Procedimentos de preparação de uma lâmina histológica para observação

em microscopia óptica

Visa à preparação dos tecidos destinados ao estudado à microscopia de luz.

O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida

Significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado.

Assim: é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes.

Fixação

Inclusão/Embebição: Desidratação Diafanização

Corte: Secções ao micrótomo/criostato

Montagem da lâmina

Coloração

Observação ao microscópio

Destina-se a preservar as células, evitando as modificações post mortem conhecidas por autólise e conservando, deste modo, a estrutura morfológica.

Consiste basicamente na estabilização da estrutura das proteínas, por coagulação.

Os agentes fixadores mais utilizados são o formol tamponado e o líquido de Bouin. Ambos fixam as proteínas evitando sua degradação

o fixador mais utilizado é o formol, por ser mais acessível e de uso simples

Contudo, seus resultados geralmente não são satisfatórios.

Por isto, é recomendada a dissolução de formol em tampão fosfatado (Junqueira e Junqueira, 1983).

Outros: álcool etílico, ácido acético, ácido pícrico.

O tempo de fixação dependerá do tamanho do fragmento do tecido, podendo variar entre 06 e 24h.

É recomendado que, sempre que possível, não ultrapasse a 3 mm de espessura.

Objetivo: proceder com a infiltração de substâncias endurecedoras nos fragmentos dos órgãos

Permite a obtenção dos cortes extremamente delgados.

São etapas rigorosamente seqüenciais e obrigatórias

Uma etapa mal executada acarretará em material de má qualidade para análise.

Desidratação Diafanização

Objetivo: retirar a água dos tecidos e a sua substituí-la por álcool.

São utilizados álcoois graduados em tempos adequados ao fixador e ao material.

Para ME, utiliza-se ainda acetona ou óxido de propileno.

Objetivo: retirar o álcool da peça (as substâncias inclusoras dissolvem-se mal no álcool) e torná-la transparente.

Utiliza substâncias solúveis em álcool e capazes de eliminá-lo, por exemplo o toluol, xilol, benzol, etc.

Comumente: parafina histológica e resinas plásticas,

metacrilato resina epon

As resinas apresentam resultados mais adequado

As substâncias que retiraram o álcool são substituídas por parafina fundida em pequenos blocos.

Obtenção de cortes o mais delgado possível, que possibilite a sua observação aos microscópios de luz ou eletrônico.

De um modo geral, são obtidos cortes entre 5 e 7 micrômetros.

Micrótomo: - aparelho apropriado para este fim - sua regulagem medida em micrômetros e nanômetros

- permite a obtenção do corte na espessura desejada é - formado por uma lâmina (fixa ou descartável) de aço, afiada, e um braço ao qual se prende o bloco e que se desloca verticalmente.

 

Micrótmo (tipo “rotativo”) e operação de corte

Lâminas:

Previamente limpas com detergente

Estocadas em álcool 80%

Previamente secas.

Antes da sua utilização, é necessário revestir suas superfícies com uma fina camada de albumina para facilitar a adesão da peça.

As fitas obtidas a partir do micrótomo são transferidas para um banho-maria, com o auxílio de uma pinça, para serem distendidas

A água deve estar entre 3 e 8º C abaixo do ponto de fusão da parafina utilizada.

Nesta etapa, são retiradas as dobras e evitadas as bolhas abaixo da fita.

Após a distensão, os cortes são separados individualmente ou em grupos, conforme a conveniência, utilizando se lâminas de vidro

Os cortes obtidos podem ser transferidos, inicialmente, para uma estufa onde ficam alguns minutos (não mais que dez minutos) para posteriormente serem colocados em um suporte inclinado.

Finalmente, os cortes devem ser depositados em uma estufa a 60º C para secagem entre uma e 24 horas.

Importante para a visualização das estruturas do tecido.

Geralmente podem ser agrupados em três classes distintas (Gartner e Hiatt, 1999):

1. Corantes que diferenciam os componentes ácidos e básicos das

células;2. Corantes especializados que diferenciam os componentes

fibrosos da matriz extracelular;3. Sais metálicos que precipitam nos tecidos.

Os corantes mais utilizados nos procedimentos histológicos são a Hematoxilina e a Eosina (HE).

A Hematoxilina é uma base que cora, preferencialmente, componentes ácidos das células em um tom azulado escuro.

Como os componentes ácidos mais abundantes são o DNA e o RNA, tanto o núcleo, quanto certas partes do citoplasma, se tornam azulados.

Esses componentes são chamados de basófilos.

A Eosina, ao contrário, é um ácido que cora as estruturas básicas da célula de rosa.

Estas estruturas são abundantes no citoplasma e são chamadas de acidófilas.

Componentes celulares e de tecidos: purificados e isolados

Usa força centrífuga para separar

Em função do coeficiente de sedimentação

Coeficiente de sedimentação: tamanho, forma, densidade e viscosidade do meio

Assim: a composição química as funções podem ser estudadas in

vitro

As frações obtidas: ME

Métodos que identificam e localizam substâncias em cortes histológicos ou

em células cultivadas

É uma técnica histológica que tem por objetivo a identificação da natureza química de constituintes celulares.

Consiste na coloração específica desses constituintes, recorrendo basicamente a substâncias que, reagindo com os componentes celulares, dão origem a produtos corados.

Esta técnica contrasta com a coloração histológica comum, na medida em que esta última se baseia na absorção, pelas estruturas, de substâncias coradas (os corantes), enquanto que na histoquímica, as cores são propriedades de produtos que se formam in situ.

Um dos exemplos clássicos é o método de Feulgen que se destina a identificar o DNA.

O princípio da reação baseia-se no fato de que o DNA, após hidrólise ácida moderada, quando tratado pelo reagente de Schiff , dá lugar à formação de um produto que se cora em vermelho arroxeado.

São processos de coloração que conferem especificidade

Expõem os grupamentos e radicais químicos que compõem as estruturas

Assim são especificamente evidenciados pelos corantes histoquímicos.

Ex: carboidratos, ácidos nucléicos, aminoácidos, íons, lipídeos, etc.

- Localização de ácidos nucléicos: método de Feulgen.

- Localização de carboidratos: técnica do PAS (Periodic Acid-Schiff).

Molécula: compostos específicos que se ligam à mesma

Compostos: acoplados a uma marcador

Conjunto: molécula-composto-marcador → microscópio

Marcadores: substâncias fluorescentes átomos radioativos moléculas de enzimas (peroxidase) metais

Detectam: açúcares, proteínas e ácidos nucléicos

Faloidina: filamentos de actina

Proteína A: imunoglobulinas

Lectinas: moléculas de membranas celulares contendo seqüências específicas de açúcares

Metodologia que utiliza anticorpos para identificar moléculas em cortes ou camadas de células.

Células em cultura ou um corte de tecido: supões conter uma determinada proteína

São incubados numa solução que contém um anticorpo

Anticorpo: reconhece essa proteína se liga especificamente à proteína sua localização pode ser evidenciada por microscopia eletrônica ou de luz – dependendo do marcador

Exigência: disponibilidade do Ac contra a proteína que se quer detectar

Produzir Acs contra a proteína X de uma certa espécie animal (rato)

Se X já está isolada: injetada numa outra espécie (coelho)

Se a proteína é muito diferente para este animal reconhecê-la como estranha

O animal vai produzir Acs contra a proteína: Acs de coelho contra proteína X de rato

Esses Acs são coletados do plasma do animal e utilizados na imucitoquímica

Ag num animal

Vários grupos de linfócitos podem reconhecer porções diferentes de X

Produzindo Acs diferentes contra as várias porções

Resulta: mistura de Acs

Mistura: Anticorpo policlonal

Fornecer a proteína X a linfócitos mantidos em cultura

Os diferentes grupos (clone) de linfócitos produzirão Acs diferentes contar as várias porções da proteína X

Cada clone: isolado e cultivado isoladamente

Os diferentes Acs contra X podem ser coletados e separados

Cada um destes Acs: um Ac monoclonal

São mais específicos

Mais precisos no reconhecimento da proteína X

Assim: menos ligações inespecíficas com outras proteínas

Poderia dificultar o reconhecimento da proteína X

Técnica direta:

O Ac contra a proteína X (monoclonal ou policlonal) é ligado a uma marcador apropriado

Um corte de tecido é incubado com o Ac durante algum tempo

O Ac interage e se liga a X

Em seguida, o corte é lavado para remoção do Ac não ligado

O corte pode então ser observado por microscopia de luz ou eletrônica (dependendo do marcador)

Técnica Indireta:

Necessário: produzir dois Acs ≠

Um Ac contra a proteína de ratos feitos por um coelho

Um Ac de um outro coelho é injetado numa 3° espécie: ovelha

O Ac de coelho é considerado estranho por ovelhas e cabras → produzir um Ac contra a imunoglobulina: um anti-Ac ou antiimunoglobulina → será ligado ao marcador

Técnica Indireta:

Um corte de tecido de rato que se supõe conter a proteína X é incubado inicialmente com Ac de coelho antiproteína X de rato

Lavar os cortes

Incubá-los com o anti-Ac marcado que reconhecerá e se ligará ao Ac de coelho que se havia ligado à proteína X

O corte pode então ser observado por microscopia de luz ou eletrônica (dependendo do marcador)

Ultracentrifugação

Cromatografia

Eletroforese em gel

Uma mistura de proteínas obtida de células ou de tecidos homogeneizados

Centrifugada em alta velocidade por várias horas

As proteínas se separam em bandas (de acordo com o tamanho e a densidade das moléculas)

Meio centrifugado: drenado e dividido em várias frações (contêm as ≠ proteínas)

Aí podem ser analisadas separadamente

Uma solução contendo uma mistura de proteínas é colocada numa coluna

Coluna: preenchida por partículas com diferentes propriedades

Durante a migração pela coluna, o movimento das proteínas é retardado pela interação com as partículas

Quando o líquido da coluna é recolhido, diferentes grupos de proteínas podem ser coletados separadamente.

Isolamento das proteínas

Detecção e identificação das proteínas Coloração Radioautografia Immunoblotting

Misturas de proteínas são obtidas de células e tecidos homogeneizados

São tratadas com detergente (dodecil sulfato de sódio) e mercaptoetanol: desenovelar e separar as cadeias e subunidades de proteínas

Coloca-se as amostras na porção superior de uma placa de gel de poliacrilamida

Placa de gel: submetida a uma corrente elétrica contínua

Migração das proteínas ao longo do gel

Coloração: As proteínas são coradas A intensidade da coloração é proporcional à concentração das

proteínas

Radioautografia: Um filme de raios X é colocado sobre o gel durante algum tempo e

depois revelado Revelação: manchas escuras no filme de raios X

Immunoblotting: As proteínas podem ser transferidas do gel para uma membrana de

nitrocelulose É incubada com um Ac que reconhece proteínas que podem estar

presentes

Permite a identificação de seqüências específicas de DNA ou RNA

É a ligação entre duas moléculas de cadeia única de ácidos nucléicos: DNA com DNA, RNA com RNA ou RNA com DNA – se reconhecem um ao outro se suas seqüências forem complementares, formando moléculas de cadeia dupla

Técnicas altamente específicas

Utilizadas em pesquisas, diagnóstico clínico e medicina forense

Quando aplicada diretamente:

Células

Cortes de tecidos

Esfregaços

Cromossomos de células mitóticas

Excelente para:

Averiguar se uma célula tem uma seqüência específica de DNA

Definir a localização de um gene num cromossomo

Identificar as células nas quais um gene específico está sendo transcrito

O DNA deve ser inicialmente desnaturado

Por calor ou agentes desnaturantes

Fazendo com que as duas cadeias se separem

As cadeias separadas estão prontas para serem ligadas a um segmento de cadeia simples de DNA ou a um segmento de RNA que sejam complementares à seqüência que desejamos analisar

Esta seqüência: sonda

Obtida: Clonagem PCR (amplificação da seqüência) Síntese (se for curta)

Deve ser ligada a um marcador: isótopo radioativo ou nucleotídeo modificado

As lâminas contendo os cortes de tecido, células ou cromossomos são aquecidas

Em seguida, uma solução contendo a sonda é colocada sobre o espécime por um período de tempo necessário

Depois de lavar a lâmina, a localização da sonda ligada a sua seqüência complementar é denunciada pelo marcador

Southern blotting – eletroforese com moléculas de DNA

Northern blotting - eletroforese com moléculas de RNA

Exemplos de proteínas (Ags) importantes para o diagnóstico e subseqüente controle de tratamento de algumas doenças

Antígenos Finalidade Diagnóstica

Proteínas de filamentos intermediáriosCitoqueratinas Tumores de origem epitelialProteína fibrilar ácida glacial Tumores de certas células da neuróglia Vimetina Tumores de tecido conjuntivoDesmina Tumores de tecido muscular

Outras proteínasHormônios protéicos ou polipetídicos Tumores produtores de hormônios protéicos ou polipetídicosAntígeno carcinoembriogênico (CEA) Tumores de glândulas, princip. as do tubo digestivo e mamárias

Receptores para hormônios esteróides Tumores das células dos ductos das glândulas mamárias

Antígenos de vírus Infecções viraisJunqueira e Carneiro. Histologia Básica. Texto e Atlas. 11° Edição, Editora Guanabara: Rio de Janeiro, 2006.

Distorções e artefatos causados pelo processamento dos tecidos

A totalidade do tecido

Duas dimensões e três dimensões

As várias etapas podem distorcer os tecidos

Imagem que pode diferir da real in vivo

Causa: retração produzida pelo fixador, etanol e calor da parafina usada para a inclusão

Retração atenuada: tecidos incluídos com resina

Conseqüência da retração: espaços artificiais nas células e entre as células e outros componentes de tecido

Tb provocam espaços artificiais: a perda de moléculas que não foram mantidas corretamente nos tecidos pelo fixador ou que foram retiradas pelas soluções de desidratação e clareamento

Espaços artificiais e distorções: artefatos de técnica

Outros artefatos: pregas do corte – capilares sangüíneos precipitados de corantes ou de sujeira – grânulos

citoplasmáticos

Dificuldade: impossibilidade de se corar diferencialmente todos os componentes da célula e tecidos num só preparado

Necessário: várias preparações diferentes

Cada qual corada por métodos diferentes

Obter: uma visão completa da composição e estrutura de um tecido

Corte em secções de uma estrutura tridimensional: parecem ter só duas dimensões – comprimento e largura

Freqüente causa de erros

Necessário estudar várias secções em planos diferentes

Coloração:

Do tipo Romanowsky

Papanicolau

Azul de Metileno

Panóptico, Diff-Quick, Wright, May-Grumwald-Giemsa Baratas, fáceis de preparar, guardar e usar.

Coram bem microrganismos e o citoplasma.

Coram mal os núcleos, mas o suficiente para avaliar critérios de malignidade.

Particularidades: Panóptico Diff-Quick: não cora bem grânulos de mastócitos (problema)

May-Grunwald-Giemsa: é a melhor delas (é um pouco mais complicada)

TODAS necessitam fixação ao ar (rápida!!!)

É demorada e complicada, mas é a rainha das colorações para citologia.

Ótima coloração de núcleos e citoplasma.

Ótima para avaliar critérios de malignidade.

Permite enxergar os núcleos mesmo em grumos grandes de células.

Necessita fixação com álcool 70 a 90% ou fixador citológico !!!!

Fácil de utilizar

Cora mal o citoplasma, mas cora muito bem o núcleo e permite avaliar detalhes nucleares.

Cora bem grânulos de mastócitos

Fim !!!