Técnicas moleculares aplicadas en Bioquímica Clínica-2013

Dra. María Gabriela Lacoste

Alelle-specific oligonucleotide (ASO)-PCR

PCR con Sondas Alelo Específicas

El análisis de mutaciones puntuales utilizandola hibridación de sondas ASO se basa en elprincipio de que la presencia de UN SOLOERROR DE APAREAMIENTO entre unnucleótido de la sonda y el ADN blanco essuficiente para desestabilizar el híbrido.

Una de las primeras técnicas utilizadas parael análisis de mutaciones puntualesCONOCIDAS sobre fragmentos amplificadosde ADN.

SONDAS

Oligonucleótidos cortos (15-17 nucleótidos).

30-50% contenido G/C.

El nucleótido discriminante en el medio de la sonda.

Los errores de apareamiento A:A, T:T, C:T y C:A tienen unefecto más desestabilizante.

Evitar secuencias que contengan polimorfismos cercanos a lamutación ya que pueden desestabilizar el híbrido.

Marcación radioactiva o no radioactiva

interna o externa

Marcación Interna

Desplazamiento de mella (nick translation)

Random primers

Marcación Externa

Polinucleótido quinasa (marcación en extremo 5’, utiliza γ[32P]-ATP)

Transferasa terminal (marcación en extremo 3’,

utiliza α [32P]-ATP)

Marcaciones Radioactiva y No Radioactivas

PCR-ASO

1. Amplificación por PCR del fragmento de interés.

PCR-ASO

2. Dot Blot: transferencia de los productos amplificados a unamembrana.

El producto de PCRse desnaturaliza(NaOH 2N y 95 °C).Se añade a lospocillos donde elvacío impulsa elpasaje de la solucióna través de lamembrana (nylon onitrocelulosa).

La membrana seseca entre filtrosdurante una hora a80° C en estufa (opor cross – linker).

PCR-ASO

3. Hibridación de las sondas ASO marcadas, específicas ycomplementarias para la secuencia de interés.

Pre-hibridación: solución de SDS y ADNde esperma de salmón desnaturalizado.Bloquea la membrana para evitarreacciones inespecíficas (2h a 37°C).

Hibridación: sonda normal y mutada (8ha 37°C).

PCR-ASO

4. Revelado: dependiente de la marcación utilizada.

Interpretación e informe:

Individuo 1: +/- : Heterocigota para la mutación.Individuo 2:-/- : No presenta la mutación.Individuo 3:+/+: Homocigota para la mutación.Individuo 4:+/- : Heterocigota para la mutación.Individuo 5:-/- : No presenta la mutación.Individuo 6:+/+: Homocigota para la mutación.Individuo 7:-/- : No presenta la mutación.Individuo 8:+/+: Homocigota para la mutación.

5. Interpretación e informe.

PCR-ASO

Anemia Falciforme

PCR-ASO

Β-Talasemia

1 2 3 4 5 6 7 8

7: control negativo de la PCR

8: control negativo de hibridación (gen de tiroglobulina)

1: portador de la mutación 1 –1

2: portador de la mutación 1 –1

3: portador de la mutación 1 - 110

4: portador de la mutación 39

5: portador de la mutación 39

6: normal

PCR-ASO es muy útil cuando un gran número de muestras esexaminado para un pequeño número de alelos mutantes.

PCR-ASO necesita de sondas marcadas diferentes para cada alelo ycondiciones de hibridación diferentes para cada sonda.

¿¿Y si necesito analizar múltiples mutaciones???

PCR-ASO-REVERSA

PCR-ASO-REVERSA

1. Inmoviliza la sonda ASO en la membrana (linkers en el extremo 5´).

2. Se hibrida el producto amplificado y marcado por PCR.

Screening de genes con numerosos alelos mutantes : α-talasemia,β-talasemia y fibrosis cística.

VENTAJAS

La PCR-ASO, en especial el su formato reverso, es una técnicasimple para el genotipaje simultáneo de un gran número demutaciones y polimorfismos.

No requiere instrumentos especializados para su realización.

Puede ser aplicado a casi cualquier variación de secuenciaCONOCIDA.

LIMITACIONES

El diseño de sondas que funcionen bajo las mismas condiciones deastringencia e hibridación puede ser engorroso.

La metodología se basa en la posibilidad de introducir mutacionespuntuales durante la reacción de PCR.

Los cambios de secuencia se eligen de modo que generen sitios dereconocimiento para enzimas de restricción sólo en un aleloespecífico.

La técnica fue introducida por Haliassos et al (1989) en Franciapara la rápida detección de mutaciones en el oncogen ras y fueaplicada al diagnóstico de fibrosis cística por Friedman et al (1991).

Uno de los problemas que presenta es la posibilidad de falsosnegativos cuando la enzima, por diferentes razones, no corta(controles).

MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR

MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR

Mutación ΔF508 en el gen del CFTR

Utiliza un cebador 5’ con un cambio puntual en una base que limitacon la mutación ∆F508.

Este cambio introduce un sitio para la enzima Mbol (5’GATC3’) en elalelo sano, pero no aparece en el alelo con la deleción ∆F508 por nocompletarse la secuencia de corte.

Para el extremo 3’ se buscó un cebador que permitiera abarcar en elproducto de amplificación un sitio de corte constitutivo para quesirviera como control interno de la actividad de la enzima derestricción.

MboI

MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR

Sin MboI Con MboI

Normal: 262 pb

Mutado: 259 pb

Normal: 17 pb, 201 pb y 44 pb

Mutado: 215 pb y 44 pb

MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR

Sin corte con la enzima de restricción

Normal: 262 pb Mutado: 259 pb

El tamaño del gel y las condiciones de corrida no son suficientes para detectar estapequeña diferencia.

Heterodúplex: formados por la hibridación de una hebra sana y una mutada durante la PCR.

La falta de una adecuada complementariedad de bases debido a la deleción hace que losheterodúplex migren con dificultad en los geles.

MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR

Con corte con la enzima de restricción

Los heterodúplex no presentan sitio de corte para Mbol en la hebra con la delección, por lotanto no son cortados y migran por encima del homodúplex

Normal: 17 pb, 201 pb y 44 pb Mutado: 215 pb y 44 pb

Multiplex Allele Specific-PCR

PCR Multiplex Alelo Específica

Es la amplificación, en un único tubo, de múltiples fragmentos deuna determinada secuencia.

Elección correcta de pares de primers que deberán dar lugar afragmentos de diferente tamaño, que deberán ser fácilmenteresueltos en una única línea de corrida de un gel.

Los primers usados son alelo-específicos.

Distrofia muscular de Duchenne, Lesch-Nyhan, β-talasemia yfibrosis cística

MAS-PCR

Detección de ΔF508 y G542X

MAS-PCR

2 REACCIONESMaster Mix NORMAL

Primers:Forward: CF-W1468-NReverse: CF-508 RP

Forward:5´IVS-11Reverse:G542X-N

Master Mix MUTADA

Primers:Forward: Δ508Reverse: CF-508 RP

Forward:5´IVS-11Reverse:G542X-M

20 µl Master Mix

5 µl ADN

MAS-PCR

WT (139 pb), ΔF508 (136 pb) y G542X (174 pb)

MAS-PCR

Análisis del gen de la distrofina por PCR multiplex, detección dedeleciones. Los números superiores corresponden a cada pacientes. Losnúmeros de la derecha corresponden a los exones amplificados. N: Controlnormal con todos los exones. Paciente 2 presenta deleciones en los exones50 y 52. Paciente 1 presenta deleciones en los exones 50, 47 y 52.Paciente 10 presenta deleción en el promotor Pm. Paciente 7 presentadeleción en el exón 52. Paciente 4 presenta deleción en los exones 3 y 6.Paciente 5 presenta deleción en los exones 43, 13 y 47.

Amplification Refractory Mutation System-PCR

Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR

Detección de mutaciones puntuales.

Fundamento: la amplificación del ADN será ineficiente o completamenterefractaria si hay un error de apareamiento (mismatch) entre el nucleótidodel extremo terminal 3´ del cebador y su correspondiente nucleótido enADN molde.

ARMS-PCR

Se requiere un apareamiento de bases complementario en el extremo 3´del cebador para que la Taq ADN polimerasa pueda amplificareficientemente el fragmento de ADN deseado, permitiendo mayorespecificidad y discriminación por parte de la enzima.

El alelo deseado es amplificado fácilmente mientras que el otro no esamplificado o lo es escasamente.

ARMS-PCR

Para incrementar la especificidad se introduce en ellos un cambio de unabase adicional en el segundo al cuarto (2º-4º) nucleótido del extremo 3’, deeste modo se asegura que cada cebador permita únicamente la amplificacióndel alelo para el que su nucleótido 3’ terminal es complementario.

2 REACCIONESMaster Mix 1

Cebador alelo específico NCebador común

Master Mix 2

ARMS-PCR

Cebador alelo específico MCebador común

Puede utilizarse también un par de primers control, que amplifican unsegmento de ADN diferente, no relacionado a la mutación buscada y que nointerfiera con la amplificación del segmento de interés.

control

ARMS-PCR

ARMS-PCR

Genotipificación de ApoE

Cebadores Alelo Específicos

Cebador común

Cebador control interno

Cebadores Alelo Específicos

Cebador común

Cebador control interno

2 REACCIONES

ARMS-PCR

Genotipificación de ApoE

E2: Cys112 y Cys158E3: Cys112 y Arg 158E4: Arg112 y Arg 158

VENTAJAS:

Relativamente sencillo, rápido y confiable.

No requiere equipo especial (sólo termociclador).

Distingue entre heterocigotos y homocigotos.

No requiere digestión ni secuenciación.

Análisis mediante electroforesis en geles de agarosa opoliacrilamida.

ARMS-PCR

Condiciones para PCR Múltiples (MAS y ARMS)

Paso a Paso:

1. Seleccionar la secuencia de interés2. Seleccionar y diseñar los cebadores

-Fragmentos de diferente tamaño

-Cebadores con características similares (contenido GC, tamaño,T°annealing).

3. Desarrollar la PCR con cada fragmento por separado

-Concentraciones equimolares de los cebadores.

4. Adicionar los cebadores secuencialmente

Ajustar las concentraciones de los cebadores (0,04-0,6 µM).

-El amplicón más corto suele amplificarse preferencialmente.

-Si la intensidad del amplicón es débil, aumentar el primer y si es muyfuerte, disminuirlo.

-Concentraciones muy bajas disminuyen el rendimiento y muy altas,aumentan la inespecificidad.

Condiciones para PCR Múltiples (MAS y ARMS)

Paso a Paso:

6. Ajustar los componentes de la reacción

-Mg2+ (1-2 mM) concentraciones bajas disminuyen el rendimiento yconcentraciones altas aumentan la especificidad y los errores deincorporación.

-dNTPs (200-400 µM) concentraciones más bajas aumentan la fidelidad yla especificidad, pero disminuye el rendimiento.

-Taq

-Cantidad de ADN molde: mucho ADN causa productos inespecíficos oinhibición de la PCR y poco ADN, bajo rendimiento.

6. Ajustar los componentes de la reacción

-Tiempos: extensión se puede aumentar para completar la síntesis detodos los fragmentos.

annealing se puede acortar para aumentar la especificidad.

-Temperatura annealing: temperaturas altas son más específicas peropueden disminuir el rendimiento

temperaturas bajas producen productosinespecíficos por apareamiento inespecífico de los cebadores.

-Ciclos: 28-30

-Aditivos: DMSO, Tritón X-100 (disminuye inespecíficos)

Condiciones para PCR Múltiples (MAS y ARMS)

CONDICIONES PARA MEJORAR LA ESPECIFICIDAD

Mg2+

[dNTPs]

Tiempo de los ciclos

Número de ciclos

[primer]

T° annealing

DISMINUIR AUMENTAR