Tecniche ottiche innovative: applicazioni in medicina

• Microscopia ottica di (auto)fluorescenza

• Microscopia confocale

• Optical tweezers (pinzette ottiche)

campione

00 IRRTTII SpSSfA

Microscopia di (auto)fluorescenza

• cos’è l’autofluorescenza• microscopia ad autofluorescenza• sorgente di eccitazione• il campione• ottiche di raccolta• immagini in autofluorescenza• spettro di autofluorescenza• vantaggi e svantaggi della tecnica

cos’è l’autofluorescenza

• Le cellule ed i tessuti biologici contengono molecole che, se eccitate con radiazione di opportuna lunghezza d’onda, sono fluorogeniche

• L’autofluorescenza è l’emissione di fluorescenza spontanea, dovuta a fluorofori endogeni in cellule e tessuti.

• L’ autofluorescenza è così denominata per essere distinta dalla fluorescenza ottenibile con marcatori fluorescenti esogeni (fluorescenza indotta o secondaria).

La tecnica

• sorgente per l’eccitazione

• ottiche di focalizzazione• cella con il campione• ottiche di raccolta• rivelatore• analisi dei dati

(Nikon Italia)

Schema di principioSchema di principio

sorgente

Filtro di eccitazione: seleziona la banda di eccitazione

I filtro

campione

rivelatore

II filtro

Filtro di raccolta: seleziona la banda di emissione e blocca la luce di eccitazione non assorbita dal campione

(misura in trasmissione)

Problemi della tecnica in trasmissione:

- assorbimento della luce di eccitazione da parte del campione

- assorbimento dell’emissione da parte del campione

- diffusione della luce di eccitazione e di emissione da parte del campione

- non si ottimizza la raccolta dell’emissione, a meno di non avere un condensatore di qualità pari all’obiettivo

- scarsa praticità (non adatta a microscopi invertiti)

tecnica in riflessione

- l’emissione non attraversa il campione- l’obiettivo agisce sia da ottica di focalizzazione che di raccolta- maggior praticità (microscopi invertiti)

sorgente

campione

filtro per l’eccitazione

filtro per l’emissione

specchio dicroico

obiettivo

rivelatore

dalla sorgente per l’eccitaz.

al rivelatore

excFLUOR

sorgente per l’eccitazione

• deve avere una buona emissione nella zona UV-blu dello spettro (300400nm)

• deve avere un’alta brillanza, costante nel tempo

• in genere si utilizza una lampada ad arco corto a vapori di mercurio

• in alternativa: lampada a vapori di Xenon; Xe-Hg; luce laser*

il campione

• cellule in condizioni vitali• fettine sottili di tessuto• (cellule fissate)

ATTENZIONE A:

presenza di sostanze fluorescenti nel terreno di coltura => lavare le cellule ! cellule morte: rilasciano fluorofori (endogeni) nel mezzo => aumenta il fondo ! usare vetrini (ed ottiche) non fluorescenti

• spessore della cella di misura: paragonabile alle dimensioni di una cellula

• segnale: può provenire in parte dal tampone

ob.

porta oggetti

copri oggetti

c1c2

c1,c2: cellule adese sul fondo

emissionedi autofluorescenza

INFO:metabolichefunzionali

INFO:strutturalimorfologiche

spettro della luce emessa immagine della luce emessa

acquisizione sia dello spettro che dell’immagine di autofluorescenza

spettrometro

CCD per imaging di autofluorescenzaavrò bisogno di:

MIAM (Multispectral Intensity Autofluorescence

Microscopy)

SPECTRUM

ANALYSER

COOLED CCD

CAMERA

un possibile setup sperimentale

immagini

• come si acquisiscono

• cenni ai sensori CCD

• come accoppiare obiettivo e telecamera

• risoluzione spaziale

• CCD: array di elementi fotosensibili , lineari o bidimensionali (es.: 512x512; 1024x1024, dimensione elemento tipica 10 m x 10 m)• I fotoni incidenti sulle zone sensibili generano elettroni (fotoelettroni) che vengono accumulati in regioni dette pixel• I fotoelettroni vengono intrappolati nei pixels da un campo elettrico locale• La presenza di elettrodi permette di spostare i fotoelettroni sul CCD• l’intensità del pixel è proporzionale al numero di fotoelettroni prodotti, ovvero all’energia rilasciata dalla luce incidente

Charge Coupled Device (CCD)

Immagine in bianco e nero.Il livello di grigio di ogni punto è proporzionale all’intensità luminosa che arriva.emissione di

autofluorescenza

CCDB/N

in alternativa:

CCDcolori

immagine a colori

Soluzione meno adatta. Spesso non ha la sensibilità e risoluzione spaziale di una CCD B/N.

Immagine B/N.Intensità dei punti proporzionale all’intensità di luce ROSSA incidente

F1

Immagine B/N.Intensità dei punti proporzionale all’intensità di luce VERDE incidente

F2

Immagine B/N.Intensità dei punti proporzionale all’intensità di luce BLU incidente

F3

+

+

immagine RGB finale(ad ogni immagine sostituisco i livelli di grigio

con livelli di Rosso, Verde, Blu rispett.)

=

CCD

CCD

CCD

filtro passa banda

emissione di autofluorescenza

revolver con i 3 filtri

BLU VERDE ROSSO

3 acquisizioni distinte, in successione temporale

immagine finale

• ricombinazione di immagine(es.: 3 layer con Photoshop® )• problemi derivanti dal movimento del campione e dal bleaching

come accoppiare la CCD all’obiettivo

Il flusso di eccitazione focalizzato sul campione è proporzionale a (NAobj)2

L’intensità di fluorescenza emessa è proporzionale al

flusso di eccitazione

(se questo non è così elevato da produrre quenching)

EPI-FLUORESCENZA(epi- : “raccolgo dalla stessa parte da cui eccito”)

La frazione di autofluorescenza emessa che viene recuperata dall’obiettivo è

proporzionale a (NAobj)2

Se l’ingrandimento totale sul rivelatore (fotocamera) è M, verrà proiettata un’immagine di

una superficie M2 volte più grande,

Ovvero

L’intensità che arriva su ogni pixel (I)

è proporzionale a 1/ M2

RIASSUMENDO

I (NAobj)4 / M2

RISOLUZIONE SPAZIALE

Criterio di Raileigh

E’ la minima interdistanza r tra 2 punti sorgente visti

come distinti:

r(m) = 0.61 / NAobj

= 550nm, NA =1.4 r = 0.24 m

La risoluzione cresce proporzionalmente a NA

r “piccolo” => grande risoluzione

Per ottimizzare la risoluzione del sistema microscopio-CCD

La larghezza W del pixel deve essere tale che

W (rM)/2 = 0.61 M / 2NAobj

W

r M

Ovvero

M 2W/r = 2 W NAobj / (0.61)

ESEMPIO

Pixel 9x9 m ; = 550nm; NA =1.4

M 2W/r = 2 W NAobj / (0.61)

M 18/r = 18/0.24 = 75 x

Volendo incrementare la risoluzione dobbiamo far sì che la distanza tra 2 punti sia almeno di 3 pixel e quindi aumentare M

M 3W/r =27/0.24 =113x

(Tra 75x e 113x la risoluzione non cambia….)

M non dipende solo dall’obiettivo. Per es. nei microscopi Nikon c’è un’ulteriore ingrandimento 2x o 1.5x sulla porta della

fotocamera

Ricordando che

I (NAobj)4 / M2

è necessario un compromesso tra intensità del segnale e risoluzione (ingrandimento)

Fissata NAobj, I alta => M “basso” => fissata la dimensione dei pixel, con M basso posso non arrivare a sfruttare la risoluzione dell’obiettivo

M “alto” => I bassa: fissata NAobj, con M alto posso avere un’intensità troppo bassa => basso rapporto segnale-rumore

risoluzione spaziale del sistema CCD - obiettivo

• Ci si dovrebbe sempre riferire alla risoluzione spaziale dell’intero sistema CCD - obiettivo

• Viene a volte definita per la sola CCD, come numero di pixel totali o come dimensioni dell’elemento sensibile: non e’ una vera risoluzione!

• dipende dalla risoluzione spaziale dell’obiettivo e dalle caratteristiche della camera• la camera deve essere commisurata all’obiettivo in uso: e’ inutile usare una camera da 5Mpixel con un obiettivo a bassa apertura numerica (es.: N.A.=0.4). Otterro’ la stessa risoluzione spaziale complessiva usando per es. una camera da 2Mpixel!

Risposta spettrale • Indica la sensibilita’ alla luce di una data . Il

dato viene presentato come efficienza quantica (Quantum Efficiency) o come risposta (Responsivity o Sensitivity) in funzione di .

• Serve a scegliere la camera capace di rispondere alla banda spettrale della radiazione considerata.

• Tutti i CCD al silicio hanno una risposta soddisfacente nel visibile e fino a 1000nm circa.

Esempio

• sensore 512x512 pixel o superiore con pochi difetti costruttivi• dimensione del pixel: 5-10 m• raffreddata (fino a -30 oC)• tempo di integrazione di immagine: da 1ms a >30s; tempi tipici: 1-4s• tempo di svuotamento del sensore (lettura immagine): 2-4s

In pratica: se non si vogliono vedere fenomeni veloci (t<<1s) è indicata una CCD più sensibile ma più lenta.

Gli elementi ottici del microscopio (flitri dicroici, lenti, filtri

interferenziali etc. ) riducono la luce

Efficienza di raccolta max 10%

Efficienza media delle camere CCD

(front illuminated ) circa 40%

nel blu circa 20 %

(back illuminated) circa 70%

nel blu circa 40 %

EFFICIENZA TOTALE 4%

Rumore nelle CCD

• Rumore quantistico: Photon noise (shot noise). Dovuto alla variazione statistica del numero di fotoni incidenti e portatori di carica prodotti (N). SNR = N/√N = √N migliora al crescere di N. Es.: 0.1105 fotoni/(spixel)

• Rumore termico: dark noise (dark current). Dovuto alla generazione di portatori di carica termici. Cresce con la temperatura T. Es.: 0.01 50 elettroni/(spixel)

• Rumore elettronico: read noise. E’ relativo ai processi di conversione della carica prodotta in segnale digitale. Non dipende dal tempo di esposizione. Dipende poco da T; piu’ importante a bassi livelli di segnale. Es.: 0.1 20 elettroni rms/pixel

Rumore: lo scarto quadratico medio della variazione del segnale catturato da un pixel

2d

2s

2rtot RRRR Rumore totale sul segnale:

Segnale massimo (saturazione)Rumore

Dinamica =

Dinamica usualmente espressa in bit di risoluzione: es. dinamica di 16 bit livelli65.5362

Rumore

eSaturazion 16

binning

• E’ l’accorpamento di piu’ pixel in un unico pixel risultante. Es.: 600x1000 pixels =>200x125 pixels con binning 3x8

accresce il rapporto S/N, la sensibilita’, la velocita’ di acquisizione

diminuisce la risoluzione spaziale; accresce la corrente di buio

Usato spesso in modalita’ di preview, o per avere immagini sufficientemente intense con alto frame rate

(« il segnale che perdo andando veloce, lo recupero con il binning, perdendo pero’ in risoluzione spaziale »)

per diminuire il rumore

• Rumore quantistico: si accresce il numerodi fotoelettroni prodotti (se si puo’…)

(i) eccitazione piu’ intensa (ii) tempi di integrazione maggiori (iii) binning (iv) CCD con efficienza quantica piu’ alta

• Dark noise: si raffredda il sensore CCD (tipicamente T=-5-20 oC, fino a T di N2 liquido)

• Read noise: filtri elettronici. Sensore con elettronica migliore.

rapporto segnale-rumore: ~ 2

segnale: media dei valori dei pixel della cellula

rumore: media dei valori dei pixel del fondo

1. Aumentare il tempo di integrazione. Aumentare l’intensità di eccitazione. (pero’: rischio di bleaching e danno cellulare !)

2. Raffreddare maggiormente la CCD3. Verificare la corretta centratura dell’illuminazione UV4. Lavare ulteriormente le cellule (con tampone non fluorescente)

spettro di autofluorescenza

• cos’è

• come si acquisisce

• un esempio

l’emissione di autofluorescenza raccolta dall’obiettivo viene inviata ad uno spettrometro (es. attraverso una fibra ottica)

lo spettrometro la separa nei vari colori; il fascio così suddiviso incide su una telecamera CCD, di larghezza pari alle dimensioni trasversali del fascio.

l’intensità luminosa, per ogni lunghezza d’onda, viene così trasformata in segnale (livello di grigio del pixel corrispondente)

immagine di un fascio con spettro fatto di righe(illuminazione “al neon” del laboratorio)

alloggiamento per la fibra ottica

mazzo di fibre(bandolo)

raccordo fibra-microscopio

CCD per l’acquisizionedello spettro

policromatore(spettrometro) arrivo della fibra e

fenditura di ingresso al policromatore

dimensione maggiore della CCD: asse della lunghezza d’onda

dimensionetrasversaledel fasciosulla CCD(=dimensione maggiore dellafenditura)

spettro = istogramma dei conteggi della CCD N.conteggi() intensità luminosa ()

80

100

120

140

160

180

200

220

240

350 400 450 500 550 600 650 700 750

nu

mer

o d

i co

nte

gg

i

F correzione per le ottiche

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

350 400 450 500 550 600 650 700 750

lunghezza d'onda (nm)

un

ità

arb

itra

rie

spettro “grezzo”

0

50

100

150

200

350 400 450 500 550 600 650 700 750

lunghezza d'onda (nm)

inte

nsi

tà (

u.a

.)

0

50

100

150

200

250

300

350 400 450 500 550 600 650 700 750

lunghezza d'onda (nm)

inte

nsi

tà (

u.a

.)

spettro corretto

vantaggi su altre tecniche

• non richiede particolare preparazione del campione

• scarsamente invasiva (assenza di fluorofori esogeni)

• campioni in condizioni vitali

• intensità di eccitazione contenuta

• MIAM: info sia morfologiche che funzionali

svantaggi

• il segnale è basso => CCD sensibili, a basso rumore

• uso di ottiche con bassissima emissione di fluorescenza

• non tutti i compartimenti cellulari sono autofluorescenti (es. nucleo)

• minor selettività rispetto alla fluorescenza per lo studio di specifiche strutture cellulari

• la massima utilità e’ su campioni vivi (ex-vivo)

conclusioni

• emissione di autofluorescenza• misura del segnale di autofluorescenza:

- sorgente di eccitazione- campione ed emissione- raccolta di luce

• analisi dell’emissione:- immagini- spettro

MICROSCOPIA CONFOCALE

1) microscopia ottica convenzionale

non solo il piano di fuoco dell'obbiettivo, ma anche gran parte dello spessore dell'oggetto biologico sono uniformemente e simultaneamente illuminati => le aree sopra e sotto il piano focale di interesse rendono meno distinguibili le strutture cellulari.

…cominciamo con un confronto:

campione

00 IRRTTII SpSSfA

2) microscopia confocale

- la luce emessa da regioni fuori del piano di fuoco dell'obbiettivo viene eliminata

- l'illuminazione non e' simultanea, ma sequenziale, concentrata come un punto su un singolo elemento del volume del campione alla volta

- per formare l'immagine, il raggio luminoso di illuminazione esplora il campione secondo uno schema raster -sorgente laser: monocromatica, molto sottile e poco penetrante

la luce riflessa o la fluorescenza emessa vengono rilevate da un tubo fotomoltiplicatore e convertite in segnale digitale (=> monitor)

- principio di Minsky: i sistemi di illuminazione e di rivelazione sono focalizzati sul medesimo elemento del volume dell'oggetto biologico, ovvero sono confocali

- un filtro spaziale (pinhole), messo davanti al rivelatore, elimina la luce emessa dalle regioni fuori del piano di fuoco dell'obbiettivo => immagine piu’ dettagliata, perche' vengono eliminate le informazioni fuori fuoco.

Credit:Luca Verderame (liceo ISSEL, Finale Ligure)Giacomo Carrabino (liceo A. Pacinotti, La Spezia)Gabriele Marino (liceo Grassi, Savona)

vantaggi

svantaggi

• Maggiore risoluzione spaziale• Maggior contrasto• miglior sezionamento ottico => migliore qualità ricostruzioni 3D• campioni “sezionabili” in vari piani spaziali, non solo x-y• disponibilità di ottime soluzioni commerciali ma anche “fai da te”

• peggiore risoluzione temporale*• maggiore invasività (in alcuni casi)• maggior costo

* vedi pero’ sistemi a molti punti

pinzette ottiche (optical tweezers)

“Tecnica che utilizza luce fortemente focalizzata per esercitare forze di intrappolamento stabile su oggetti microscopici, in genere presenti all’interno di una soluzione acquosa”

• luce laser ( t.c. bassissimo assorbimento da parte del mezzo e dell’oggetto)

• obiettivi ad alta apertura numerica

• campione tale che nmezzo<noggetto intrappolato

• “oggetto”: 10nm-10µm (es.: batterio, cellula eucariota, sferetta di lattice)

“in sostanza, l’oggetto è intrappolato perché si crea, in 3D, una buca di potenziale stabile, le cui caratteristiche dipendono dalla sorgente, dalla

focalizzazione, dalle caratteristiche fisiche del mezzo e dell’oggetto”

Schema di principio

Intrappolamento di una sfera dielettrica: regime di ottica geometrica. Cessione di momento dall’onda all’oggetto.

dt

dqF s

“perché funziona”

regime di ottica geometrica

regime di ottica fisica

Intrappolamento: piano orizzontale.W0: semi-larghezza del fascio laser

Intrappolamento verticale

2EFg

regime di ottica fisica

si distinguono 2 tipi di forze: Fg=forza di gradienteFs=forza di scattering

1. La forza del tweezer aumenta proporzionalmente alla potenza del fascio laser

2. per ottenere trappole forti è necessario usare fasci con grandi angoli di convergenza (fino a 70gradi), altrimenti assialmente la forza di scattering domina su quella di gradiente

3. per ottenere grandi angoli di convergenza è necessario usare un obbiettivo ad alta apertura numerica (fino a 1.4) e presentare in ingresso a questo un fascio di dimensioni maggiori o uguali al suo diaframma di ingresso

4. il tweezer è più forte radialmente che assialmente5. la stabilità del tweezer può essere quantificata dal rapporto tra la

profondità U della buca e kBT. Si può definire stabile una trappola in cui è maggiore di un valore di soglia (per es. 50 o 100) oltre il quale gli effetti di moto termico possono essere considerati trascurabili e la particella pensata come “ferma”

6. se l’indice di rifrazione della particella è inferiore a quello del mezzo in cui è immersa (es. una bolla d’aria in acqua), il tweezer non è stabile poiché la forza di gradiente cambia verso. L’effetto è repulsivo.

Esempio di setup per una pinzetta ottica accoppiata ad un microscopio

pinzette multiple

• è possibile commutare la posizione di focalizzazione del laser fra 2 o piu’ punti del campione

• dovro’ usare per es. un Modulatore Acusto-Ottico

• frequenza di commutazione: es: 1KHz (mi devo confrontare con il moto diffusivo dell’oggetto)

• ultima frontiera: pinzette multiple (N>1000) sfruttando effetti diffrattivi di speciali “chip”

applicazioni

• “chromosome surgery” / genetica• studi su mitosi e motilità cellulare• studi sulla membrana cellulare / fusione cellulare• fertilizzazione in vitro• “scalpello laser”• principi del funzionamento muscolare• protein folding• biofisica di singola molecola / cellulare

• applicabile ex vivo, in vitro• permette di manipolare la

singola cellula / batterio / molecola

• utilizzabile insieme a numerose altre tecniche di microscopia

• campione immerso in un mezzo liquido (es.: soluzione tampone)

• scarsa preparazione del campione

• possibilità di misure di forza / lunghezza (=> parametri elastici) di tipo “puntuale”

• bassi costi (se “basta che funzioni”)

• non applicabile in vivo• non applicabile “a secco”• difficilmente applicabile ad un

sistema con N »1 elementi (pur se microscopico)

• difficilmente applicabile ad oggetti di dimensioni » 10-50 µm

• alti costi (se si vogliono grandi forze, basso rumore, alta risoluzione spazio-temporale)

• ancora non (sufficientemente) disponibile come “kit all included” in commercio

• non facilmente trasportabile da un luogo all’altro

PRO CONTRO