatase cida segundo Gmori. Mitocndrias segundo o mtodo de Rgaud. Complexo de Golgi segundo o mtodo de Ramon e Cajal.

2 - MICROSCOPIA ELECTRNICA Microscpio Electrnico de Transmisso Observao de grelhas para o respectivo microscpio com cortes ultra- finos contrastados. Observao e interpretao de microfotografias de clulas animais, vegetais e microorganismos infectando ou no, as clulas hospedeiras. Observao e interpretao de microfotografias de contrastao negativa Microscpio Electrnico de Varrimento Observao e interpretao de microfotografias de rplicas celulares

6 TCNICAS DE OBTENO DE PREPARAES CROMOSSMICAS Cultura celular Escolha de tecido, Colheita, Cultura e meios de cultura e respectiva tcnica Bandas Tcnicas para as Bandas G, R, C e NOR Observao ao microscpio e de fotografias Estudo das leucemias

3 - CLULA VEGETAL O estudo da clula vegetal e a sua importncia em Botnica Farmacutica, como auxiliar na caracterizao de frmacos de origem vegetal e na deteco de adulterantes. A parede celular em microscopia ptica Composio qumica da parede celular primria e secundria. Diferentes reaces de caracterizao qumica dos seus principais constituintes: celulose, lenhina, cutina e suberina. Sua aplicao caracterizao de frmacos de origem vegetal. O sistema vacuolar Os vrios tipos de vacolos e o seu contedo. Tcnicas para a sua observao. Realizao de testes histoqumicos para a caracterizao de alguns grupos de compostos do metabolismo secundrio armazenados nos vacolos: compostos fenlicos e alcalides. Utilizao do microscpio de fluorescncia para a caracterizao de contedos vacuolares. Aplicaes ao estudo de alguns frmacos de origem vegetal e seus adulterantes. O sistema plastidial Observao de diferentes tipos de plastos em microscopia ptica: cloroplastos, cromoplastos, amiloplastos e leucoplastos.

7 Observao de gros de amido, sua classificao e colorao. Importncia da sua utilizao como auxiliar na identificao de frmacos de origem vegetal e seus adulterantes, atravs da consulta da Farmacopeia Portuguesa. Histologia e Anatomia Vegetal. Aplicaes ao estudo de Frmacos de origem vegetal Observao e caracterizao de alguns tecidos vegetais. Sua importncia em Botnica Farmacutica como auxiliar na caracterizao de frmacos de origem vegetal e na deteco de adulterantes. Estudo do tecido epidrmico Observao de alguns microcaracteres a nvel do tecido epidrmico: classificao de estomas e determinao do ndice estomtico; tricomas tectores e secretores. Importncia destes caracteres em taxonomia e na identificao de frmacos de origem vegetal. Utilizao de monografias da Farmacopeia Portuguesa para estudo de microcaracteres da epiderme em frmacos de origem vegetal. Cortes histolgicos As estruturas primrias e secundrias de raz, caule e folhas em exemplares de monocotiledneas e de dicotiledneas. Observao de cortes histolgicos de vrios exemplares.

4 CICLO CELULAR EM CLULAS ANIMAIS E VEGETAIS Estudo do ciclo celular Observao microscpica de mitoses em clulas animais e vegetais. Observao microscpica de figuras das fases das duas divises meiticas em anteras de vegetais. Observao microscpica de cromossomas em interfase Observao microscpica dos cromossomas gigantes das glndulas salivares da Drosophila, visualizao das diferentes bandas e observao dos cromossomas plumosos.

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Observao microscpica e fotogrfica de cromossomas humanos em metafase cariotipo humano Observao microscpica e fotogrfica das placas metafsicas marcadas por diferentes tipos de bandas. Apoptose Observao de preparaes em microscopia ptica de clulas com figuras de apoptose. Bibliografia ALLAN JONES, ROB REED and JONATHAN WEYERS. (1998). Practical Skills in Biology. Longman Press. Azevedo, C. (1999). Biologia Celular e Molecular. Lidel Edies Tcnicas, Lisboa. DUTRILLAUX, B., COUTURIER, J., La pratique de l analyse chromosomique. Masson, 1983 BENCROFT, J.D., e STEVENS, A. (1990). Techniques, Churchill Livingstone. Theory and Practice of Histological

BRYAN G. BOWES. (1977). A Colour Atlas of Plant Structure. Manson Publishing. CELIS, J. (1998). Cell Biology - A laboratory hand book. Academic Press. United Kingdom. FRANCO, J. A. (1971). Nova Flora de Portugal. Vol. I, II, III, Lisboa. FRESHNEY, R.I. (1986). Animal Cell Culture. A practical approach. IRL Press, England. FARMACOPEIA PORTUGUESA. (1997) 6 Edio, INFARMED, Lisboa. JUDD, W. at al. (1999). Plant Systematics: A Phylogenetic Approach. Massachussets. Sinauer Associates, Inc. Publ. MELLO, M. LUIZA., e VIDAL, BENEDICTO. (1980). Prticas de Biologia Celular. Edgard Blucher Ltda. So Paulo, Brasil. PEARSE, A.G.E. (1985). Histochemistry: Theorical and Applied..Volumes I e II: Preparative and Optical Technology e Analytical Technology. Churchill Livingstone, London. PRIEST. JEAN H., Medical Cytogenetics and Cell Culture. Lea & Febiger, 1977.

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RAVEN, P. H., EVERT, R. F. & EICHHORN, S. E. Biology of Plants. (1999). 6th ed. New York. W. H. Freeman and Company / Worth Publishers, Inc. 1999. SALEMA, R. et al. (1983). Atlas de Ultraestrutura Celular. Porto Editora.

mbitoA descoberta e o estudo das clulas feita por M. Schleiden, botnico e pelo zologo T. Schwann reconheceram semelhanas entre clulas vegetais e animais e a TEORIA CELULAR foi proposta juntamente com R. Virchow que sugeriu que todas as clulas so originrias doutras clulas pr- existentes. Ao objectivo da Biologia Celular alia-se o da aprendizagem das tcnicas de manuseio de diferentes tipos de microscpios pticos, observao de estruturas celulares em microscopia ptica e electrnica, metodologias utilizadas nos diferentes microscpios assim como, o reconhecimento e interpretao de imagens de microscopia e anlise crtica experimental. Conjuntamente, sero estudadas as tcnicas experimentais mais importantes para o estudo das clulas. O estudo da clula Vegetal, a Histologia e Anatomia Vegetal com a Aplicao ao Estudo de Frmacos de origem Vegetal ser um dos objectivos desta Licenciatura. O estudo e observao de culturas de clulas ser determinante para os ensaios in vitro dos projectos cientficos das cincias farmacuticas. A citoqumica de acidos nucleicos, lpidos e carbohidratos assim como, a micrometria de diferentes clulas ao microscpio ptico e electrnico dar base para o bom estudo do novo medicamento.

10 INSTRUMENTOS DE ANLISE DE ESTRUTURAS BIOLGICAS

MICROSCOPIA A microscopia tem a maior importncia no estudo das clulas. Muitas caractersticas importantes de interesse nos sistemas biolgicos so demasiado pequenas para serem vistas a olho nu, s podendo portanto, ser observadas com o microscpio. Nos anos mais recentes, tem-se notado um grande desenvolvimento em microscpios, corantes, protocolos de colorao e tcnicas de preparao para ajudar a esclarecer melhor a estrutura e funo das clulas. Descreveremos as capacidades e aplicaes das vrias tcnicas de microscopia usadas para visualizar as clulas, as suas estruturas subcelulares e ainda as suas molculas. As estruturas celulares que necessitamos de estudar tm dimenses que, em regra, so invisveis vista desarmada. 1mm (milmetro) = 1 000 m (micrmetro) = 1 000 000 nm (nanmetro) = 10 000 000 (Angstrom). O olho humano s consegue formar imagens de objectos com dimenses superiores a cerca de 0,2mm. Para observar objectos mais pequenos necessrio formar deles uma imagem ampliada. Os microscpios so os aparelhos utilizados para formar essas imagens. Radiao electromagntica Os microscpios usam radiaes electromagnticas para formar imagens ampliadas dos objectos a observar. O microscpio ptico usa a luz visvel (radiao electromagntica com comprimento de onda compreendido entre 400 e 800 nm)

11 O microscpio electrnico usa raios catdicos (feixe de electres) cujo comprimento de onda inversamente proporcional voltagem de acelerao dos electres usados no microscpio, sendo de 0,0037nm para uma voltagem de 100KV. Resoluo e ampliao H um limite mnimo para a dimenso dos objectos que podem ser observados com um determinado sistema ptico, limite esse que se denomina resoluo do sistema. Por exemplo, a resoluo do olho humano de cerca de 0,2mm, e determinada pela estrutura celular da retina. A de um microscpio ptico de 0,2mm e limitada pelo comprimento de onda da luz visvel. A ampliao da imagem produzida pelo sistema ptico, permite observar objectos de dimenses inferiores a 0,2 mm (resoluo do olho humano), mas apenas at ao limite de resoluo do sistema ptico. Objectos menores que este limite no podem formar imagens, por maior que seja a ampliao utilizada. A ampliao til a ampliao necessria para que a imagem do objecto se torne visvel, ou seja, para que atinja dimenses iguais ou superiores ao limite de resoluo do olho humano. Para conforto do observador, as imagens so ampliadas at dimenses que tornam a sua observao confortvel. O factor de ampliao adicional a ampliao vazia. Exemplo: Para que um objecto no limite de resoluo do microscpio ptico se torne visvel necessrio ampli-lo: 0,2mm / 0,2 m = 200 m / 0,2 m = 1000 x. Para uma observao confortvel, podemos ampli-lo at 1mm, utilizando um factor de ampliao adicional de 1mm/0,2mm=5. V-se assim que a ampliao til de um microscpio ptico no excede as 1000x Tipos de microscpio O limite de resoluo de um microscpio depende do comprimento de onda da radiao electromagntica usada para formar a imagem e de aberraes das lentes .

12 Deste modo, pode-se melhorar a resoluo construindo microscpios que utilizem radiaes de comprimento de onda menor que o da luz visvel. A construo deste tipo de microscpios depende da capacidade de produzir lentes para a radiao em causa. A radiao ultra-violeta permite algum ganho de resoluo, mas usada principalmente nos microscpios de fluorescncia. Os raios-X comeam a poder ser usados com lentes especiais, e raios-gama no foram ainda usados por falta de dispositivos que possam funcionar como lentes. Os raios catdicos (feixes de electres) utilizam ++ e so usados nos microscpios electrnicos. Nos microscpios mais comuns, o feixe de radiao esttico e irradia simultaneamente toda a rea observvel da amostra. Noutros aparelhos (microscpios de varrimento), o feixe possui dimenses muito reduzidas irradiando apenas um ponto da amostra, e dotado de um movimento relativamente quela, irradiando em sequncia todos os pontos do objecto (varrimento ou varredura). O microscpio ptico usa a luz visvel como radiao electromagntica. Os componentes principais do microscpio ptico so:

Fonte luminosa: Condensador Diafragmas de campo e do condensador Platina Objectiva Tubo Oculares MICROSCPIO PTICO FOTNICO VULGAR

No microscpio ptico de transmisso a luz emitida pela fonte luminosa e concentrada pelas lentes condensadoras, atravessa a amostra e penetra na objectiva. A objectiva forma uma imagem real, ampliada, do objecto e as oculares formam uma imagem virtual, tambm ampliada, da imagem real produzida pela objectiva. A imagem virtual situa-se distncia de 25cm do olho do observador, e a imagem que pode ser observada. A

13 ampliao total o produto dos factores de ampliao da objectiva e das oculares, podendo existir outros dispositivos no trajecto da luz que introduzam factores multiplicativos adicionais. O feixe luminoso que atravessa a amostra modificado por interaces com esta, que consistem na absoro de certos comprimentos de onda produzindo cr, difraco, refraco, reflexo, diferena de fase etc. Estas interaces vo-se traduzir na produo de diferenas de cr ou de intensidade luminosa na imagem do objecto, que podem ser percebidas pelo olho humano. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE Ambos os microscpios usam a propriedade de dar contraste a estruturas biolgicas transparentes luz visvel, visto que fazem mudanas de fase e/ou atrasos nas radiaes que atravessam essas estruturas. O microscpio de contraste de fase usa um condensador e objectivas especiais. O condensador est provido de um diafragma em forma de anel (diafragma anular) que produz um cone oco da luz que o atravessa. A luz ilumina o objecto e o que o rodeia. A luz que passa o objecto desviada em relao que passa directamente o meio que o rodeia. O efeito de fase depende da interferncia entre a imagem geomtrica directa e a imagem difractada lateral. Se os dois grupos de raios se somam em contraste brilhante ou negativo o objecto aparecer mais brilhante que o meio. Quando o contraste positivo ou escuro os jogos de raios experimentam uma interferncia substrativa sendo a imagem do objecto mais escura que o meio. Deste modo, pequenas mudanas de fase so transformadas em diferenas de amplitude (intensidade).I S+D

D

Comp. de onda S

D. Raios difractados S. Raios directos

14I

S S-D

Comp. de onda D

Para obter os dois tipos de contrastes o microscpio provido de objectivas com dispositivos de fase especficos: CONTRASTE BRILHANTE

vidro material retardante de fase material absorventeCONTRASTE ESCURO A)

vidro

material absorventeB)

vidro material retardante de faseConforme os fabricantes de microscpios o contraste escuro pode ser obtido com dois dispositivos diferentes (ver Figuras A e B). Utilizando o dispositivo A, a luz directa

15 levada ao foco da objectiva onde est colocada a placa de fase. Esta, tem uma ranhura em forma de anel que coberta por uma fina camada de metal que tem por fim fazer avanar os raios da luz directa de um quarto de comprimento de onda e reduzir a sua intensidade. Os raios da luz desviada do objecto que tinham sido atrasados comparativamente luz da fonte luminosa passam sem alterao pela placa de fase. Em seguida, as ondas de luz que passaram pelo objecto e aquelas que passaram pelo meio que o circunda, encontram-se no plano onde se forma a 1 imagem dada pela objectiva. Aqui, algumas das ondas de luz interferem entre si e o brilho reduzido. A ocular recebe os dois conjuntos de ondas de luz para formar uma imagem altamente contrastada do objecto. Esta imagem tem um halo considervel em virtude dos efeitos de difraco. Os esquemas mostram a passagem da luz atravs da preparao, e os dispositivos de fase.

A microscopia de interferncia tem por base princpios semelhantes ao microscpio de contraste de fase, mas tem a vantagem de fornecer dados quantitativos. Este microscpio, permite a deteco de variaes pequenas e contnuas de ndice de refraco, enquanto que o microscpio de fase s revela variaes acentuadas. Porque o atraso de fase consequente da diferena entre o ndice de refraco do meio e do objecto, e porque o aumento refractivo quase o mesmo para todas as molculas

16 biolgicas, possvel avaliar a quantidade de massa seca por unidade de rea do objecto, medindo o atraso de fase. A quantificao do atraso de fase feita usando um compensador que reduz o brilho do objecto a negro. Embora o seu uso seja remoto, pode ser empregue no futuro com sistemas analisadores de imagem. MICROSCOPIA DE FUNDO ESCURO No microscpio de fundo escuro, a luz dirigida do condensador amostra num ngulo oblquo de maneira a que nenhuma luz incidente entre nas lentes da objectiva (criando um campo escuro se nenhuma amostra estiver presente). Nestas condies, s a luz refractada ou difractada pela amostra entra nas lentes da objectiva para formar a imagem. A resoluo no muito boa, mas com este mtodo podemos observar objectos pequenos que refractam a luz incidente. usado na microbiologia, para detectar bactrias ou na autoradiografia, para detectar gros de prata produzidos na emulso fotogrfica por radiao. A Figura mostra um esquema deste tipo de microscpio.

Uma das grandes vantagens dos microscpios de contraste de fase, interferncia e de fundo escuro que eles tornam possvel a observao dos movimentos envolvidos em processos como, mitose e migrao celular. Como muitos movimentos so demasiado lentos para observar em tempo real til fotografar (microcinematografia) ou filmar em sistema de vdeo. Ultimamente, as cmaras de vdeo e a tecnologia associada do processamento de imagem tm tido maior impacto na microscopia ptica. Alm de possibilitarem a resoluo de certas

17 imperfeies do microscpio, resolveram de igual modo as limitaes do olho humano, tais como a percepo de pequenas diferenas na intensidade da luz contra um fundo brilhante. Como as imagens dadas pelas cmaras de vdeo so em forma electrnica, elas podem ser digitalizadas e processadas por um computador. Este facto tornou possvel, atingir o limite de resoluo terico do microscpio ptico e aumentar o contraste das imagens. Um dos exemplos a observao de microtbulos, com dimetros de dimenso inferior ao da luz (0,025 m) no microscpio de interferncia assistido por um computador.

MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA um microscpio de luz incidente (epi-iluminao), como o microscpio de reflexo. O feixe luminoso tem no entanto um comprimento de onda apropriado (habitualmente na regio azul ou ultravioleta) para excitar substncias fluorescentes (fluorocromios) que se encontram na amostra. Estas substncias podem fazer parte da composio natural amostra ou ser introduzidas pelo processamento tcnico como corantes. A luz emitida pelos fluorocrmios excitados pelo feixe luminoso, entra na objectiva para formar a imagem. Mecanismo da fluorescncia Quando certas substncias como o vidro, gotas de gordura e diversos corantes so expostos s radiaes UV, modificam o comprimento de onda destas radiaes e tornam-se luminosas, isto , so fluorescentes. Se tratarmos tecidos, clulas, bactrias com um corante fluorescente e as examinarmos ao microscpio com luz UV, elas tornam-se luminosas e aparecem como corpos brilhantes num fundo escuro. A fluorescncia data de 1904 com Kohler e foi usada mais frequentemente com Coons que introduziu a tcnica dos anticorpos fluorescentes em 1941. A fluorescncia um fenmeno ptico no qual a luz absorvida por uma substncia chamada fluorforo e quase instantneamente re-emitida com luz dum maior. Como resultado da absoro da luz, as molculas de fluorforo tornam-se excitadas, quer dizer, absorvem a energia da luz e o seu estado electrnico mudado para um estado excitado no qual a energia de cada molcula maior do que o seu estado normal.

18 A energia excedente dissipada em calor, emitida em fluorescncia, ou usada numa reaco fotoqumica. No primeiro caso, a luz meramente absorvida sem fluorescncia. No segundo, a fluorescncia ocorre. No terceiro, a reaco fotoqumica induzida pela luz apagar-se-. Esta tcnica no s utilizada quando se pretende detectar substncias em concentraes mnimas, mas tambm se usa para observaes depois de tratamentos qumicos. Quando surgem mudanas de excitao ou emisso do espectro de substncias fluorescentes devido sua unio ao substrato, tambm se podem obter informaes a respeito da conformao das molculas do substrato. Tipos de fluorescncia do material biolgico Tipos de fluorescncia Autofluorescncia Locais e Tcnicas Fluorescncia natural de substncia(s) no tecido Drogas fluorescentes Substncia no tecido convertida a fluorfero A.Tc.colorao simples sem p. trat. Qumico B. Reac. qumica seguida de colorao, ex. Feulgen Fluorocromia indirecta Mt. Fluorescentes

Fluorescncia induzida Fluorescncia do corante

Imunofluorescncia Fluorescncia prod. Enzimaticamente

No Quadro, podem ver-se os tipos de fluorescncia e os materiais microscpio de fluorescncia.

a observar no

Autofluorescncia A autofluorescncia predominante nos tecidos vegetais. Nos tecidos animais, podemos encontr-la nas fibras do tecido conjuntivo (colagnio e elastina) e nas lipofucsinas. No interior celular, a maior parte da autofluorescncia devida presena do NADH unido a uma dehidrogenase mitocondrial.

19 Todas as protenas fluorescem quando so excitadas a 250-280 nm (UV), devido presena do triptofano, tirosina e fenilalanina. As gotas lipdicas tambm podem ser observadas no microscpio de fluorescncia. Fluorescncia induzida Algumas substncias podem ser convertidas a fluorescentes por tratamento qumico. Ex o formol reage com as ariletilaminas por reaces de condensao levando formao de isoquinolinas e outros compostos fluorescentes. Fluorocromia Os corantes fluorescentes so conhecidos por fluorocromos em contraste com os que so visualizados no microscpio de luz que so chamados diacromos. Muitos corantes podem ser usados como diacromos e fluorcromos: Vermelho Congo, Vermelho neutro, Eosina e Fucsina Bsica. A maioria dos corantes amarelos, laranja, e vermelhos so de facto, fluorescentes, (laranja de acridina e quinacrina, esto entre eles. A colorao do DNA com fluorcromos importante, principalmente, devido aos estudos fluorimtricos. Primeiro, foi usada para o estudo da conformao do DNA, mas agora utilizada para a quantificao do contedo em DNA. Usam-se Laranja de Acridina, reaco de Feulgen, Brometo de etdio, etc. Fluorescncia Metacromtica Alguns fluocromos so metacromticos, isto , fluorescem com mais de uma cor. Com os fluorcromos metacromticos, assim como os diacromos, a mudana da ortocromasia para metacromasia envolve um aumento no pico de excitao (absoro) em direco a curtos comprimentos de onda, e um decrscimo na absoro mxima. Adicionalmente, existe um correspondente aumento do espectro de emisso em direco a grandes . Resumindo, a cor emitida pela fluorescncia muda para uma de maior, e o brilho da fluorescncia diminui. A fluorescncia metacromtica devida formao de dmeros e polmeros como resultado duma agregao das molculas do corante. Dos corantes fluorescentes metacromticos, o mais conhecido a Laranja de Acridina, verde na sua forma ortocromtica, cora o DNA, e vermelho na forma metacromtica, cora o RNA, DNA desnaturado e polissacridos.

20 Imunofluorescncia Certos corantes fluorescentes podem utilizar-se para marcar os anticorpos do soro. Eles so adicionados s gamaglobulinas custa de determinados radicais e tornam fluorescente o conjugado resultante. Pode empregar-se o isotiocianato de fluorescena. As figuras 1 e 2 apresentam, respectivamente, as estruturas da fluorescena e tetrametilrodamina, dois corantes usados em imunoflorescncia. O 1 emite luz amarela esverdeada quando activado por luz de comprimentos de onda prprios, enquanto que o 2 emite luz vermelha. Na zona sombreada onde esto localizadas os grupos reactivos quimicamente. Nesta posio vai ser formada uma ligao covalente entre o corante e a protena ou outra molcula. Quando se ligam a protenas a ligao feita ao grupo SH ou ao NH2.OCH 3CH 3 + N

HO

OH3 C

N

O

CH 3

COO

-

COO

-

Fig.1 - Fluorescena

Fig. 2 - Tetrametilrodamina

Fluorescncia produzida enzimaticamente A actividade enzimtica nas clulas (vivas ou fixadas) pode ser estudada em sistemas onde a enzima produz uma mudana de fluorescncia pela aco num substracto ou co-enzima.

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MicrotubulesRat aortic smooth muscle cells stained with an anti-tubulin antibody and FITC-conjugated secondary antibody (green). (Omega Optical Filter Set # XF71). Photograph by Jim San Fillipo

Aplicaes As tcnicas de fluorescncia podem ser aplicadas a todas as espcies de material biolgico. O microscpio de fluorescncia tem grande sensibilidade tornando possvel detectar pequenas quantidades de substncia ou partculas de tamanhos abaixo da resoluo do microscpio de luz. Podem ser visualizadas as mesmas preparaes que no MO de luz e tem a vantagem de observar os corantes que absorvem na regio do UV fluorescendo no visvel. MICROSCOPIA DE POLARIZAO Este mtodo baseia-se no comportamento de certos componentes de clulas e tecidos, quando so observados com luz polarizada. Se o material for isotrpico, a luz polarizada propaga-se atravs dele com a mesma velocidade, independentemente da direco do plano de incidncia. Estas substncias caracterizam-se por terem o mesmo ndice de refraco em todas as direces. Por outro lado, num material anisotrpico a velocidade de propagao da luz polarizada varia. Este material tambm chamado birrefringente, porque apresenta dois ndices de refraco diferentes, correspondentes a diferentes velocidades de transmisso. Nas fibras biolgicas, a birrefringncia positiva se o ndice de refraco for maior ao longo do comprimento da fibra, do que no plano prependicular, e negativa no caso oposto. A birrefringncia (B) pode ser expressa quantitativamente como a diferena entre os dois ndices de refraco (Ne N0) associados com os raios de maior e menor velocidade.

22 Na prtica, com o microscpio de polarizao, mede-se o atraso (T) que a luz sofre num plano, relativamente velocidade que a luz apresenta num plano perpendicular a este. O atraso est relacionado com a espessura do espcime (t) da seguinte maneira: B = Ne - N0 = T/ t O microscpio de polarizao difere do microscpio vulgar pela presena de dois elementos de polarizao: o polarizador e o analizador, que consistem de folhas polaride ou de prismas de Nicol em calcite. O polarizador monta-se por baixo do condensador e o analizador por cima da objectiva. O microscpio de polarizao, tal como o microscpio de interferncia, pode ser acoplado a uma cmara de vdeo, o que melhora consideravelmente o contraste e a qualidade de imagem. Microscpio confocal Trata-se de um microscpio ptico que funciona em modo de varrimento. Portanto o feixe luminoso irradia apenas um ponto da preparao, sendo produzido por um laser. Do mesmo modo que no SEM, o feixe de radiao percorre a preparao. Microscpio invertido um microscpio ptico de transmisso, em que as posies da objectiva e do condensador se encontram invertidas relativamente platina. O aparelho usado para observar o fundo dos frascos de cultura de clulas, que no podem ser facilmente estudados com os microscpios normais. ALINHAMENTO DOS MICROSCPIOS PTICOS Focar a preparao e fechar o diafragma de campo ate observar um pequeno crculo. Centrar o crculo com os parafusos do condensador e deslocar o condensador na vertical para que os bordos do diafragma que delimitam o crculo fiquem perfeitamente focados. Manter o condensador nesta posio para a objectiva alinhada. A rea iluminada pode ser ajustada abrindo ou fechando o diafragma de campo. S deve ser iluminada a rea a observar abrindo o diafragma at que todo o campo esteja iluminado e no mais que isso.

23 O diafragma do condensador pode ser usado para regular o ngulo do cone de luz que entra na objectiva. Em condies ideais, este cone de luz deve iluminar toda a lente frontal da objectiva e no mais do que isso. Nestas condies toda a abertura numrica da lente aproveitada, e toda a luz proveniente do condensador entra na objectiva. Uma maior abertura do diafragma do condensador pode produzir maior intensidade luminosa, mas produz um fundo brilhante que impede a visualizao de pequenos detalhes. O fecho do diafragma vai diminuir a abertura numrica da objectiva, reduzindo a resoluo, mas permite aumentar o contraste da preparao. A imagem do diafragma do condensador pode ser monitorizada no plano focal da objectiva, que directamente observvel removendo a ocular e observando directamente o interior do tubo do microscpio. As condies de iluminao descritas designam-se por "iluminao de Koeller".

MICROSCOPIA ELECTRNICA DE TRANSMISSO Interpretao da imagem em microscopia electrnica de transmisso As imagens observadas com um microscpio electrnico de transmisso (TEM Transmission Electron Microscope) so imagens de cortes de objectos tridimensionais. A formao das imagens no microscpio depende de mtodos de contrastao que introduzem nos cortes metais pesados que, ao interagir com o feixe de electres, do origem imagem. Na interpretao destas imagens h que atender portanto a estes dois factores: 1. Em que medida que a imagem produzida pelo mtodo de contrastao corresponde realidade estrutural, e que dados sobre a sua composio qumica se podem recolher por maniulao dos mecanismos de contrastao.

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2. Que se pode inferir relativamente estrutura do objecto tridimensional que se pretende compreender, do estudo das seces bidimensionais, em termos qualitativos e quantitativos.

O contrastePara compreender a primeira questo necessrio conhecer o mecanismo da formao do contraste no TEM. O feixe de electres, acelerado por um potencial de vrias dezenas de kilovolts (tpicamente 60-80 KV em estudos de materiais biolgicos), atravessa a amostra interagindo com os seus tomos. As colises dos electres do feixe com os tomos da amostra processam-se segundo dois processos essenciais: 1) colises dos electres do feixe com os electres dos tomos da amostra. 2) colises com os respectivos ncleos. No primeiro caso, o electro do feixe transmite parte da sua energia ao electro do tomo da amostra e pouco desviado da sua trjectria. Trata-se de uma coliso no elstica. Estas colises reduzem a energia dos electres do feixe, que podem produzir contraste por interfncia com os electres do feixe que no sofreram colises. Este mecanismo de formao do contraste tem importncia sobretudo para o detalhe mais fino, perto do limite de resoluo do microscpio. No segundo caso, os electres do feixe no perdem energia, mas so desviados da sua trajectria segundo ngulos elevados, quando colidem com ncleos de tomos pesados. Estes electres podem ser selectivamente removidos pela introduo de diafragmas que s deixam passar os electres no desviados (fig). Consequentemente, nas regies da amostra onde h maior concentrao de tomos pesados, h uma maior fraco de electres desviados e removidos do feixe, gerando regies deficientes em electres.

Tcnicas de contrastaoUma vez que o contraste que interessa obter principalmente contraste de amplitude, dependente das colises elsticas dos electres do feixe com tomos pesados, este efeito pode-se obter ligando qumicamente amostra compostos com metais pesados. Alguns destes compostos funcionam tambm como fixadores (tetrxido de smio, acetato de uranilo) e so usados para tratar as amostras no includas, durante os passos de fixao. Outros (acetato de uranilo, citrato de chumbo) so usados para tratamento dos cortes finos (Fig. 2). A contrastao negativa (Fig.1) mostra o contraste por um corante negativo, isto , aquele que fica fora do material a observar.

25 Microscopia electrnica de varrimento Enquanto que nos microscpios de transmisso convencionais o feixe irradia toda a amostra, e so as alteraes produzidas no feixe por interaco com esta que vo ser convertidas na imagem, nos microscpios de varrimento o feixe irradia apenas um ponto da amostra. O feixe percorre sistemticamente toda a amostra por um processo de varrimento, e a interaco do feixe com a amostra gera sinais que podem ser medidos por detectores apropriados. A imagem forma-se ponto por ponto em tubos de raios catdicos nos quais o feixe de electres se move de um modo sincronizado com o movimento do feixe de radiao do microscpio de modo que a cada ponto do objecto corresponde um ponto da imagem. A intensidade e/ou cr do ponto imagem so moduladas pelo sinal recolhido pelo detector. A resoluo deste tipo de aparelhos depende principalmente do tamanho da rea do objecto irradiada pelo feixe O modo de varrimento pode ser implementado quer em microscopia de transmisso quer em microscopia de reflexo quer ptica quer electrnica. As implementaes actualmente mais importantes em biologia so o microscpio electrnico de varrimento (SEM scanning electron microscope), que essencialmente um microscpio electrnico de reflexo, e o microscpio confocal, que um microscpio ptico funcionando tambm em modo de reflexo (fazendo uso principalmente de tcnicas de imunofluorescncia). Merece tambm referncia o microscpio electrnico de varrimento-transmisso (STEM Scanning-transmission electron microscope) que um microscpio electrnico funcionando em modo de transmisso. SEM Funcionamento do instrumento No microscopio electrnico de varrimento o feixe de radiao um feixe de electres que focado num ponto da amostra pelas lentes electromagnticas do microscpio.A interao do feixe de electres com a amostra gera um conjunto de sinais em que se contam electres secundrios, electres retrodifundidos, raios-X, etc. Estes sinais podem ser medidos por detectores apropriados, repectivamente para electres de baixa energia (electres secundrios), de alta energia (electres retrodifundidos), e raios-X. Estes sinais, so

26 convertidos pelo detector em correntes elctricas de maior ou menor intensidade que vo modular a intensidade do feixe de electres que forma a imagem no tubo de raios catdicos. As amostras estudadas no SEM so amostras espessas, como dentes inteiros, no sendo importante que o feixe de electres seja capaz de a atravessar uma vez que os sinais recolhidos dizem respeito, em regra, apenas interaco com a superfcie da amostra. Portanto estes instrumentos esto particularmente adaptados ao estudo das superfcies das amostras e no da estrutura interior. Preparao das amostras para o SEM Uma vez que interessa estudar a superfcie de amostras inteiras, os mtodos de preparao tm por objectivo preservar as superfcies, de um modo to fiel quanto possvel. Quando se torna necessrio estudar o interior das amostras, estas podem ser cortadas ou fracturadas de modo a expr o interior. Como as amostras so observadas no vcuo do microscpio, elas tm de ser fixadas e secas. A secagem habitualmente o passo mais delicado, uma vez que no seu decurso, os fenmenos de tenso superficial exercem foras capazes de destrur a maior parte da estrutura biolgica observvel. Para evitar estes efeitos recorre-se secagem por mtodos de ponto crtico ou a partir de lquidos de tenso superficial muito baixa. Modernamente tm vindo a ser desenvolvidos microscpios electrnicos de varrimento ambientais nos quais a cmara que contm a amostra pode ser mantida a uma presso elevada, prxima da presso atmosfrica, permitindo a observao de amostras no desidratadas. Imagens produzidas pelos electres secundrios Trata-se do modo de observao mais utilizado no SEM. Os electres secundrios so os electres ejectados dos tomos da amostra pelas colises no elsticas com os electres do feixe. Estes electres so ejectados direccionalmente em funo da topografia da amostra. A intensidade da emisso depende da natureza qumica da amostra. Os metais, que

27 possuem electres mais fracamente ligados, emitem melhor que as substncias em que os electres se ligam mais firmemente aos tomos, caso dos compostos orgnicos. Por este motivo, a superfcie das amostras recoberta com finas pelculas metlicas. Como o detector se localiza num dos lados da cmara de observao, a intensidade do sinal recolhido maior para os pontos das superfcies viradas para o detector. Por este motivo, o mtodo ideal para revelar a topografia das superfcies. Imagens produzidas pelos electres retrodifundidos Estes electres so os electres do feixe que, atravs de sucessivas colises elsticas com os tomos da amostra so desviados do seu trajecto o suficiente para se libertar da amostra e re-entrar no vcuo da cmara de observao (retro-difuso). Como se trata de electres do feixe de radiao do microscpio, desviados por colises elsticas, a sua energia muito maior que a dos electres secundrios. A sua emisso tambm direccional como a dos electres secundrios. No entanto trata-se de electres que penetram na amostra a maior profundidade e que so deflectidos mais intensamente nas regies de maior densidade de massa ( semelhana do que se passa no mecanismo de formao de contraste do TEM). Portanto, a intensidade do sinal reflecte no apenas a topografia da amostra como a sua composio qumica. Tcnicas especiais de microscopia electrnica Tcnicas citoqumicas para localizao de polissacardeos e cidos nucleicos. Digestes enzimticas em cortes ultrafinos para localizao de protenas e lpidos. Os mtodos citoqumicos para deteco de actividades enzimticas. A autorradiografia, a criomoldagem e a colorao negativa. Tcnicas de imunocitoqumica.

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Fotografia de E. Coli num SEM

CULTURA DE TECIDOS

A Biologia Celular faz crescer clulas em condies artificiais para os seus ensaios, so chamados os estudos in vitro e so feitos em culturas de tecidos. Estas clulas tm vantagem para alguns estudos e sobre isso falaremos. 1. Breve histria 2. Possibilidade de fazer crescer em laboratrio clulas animais e vegetais. 3 Importncia e aplicaes. 4. Biologia das clulas em cultura: sua origem, caracterizao e diferenciao. 5.Tipos de clulas: Culturas primrias, linhas celulares e clulas hbridas. 6.Curva de crescimento das clulas eucariotas 7.Diferenas entre a cultura de procariotas e eucariotas 8.Meios de cultura: composio e importncia. Cultura de tecidos a arte de manter e crescer clulas vivas ou tecidos num meio artificial controlado.

29 Comeou a ser realizada em 1800 com o exame in vitro de orgos e tecidos do corpo que podem ser mantidos fora do corpo, assim como de clulas tumurais. A possibilidade de estudar clulas depende da maneira como elas podem crescer e ser manipuladas em laboratrio. Embora o protocolo da cultura de clulas no seja to fcil como o que diz respeito cultura de bactrias, j se faz por rotina a cultura de tecidos animais e vegetais. Importncia e aplicaes Em primeiro lugar, importante referir o desejo dos investigadores de estudar as prprias clulas, isto , como elas crescem, quais os factores que as estimulam ou inibem, quais as suas necessidades e como que morrem. Os sistemas de cultura celular in vitro tm dado possibilidade aos investigadores de estudarem o crescimento e diferenciao celular, a modulao do ciclo celular, o crescimento viral, as interaces vrus-clula (muito importantes, porque permitem melhorar e esclarecer mecanismos e factores celulares at agora desconhecidos) e as manipulaes genticas com vista ao estudo da estrutura e expresso gnica. Alm destas aplicaes, so referidos outros usos em processos biolgicos e qumicos: - Ensaios para antibiticos, vitaminas, aminocidos, vacinas, qumica orgnica e alimentos - Testes de diagnstico clnico - Produo de produtos farmacuticos - Produo energtica e fermentao - Investigao sistemtica e taxonmica - Testes de toxicidade e diagnstico de doenas Metodologia Depois da disperso dum tecido nas suas clulas componentes, estas so colocadas numa placa de Petri ou num frasco de plstico prprio ou de vidro tratado, juntamente com o meio de cultura contendo os respectivos nutrientes. Os tipos de clulas mais utilizadas so: fibroblastos, clulas epiteliais, embries ou clulas tumurais. Contudo, em condies especiais muitas clulas especializadas podem ser postas

30 em cultura levando os investigadores ao estudo das suas propriedades de diferenciao. Resumindo, temos as culturas primrias e as linhas celulares. As culturas primrias consistem na manuteno de clulas normais ou tecidos que so obtidos duma fonte viva num sistema in vitro.Claro que para os tecidos sobreviverem intactos devem ser seccionados finos de modo a promoverem as trocas de gs e eliminarem os resduos. O maior problema com as culturas de tecidos primrias o facto de, tal como no animal normal, as clulas s se poderem dividir um nmero de vezes antes de ficarem quiescentes. Tambm possvel transformar clulas primrias em imortais, transfectandoas.As linhas celulares podem ser obtidas depois da triturao de um tumor e observao das clulas que ficaram aderentes placa de Petri, pois muitas das clulas devero ser de origem tumural e ficaro imortais. Isto significa que se as colocarmos num meio favorvel elas continuaro a proliferar criando uma linha celular. A linha celular clonal quer dizer, que um largo nmero de clulas foi originado apenas de uma clula. As linhas celulares so armazenadas na American Type Culture Collection. Os meios de cultura comearam por ser o plasma, soro e extractos embrionrios. Em 1955, Harry Eagle descreveu o primeiro meio sinttico que permitiu o crescimento celular. Eagle estudou o crescimento de duas estirpes celulares: HeLa e fibroblastos de rato. Para isso, estas clulas foram colocadas a crescer num meio formado por uma mistura de sais, carbohidratos, aminocidos, vitaminas e soro de bovino. Para saber quais os nutrientes especficos para o crescimento celular, Eagle foi variando os componentes do meio. O meio descoberto por Eagle ainda hoje o meio base de todas as culturas de clulas (ver o Quadro).

~

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Meio base de Eagle Vitaminas (mM) (mM) Arginina 0.1 Biotina 10-3 NaCl Cistina 0.05 Colina 10-3 KCl Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina 0.05 Fenilalanina Trionina Triptofano 0.02 Tirosina Valina Contaminao Consiste no crescimento de microorganismos (fungos ou bactrias) indesejveis cultura de clulas. Crescimento celular Quando se comea com metade do nmero de clulas a cobrir o frasco de cultura e posteriormente se observa o frasco todo coberto, isto significa que as clulas cresceram. Ao longo do tempo, as clulas utilizam os nutrientes do meio e os resduos aparecem modificando muitas vezes o pH do meio. Depois de trs dias, se as clulas no cresceram 70-80% da confluncia ( quando no existe nenhum intervalo entre elas, neste ponto as clulas deixam de crescer), ento pode-se substituir parte ou a totalidade do meio por meio fresco aquecido. 2.0 cido flico3 3

L- aminocidos

Sais (mM)

Outros 100 Glucose 5 mM 5 Penicilina 0.005% 1 Estreptomicina 0.005% 20 Vermelho fenol 0.005%

10- NaH2PO4 . H2O 10- NaHCO3

0.05 Nicotinamida 0.2 cido 10-3 0.2 Piridoxal 0.2 Tiamina3

pantotnico CaCl2 1 -3 10 MgCl2 0.5 1010-4

Riboflavina 0.1 0.2 Soro de bovino ou 0.1 0.2

cavalo a 10% para

todas as culturas stock

32 Quando as clulas atingem a confluncia, usualmente so removidas do frasco com tripsina e colocadas num novo frasco numa concentrao celular mais baixa. Ento, elas proliferam at que se faa novamente a sub-cultura. Cada vez que se passa as clulas considerado uma passagem. Para as clulas primrias normais, existe um nmero finito de passagens, enquanto as imortalizadas continuam a crescer. Contudo, no se devem fazer muitas passagens para no alterar a linha celular original porque com o tempo as clulas tendem a duplicar parte ou a totalidade dos cromossomas e consequentemente alterar os genes que exprimem.

Mtodos citoqumicos e imunocitoqumicosA aplicao de compostos qumicos com metais pesados pode ser feita por intermdio de reaces qumicas que apresentem especificidade para componentes qumicos presentes nas amostras, como glcidos, cidos nucleicos, etc. Estas reaces de que so exemplo as reaces derivadas da reaco de Feulgen para contrastao do DNA ou PAS para contrastao dos glcidos, designam-se por reaces citoqumicas, e permitem revelar, de um modo especfico ou preferencial, a presena de componentes qumicos nas amostras. Devido possibilidade de, por pouca especificidade dos mtodos qumicos que podem marcar vrias substncias (muitas vezes devido a impurezas dos reagentes difceis de controlar), necessrio, como em todas as experincias cientficas, elaborar controles que garantam que a marcao observada especfica. Para esse fim podem-se usar neste caso digestes enzimticas, com enzimas que removem selectivamente os compostos que se pretende identificar. Aps o tratamento enzimtico, o componente marcado dever desaparecer. Mecanismo de colorao para a microscopia ptica vulgar A maioria das clulas e tecidos no seu estado natural contm pouco pigmento para a absoro da luz. Normalmente so translcidas luz e por essa razo no possvel ver muitos detalhes. Consequentemente, tm de ser empregues mtodos para a colorao das clulas e das suas estruturas. Falaremos de tcnicas para a observao dos componentes celulares e de outros, os citoqumicos, para a observao dos seus componentes qumicos.

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1. Mecanismo de produo de cores: noo de grupo cromforo e auxcromo 2. Tipos de corantes: cidos e bsicos mecanismo de colorao; noo de ponto isoelctrico das protenas.Exemplos. 2.1 Outro tipo de corantes: neutros, anfotricos, indiferentes e metacromticos. 2.2 Inverso da colorao 2.3 Uso de mordentes e diferenciadores. 2.4 Classificao dos tipos de colorao: colorao vital e ps-vital. Colorao progressiva e regressiva, directa e indirecta. Mtodo das coloraes combinadas.

COLORAO VITAL EM CULTURA DE TECIDOS E CLULAS VIVAS As clulas Vero foram obtidas da American Type Culture Collection e cresceram em monocamada no meio Eagle modificada por Dulbeccu (Gibco, Scotland). Este meio foi suplementado com 10% de soro de vitela recm nascida e 50g/ml de gentamicina. Estas clulas so de linha contnua fibroblstica de rim de Cercopithecus aethiops (macaco African Green). Este trabalho tem como objectivo observar clulas vivas coradas com diferentes tipos de corantes vitais. Material Microscpio; Clulas Vero; Lminas de vidro ; Papel de filtro; Pipeta Pasteur; Pina Reagentes Azul de metileno; Vermelho neutro; Lugol; Azul de tripano; Soro fisiolgico TCNICA Coloque uma gota de Soro fisiolgico numa lmina limpa. Retire uma lamela com monoestrato celular Vero da caixa de Petri e monte-a na lmina e observe ao Microscpio. Retire a preparao do Microscpio e coloque uma gota de um corante vital num bordo da lamela para que a soluo entre por capilaridade. A penetrao mais rpida,

34 se do lado oposto aquele em que ps a gota, extrair o lquido que sobra, com o auxlio de papel de filtro. Visualizar ao m. o. Clulas de cultura sem colorao

Verde de Janus uma colorao vital, especfica para mitocndrias. Dependendo do organismo e do seu estado fisiolgico, aps alguns minutos esta soluo cora as mitocndrias de azul escuro ou verde. medida que os organismos vo morrendo, outros organelos celulares comeam tambm a receber o corante, pelo que importante ter em considerao o aspecto da preparao antes da colorao (exame a fresco). Protocolo: Retirar uma gota da suspenso celular e colocar sobre a lmina. Cobrir com a lamela contendo o filme de corante, esperar 1 a 2 minutos e observar ao microscpio. Registar as observaes.

Colorao com Vermelho neutro: Esta soluo cora ligeiramente os ncleos e outras incluses, como os fagolisossomas. Este corante tambm utiizado como indicador de pH: cor de laranja a pH alcalino, vermelho-cereja a pH neutro e azul a pH cido. Isto d-nos uma indicao do que ocorre a nvel dos vacolos digestivos, que tm um pH cido Imagem de clulas Vero sem col..

35 Protocolo: Retirar uma gota da infuso e colocar sobre a lmina. Cobrir com a lamela contendo o filme de vermelho neutro, esperar 1 a 2 minutos e observar ao microscpio. Registar as observaes.

Colorao com verde Janus uma colorao vital especfica para mitocndrias.Dependendo do organismo e do seu estado fisiolgico, aps alguns minutos esta soluo cora as mitocndrias de azul escuro ou verde. medida que os organismos vo morrendo, outros organelos celulares comeam tambm a receber o corante, pelo que importante ter em considerao o aspecto da preparao antes da colorao (exame a fresco). TCNICA Retirar uma gota da suspenso celular e colocar sobre a lmina. Colocar gota do corante e esperar 1-2 minutos. Observar ao mcroscpio Colorao com azul de tripano O mtodo de excluso do Azul de Tripano baseia-se no princpio de que clulas viveis apresentam membranas intactas, que evitam a entrada do corante,enquanto que membranas metabolicamente inactivas de clulas mortas (no viveis) no conseguem evitar a penetrao do corante na clula. Logo, clulas azuis correspondem a clulas mortas. A diferena entre o nmero total de clulas e o o nmero de clulas mortas ser o nmero de clulas viveis numa dada amostra da nossa cultura

Colorao com azul de metileno

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Col. Vermelho neutro

Co. Azul de Tripano

FUNDAMENTO DO PROCESSAMENTO DE CLULAS E TECIDOS PARA OBSERVAO AO MICROSCPIO PTICO Existem muito poucas clulas suficientemente finas para serem visualizadas directamente ao microscpio (algas, protozorios, sangue e cultura de tecidos), a maioria dos tecidos (fgado, rim, crebro,e outras) so suficientemente espessos para permitir a passagem da luz. Ento, os tecidos devem ser seccionados em fatias muito finas depois de previamente processados para impedir a danificao das clulas. Este processamento envolve vrios passos: fixao, desidratao, impregnao e corte feito em micrtomo. Estes passos sero estudados assim como, algumas das modificaes introduzidas na estrutura e composio das clulas. Preparaes extemporneas, exame a fresco e vital

37 Estudo post-mortem. Autlise, putrefaco e fermentao. Esfregaos de bactrias e sangue. Vantagens e inconvenientes. Opacidade. Mtodo dos cortes Fixao. Conceito e mtodos. Tipos de fixao: qumica e fsica. Perfuso. Classificao de fixadores qumicos (aldedos, agentes oxidantes, agentes desnaturantes de protenas, etc.). Vantagens e inconvenientes dos diferentes tipos de fixao Qualidades dos fixadores e solues tampo. Desidratao Diafanizao Impregnao e Incluso Microtomia: Micrtomo de Minot, de corredia e de congelao.

EXAME DE PREPARAES FIXADAS Introduo Sempre que possvel usam-se, em conjunto com o exame a fresco, materiais biolgicos fixados e cortados em fatias finas (cortes). Estes so atravessados pela luz e podem ser corados para introduzir contraste e diferenciao entre as estruturas celulares. O exame de cortes permite a conservao dessas preparaes o que traz algumas vantagens: - permite exames mais demorados; - podem repetir-se as observaes sempre que se deseje; - podem confrontar-se antigas e novas preparaes; - podem arquivar-se documentos dos trabalhos realizados. Tambm se usam clulas fixadas sem serem submetidas ao corte, para serem observadas. Um dos exemplos, o esfregao.

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Esfregaos (bactrias e sangue) Por cima de uma lmina, coloca-se uma gota de gua estril contendo as bactrias e faz-se um esfregao que seca ao ar para depois ser fixado pelo calor, colocando-o numa placa metlica aquecida. Depois o esfregao est preparado para ser corado. No caso do sangue, coloca-se uma gota com uma lanceta estril e posteriormente feito o esfregao. Neste caso so necessrias 2 lminas. Depois de se ter colocado a gota de sangue na extremidade de uma lmina, leva-se a outra segundo um determinado ngulo a tocar o sangue e espalha-se o sangue at outra extremidade da lmina (ver na Figura). O sangue seco e depois corado.

Esfregao de sangue Para a execuo da tcnica de observao de material biolgico em corte so realizados vrios passos dos quais se destacam: A colorao com um corante aninico ou cido, a eosina e com um corante catinico ou bsico, a hematoxilina, uma maneira de fazer contrastes de colorao necessrios para um estudo morfolgico. A eosina um corante sinttico aninico ou cido. Como se sabe todos os corantes sintticos so derivados do benzeno. Quando a eosina utilizada para a colorao de um tecido, as estruturas acidfilas so chamadas eosinfilas. A hematoxilina um corante natural extrado do tronco da rvore: Campechium Hernatoxylin encontrada na Amrica Central e do Sul. O extracto sofre oxidao em hematena que um cromognio cido com pequena afinidade ou especificidade, ento, um mordente essencial para a converso deste corante a base podendo ligar-se fortemente aos cidos nucleicos.

39 1 - Colheita do material biolgico A colheita deve ser feita o mais rapidamente possvel, tendo em conta que aps a morte do ser vivo, se iniciam uma srie de processos destrutivos intracelulares de natureza enzimtica, isto , a autlise. Tambm se pode fazer colheitas com animais vivos. Estas so feitas por mtodos endoscpicos ou cirrgicos (bipsias). 2 - Fixao 2.1. Introduo A fixao dos tecidos deve ser feita imediatamente a seguir paragem da circulao para prevenir a decomposio postmortem, e tem como objectivo preservar a estrutura dos tecidos o mais possvel existente in vivo. A fixao consiste em mergulhar fragmentos celulares ou tecidulares em solues qumicas orgnicas ou inorgnicas, aquosas ou no, que podem ou no precipitar ou coagular as protenas. A maioria dos fixadores so solues que exercem a sua actividade principalmente ao nvel dos complexos proteicos da clula. Portanto, necessrio escolher um fixador que mantenha a estrutura das protenas prxima da original, precipitando-as o menos possvel. Logo que se coloca um fragmento de tecido num fixador a morte das clulas no instantnea e, assim, podem produzir-se modificaes nos tecidos em consequncia da: - autlise (aco enzimtica); - alteraes osmticas; - actividade microbiana; - extraco de molculas intra- e extracelulares. A fixao pode ser feita por perfuso, que consiste em passar o fixador na corrente sangunea do animal antes da remoo dos orgos, tendo a vantagem de reduzir artefactos resultantes do manuseamento dos tecidos a fixar. Tcnica de perfuso Alm da fixao por imerso das peas no lquido fixador emprega-se, em certos casos, em que se pretende actuar mais directamente, a fixao por injeco do lquido nos vasos do animal. 1 - Anestesiar o animal com ter. 2 - Abrir o trax, deixando o corao a descoberto.

40 3 - Fechar as artrias mamrias e passar um lao no pedculo do corao. 4 - Introduzir o catter no ventrculo esquerdo penetrando na aorta ascendente. 5 - Cortar a veia cava inferior para aspirar o sangue e abrir imediatamente a perfuso (fixadores mais usados: fixador de Bouin, formol e lcool a 70) para que este fluxo substitua o do sangue. 6 - O tempo deve ser de 15-20 minutos e o volume deve ser 20 vezes superior ao do sangue do animal. 2.2. Objectivos Os objectivos da fixao so: - Impedir a: - autlise, processo precoce que resulta da aco de enzimas proteolticas das prprias clulas (lisossomas rompem-se e libertam as enzimas). Essas enzimas digerem e alteram a clula introduzindo aspectos que no existiam in vivo e que resultam das tcnicas usadas e da prpria morte celular; - putrefaco, degradao proteica por aco de microorganismos (bactrias, fungos, etc.); - fermentao e liplise, degradao dos lpidos e dos glcidos por aco de microorganismos; - Manter as estruturas o mais possvel iguais s que existiam in vivo; - Dar resistncia pea para suportar as operaes subsequentes na tcnica da incluso; - A fixao tem ainda duas funes acessrias: - facilitar certas coloraes; - comear o processo de endurecimento das peas, para que cortes finos sejam possveis. 2.3. Qualidades de um bom fixador Um fixador tem propriedades fixantes, isto , d resistncia ao tecido para as operaes subsequentes da tcnica de incluso e prepara a colorao. Tambm se observam nos fixadores propriedades conservantes, isto , no produzem tumefaces, retraces ou remoes celulares; destroem os microorganismos evitando a sua proliferaco e inactivam as enzimas hidrolticas. Portanto, um bom fixador aquele que: - tem bom poder de penetrao e por isso mata o tecido rapidamente; - quando se difunde pelas clulas do tecido no deve remover nem arrastar certos constituintes das mesmas, tais como, glcidos ou lpidos; - deve preparar o tecido para no ser alterado pelos processos que se seguem:

41 - desidratao,diafanizao, incluso, corte, colorao e montagem; - no causa retraco dos tecidos; - revela todos os organitos da clula sem os mascarar; - preserva os fenmenos de osmose; - deve permitir usar vrias tcnicas de colorao (no entanto, a colorao de detalhes celulares especficos como o aparelho de Golgi ou as mitocndrias requerem fixadores especiais, assim como citoqumicas especficas de enzimas.). 2.4. Regras gerais para uma boa fixao 1 - Utilizar tecidos vivos logo aps a morte; 2 - Utilizar fragmentos pequenos ( 2 cm de comprimento e 4-5 mm de espessura) para que o fixador fixe igualmente periferia e no interior do tecido; 3 - Havendo paredes contrcteis no tecido ou rgo a fixar (ex. Intestino), devem ser fixados os dois topos para impedir a contraco; 4 - O volume do fixador deve ser em mdia 20 vezes maior do que a pea a fixar; 5 - O tempo de fixao deve ser calculado em funo dos resultados de uma boa fixao. 2.5. Tcnica de fixao 1 - Pequenos blocos de tecido so colocados numa quantidade de fixador seleccionado o mais rapidamente possvel depois da colheita, durante 6-48 horas a 4C. Claro que, o tempo da fixao depende do tamanho e da densidade da pea a fixar e da temperatura a que se processa a fixao. 2 - Remoo do fixador por lavagem com meios determinados pelo fixador. Nas fixaes em Lquido de Zenker, os tecidos devem ser lavados em gua corrente de 1 a 24 horas para remover a colorao amarela deixada pelo dicromato de potssio. Quando se usa o formol como fixador, o tecido deve ser lavado rapidamente em gua e ser transferido para o lcool a 70, porque o formol extrado mais depressa em lcool. 2.6. Mecanismo da fixao. 2.6.1. Protenas Na fixao dos tecidos as reaces mais importantes so aquelas que estabilizam as protenas. Embora os detalhes no sejam conhecidos, parece que alguns fixadores tm a propriedade de formar "cross links" entre as protenas formando um gel e idealmente

42 conservando-as como se encontravam in vivo. As protenas solveis so fixadas a protenas estruturais, ficando assim insolveis e deste modo do uma fora mecnica estrutura total permitindo os passos subsequentes no processo de incluso. A desnaturao das protenas causada pela fixao no muito importante nas observaes de rotina mas, no deve acontecer na imunocitoqumica e trabalhos de microscopia electrnica de alta resoluo. 2.6.1.1. Aldedos (Formaldedo ou formol, Glutaraldedo e Acrolena) A formao de "cross links" entre os grupos terminais das protenas so devidas a estes fixadores. Formol As reaces do formol com as protenas tecidulares so numerosas e complexas. A reaco mais frequente a formao do composto metilol. RH + CH2OR.CH2O(OH)

Este composto reactivo e pode condensar-se com um tomo de Hidrognio para formar uma ponte metilnica (-CH2- ): R.CH2(OH) + HRRCH2 R + H2O

Estas pontes metilnicas, como a que est na reaco anterior, so desfeitas por hidrlise. O formol tambm pode reagir com ligaes duplas etilnicas nas cadeias de lpidos insaturadas. Caractersticas: - usa-se dissolvido em gua a 5 ou 10%; - um bom fixador, no dissolve as gorduras pois, reage com os cidos gordos insaturados durante a fixao, e a dupla ligao atacada, sendo formados 1:3 glicis e 1:3 dioxanas; - presta-se a cortes por congelao; - simultaneamente um agente conservante; - ideal para microscopia ptica; - tem uma boa penetrao, danifica pouco e barato; - irrita as mucosas; - a sua reaco lenta e pode ser reversvel com um excesso de gua nas primeiras 24 h e depende do pH sendo mais rpida a pH alcalino; - preserva mal a estrutura das protenas;

43 - um dos fixadores eleitos para a imunologia, pois consegue manter melhor que o glutaraldedo a antigenicidade das protenas. Glutaraldedo

COH COHH C OH

C

O

(CH 2) 2Protena

(CH2 ) 2

CH2

+

N

(CH2 ) 3(CH2 ) 2C H O H

N

+

CH2

Protena

(CH2 ) 2 C O

Fig. 2 - Estrutura do glutaraldedo glutaraldedo

Fig. 3 - Formao de cross-links com o

As reaces do glutaraldedo (Figs. 2 e 3), um aldedo bifuncional, com as protenas so anlogas s do formol, ficando completas ao fim de 30 minutos, aps a adio do aldedo. Caractersticas: - mais rpido e eficaz na sua aco que o formaldedo; - causa uma perda de 30% da estrutura em hlice das protenas. - sempre utilizado em microscopia electrnica; - desnatura um pouco as protenas e enzimas; - penetra mais dificilmente do que o formol nos tecidos a fixar; - a sua reaco reversvel e tambm depende do pH sendo mais rpida a pH alcalino. Acrolena A acrolena penetra rapidamente o tecido preservando a morfologia e actividade enzimtica. O aldedo acrlico ou acrolena, H2C = CH.CHO, um aldedo bifuncional que capaz de fazer um maior nmero de cross links do que o formol. Reage de maneira semelhante ao formol com as protenas.

44 A acrolena reage com os grupos -OH e -NH das protenas para formar CH2=CH-CH-N-. Segue-se um processo de polimerizao. OH Tambm reage com cidos gordos e com as duplas ligaes dos alcenos. 2.6.1.2. Agentes oxidantes (Tetrxido de smio, permanganato de potssio e dicromato de potssio) Tetrxido de smio Caractersticas: - o tetrxido de smio (OsO4) forma cross links com as protenas; - pode empregar-se imergindo as peas no lquido, ou submentendo-as ao seu vapor; - tem fraca penetrao; - devido a ser um coagulante enrgico e rpido do citoplasma (sem o retrair) e de se reduzir ao contactar com as gorduras dando uma cor caracterstica, recomenda-se o seu uso em histologia; - muito caro; - altera-se facilmente. 2.6.1.3. Agentes desnaturantes de protenas (cido actico, lcool metlico e lcool etlico) lcool metlico e lcool etlico Os lcoois reduzem a constante isoelctrica das protenas causando a sua precipitao prximo ou nos seus pontos isoelctricos. A alterao da estrutura das protenas causada pelo metanol e etanol devida disrupo das suas ligaes hidroflicas, importantes na manuteno da sua estrutura terciria. No entanto, os lcoois conservam a estrutura secundria das protenas. O lcool absoluto ocasionalmente usado como fixador porque desidrata. usado especificamente para preservar o glicognio. Caractersticas: - alteram a estrutura terciria das protenas fazendo com que haja ruptura das pontes hidrofbicas; - removem histonas; - podem causar retraces.

45 2.6.1.4. Agentes de Mecanismo desconhecido (Cloreto de mercrio e cido pcrico) Cloreto de mercrio Com este fixador existe um nmero relativamente grande de resduos de aminocidos a reagir (tiol, amino, imidazol, fosfato e grupos hidroxilo). A reaco deste fixador com o grupo tiol tem merecido mais ateno. Como se mostra, formado um grupo dimercaptide: RSH + HgCl2 RSHgCl + HClRSHgCl + RSH(RS)2Hg + HCl

Tambm existe evidncia da reaco do cloreto de mercrio com os grupos disulfureto formando produtos de reaco que podem variar com o pH da soluo. 2.6.2. Mecanismo de fixao dos lpidos Os lpidos tm sido demonstrados em seces de tecido desde 1896 com os corantes Sudan. Contudo, os lpidos individualizados s recentemente foi possvel observ-los, devido sua estrutura molecular e depois da determinao das suas propriedades fsicas e qumicas 2.6.2.1. Classificao de lpidos Os lpidos mais complexos consistem de cidos gordos ligados a lcoois (glicerol) por ligaes ster, ou alternativamente ligados a bases por ligaes amida. Adicionalmente eles podem conter bases orgnicas, cido fosfrico e acares. A distino mais til do ponto de vista histoqumico o facto de serem hidrofbicos ou hidroflicos. As propriedades de superfcie dos lpidos determinam a sua permeabilidade aos reagentes aquosos ou aos solventes orgnicos. Os fosfolpidos com grupos bsicos e polares fosforilados so hidroflicos. Os glicolpidos acdicos (gangliosidos e sulfatdeos) e os glicolpidos neutros (cerebrsidos) so tambm moderadamente hidroflicos. Os no combinados (colesterole cidos gordos livres) e os simples steres tm uma preponderncia de grupos no polares e so hidrofbicos. Mostra-se o uadro, com as caractersticas que influenciam a histoqumica dos lpidos.

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Classe I. LPIDOS NO POLARES

Membro

Caractersticas que influenciam a histoqumica Ponto de fuso e Sudanofilia dependente do n. de duplas ligaes. HIDROFBICOS. No sudanoflico. Birrefringente luz polarizada. HIDROFBICOS.

cidos gordos 1. Lpidos no conjugados Colesterol

2. steres

Ponto de fuso depende do grau steres do colesterol Mono- Di - e Tri - glicridos de saturao dos constituintes dos cidos gordos. HIDROFBICOS. Fosfolpidos com cido fosfrico, longas cadeias de cidos gordos, lcoois polihdricos e vrias bases nitrogenadas. HIDROFLICOS. So bsicos e com ligao ster. Ligao ster. Acdicos. Ligao ster. Bsicos. Um cido gordo saturado liga-se esfingosina por uma ligao amida mais fosforil colina. Bsicos. Tm uma hexose (glucose) ligada ceramida. Neutros. steres de cerebrsidos. Muito Acdicos. Com cido neuramnico Nacetil (cido silico). Solveis em gua. Acdicos.

II. LPIDOS POLARES 1. FOSFOLPIDOS Fosfatidil colina-Lecitinas a. Com base glicerol

Fosfatidil serina Fosfatidil etanolamina b. Com base esfingosina Esfingolpidos

2. GLICOLPIDOS

Cerebrosidos Sulfatidos

Gangliosidos

47 2.6.2.2. Fixao de lpidos A melhor maneira de os fixar atravs da congelao, e os nicos reagentes capazes de os fixar so o tetrxido de smio e o cido crmico, mas ambos alteram a sua reactividade qumica. Agentes oxidantes Os lpidos insaturados reduzem o OsO4 formando compostos negros.CH+ OOCH O

OsO 2CH O

CH

OsO 2

A outra poro livre na molcula pode reagir, se um grupo etilnico oxidado estiver disposio e ento, forma-se um dister.CH OHO CHCH OOsO CH O CHO

OsO 2 +CH O

HO CH

CH O

Formao do dister Em microscopa electrnica observa-se a deposio do smio nas micelas lipdicas no local dos grupos polares e no no local original de reaco ou seja, no interior hidroflico das micelas. Na figura indica-se os dois locais possveis da deposio do smio.

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Grupos polares Deposio intramicelar

45 A

P

Deposio polar

45 A

2.6.3. Mecanismo de fixao dos cidos nucleicos Muitos fixadores tm sido usados para fixar cidos nucleicos, mas relativamente poucos reagem com estas molculas. O etanol e metanol so usados para fixar DNA e RNA e produzem-lhes pouca alterao apesar de os precipitarem. A presena de sais na reaco essencial para obter a mxima precipitao. Outro fixador utilizado o Carnoy. Carnoy: - constitudo por: lcool absoluto, clorofrmio (fixa bem o citoplasma), cido actico (fixa bem o ncleo pois penetra bem) (6:3:1); - um bom penetrador; - extrai as histonas; - um fixador cido bom para os cromossomas;

49 - necessrio ter cuidado com o tempo de fixao, pois se o excedermos, extrai o RNA e depois o DNA; - passar logo por lcool absoluto e incluir, uma regra a ter em conta; - utilizado para fixar o ncleo, cidos nucleicos e glicognio. 2.6.4. Misturas de fixadores Nem todos os fixadores apresentam as mesmas capacidades. Uns conservam bem as estruturas do ncleo outros, determinadas formaes do citoplasma. Por vezes, o ideal fazer misturas de fixadores. lcool-ter em partes iguais - fixador do sangue ou doutros esfregaos; - tempo de fixao: 10 min. lcool-formol (9:1): - bom fixador para o tecido nervoso. Bouin: - fixador universal; - fixa protenas e cidos nucleicos; - constitudo por: formol a 40 %, soluo aquosa saturada de cido pcrico e cido actico glacial (25:75:5); - a fixao pode durar de 24 h a 3 - 8 dias; - um bom fixador para estudos citolgicos de glndulas, rgos linfides, ncleos e glicognio. Flemming: - constitudo por: tetrxido de smio (4g), trixido de crmio (15g), cido actico cristalizvel (1g) e gua destilada (100ml); - excelente fixador citolgico mas de fraca penetrao por causa do cido smico. A presena de cido actico atenua tal inconveniente; - em regra s ficam bem fixadas as partes superficiais, a no ser que as peas sejam muito pequenas; - utilizado para a fixao de lpidos. Zenker: - constitudo por: dicromato de potssio (2,5g), sublimado de cloreto de mercrio (5g) e gua destilada (95 ml). Na altura de utilizar, acrescenta-se 5ml de cido actico; - um fixador universal compatvel com a maior parte dos corantes; - muito bom para estudos citolgicos; - utilizado para fixar ncleos e tecido conjuntivo.

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NOTA: os fixadores que permitem obter boas fixaes da estrutura citoplasmtica ou so muito caros (por conterem cido smico, cloreto de platina, etc.) ou requerem tcnicas demoradas. 2.6.5. Mecanismo de fixao por meios fsicos 2.6.5.1. Congelao e dessecao Este mtodo consiste numa rpida congelao dos tecidos, seguida de desidratao no vcuo a baixas temperaturas. Inicialmente, as peas so imersas em azoto lquido (-160 a 190 C) para serem dessecadas no vcuo a temperaturas da ordem dos 30 - 40 C. Nestas condies o gelo dos tecidos sublima ao estado gasoso e produz-se a desidratao. As vantagens so: - no causa retraco dos tecidos; - a fixao homognea; - no h extraco de molculas solveis; - a composio qumica mantm-se; - a estrutura conserva-se com raras modificaes produzidas pelos cristais de gelo; - a fixao rpida. 2.6.5.2. Congelao e substituio Neste caso, o tecido mantm-se congelado a baixa temperatura (-20 a -60C) num reagente que dissolve os cristais de gelo (etanol ou acetona). As vantagens so semelhantes ao mtodo anterior. 3 - Desidratao A desidratao consiste na remoo da gua livre ou possvel de extrair do tecido fixado por aco do lcool. A razo deste passo, deve-se ao facto de que nem a parafina, celoidina ou outra substncia de incluso so miscveis em gua. Este processamento consiste em passar o material fixado por lcoois de concentraes crescentes desde 70 at ao absoluto. O tempo da permanncia em cada um dos lcoois depende do volume, espessura e do tipo de tecido. A espessura ideal de tecido deve ser de 0,5 cm e o tempo mdio da desidratao de 1 hora. O etanol o mais usado por no ser txico e ser rpido na aco. Existe uma substncia, a dioxana, que permite passar directamente do fixador para a parafina sem os intermdios ordinrios.

51 4 - Diafanizao Consiste na passagem dos blocos de tecido fixados e desidratados por uma substncia diafanizadora, normalmente o xilol. A razo deste passo deve-se ao facto da parafina no ser solvel em lcool, mas sim em xilol, substncia que por sua vez se dissolve no lcool. O tempo de diafanizao de 30 min a 2h. Quando a pea introduzida no xilol fica com um aspecto mais claro e translcido. O xilol vai ocupar o espao vazio anteriormente ocupado pela gua. 5 - Impregnao Substitui-se o xilol pela parafina ou celoidina. A parafina e a celoidina so substncias que penetram homogeneamente na clula na forma lquida e que depois de solidificarem a tornam rgida, mas no quebradia. Faz-se na estufa, ao mesmo tempo que o xilol vai evaporando a parafina ocupa os lugares deixados pelo xilol dando consistncia ao meio celular depois de retirado da estufa. 6 - Incluso Este passo consiste na infiltrao no tecido duma substncia de suporte para que seja possvel cortar o tecido em fatias finas de modo a observ-las ao microscpio. As substncias a ser usadas devem ser convertidas rapidamente do estado lquido ao slido e quando lquidas devem penetrar nos interstcios do tecido. A converso pode ser feita por: cristalizao por arrefecimento (parafina); evaporao do solvente (celoidina); polimerizao (plstico). Os blocos diafanizados devem ser imersos num banho de parafina e serem mudados pelo menos duas vezes para novos banhos para remover o xilol que est presente nos tecidos. O tempo de infiltrao depende do volume, espessura e do tipo de tecido, mas dura aproximadamente 1 hora e 30 min. 6.1 - Parafina A parafina slida temperatura ambiente e aquecida a 45 - 60C, torna-se lquida. insolvel na gua e quase insolvel no lcool e solvel no xilol, acetona e ter de petrleo. 6.1.1. Vantagens - A incluso fcil e rpida; - Obteno de cortes suficientemente finos e seriados; - Conservao dos blocos por perodo indefinido.

52 6.1.2. Desvantagens - No se deve sobreaquecer a parafina porque torna difcil a obteno de bons cortes; - O prolongado tratamento dos tecidos com esta substncia de incluso, endurece-os; - S d bons resultados com peas pequenas; - Endurece demasiado certos tecidos e rgos (msculo, pele); - Retrai mais ou menos os tecidos. 6.1.3. Tcnica de incluso com parafina 1 - Funde-se a parafina; 2 - Bafeja-se os quadros de Leuckart para a parafina no aderir (Actualmente usam-se cassetes de plstico); 3 - Tira-se a pea do banho de impregnao e posiciona-se com pinas de incluso, dentro do molde; 4 - Deita-se a parafina lquida, mas no a ferver; 5 - Deixa-se solidificar temperatura ambiente ou arrefecendo com gua. No final da incluso obtemos um bloco de parafina dentro do qual est includa a pea. 6.1.4. Artefactos introduzidos pela incluso em parafina - Remoo de constituintes: lpidos; glicognio. - Precipitao; - Pregas; - Estrias causadas pela faca do micrtomo. Micrtomo de Minot

Micrtomo de Minot Colher pequenos fixar 24 h em 10% fragmentos de um orgo e de formol em tampo

53 fosfato com pH neutro. Desidratar com lcool 70 12 h e mudar para o lcool absoluto duas vezes, a primeira 2h e a segunda 3 h. Fazer dois banhos de xilol, o primeiro 2 h e o segundo 90 min. Fazer o 1 banho de parafina numa estufa temperatura do seu ponto de fuso (60) 16h. Pode ou no ser feito um 2 banho de parafina nas mesmas condies 5h. Fazer as incluses em parafina em moldes de lato (Leuckart) ou em cassetes. 7 - Corte Os blocos com as incluses devem ser cortados em micrtomos, depois de talhados em pirmides quadrangulares, segundo seces especficas, que podem ser transversais ou longitudinais. As seces podem ter 5-10 m de espessura. em fatias finas e regulares para serem estudados por transparncia. 7.1. Equipamento necessrio - Micrtomo; - Banho maria a 45 C, para suportar os cortes; - Placa aquecida, para secar os corte; - Pina; - Escova para limpar a face do micrtomo; - Lminas; - gua albuminosa (meio de colagem); - Cubos de gelo. 7.2. Tipos de micrtomos Faca de Valentim: - dupla faca com 2 lmininas, em que o afastamento das duas lminas graduado e d-se por meio de um parafuso. Corta o rgo por 2 planos muito prximos, sendo a largura do corte dependente da distncia entre as duas lminas. Mcrotomo de Minot: - representado na figura, caracterizado por ter a faca fixa, sendo o suporte com o bloco que se desloca verticalmente, mais cmodo e o mais usado. Micrtomo de Corredia: - o suporte da faca (tren ou corredia) move-se numa goteira horizontal ou plano inclinado e o suporte do bloco elevado a cada corte. Micrtomos de congelao e criostatos: So aparelhos utilizados para fazer os cortes mantendo a congelao e tm a vantagem de fazer cortes de boa qualidade. As suas principais vantagens so: O corte de peas no

54 destri substncias que se pretendem observar e tambm se usam quando necessrio uma observao rpida (ex. exames extemporneos operatrios). 7.3. Tcnica do corte 1 - Resfriar o bloco e talh-lo; 2 - Fixao do bloco no suporte do micrtomo; 3 - Orientao do bloco e da faca, regulao da espessura dos cortes; 4 - Execuo dos cortes, que se recolhem superfcie da gua a 45 C: 5 - Colagem dos cortes (gua albuminosa ou gelatina); 6 - secagem na estufa das lminas ou lamelas com os cortes colados. Talha-se o bloco debastando-o pouco a pouco por todos os lados, tirando assim sucessivas camadas de parafina. O suporte do bloco mvel segundo as 3 dimenses no espao o que permite orient-lo de modo que a face superficial do bloco fique num plano vertical nos micrtomos de Minot e horizontal nos de corredia. Orientada a pea, fixa-se solidamente a sua posio, por meio de parafusos, a faca tambm solidamente fixada ao suporte e este ao aparelho. Uma vez acertado o aparelho para a espessura que se deseja, comea-se a cortar a pea. A cada movimento sai um corte e o que se lhe segue vem colar-se-lhe pela aresta vizinha, constituindo-se assim fitas ou tnias de cortes. 8 Colagem A colagem assegura um perfeito estendimento dos cortes, de modo a que no fiquem dobras ou rugas. Meio de colagem gua albuminosa diluda: clara de ovo (50 ml); glicerina (50 ml); salicilato de sdio. Mistura-se, filtra-se e coloca-se uma gota antes de pr a seco do corte. 8.1. Tcnica de colagem 1 - Coloca-se algumas gotas do meio numa lmina; 2 - Coloca-se o corte em cima da lmina; 3 - Com agulhas e com calor moderado estica-se o corte; 4 - Escorre-se o excesso de gua no deixando sair o corte;

55 5 - Leva-se a secar na estufa a 45 C. A seguir resumem-se os passos para a observao do material biolgico em cortes de incluses em parafina.

PROTOCOLO GERAL PARA COLORAO DE HEMATOXILINA-EOSINA EM CORTES HISTOLGICOS INCLUIDOS EM PARAFINA

Clulas coradas com hematoxilina-eosina. As reas escuras tm basofilia, ncleo (nuclolos e heterocromatina) e as mais claras (rosa) fundamentalmente citoplasma. 1. DESPARAFINAO Deitar xilol sobre o corte histolgico durante 10 min. 2. HIDRATAO Cobrir a lmina com alcol 100 durante 3 min. Proceder da mesma forma com a srie descendente de alcoois e finalmente com a gua destilada durnte 1 min. 3. COLORAO Cobrir a lmina com HEMATOXILINA 10 min Lavar com H2O corrente (3 mudanas) Diferenciar com HCl 1% - 5 sec. Passar em H2O corrente (2 mudanas) Corar com eosina 2 min. 4. DESIDRATAO

56 Cobrir a lmina sucessivamente com uma srie ascendente de alcois at ao lcool absoluto, 3 min. em cada lcool. 5. DIAFANIZAO Cobrir a lmina com xilol (2 mudanas). 6. MONTAGEM Depositar uma gota de meio de montagem e cobrir o corte com uma lamela. Rotular. 7. RESULTADOS e OBSERVAO Visualizar ao m. o. ncleos azuis e citoplasma rosa. Hematoxylin (Ehrlich's) C16H14O6 MW: 302.3Nuclear stain; used especially in histology and cytology. This is one of the two "cornerstone" dyes for all H & E techniques, the other being Eosin. When used in conjunction with eosin, the nuclei come out dark blue and the cytoplasm and nucleoli, red. Mayers Hematoxylin

PROTOCOLO GERAL PARA COLORAO COM AZUL TOLUIDINA EM CORTES HISTOLGICOS INCLUIDOS EM PARAFINA 1. DESPARAFINAO E HIDRATAO Deitar xilol sobre o corte histolgico durante 5 min e depois cobrir a lmina com alcol 100 durante 3 min e finalmente com gua destilada durante 1 min. 2. COLORAO Cobrir a lmina com 10 gotas de 2,5% de carbonato de sdio e 1 gota de 1% AZUL DE TOLUIDINA durante 2 min. 3. DESIDRATAO E DESIDRATAO Lavagem 3 vezes com gua destilada e desidratao com uma srie ascendente de alcois at ao lcool absoluto, 1 min. em cada lcool. 4. DIAFANIZAO E MONTAGEM Cobrir a lmina com xilol e depositar uma gota de meio de montagem e cobrir o corte com uma lamela. Rotular.

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5. OBSERVAO Visualizar ao m. o. O citoplasma violeta metacromtico porque a polimerizao de uma molcula de coloraao com certas estruturas resulta num determinado comprimento de onda de emisso alterado. Os sinais de metacromasia so a mudana do espectro de aboro de certos corantes bsicos quando esto unidos a polmeros polianinicos como nucleoprotena. Os corantes de tiazina tais como, o azul de toluidina so azuis ortocromticos, contudo podem estar agregadosmem dmeros ou polmeros, que absorvem a um baixo comprimento de onda e aparecem vermelho metacromtico.

COLORAES CITOQUMICAS LPIDOS Colorao Negro de Sudo Esta colorao utilizada para corar todos os tipos de lpidos. O Negro do Sudo uma susbstncia no polar que se dissolve nos lpidos, tornando-os visveis. Estes so ento corados de vrios tons de cinzento-escuro, azul muito escuro e preto. Protocolo: Negro de Sudo/ Propileno glicol: Negro de Sudo 0. 7 gm Propileno glicol 100 ml

58 Dossolver Negro de Sudo em Propileno glicol lentamente. Aquecer at 100C durante poucos minutos, e agitar constantemente. Filtrar em papel de filtro Whatman 2. Arrefecer e filtrar novamente por um filtro de vidro de meio poroso com suco 1. Fixar cortes de congelao em 10% de formol 2. Lavar bem em gua destilada 3. Passar duas vezes, cada 5 min em l propileno glicol 4. Agitar 7 min em Negro de Sudo 5. Colocar 3 min em 85% de propileno glicol 6. Lavar bem em gua destilada 7. 3 min em Nuclear fast red 8. Lavar bem em gua corrente e destilada 9. Montar em glicerina 10. Visualizar ao m. o. 11. Desparafinao e hidratao at alcol a 70 do corte histolgico 12. Cubra a lmina com o corante Sudan Black durante a noite temperatura ambiente 13. Lave e diferencie em alcol a 70 o corte histolgico at ver o fundo cinzento claro 14. Lave com gua da torneira 15. Monte uma lamela por cima do corte histolgico com liqudo de montagem aquoso

PROTOCOLO GERAL PARA COLORAO DE SUDAN BLACK B EM CORTES HISTOLGICOS INCLUIDOS EM PARAFINAFUNDAMENTO: O Sudo Black B um corante bsico e combina-se com grupos acdicos em compostos lipidicos e tambm fosfolpidos.

TCNICA Desparafinao e hidratao at alcol a 70 do corte histolgico Cubra a lmina com o corante Sudan Black durante a noite temperatura ambiente Lave e diferencie em alcol a 70 o corte histolgico at ver o fundo cinzento claro Lave com gua da torneira Monte uma lamela por cima do corte histolgico com liqudo de montagem aquoso

OBSERVAO DE LPIDOS EM CORTES HISTOLGICOS (SUDO III) Observao de lpidos em cortes efectuados em sementes. A colorao dos lpidos feita com Sudo III (corante especfico) TCNICA 1- Faa um corte muito fino na semente em estudo com o auxlio de um bisturi.

59 2- Coloque um pouco de gua destilada num vidro de relgio e com o auxlio de um pincel lave o corte. 3- Em seguida coloque um pouco de Sudo III noutro vidro de relgio e deixe o corte corar mergulhado no corante durante 3 a 5 minutos. 4- Finda a colorao lave o corte, para retirar o excesso de corante, passando-o por gua destilada contida num vidro de relgio. 5- Observe entre lmina e lamela.

Col Sudam III COLORAO DE AZUL-DE- NILO PARA LPIDOS NO CIDOS 1. Fixar o material biolgico em formol a 10%, fazer a incluso em parafina e cortar seces com espessura de 5m. 2. Os cortes so desparafinados 3. Corar 15 min numa soluo de azul-de-Nilo 1%. 4. Lavar em gua 5. Diferenciar rapidamente em cido actico a 1% 6. Lavar em gua 7. Montar Resultados: Os lpidos de natureza no cida coram de rosa e os cidos coram de azul assim como outros componentes cels bioquimicamente de natureza no lipdica . COLORAO VERDE DE METILO PIRONINA Fundamento: DNA + RNA Colorao Verde-Metilo Pironina O mtodo do verde-metilo pironina utiliza a elevada taxa de carga negativa dos cidos nucleicos. O verde-metilo um corante catinico que se liga de um modo especfico ao

60 DNA e portanto adequado colorao de ncleos, tanto em clulas vivas como em material fixado. A pironina um corante vermelho cuja especificidade para o RNA no to elevada e portanto algumas protenas podem de igual forma corar. A execuo e os resultados desta tcnica dependem em grande parte da utilizao de condies cuidadosamente controladas de pH da soluo e da concentrao dos dois corantes. A existncia de lminas de controlo importante para a interpretao dos resultados, uma vez que este mtodo de colorao est sujeito a artefactos. Nas lminas de controlo, um ou ambos os cidos nucleicos devem ser removidos, por extraco enzimtica ou cida. Tcnica: 1- gua destilada 2- Verde de metilo-pironina (20 minutos) 3- Verde de metilo...........................0,5 g 4- Tampo acetato 0,1M pH4,4........100 ml 5- Purificar com clorofrmio e juntar Pironina Y (0,5 g) 6- Butanol tercirio (4 mudas) 7- Xilol (2 mudas de 10 minutos cada) 8- Blsamo 9- Duas lminas: 1 para a ribonuclease a 40 , durante 4h seguida de verde de metilopironina. Concentrao da ribonuclease: 1 mg/ ml 1 para gua destilada a 40 , durante 4h seguida de verde de metilo-pironina. COLORAO DE DNA REACO DE FEULGEN 1. DESPARAFINAO Deitar xilol sobre o corte histolgico durante 3 min. 2. HIDRLISE Colocar os cortes em cido clordrico normal temperatura de 60 durante 10 min. Lavar com gua destilada. 3. COLORAO Colocar os cortes numa tina de colorao com o reagente de Schiff durante 1 h. Passar os cortes por 3 tinas contendo gua sulfurosa durante 2 min. Lavar com gua destilada. 4. DESIDRATAO E MONTAGEM Cobrir os cortes sucessivamente com a srie ascendente de lcoois (70, 95 e 100) durante 3 min. Passar por xilol. Montar.

61 5. OBSERVAO E RESULTADOS Os ncleos celulares e o contorno nucleolar apresentam-se rosa resultante da presena de DNA. O mtodo de Feulgen sem dvida o mais largamente utilizado e o mais quantitativo de todos os mtodos citoqumicos. um procedimento especfico de demonstrao de desoxirribose. Nesta tcnica, utiliza-se uma hidrlise cida com HCl 1N a 60 C para quebrar a ligao purina-desoxirribose, da qual resultam aldedos reactivos que soposteriormente demonstrados pelo reagente de Schiff. Elementos que contenham DNA so corados de vermelho-prpura. A intensidade da colorao proporcional concentrao de DNA da nossa amostra. Assim, possvel efectuar observaes morfomtricas e micro-fotomtricas e determinar as quantidades de DNA no ncleo das clulas. A ligao purina-ribose no afectada pela hidrlise e consequentemente o RNA no demonstrado por esta tcnica

. COLORAO DE DIMETILAMINOBENZALDEDO/ NITRITO PARA PROTENAS COM TRIPTOFANO 1 - Deitar xilol sobre o corte histolgico durante 10 min. 2 Passar por etanol absoluto, lavando bem o xilol 3 Deixar secar ao ar 4 Mergulhar 1 min o corte na sol. De DMAB a 5% em HCl conc. 5 Oxidar o corte 1 min em nitrito de sdio a 1% em HCl conc. 6 Lavar em H2O dest. 7 Contrastar os ncleos durante 1 min corando-os numa sol. de Safranina de 1 gr. em 100 ml de etanol absoluto e 50 ml de H2O dest. 8 Lavar o excesso de corante em H2O dest. 9 Passar por 2 banhos de Etanol Absoluto 10 Passar pro acetona (para fixar o corante nuclear e no desaparecer com o tempo) 11 Clarificar em xilol 12- Montar com DXP. RESULTADO DA COLORAO: As protenas ricas em triptofano coram de azul ( grnulos azuis ) Os ncleos coram de rosa vivo pela Safranina

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COLORAO DAS PROTENAS TOTAIS POR FAST GREEN CIDO SEGUNDO DEITCH Procedimento 1. Tratar os cortes com cido tricloroactico a 5%, recm-preparado, durante 15 min, a 90C. 2. Mergulhar as lminas em cido tricloroactico a 5%, recm-preparado, a frio, e a seguir vrias vezes em gua destilada. 3. Corar com a soluo fast green a pH 2,7, durante 30 min. 4. Lavar os cortes durante 1 min. em soluo de cido actico a 1%. 5. Desidratar em trs banhos de butanol. 6. Diafanizar em xilol e montar com entellan. Resultados As protenas totais coram de verde Soluo Corante Fast green cido actico a 1% pH 2,7 0,1g 100ml

EVIDENCIAO DE PEROXIDASES PELO MTODO DA BENZIDINA, SEGUNDO PRENANT 1. Mergulhar as seces de tecido cortadas no critomo numa soluo saturada de benzidina acidificada a pH 4,5 com algumas gotas de cido actico durante 3 min. 2. Mergulhar os cortes em gua oxigenada durante 3 min. 3. Secar, montar e observar ao microscpio ptico.O local de actividade das perox