Técnicas histológicas y coloraciones

8/6/2019 Tcnicas histolgicas y coloraciones

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TCNICAS HISTOLGICAS YCOLORACIONES

En este captulo estudiaremos: D1. GeneralidadesD2. Tcnicas histolgicasD3. Tcnicas especialesD4. Las coloraciones empleadas en histologa

D1. GENERALIDADES

Tcnicas histolgicas es el conjunto de procedimientos utilizados para el estudio microscpico(histolgico) de las piezas anatmicas. Estos procedimientos complejos, que van desde larecepcin de una pieza anatmica hasta el diagnstico microscpico de la misma, si bien escierto que no van a ser realizados ni por el estudiante ni por el mdico que no se dediquen a lainvestigacin histolgica e histopatolgica, pero es necesario el que ellos conozcan susfundamentos, su ejecucin, la interpretacin de los resultados para una mejor comprensin del

estudio histolgico, por lo que aqu se los trata de una manera resumida.

Todas las tcnicas tienen en comn el que requieren de un corte muy delgado del tejido(llamado corte histolgico), y el montarlo en una lmina muy fina de vidrio, la cual se la sometea diversas coloraciones antes de observarla al microscopio, ya que luego se la cubre por unalaminilla.

D2. TCNICAS HISTOLGICAS

Hay dos tcnicas principales para proceder a la preparacin y tincin de los cortes histolgicosde los tejidos: la de la parafina y la de la congelacin. La importancia y la utilizacin de cadauna de ellas, tiene su justificacin precisa, como se ver a continuacin.

D2.1. LATCNICADELAPARAFINA: se inicia siempre por la obtencin de la muestra, la que pasaluego, por los siguientes procedimientos: fijacin, deshidratacin, aclaracin, inclusin, secciny finaliza con el montaje y la tincin.

a.LAOBTENCINDELAMUESTRA: es el tomar un pequeo fragmento de rgano o tejido, lo cual se verifica yaen el cadver (necropsia), o ya en el vivo (biopsia), en este caso, ya en un acto operatorio, o ya mediantemtodos especiales, por los cuales y sin que se haga una verdadera intervencin quirrgica, se obtienenfragmentos de tejido para su estudio microscpico.

En los dos casos, este paso debe ser realizado mediante movimientos delicados y usando instrumentalbien afilado, para no producir cambios artificiales en las estructuras a observar, ya por presionesindebidas o ya por secciones realizadas con instrumentos en mal estado.

Dr. Gustavo Mora Venner Pg. D-1


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Pg. D-2 Dr. Gustavo Mora Venner

En una necropsia se tratar de obtener las muestras lo ms rpidamente posible para que los rganos nosufran lesiones postmortem, sto es, las que necesariamente ocurren una vez que se ha producido lamuerte; como la muestra as obtenida debe ser sometida a los siguientes pasos, para que losprocedimientos de stos acten bien, el fragmento debe ser de pocos milmetros de espesor.

b.FIJACIN: la muestra obtenida es de un tejido blando y a veces demasiado blando, por ello, este paso dela tcnica tiene por finalidad endurecerlo, a la vez que detiene las degeneraciones postmortem. El

fundamento de este paso es el coagular las protenas del tejido para que se enduren; para conseguir sto,se acude al aldehdo frmico en solucin al 4%. Al endurecer las protenas por coagulacin, stasaprisionan a algunos de los dems elementos de los tejidos y realmente causan la fijacin del mismo. Losfijadores son antispticos, por lo que matan a cualquier agente patolgico que contenga el fragmento.

c.DESHIDRATACIN: como para realizar los cortes de las muestras es necesario incluir a stas en una sus-tancia que se endure completamente, se emplea para este fin, la parafina, pero sta necesita tener en lamuestra un espacio para ocupar; los tcnicos entonces idearon al conocer que el tejido tena muchacantidad de agua (aproximadamente el 65%), el eliminar sta y reemplazarla por la parafina lquida, conlo cual se cumple el paso de la deshidratacin. Para sto, se lava la muestra con alcoholes de grado cadavez superiores hasta llegar al alcohol absoluto, que elimina completamente el agua del tejido.

d.ACLARACIN: luego de eliminada el agua, la muestra queda con alcohol en el que tampoco se disuelve laparafina, por lo que los investigadores debieron buscar un solvente comn de cera de parafina y dealcohol, y para este efecto se emplea el xilol, a cuya accin se somete a la muestra, con lo que se eliminade ella a todo el alcohol.

e. INCLUSIN: realizada la aclaracin, la muestra se incluye en parafina lquida, la que penetra en elfragmento y sustituye al xilol.

f.SECCIN: al enfriarse la parafina, sta se endura y con ella se endura tambin el fragmento orgnico dela muestra, constituyendo un bloque compacto de parafina que fcilmente se presta para ser cortado. Pa-ra cumplir con este paso, debi investigarse mucho y mejorar los instrumentos que se empleaban, ya quese necesitaban hacer cortes de pocas micras de espesor (entre 5 y 10 micras); por ello, se ide el aparatollamado MICROTOMO (Fig. D-1 y D-2), que por una parte dispone de una cuchilla muy fina y por otra deun sistema con movimiento, de modo que, cada vez que la cuchilla realiza una seccin, hace avanzar a lamuestra una cantidad fija de micras que se pueden graduar a voluntad. De este modo, se logra obteneruna verdadera cinta de cortes sucesivos, en los cuales, el borde uno se adhiere al borde del siguiente.

Fig. D-1. Fotografa que muestra a un tcnico utilizandoun ultramicrotomo, aparato que est en funcionamiento.


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g.MONTAJEYTINCIN: una vez que se ha obtenido la cinta de los cortes, se procede a montar uno de ellossobre una laminilla portaobjetos para proceder y someterlo a la tincin. Como el corte del tejido tiene ensu interior parafina y como la mayor parte de los colorantes ms usuales no son solubles en la parafina ysi en agua (ver sobre sto ms adelante en este mismo libro), hay que volver a hidratar al corte, de modoque permita colorearlo. Luego, y una vez montado el corte en a placa, se procede a realizar los pasosinversos que se han analizado hasta llegar a la inclusin; por ello, primero se lavar en xilol, con lo cualse disuelve la parafina, luego se lavar en alcoholes decrecientes de grado para eliminar el xilol yfinalmente, se lo lavar con agua, para que sta ocupe las partes anteriormente llenas de ella y as pueda

ser teido con colorantes solubles en agua. Realizada la coloracin, se proceder nuevamente al lavadocon alcoholes crecientes y luego con xilol, para finalmente proceder a la observacin del cortemicroscpico (Fig. D-3).

D2.2. LATCNICADELACONGELACIN: es la otra tcnica ms usada para realizar estudios histol-gicos y sobre todo histopatolgicos, pues de ella nos valemos cuando el cirujano necesita porejemplo, un diagnstico histopatolgico de un supuesto tumor canceroso durante el curso deuna intervencin quirrgica; con el diagnstico del tejido obtenido durante la ciruga, l sabrque conducta seguir durante la operacin, ya que si se comprueba que es maligno, deber ha-cer resecciones quirrgicas mayores, caso contrario, solo extirpar el tumor o solo la parteextrada par la observacin y no proseguir su intervencin; como en el ejemplo indicado, te-nemos infinitos de los que se vale la ciruga para sus intervenciones, mediante el uso de la tc-

nica de la congelacin.La tcnica en mencin consiste en realizar la solidificacin del fragmento de muestra mediantela congelacin. Este procedimiento se realiza de varias maneras, siendo la ms usada, la quese vale de una corriente de bixido de carbono, que se conecta al portapiezas, mediante undispositivo, cuya espita o vlvula sobresale sobre la pieza para producir el llamado hielo seco,luego de lo cual se realiza enseguida el corte y la observacin al microscopio.

Actualmente, se usa mucho el aparato llamado CRIOSTATO (Fig. D-4), que permite lacongelacin de la muestra y su corte a igual temperatura, con lo cual se abrevia el tiempo depreparacin.

D3. TCNICAS ESPECIALES

Fig. D-2. Fotografa de un ultramicrotomo, que enprimer plano muestra el cuchillo para losultradel ados cortes de te ido.


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Es necesario que el estudiante conozca por lo menos los fundamentos y la importancia de losresultados de las ms modernas tcnicas, aunque no las vaya a ver o a realizar. De estas tc-nicas, las ms trascedentales son la radioautografa, la microscopia electrnica, la microscopade fase o de interferencia, los mtodos inmunohistoqumicos, que incluye la inmunohistoqu-mica indirecta y otras tcnicas.

D3.1. LARADIOAUTOGRAFA: su fundamento radica en la introduccin de istopos radiactivos enlos elementos estructurales de los tejidos, a los istopos se los observar posteriormenteformando parte de los tejidos en estudio, gracias a la propiedad de dichos istopos de

convertirse en fuentes de energa capaces de impresionar las emulsiones fotogrficas,pudiendo de este modo ser detectados en sus diversos trayectos.

Es una tcnica que a esta poca del 2006, data de hace unos 45 aos y que se aprovech de lafsica nuclear para la produccin de cierto tipo de istopos radiactivos mediante el ciclotrn yla pila atmica. Estos istopos, que al comienzo fueron muy pocos (inicialmente uno solo),posteriormente han aumentado considerablemente en su nmero y en la actualidad hay unagran variedad para el estudio de los ms diversos componentes celulares. Estos componentescelulares denominados piedras de construccin reciben un radioistopo y pasan adenominarse precursores y producto al elemento resultante con el precursor.

Uno de los elementos radioactivos ms empleados es el TRITIO, que se constituye en la piedrade construccin usada para protenas, como sucede con la leucina; en el caso de los cidosnucleicos, la TIMIDINA se emplea para el DNA y la URIDINA para el RNA. Para los lpidos el 3H-OLEICO y el 3H-PALMTICO; para fosfatos de calcio, se emplean los istopos radioactivos decalcio y fsforo; para los carbohidratos, se emplea la glucosa marcada con el mismo tritio, y as

Fig. D-3. Serie de fotografas que muestran algunas de las fases en la preparacin de un frotisde material patolgico para su observacin con el microscopio. (1) Toma de la muestra; (2)Extensin sobre un portaobjetos; (3) Fijacin mediante calor; (4) Coloracin del material; (5)


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sucesivamente. As, la radioautografa se basa sobre dos principios fundamentales: (1) laradiacin ionizante tiene el mismo efecto sobre una emulsin fotogrfica que la luz visible; y,(2) un precursor biolgico con marca radiactiva, por ejemplo, un aminocido, tieneexactamente iguales propiedades biolgicas y destino metablico en el organismo que lamolcula correspondiente sin marca. Por marca radiactiva se entiende que un tomo de unamolcula determinada es reemplazada por su istopo radiactivo correspondiente, por ejemploel reemplazo de hidrgeno por tritio 3H.

Los resultados que se obtienen son extremadamente importantes, ya que solo mediante estatcnica se pueden hacer estudios histolgicos en el tiempo y puesto que todas las dems

tcnicas nos presentan las imgenes de los tejidos hasta cierto punto estticos y no se lospuede estudiar en relacin con el tiempo de desarrollo, como sucede con la vida de la clula, elciclo de un epitelio, etc., o bien en los procesos activos, como son la sntesis de productos, elpaso de ellos de una estructura a otra, el perodo de su produccin, su eliminacin, etc., todasestas situaciones se han hecho posibles gracias a la radioautografa. Insistiendo, con estatcnica es posible obtener informacin directa respecto al sitio dentro de la clula donde sesintetiza un producto y los componentes qumicos que lo forman, adems de sus eventualesdesplazamientos dentro de la clula o hacia otras localizaciones del organismo, despus desalir de la clula. Adems, es posible seguir los desplazamientos de toda la clula y suposterior destino en el organismo. Por lo tanto, la radioautografa provee de informacinreferida a los aspectos dinmicos de la morfologa de las clulas y los tejidos.

El procedimiento radioautogrfico puede ser el siguiente, por ejemplo: en un animal deexperimentacin se inyecta una molcula de importancia biolgica marcada con un istoporadiactivo, por ejemplo 3H-leucina, que interviene en la formacin de varias protenas. Lasmolculas con marca radiactiva son integradas rpidamente a las macromolculas, que se pue-den conservar en los cortes de tejido al hacerlas insolubles por fijacin. Las molculasinyectadas son solubles y se eliminan por lavado durante la preparacin de los corteshistolgicos, a menos que hayan sido incorporadas al producto de sntesis macromolecularantes de ser sacrificado el animal. Despus del montaje de los cortes, se les agrega en cmaraoscura una capa muy delgada de emulsin fotogrfica (cristales de bromuro de plata enemulsin de gelatina) (Fig. D-8). Durante el posterior perodo de exposicin, que puede duraralgunos das o semanas, de acuerdo al trabajo experimental, desde los sitios radiactivos deltejido se emiten partculas o rayos gamma. Algunos de ellos atraviesan la emulsin fotogrficae inciden en los cristales de bromuro de plata, que se transforman entonces, en parte, de iones

plata a plata metlica. Despus de un perodo prudencial de exposicin se aplica un reveladorqumico que transforma todos los cristales incididos por los rayos en plata metlica. Por ltimose eliminan todos los cristales no incididos mediante una solucin de tiosulfato (fijacinfotogrfica). A continuacin, se puede tratar el corte de la misma manera que cualquier otro,

Fig. D-4. Ilustracin que muestrael corte de trozos de tejidore arado en un criostato.


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por ejemplo teido de manera adecuada, con posterior deshidratacin e inclusin. En laobservacin con el microscopio se distinguen los granos de plata metlica como pequeasmanchas o puntos negros en los sitios de localizacin de la sustancia radiactiva en el corte deltejido subyacente (Fig. D-6).

El poder de resolucin, entendido como la exactitud de la localizacin del istopo radiactivo, esde alrededor de una micra con el microscopio ptico, pero si se utiliza el microscopioelectrnico (Fig. D-7), es posible obtener un poder de resolucin de alrededor de 0,1 micras. Enlas imgenes obtenidas por microscopio electrnico a menudo los grnulos ocultan variasestructuras y el estudio ms exhaustivo de las radioautografas puede requerir un anlisisestadstico.

El mtodo slo demuestra sustancias que se incluyen en los componentes tisulares, mientrasque el material marcado se encuentra dentro del organismo. Precisamente por ello es posibleobtener informacin sobre las relaciones dinmicas de los procesos metablicos. Unaimportante aplicacin de la radiautografa es el marcado de los ncleos celulares (Fig. D-6),tras el cual se puede seguir el desplazamiento y el destino de las clulas marcadas dentro delorganismo. Si, por ejemplo, se inyecta timidina marcada con tritio (que en el organismo seincluye como la base timina en el DNA) en un feto, ser incluido en el ncleo de todas lasclulas que sintetizaban DNA en el momento de la inyeccin, como paso previo para la divisincelular. En la actualidad el mtodo es muy importante para el estudio de la histognesis (el

desarrollo de las clulas embrionarias indiferenciadas a clulas especializadas en un tejido).

Fig. D-5. Esquema de un preparado radioautogrfico parauso con ME. Parte superior: el preparado durante laexposicin; parte inferior: el preparado tras el revelado y la

Fig. D-6. Microfotografa de un preparado radioautogrficode tejido renal para ME. Se inyect timidina tritiada que se

incorpor a todos los ncleos celulares que muestran puntosne ros corres ondientes a los rnulos de lata metlica.


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D3.2. LA MICROSCOPA ELECTRNICA: como con el microscopio de luz (ML) no se podan alcanzarmayores aumentos que los conocidos, debido fundamentalmente a la longitud de onda de laluz, se busc la forma de resolver este problema y se ide la fabricacin de lentes de cuarzo yya no de cristal, toda vez que en estos se detena la luz ultravioleta (UV) que siendo de mucha

menor longitud de onda permita mayor resolucin de las imgenes y obviamente, mayoramplitud de las mismas; as se invent el ULTRAMICROSCOPIO, que si bien no permita lavisualizacin de imgenes por ser la luz UV invisible, si impresionaba las emulsionesfotogrficas y se podan obtener microfotografas con una ampliacin hasta del doble de la queofreca la luz normal.

La longitud de onda no haba sido disminuda lo suficiente hasta que se invent el microscopioelectrnico (ME), en el cual ya no existe la longitud de onda, por estar ste fundamentado en elprincipio de los campos magnticos o electrostticos a manera de haces de electrones quereemplazaran a los lentes de cristal o de cuarzo, electrones que al acelerarseconvenientemente convertan a la longitud de onda en factor despreciable de modo de poderobtener grandes ampliaciones de las imgenes. Desde entonces se han venido utilizando loselectrones en reemplazo de la luz y as desde 1938, ao en el cual Knoll y Ruska crean el

primer ME hasta 1950, cuando se lo perfeccion y comercializ, se ha pasado por varias etapasde investigacin y estudio para actualmente transformarlo en un valioso elemento de ayuda enlas investigaciones histolgicas e histofisiolgicas, as como para la docencia y sus prcticas,puesto que en los antiguos microscopio de luz se obtenan aumento de hasta 500 dimetros oalgo ms y en los ultramicroscopios de hasta el doble, sto es ms de 1.000 dimetros, en elmicroscopio electrnico se obtienen aumentos de hasta 500.000 dimetros, estando los mscomnmente usados entre los 10.000 y los 80.000 dimetros.

Las diferencias importantes entre el ML y el ME, es que en el primero, las observaciones sonindividuales, a colores y mviles, y el ME entrega solamente imgenes fotogrficas y en negroy blanco. Es importante reconocer las imgenes obtenidas con el ME, pues ellos servirprimero al estudiante, que sin necesidad de ME tendr a su alcance el estudio demicrofotografas, y luego en la vida profesional, continuar observndolas con los nuevosestudios y experimentos de la ciencia mdica.

Fig. D-4. Imagen de un preparado radioautogrfico deeritrocitos (E) y reticulo-citos (R) capatada con ME. Lasclulas fueron incubadas con in Vitro con leucina tritiada. Seobserva una gran cantidad de grnulos de plata por sobreun R, pero ninguno sobre los E, debido a que la leucina

Fig. D-7. Imagen de un preparado radioautogrfico deeritrocitos (E) y reticulo-citos (R) capatada con ME. Lasclulas fueron incubadas con in Vitro con leucina tritiada. Seobserva una gran cantidad de grnulos de plata por sobreun R, pero ninguno sobre los E, debido a que la leucina


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D3.3. LAMICROSCOPADE FASEODE INTERFERENCIA: es as mismo un mtodo moderno y til, sobretodo para el estudio de los tejidos en fresco, lo que es difcil solamente con el ML, ya que sontan pocas las diferencias de las densidades entre los diferentes elementos de cada clula, porejemplo entre el ncleo y el citoplasma, de tal manera que atravesndolas una igual ondaluminosa, no se obtendra casi ningn contraste, por lo que sera necesario que algunos rayosluminosos de diferente longitud de onda atraviesen estas diferentes estructuras, de modo quelas visualice a unas ms claras y a otras ms oscuras. Es justamente este fenmeno el que se

cumple con el microscopio de fase o de interferencia, el que causa que los rayos sumisos seseparen y penetren en el corte con diferencia de longitud de onda, lo que se obtiene en estetipo de microscopios con un separador de haz, insertado debajo del objeto y otro haz esdesviado (que se conoce como haz de referencia), pasando un poco al lado del objeto;consecuentemente, los dos haces no atraviesan los mismos materiales, lo que conde a obtenerimgenes con diferentes tonalidades debido al paso de de los dos haces

D3.4. LOS MTODOS INMUNOHISTOQUMICOS: el organismo est en condiciones de reaccionar antesustancias extraas o antgenos, y formar anticuerpos especficos, que se unen con los antge-nos. Por lo general actan como antgenos las macromolculas proteicas o polisacridas. Losanticuerpos son protenas producidas por las denominadas clulas plasmticas y circulan por lalinfa y la sangre. Las clulas productoras de anticuerpos pertenecen al sistema inmune del

organismo, que protege al individuo contra las macromolculas extraas que intentan ingresar,por ejemplo, como componentes de bacterias o virus. As, los anticuerpos son un eslabnimportante en la defensa del organismo contra las enfermedades infecciosas. La reaccin entreun antgeno y su anticuerpo es en extremo especfica.

Los mtodos inmunohistoqumicos se basan sobre la utilizacin de un anticuerpo especfico,que se marca mediante un enlace qumico en una sustancia que se puede transformar envisible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antgeno. Elprincipio se ilustra con la denominada tcnica de anticuerpo fluorescente. Para localizar la pro-tena muscular miosina se inyecta en un conejo miosina purificada de msculo de pollo. Al cabode cierto tiempo, el suero del conejo contendr anticuerpos contra el antgeno miosina depollo. A continuacin se extrae el anticuerpo del suero del conejo y se adosa a fluorescena.Cortes histolgicos extrados de pollo se baan en una solucin del anticuerpo fluorescente

(antimiosina), que se une especficamente con la miosina del corte. El anticuerpo en exceso seelimina por lavado y se analiza el preparado con el microscopio de fluorescencia (Figs. D-8, D-10 y D-11).

En lugar de marcar el anticuerpo con fluorescena se puede adosar a la enzima peroxidasa, porlo que se pueden identificar complejos antgeno-anticuerpo mediante la determinacinenzimohistoqumica de la peroxidasa (Fig. D-9). De esta manera es posible utilizar el mtodopara la microscopia electrnica. Adems, se puede acoplar el anticuerpo a la protenaelectrondensa que contiene hierro, ferritina, o a partculas de oro, que tambin se puedeidentificar con el microscopio electrnico (Fig. D-10).

Fig. D-8. Microfotografa captada conmicros-copa de fluorescencia de uncorte de msculo de pollo. Primero secolorea el corte con anti-cuerpofluorescente contra miosina de pollo;la antimiosina se une a las bandas A

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La especificidad de los mtodos inmunohistoqumicos depende totalmente de que el antgenoutilizado se asle sin mezclas con otras sustancias, para que sea posible producir anticuerpospuros con la inmunizacin. En consecuencia, la investigacin del grado de pureza del antgenoes un importante control del mtodo. Se obtiene un antgeno totalmente puro cuando se losintetiza, por ejemplo un polipptido de secuencia de aminocidos conocida. Es esencialsealar que no es necesario aislar el anticuerpo primario especfico de la fraccin mezclada deanticuerpos en el conejo inmunizado ni los anticuerpos especficos anticonejo en la cabra.

D3.5. LAINMUNOHISTOQUMICAINDIRECTA: el mtodo inmunohistoqumico antes descrito tambin sedenomina mtodo directo, hoy reemplazado casi totalmente por una tcnica ms sensible,llamada mtodo indirecto. En principio es un procedimiento que consta de dos pasos: primerose hace reaccionar el preparado a analizar con un anticuerpo primario no marcado dirigidocontra el componente que se desea demostrar. Cuando el anticuerpo primario reacciona con elpreparado se elimina el exceso, no fijado, y se hace reaccionar el preparado con un anticuerposecundario marcado (p. ej., fluorescente), dirigido contra el anticuerpo primario. Por ejemplo, sise obtuvo el anticuerpo primario contra una protena X del preparado por inyeccin de X en un

Fig. D-9. Microfotografa de neuronas teidas medianteinmunohistoqumica con anticuerpos contra la molculatransmisora serotonina (5-hidroxitrip-tamina), unida aperoxidasa.

Fig. D-10. Dibujo esquemtico del principio de lainmunohistoqumica; se presentan los tres mtodos ms usuales dedeterminacin histoqumica de protenas especficas mediante an-


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conejo, el anticuerpo secundario podra ser un anticuerpo de cabra dirigido contra anticuerposde conejo en general, obtenido por inyeccin del anticuerpo de conejo en una cabra. Estemtodo es ms sensible porque cada molcula del anticuerpo primario reacciona con variasmolculas del anticuerpo secundario marcado, y la reaccin se refuerza.

En los ltimos aos ha sido posible obtener gran cantidad de molculas de anticuerpototalmente iguales, los denominados anticuerpos monoclonales. La tcnica para formarlos

implica una fusin celular de clulas de mieloma (una lnea celular tumoral transformada)murinos con los denominados linfocitos B, productores de anticuerpo, del timo de ratonespreviamente inmunizados por la inyeccin del antgeno que se desea demostrar con elanticuerpo monoclonal. Despus de la fusin celular, las denominadas clulas de hibridoma(hbridas de mieloma) formadas han adquirido la capacidad de las clulas del mieloma dedesarrollar un crecimiento prolongado en cultivos celulares y la capacidad de los linfocitos B deproducir determinado anticuerpo. Despus de la clonizacin de las clulas hbridas indi-viduales, cada clon produce grandes cantidades de anticuerpo monoclonal idntico (Fig. D-11).

Los mtodos inmunohistoqumicos son uno de los ms importantes utilizados en lasinvestigaciones histolgica y biolgica celular. En principio es posible demostrar la localizacinde cada una de las protenas que se forman en el organismo. Por ejemplo, en muchos casos seha podido establecer cules son las clulas que forman determinada hormona. Los anticuerpos

tambin se pueden formar contra otras molculas, distintas de las protenas, ya sea antgenosen s mismos o, en los casos de molculas pequeas, compuestos que se acoplan a sustanciasantignicas como las protenas, a veces debido a otro tratamiento. Por ejemplo, se ha podidodemostrar la existencia de pequeas molculas transmisoras como la serotonina (5-hidro-xitriptamina) (Fig. D-9).

D3.6. OTRASTCNICAS: incluyen la histoqumica con lecitinas y la hibridacin in situ.

LAHISTOQUMICACONLECITINAS: las lecitinas son protenas (en su mayor parte extradas de vegetales,por ejemplo, de porotos rojos), que poseen sitios de unin especficos para hidratos decarbono. Distintas lecitinas se unen con diferentes molculas de hidratos de carbono o secuen-cias de stas con notable especificidad. As, existen lecitinas que se unen a glucoprotenas y

glucolpidos especficos de la superficie externa de las membranas celulares y a determinadosproteoglucanos del tejido conectivo. La utilizacin histoqumica de las lecitinas se debe a que,al igual que a los anticuerpos, se las puede marcar, por ejemplo con un colorante fluorescenteo con la enzima peroxidasa, que permiten su localizacin en un corte de tejido. La histoqumica

Fig. D-11. Microfotografa de un microtbulo dentro del citoplasma defibroblastos provenientes de un cultivo de tejido. Se demuestramediante inmunohistoqumica por l< utilizacin de un anticuerpofluorescente monoclonal contra protena tubulina que conforma el


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con lecitinas tiene amplia aplicacin para demostrar la existencia de determinadas secuenciasde hidratos de carbono en las molculas de las membranas celulares.

LAHIBRIDACIN INSITU: se basa sobre la capacidad que poseen los cidos nucleicos para hibridarseentre s, es decir, la capacidad de unirse entre s que presentan las monocadenas de cidosnucleicos que tienen secuencias de bases complementarias. La hibridacin puede ser de DNA-DNA, DNA-RNA, o RNA-RNA. Debido a la caracterstica muy especfica de la hibridacin es

posible demostrar con gran especificidad la presencia de determinadas secuencias de DNA ode RNA en su localizacin en la clula. Para la tcnica de hibridacin in situ se utiliza una sonda(del ingls sonde, probe), formada por un cido nucleico monocatenario con una secuencia debases conocida, complementaria de la secuencia de bases que se desea demostrar. Las sondasson producidas en laboratorios (por ejemplo, mediante tcnicas de donacin de genes), y semarcan con un istopo radiactivo (para ser demostradas por radioautografa, como se indicantes), o con una ramificacin adosada, que permite identificar la sonda mediante otras tcnicas, por ejemplo la inmunohistoqumica. Estas sondas varan en longitud, desde 10-15 baseshasta varios miles de bases.

Por ejemplo, si se desea demostrar la existencia de determinada secuencia de DNA en uncromosoma de las clulas de un corte histolgico o en un preparado especial de cromosomas,primero se expone el preparado a un pH elevado (bsico), que induce la separacin de la doble

cadena de la molcula de DNA por desnaturalizacin. Despus se agrega la sonda, que puedeposeer la secuencia complementaria de DNA o de RNA. Una vez hibridada la sonda con laszonas complementarias del DNA de los cromosomas se transforma en visible la localizacin enlos ncleos celulares, por ejemplo, mediante radioautografa o inmunohistoqumica.

Si se desea demostrar la presencia de molculas especficas de RNA, no se efecta ningntratamiento previo de los cortes histolgicos con pH elevado, dado que precisamente se deseaque las cadenas dobles de las molculas de DNA no se separen y, en consecuencia, no se unana la sonda. En este caso, es suficiente incubar los cortes de tejido con la sonda (despus deuna fijacin suave del tejido), que puede contener una secuencia complementaria de DNA o deRNA. As, mediante la hibridacin in situ es posible demostrar las secuencias de cidosnucleicos correspondiente a determinados genes, adems de la expresin de determinadosgenes por la demostracin de la presencia de secuencias especficas de RNA mensajero (mR-NA).

D4. LAS COLORACIONES EMPLEADAS EN HISTOLOGA

Si no colorearan o tincionaran los tejidos, stos simplemente no se podran ver al microscopio,ya que apareceran todo blancos y algunos hasta trasparentes. Por ello, los investigadores hantenido que idearse muchas maneras de pintar los tejidos para poder apreciar sus caracters-ticas microscpicas.

Las tcnicas de coloracin que son muchas tambin han atravesado por varias etapas para

llegar a los perfeccionado mtodos modernos de tincin, con los que se cuentan en laactualidad; inicialmente se utilizaba un solo colorante, lo que daba al tejido, como es natural,una sola coloracin, con algunos pequeos cambios de matices y con partes sin coloracin, esdecir, como una foto en negro y blanco, o como una pantalla de televisin con los dos colores.Posteriormente se vio que se poda colorear los cortes, primero con un colorante y luego conotro, y as se obtena el mismo corte con varios colores, aproximndose al efecto de lafotografa a colores; de este modo, elementos morfolgicamente iguales podan verse condiferente coloracin segn su estructura histolgica y su composicin qumica (comoanalizamos en los prrafos siguientes). Estas tinciones combinadas generalmente usan dostipos de colorantes, uno de naturaleza cida y otra bsica, aprovechando el hecho de quegeneralmente el ncleo toma los colorantes bsicos y el citoplasma los colorantes cidos.

Por qu se observan de colores los cortes histolgicos en general? En las siguientes lneas tra-

taremos de explicar el porque unos tejidos se observan de color azul y otros de color rosado orojo.


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Cuando se examinan preparados frescos con el microscopio ordinario de luz, hay muy pococontraste entre los diversos componentes titulares. Por lo mismo, ha habido necesidad de re-currir a los llamados COLORANTES PARA TEIR LOS TEJIDOS, tcnica que empez aproxima-damente a mediados del siglo XIX. Al principio, sola utilizarse un solo colorante para teir elcorte, y por ello, con este colorante todos los elementos adoptaban el mismo color, pero comolos diferentes componentes los tomaban con diversas intensidades, podan distinguirse unosde otros, lo cual se basaba en la intensidad de su coloracin. Esta tcnica proporcionaba,

aproximadamente, el mismo tipo de contraste que se puede obtener con una televisin deblanco y negro.

Cuando se increment el desarrollo de la industria de los colorantes se dispuso de un nmeromayor de colorantes, tanto naturales como sintticos, y algunos de los colorantes ms nuevosresultaron ser mucho ms selectivos en su accin que los empleados hasta entonces. Se com-prob, por ejemplo, que poda utilizarse la tincin de un color para teir algunos componentestisulares (por ejemplo, en azul), y luego la pieza poda someterse a una segunda coloracin queimpregnara los materiales que no se haban teido con la primera tincin, dndoles otro color(por ejemplo, rojo). Las ventajas logradas fueron, aproximadamente, las que brinda latelevisin de color en comparacin con la de blanco y negro, permitiendo distinguir a los juga-dores de ftbol que llevan uniformes azules, de los que llevan uniformes rojos, aunque ambostengan ms o menos la misma forma.

Diversos perfeccionamientos de los mtodos de nocin, que no procede mencionar aqu, au-mentaron la selectividad, ayudando a los histlogos no slo a distinguir cada vez ms entida-des en los tejidos, sino tambin estimulando la investigacin productiva.

D4.1. PRINCIPIO BIOQUMICO DE LOS DISTINTOS TIPOS DE COLORANTES: la mayor parte de colorantesutilizados en histologa son sales solubles que se ionizan en el agua. Aunque son sales, se diceque son colorantes cidos o colorantes bsicos. Para distinguirlos, recordemos que en una sal,por ejemplo, el NaCl, el Na contiene carga positiva y se denomina catin o radical bsico, y Cltiene carga negativa y se llama anin o radical cido. En un colorante (que es una sal), si elradical que proporciona el color ocupa la posicin, digamos, del Na en el NaCl, el colorante sedenomina colorante bsico porque el radical que proporciona el color es el radical bsico (el

catin). Si el radical que proporciona el color ocupa la posicin que tiene el Cl en el NaCl sedice que el colorante es cido, porque el color lo lleva el radical cido o anin. La mayor partede cortes usuales que se emplean para la observacin directa con el microscopio, estnteidos con un colorante bsico y con un colorante cido, uno despus de otro. Actualmente,estos colorantes se conocen como cidos y bsicos o de acidofilia y basofilia.

Las tcnicas de tincin que tien especficamente componentes de las clulas y los tejidos sondenominadas tcnicas de tincin histoqumica. Estas tcnicas (entre las que est la tincin deSchiff), son de valor incalculable para comprender la estructura y la funcin de la clula y deltejido, y para hacer un diagnstico en tejidos enfermos.

Consideraremos las siguientes coloraciones: de hematoxilina y eosina, reaccin de Schiff, colo-racin tricrmica de Mallory, de azul de toluidina, de metacromasia, mtodo de Feulgen y colo-rantes de Sudn negro y osmio, tricrmico de Masson, azul alcin, Van Gieson, tincin de reti-culina, de Azn, de Giemsa, mtodos de plata y oro, de alumbre de cromo / hematoxilina, deazul de isamina / eosina y mtodos de Nissl y de azul de metileno.

D4.2. LOSCOLORANTESDEHEMATOXILINAYEOSINA: la combinacin ms empleada de colorantes es lade hematoxilina y eosina; es la tcnica ms frecuentemente usada en histologa animal y en larutina anatomopatolgica. Un corte teido con este mtodo se denomina un corte de H y E (osimplemente HE).

La hematoxilina es un producto natural; para que acte como colorante debe oxidarse hastaconstituir una substancia denominada hematena. Las reacciones fsicas y qumicas que nter-

vienen en la tincin por hematoxilina no se conocen muy bien, pero, en general, actan sobreun tejido bien fijado en forma muy similar a la de un colorante bsico, aunque algunos de susefectos colorantes no puedan explicarse en esta formas La hematoxilina proporciona color azulpurpreo a los constituyentes tisulares con los cuales se combina (Fig. D-12, arriba, izquier-da).


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Por lo tanto, los materiales teidos de color azul en un corte coloreado con hematoxilina sedice que son basfilos porque quieren o apetecen un colorante bsico (Fig. D-12), como sucedecon los ncleos, los ribosomas y el retculo endoplsmico rugoso, que tienen una gran afinidadpor este colorante debido a su alto contenido de ADN y ARN, respectivamente.

La eosina es un colorante sinttico que da color rosa o rojo a los constituyentes tisulares conlos cuales se combina. Es un colorante cido; en consecuencia, los constituyentes de los teji-

dos que se tien en color rosa o rojo con este producto se dice que son acidfilos o eosinfilos(Fig. D-12, arriba, izquierda), como ocurre con la mayora de las protenas citoplsmicas queson bsicas y por ello el citoplasma generalmente se tie de rosa o de rojo rosado.

De lo expresado en lneas anteriores, se deduce que la tincin de algn ingrediente tisular pongamos, por ejemplo, con un colorante bsico no depende de que el ingrediente del tejidoabsorba en forma difusa el colorante sino de que el ingrediente del tejido contenga en toda susustancia radicales con carga negativa que se combinen firmemente con los radicales del co-lorante que proporcionan color bsico, que tienen carga positiva. En forma similar, un coloran-te que acta por sus radicales colorantes cargados negativamente se combina con gruposcargados positivamente de los componentes tisulares.

En resumen, el colorante bsico, la hematoxilina, tie las estructuras cidas de azul purpreo;en contra posicin, la eosina es un colorante cido que tie las estructuras bsicas de rojo orosa. En general, cuando la tcnica de tincin de HE es aplicada a clulas animales, los ncleosse tien de azul y el citoplasma se tie de rosa o rojo.

D4.3. LAREACCINDE SCHIFF: ya que los hidratos de carbono, que son tan importantes, se tientan mal con los colorantes de HE, la tcnica ha obligado a utilizar otra tincin sistemtica, para

Fig. D-12. Arriba a la izquierda se observa una clula heptica, coloreada con HE, donde el ncleo muestra un borde colorazul, dependiente del DNA y sensible a la hematoxilina. El citoplasma se pinta de rosado, por la protena que se tie con laeosina. Los espacios vacos dependen del depsito de glucgeno. Arriba a la derecha se observa la misma clula tenida conla tcnica de PA-Schiff (que tie algunas macromolculas e hidratos de carbono de color carmes) y hemato-xilina. La

protena del citoplasma se tie de rojo. La imagen de abajo muestra a varias clulas epiteliales sinuadas sobre tejidoconectivo laxo, teidas con la tcnica de PA-Schiff y hematoxilina. Dos de las clulas que se ven son caliciformes y secretanmoco (que es una glucoprotena).


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Fig. D-13. Fotomicrografa de la cpsula de un rganocoloreado por el mtodo de Mallory. Se observa unatincin selectiva, puesto que las numerosas fibras co-lgenas del tejido conectivo, se colorean de azul in-tenso.


preparar cortes donde se hallen estos componentes. Un hidrato de carbono abundante es elglucgeno (que es un polmero, no es muy soluble en agua y por lo cual, no se disuelvefcilmente al preparar un corte teido), que no se tie ni por hematoxilina ni por eosina; por lotanto, es transparente, y los lugares donde existan las clulas aparecen en los cortes HEcomo zonas claras (Fig. D-12, arriba, izquierda). Pero estas zonas claras de las clulas difierende las zonas claras que quedan en ellas al disolverse la grasa cuando se prepara un corte,porque los espacios que antes estaban ocupados por la grasa son redondos, mientras que las

zonas claras del citoplasma que contienen o contenan glucgeno son irregulares ydesgarradas.

Para colorearlos se emplea una tcnica alternativa, denominada REACCIN DE SCHIFF DELCIDO PERYDICO, suele abreviarse con el nombre de PAS o, mejor, de tcnica de PA-Schiff. Latcnica PA-Schiff es un mtodo en dos tiempos basado en la aplicacin a la histologa de dosreacciones bien conocidas de los qumicos.

Durante la primera etapa, el cido perydico reacciona con los grupos glicol I, II (CHOHCHOH), que existen en cada uno de los residuos de la glucosa, constituyendo la cadena delglucgeno. Al tratar cortes que contienen glucgeno con cido perydico, ambos miembros decada grupo glicol proporcionan un grupo aldehdo (CHO), de manera que la cadena poli-sacrida de glucgeno se transforma en una cadena polialdehdica. La segunda etapa estriba

en tratar los cortes con un reactivo bien conocido de los aldehdos; se trata de un colorantedenominado fucsina bsica que puede palidecer intensamente con cido sulfuroso y entoncesrecibe el nombre de reactivo de Schiff. Los aldehdos se combinan con el colorante descoloradopara producir un complejo de color carmes o prpura (Fig. D-12, arriba, derecha), que seobserva fcilmente con el microscopio. En el caso del glucgeno se observa una reaccin decolor prpura brillante. En consecuencia, se dice que el glucgeno es una sustancia PA-Schiff-positiva.

La reaccin del PAS tie carbohidratos complejos de un color rojo oscuro, descritotradicionalmente como magenta. La mucina producida por las clulas caliciformes de losaparatos gastrointestinal y respiratorio se tie de magenta con esta tcnica (y es ademsdenominado PAS positivo). Las membranas basales y los bordes en cepillo de los tbulosrenales y del intestino delgado y grueso son tambin PAS positivos, como el cartlago y hasta

cierto punto el colgeno. El glucgeno, el almacn intracelular formado por carbohidratos quese localiza en clulas como hepatocitos y clulas musculares, tambin es PAS positivo.

D4.4. LACOLORACINTRICRMICADE MALLORY: esta coloracin utiliza varios colorantes, todos cidos,que tien distintas estructuras tisulares. Se desconoce el fundamento qumico de la unin en-tre los colorantes y los componentes tisulares, debido a que estos mtodos no son especficos(a diferencia de los selectivos que tien determinados componentes tisulares), desde el puntode vista histoqumico. Sin embargo, y como se muestra en la fig. D-13, se obtienen intere-santes observaciones de los tejidos.


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Fig. D-14. Fotomicrografa de un corte de trquea teido con hema-toxilina-eosina, que muestra un ejemplo de metacromasis. La ancha

zona, intensamente rojo vilcea de la mitad inferior, de la imagen escartlago hialino, cuya sustancia basal se tie por metacromasia.


D4.5. DEAZULDETOLUIDINA: sta es una tcnica bsica que tie componentes cidos en variosgrados de azul. Se emplea comnmente en muestras muy finas incluidas en resina. Algunoscomponentes tisulares son capaces de virar el colorante azul a rojo, un fenmeno conocidocomo metacromasia.

D4.6. LA METACROMASIA: cuando se tien ciertos componentes tisulares, como por ejemplo, la

matriz cartilaginosa, con el colorante azul de toluidina, se modifica el color azul a prpura orojo violceo por unin con el tejido. Esta variacin cromtica se denomina metacromasia (delgriego, meta, variacin y, kroma, color) y los colorantes capaces de sufrir esta transformacinse denominan colorantes metacromticos. Pertenecen a este tipo de agentes ciertos colorantesbsicos, de los cuales los ms importantes son los derivados tiaznicos azul de toluidina ytionina.

Una solucin diluida de un colorante tiaznico es azul, debido a que se encuentra comomonmero. Si la solucin es concentrada, el colorante se agrega y forma polmeros, por lo queel color vira al rojo. As, un colorante tiaznico puede presentar distinto color, de acuerdo con elestado de agregacin de las molculas y es precisamente este estado de agregacin, el quepuede ser modificado por los componentes tisulares, y el que produce la metacromasia. Si setie un corte con una solucin diluida de azul de toluidina, este colorante catinico formaenlaces electrostticos con los sitios aninicos y, por los componentes tisulares capaces de serteidos metacromticamente, se agregan las molculas del colorante (Fig. D-14). En con-

secuencia, el colorante vira a rojo.Los componentes tisulares que se colorean por metacromasia son, en su mayor parte, los muycidos glucosaminoglucanos sulfatados de la matriz cartilaginosa (Fig. D-14) y los mastocitosdel tejido conectivo, que contienen la sustancia polianinica heparina. Las nucleoprotenaspresentan metacromasia moderada.

D4.7. EL MTODO DE FEULGEN: es un mtodo especfico para la determinacin histoqumica deDNA, sobre la base del contenido de desoxirribosa en el DNA (por lo general, los materialespositivos para Feulgen se limitan a la cromatina nuclear). Se eliminan los grupos purnicos delDNA por medio de una hidrlisis cida suave. De esta manera se abre el anillo de ladesoxirribosa y se forma un grupo aldehdo, que reacciona con el reactivo de Schiff, con

aparicin del color rojo caracterstico en el sitio que corresponde al DNA (Fig. D-15). Comocontrol se utilizan cortes tratados con la enzima desoxirribonucleasa antes de la tincin deFeulgen.


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Fig. D-15. Fotomicrografa de un preparado del extremo de la raz dela cebolla, teida con el mtodo de Feulgen, especfico para DNA, yaque solo se tie de rojo, la cromatina del ncleo que con-tiene DNA.

Fig. D-16. Fotomicrografa de un corte congelado detejido adiposo, teido con rojo Sudn para los lpidosde los adipositos.


D4.8. COLORANTESDE SUDNNEGROYOSMIO: estos colorantes tien las estructuras que contienenlpidos, como la mielina, de un color negro-pardo.

Despus de la fijacin de los lpidos con formalina se cortan secciones congeladas, para evitarla extraccin de los lpidos mediante solventes orgnicos. Para la demostracin histoqumica seutilizan muy a menudo los denominados colorantes Sudn. Son casi insolubles en agua, por loque se utilizan disueltos en alcohol diluido, que no disuelve las grasas. La tincin se producecuando las molculas del colorante se distribuyen entre los lpidos y el solvente, en relacincorrespondiente o la solubilidad en los dos medios. Pare evitar la extraccin del colorante y delos lpidos, los cortes se incluyen, despus de la tincin, en un medio acuoso. De este modo, loscolorantes Sudn tien con intensidad los triacilgliceroles, como por ejemplo, en la tincin de

los adipocitos con rojo Sudn (Fig. D-16). El negro Sudn tiene gran utilidad en la tincin de lasvainas de mielina de las fibras nerviosas, compuestas por lipoprotenas.

D4.9. TRICRMICO DE MASSON: esta tcnica se llama de tejido conectivo porque se usa parademostrar elementos del tejido de soporte, principalmente colgeno. Como su nombre implica,la tcnica de tincin produce tres colores: ncleos y otras estructuras basfilas se tien de


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azul, el colgeno se tie de verde o azul, dependiendo de qu variante de la tcnica se utiliza,y el citoplasma, el msculo, los eritrocitos y la queratina se tien de rojo brillante.

D4.10. AZULALCIN: el azul alcin es una tincin de mucinas que puede ser usada en unin conotros mtodos de tincin como la HE o el van Gieson (ver a continuacin). Ciertos tipos de

mucinas, pero no todos, se tien de azul con el mtodo del azul alcin, como el cartlago.Cuando la tcnica es combinada con el van Gieson, el color del azul alcin se hace verde.

D4.11. VAN GIESON: ste es otro mtodo de tejido conectivo, en el cual el colgeno se tie derojo, los ncleos son azules y los eritrocitos y los citoplasmas amarillos. Cuando se usa encombinacin con una tincin elstica, la elastina se tie de negro / azul adems de losresultados descritos arriba. Esta tcnica de tincin es particularmente til para vasossanguneos y piel.

D4.12. TINCINDERETICULINA: este mtodo demuestra las fibras de reticulina del tejido de sostn,que se tien de negro I azul con esta tcnica. Los ncleos pueden ser contrastados en azul conhematoxilina o en rojo con el colorante rojo neutro.

D4.13. DE AZN: esta tcnica es considerada tradicionalmente un mtodo de tejido conectivo,pero es excelente para demostrar detalles citolgicos finos, especialmente en epitelio. Losncleos se tien de rojo brillante; colgeno, membrana basal y mucinas se tien de azul;msculo y hemates se tien de naranja a rojo.

D4.14. DE GIEMSA: esta tcnica es un mtodo estndar para tincin de clulas sanguneas yotras extensiones de clulas, por ejemplo, mdula sea. Los ncleos se tien de azul oscuro a

violeta, el citoplasma de fondo de azul plido y los eritrocitos de rosa plido.

D4.15. MTODOSDEPLATAYORO: estos mtodos fueron muy populares al final del siglo XIX y hoyson utilizados ocasionalmente para demostrar estructuras finas, como prolongacionescelulares, por ejemplo, en neuronas, placas motoras y uniones intercelulares. Dependiendo delmtodo usado, el producto final es negro, marrn o dorado.

D4.16. ALUMBREDECROMO / HEMATOXILINA: este mtodo se usa raramente y es, en principio, similaral mtodo de HE, en el cual los ncleos son teidos de azul y los cito plasmas de rojo.Empricamente este mtodo tie las clulas secretoras de glucagn del pncreas en rosa y lasclulas secretoras de insulina en azul.

D4.17. AZUL DE ISAMINA / EOSINA: este mtodo es tambin similar al mtodo de HE pero elcomponente azul es bastante ms intenso.

D4.18. MTODOSDE NISSLYDEAZULDEMETILENO: estas tcnicas usan un colorante bsico para teirel retculo endoplsmico rugoso que se encuentra en neuronas; cuando ste se ve en grumoses llamado sustancia de Nissl.

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Técnicas histológicas y coloraciones