TEG Eduardo Ch

7/21/2019 TEG Eduardo Ch

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UNIVERSIDAD DE LOS ANDESFACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DE MICROORGANISMO“SIXTO DAVID ROJO”

Caracterización taxonómica y fisiológica de cepas de “setas”

(género Pleu ro tus ) pertenecientes al cepario del Laboratorio deBiotecnología de microorganismos SIXTO DAVID ROJO ULA.

Por: Br. Eduardo A. Chalbaud Mogollón

Trabajo presentado para optarAl Título de Licenciado en BIOLOGÍA de la

Ilustre Universidad de los Andes

Mérida 2015 - Venezuela



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AGRADECIMIENTOS

Quiero expresar mi más sincero agradecimiento al MSc. Balmore Guerrero asesor de mitrabajo especial de grado. Así como a los profesores Dr. Julio Otoniel Rojas, Dr. Juan Gaviria y Dr.Pablo García, por formar parte del comité de este trabajo, por sus valiosas sugerencias de interés, enla revisión del presente trabajo.

A la Universidad de los Andes, Mérida Venezuela; específicamente a todo el personal delLaboratorio de Biotecnología de Microorganismos “SIXTO DAVID ROJO”, a los profesores JulioOtoniel Rojas, Pablo García, Zarack Chacón, Balmore Guerrero; a la vigilancia, Gleydi Uzcategui; alos técnicos Jesús Pacheco y Flormery Bracho; a los Investigadores, estudiantes de pregrado ypostgrado Yzoleth Torres, Osman Morillo, Racely Sánchez, Datty Rosales, Alexis Sambrano y AnaDíaz por su amistad y apoyo durante la realización de esta investigación.

Al investigador independiente el Dr. José David Rosales Rangel por su interés en larealización de esta investigación y su colaboración en el uso de la herramientas de bioinformática.

Al Laboratorio de Biodiversidad y Variabilidad Molecular adscrito al Instituto Jardínbotánico de Mérida a los Mgs. Arnaldo Moguera y Mgs. Romina Ruiz por proporcionarme todos lasbases fundamentales en las técnicas de purificación de productos de PCR.

Al Laboratorio De Genética Y Química Celular (Gequimcel), a la Lic. Sophie Dulhoste y Lic.Sonia Morales por proporcionarme todos las bases fundamentales en la biología molecular y el apoyoen la ejecución de esta investigación.

A todos y cada uno de mis compañeros en la Facultad de Ciencias, con especialcariño, respeto, agradecimiento y admiración para Amelia Guerrero, Nayari Valero, LuisMora, Luz Amira, Astrid Davila y Jose Gregorio Contreras.

A mis 2 grandes preparadores Roberto Torrealba de Matemática 20 y Juan PabloBracho de Ingenieria Genética, y a todos los profesores de la Facultad de Ciencias por el apoyo yla formación durante todo el tiempo de realización de mis estudios de pregrado.



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DEDICATORIA

A mí querida Mamá:

Leticia del Carmen Mogollón Piñango

Quien siempre ha luchado por darme lo mejor, y ha sido un ejemplo de rectitud, constancia,respeto, educación y superación personal, además por todo su cariño con el que me ha formado. Y

porque siempre ha sido partícipe de mi desarrollo personal.

A mi hermano:

Esteban Ricardo Chalbaud Mogollón

Con quien he compartido gran parte de mi vida, a quien agradezco su gran paciencia, cariño yejemplo de constancia, y por estar presente en los momentos más difíciles.

A la Prof. Carmen Chacón

A quien agradezco su gran paciencia y siempre creer en mí.

Al Dr. Pedro Serena

Quien siempre me dio un ejemplo de fortaleza, principios, respeto, educación y superación personal.

Gracias a su apoyo y confianza que fueron parte fundamental para la realización de esta meta en mivida.



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ÍNDICE

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................................. III

DEDICATORIA ....................................................................................................................................................... VI

ÍNDICE ................................................................................................................................................................... VII

ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................................................ VIII ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................................ IX

ÍNDICE DE ANEXOS .............................................................................................................................................. X

RESUMEN ................................................................................................................................................................ 1

ABSTRACT .............................................................................................................................................................. 1

INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................................... 2

CAPITULO I ............................................................................................................................................................. 3

MARCO TEORICO ................................................................................................................................................... 3

I HONGOS. .............................................................................................................................................................. 3 I.1. T AXONOMÍA DE LOS HONGOS. ............................................................................................................................ 3

I.1.1 APLICACIÓN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR A LA T AXONOMÍA DE LOS HONGOS. ..................................................... 4 I.2 EL F ILUM B ASIDIOMYCOTA. ................................................................................................................................. 7

I.2.1 Género Pleurotus ..................................................................................................................................... 8

CAPITULO II .......................................................................................................................................................... 21

ANTECEDENTES .................................................................................................................................................. 21

II.1 LOS HONGOS .................................................................................................................................................. 21 II.1.1 LOS HONGOS COMESTIBLES ......................................................................................................................... 21 II.1.2 HISTORIA DEL CULTIVO DE LOS HONGOS COMESTIBLES .................................................................................. 22 II.1.3. T AXONOMÍA DEL GÉNERO P LEUROTUS ......................................................................................................... 22 II.1.3.1 EL CONTROL GENÉTICO Y MORFOLÓGICO DEL PROCESO DE FRUCTIFICACIÓN................................................ 25 II.1.3.2 ALGUNAS ESPECIES DEL GÉNERO P LEUROTUS EN L ATINOAMÉRICA. ............................................................. 26

CAPITULO III ......................................................................................................................................................... 29 JUSTIFICACIÓN. ................................................................................................................................................... 29

HIPOTESIS. ........................................................................................................................................................... 29

OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................................................... 29

OBJETIVOS ESPECIFICOS .................................................................................................................................. 29

CAPITULO IV ......................................................................................................................................................... 30

MATERIALES Y METODOS.................................................................................................................................. 30

MATERIALES ........................................................................................................................................................ 30

MICROORGANISMOS. ............................................................................................................................................. 30 MEDIOS DE CULTIVO. ............................................................................................................................................. 30

METODOLOGÍAS .................................................................................................................................................. 31

IV. DIAGRAMA GENERAL DE INVESTIGACIÓN. ........................................................................................................... 31 IV.1 DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS MORFO- ANATÓMICAS DE LAS CEPAS P3215, P132, POST, PCIT Y

PRAL PRESENTES EN EL L ABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DE MICROORGANISMOS. .............................................. 31 IV.1.1 Cultivo de las cepas P3215, P132 y Post por fermentación de estado sólidos (FES) ........................ 32 IV.1.2 Caracterización macroscópicas y microscópicas de los pleurocarpos de las cepas P3215, P132 yPost. ................................................................................................................................................................ 33

IV.2 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LAS CEPAS P3215, P132 Y POST BASADA EN LAS CARACTERÍSTICAS MORFO- ANATÓMICAS. ........................................................................................................................................................ 34



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IV.3 C ARACTERÍSTICAS DE LAS CEPAS P3215, P132, POST, PCIT, PRAL Y POST CRECIDAS EN MEDIOS

CONVENCIONALES Y NO CONVENCIONALES. ............................................................................................................ 34 IV.3.1 Características de las colonias fúngicas en medios convencionales. ................................................. 34 IV.3.2 Determinación del efecto de los medios de cultivo convencionales y la temperatura en el crecimientoy producción de biomasa de las cepas del género Pleurotus ........................................................................ 35

IV.4 IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LAS CEPAS P3215, P132 Y POST. .................................................................. 36 IV.4.1 Evaluación de los métodos de extracción de los ácidos nucleicos de las cepas P3215, P132 y Post. ........................................................................................................................................................................ 36

IV.4.2 Secuenciación del ADN. ...................................................................................................................... 38 IV.4.3 Análisis de secuencia de la región ITS1, 5.8S ADNr e ITS2 ............................................................... 39

CAPITULO V .......................................................................................................................................................... 41

RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................................................................. 41

V.1.1 C ARACTERÍSTICAS MORFO- ANATÓMICAS DE LAS CEPAS P3215, P132 Y POST PERTENECIENTES AL

L ABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DE MICROORGANISMOS. ................................................................................... 41 V.1.2 Características microscópicas de las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL. ................................... 44

V.2 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LAS CEPAS LAS CEPAS P3215, P132 Y POST BASADA EN LAS CARACTERÍSTICAS

MORFOANATOMICAS. ............................................................................................................................................. 45 V.3 C ARACTERÍSTICAS DE LAS CEPAS LAS CEPAS P3215, P132, POST Y PRAL CRECIDAS EN MEDIOS

CONVENCIONALES Y NO CONVENCIONALES. ............................................................................................................ 46 V.3.1 Características de las colonias fúngicas en medios convencionales. .................................................. 46

V.3.2 Efecto de la temperatura y el medio de cultivo en el crecimiento y la producción de biomasa de lascepas P132, P3215 y P.ost. ........................................................................................................................... 46 V.3.3 Tasa de crecimiento de las cepas Post y P3215 en medios no convencionales ................................. 49 V. 3.3. Características morfológicas de las cepas P3215 y Post en medios no convencionales. ................. 51

V.4 IDENTIFICACIÓN POR TÉCNICAS MOLECULARES DE LAS CEPAS P3215, P132, POST. .......................................... 52 V.4.1 Extracción del ADN ............................................................................................................................... 52 V.4.1.1 La PCR de la región ITS 1 a ITS 2 .................................................................................................... 52 V.4.2 Análisis de la secuencia de la región ITS 1, gen 5.8 S ANDr y la región ITS2 dentro de las cepas delgénero Pleurotus ............................................................................................................................................ 54

CAPITULO VI ......................................................................................................................................................... 65

CONCLUSIÓNES ................................................................................................................................................... 65

RECOMENDACIONES .......................................................................................................................................... 66

BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................................................... 67

ANEXOS................................................................................................................................................................. 75

GLOSARIO............................................................................................................................................................. 80

SIGLAS Y ABREVIATURAS ................................................................................................................................. 81

ÍNDICE DE TABLAS

TABLA I PRODUCCIÓN MUNDIAL DE HONGOS COMESTIBLES CULTIVA DOS EN 1986 HASTA EL 2010PESO FRESCO. TOMADO DE MILES Y CHANG, 2004 MODIFICADO.RODRIGUEZ, 2007. .................... 11

TABLA II COMPOSICIÓN PROXIMAL DE PROTEÍNAS, VITAMINAS Y MINERALES DE ALGUNAS ESPECIESDE HONGOS COMESTIBLES, LOS VALORES SE EXPRESAN COMO MG/100G DE PESO SECO.TOMADO DE CHANG Y MILES, 2004; MILES Y CHANG, 1997. ................................................................. 12

TABLA III ESPECIES BIOLÓGICAS ESTABLECIDAS DENTRO DEL GÉNERO PLEUROTUS, SUSSINÓNIMOS CORRESPONDIENTES Y/O TAXA DE NIVEL DE SUBESPECIES, Y GRUPOSRESPECTIVOS DE ÍNTERCOMPATIBILIDAD; Y SU DISTRIBUCIÓN MUNDIAL. TOMADO: VILGALYSET AL., 1996) Y KONG,. 2005. ...................................................................................................................... 24

TABLA IV MEZCLA DE REACCIÓN PARA EL SECUENCIA MIENTO DE LOS PRODUCTOS DE PCR.IVIC,2014. ............................................................................................................................................................... 39

TABLA V CARACTERISTICAS DE LA CEPA P132. ............................................................................................. 42 TABLA VI CARACTERISTICAS DE LA CEPA P3215. .......................................................................................... 43



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TABLA VII CARACTERISTICAS DE LA CEPA DE POST. .................................................................................... 44 TABLA VIII CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LAS CEPAS DEL GÉNERO PLEUROTUS ................ 45 TABLA IX CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LAS COLONIAS DE LAS CEPAS LAS CEPAS P3215,

P132, PCIT, POST Y PRAL PRESENTES EN EL LABORATORIO BIOMI, EVALUADAS EN MEDIOS DECULTIVO PDA Y SA A 22°C. ......................................................................................................................... 46

TABLA X TASA DE CRECIMIENTO MICELIAL (MM/DÍA) TRAS LA INCUBACIÓN POR 15 DÍA DE LAS CEPASP132, P3215, POST Y PRAL EN PDA (AGAR PAPA DEXTROSA) Y ASD (AGAR SABOURAUDDEXTROSA). .................................................................................................................................................. 48

TABLA XI TASA DE CRECIMIENTO MICELIAL (MM/DÍA) A LOS 15 DÍAS DE INCUBACIÓN DE LAS CEPASPOST Y P3215 EN SUSTRATOS LIGNOCELULÓSICOS COMO TUZA DE MAÍZ, SEMILLA DE SORGO, ARROZ Y SEMILLA DE PARCHITA. ............................................................................................................. 50

TABLA XII CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LAS CEPAS ESTUDIADAS EN EN MEDIOS NOCONVENCIONALES COMO SEMILLA DE SORGO (SORGHUM SP.), TUZA DE MAÍZ (ZEA MAYS),

ARROZ (ORYZA SATIVA) Y SEMILLA DE PARCHITA (PASSIFLORA EDULIS) INCUBADAS POR 15DÍAS A 25°C ................................................................................................................................................... 51

TABLA XIII COMPARACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS DEL ADN OBTENIDO A PARTIR DE LAS CEPASDEL GÉNERO PLEUROTUS A PARTIR DE LOS MÉTODOS DE SAGHAI-MAROOF, ET AL. (1984) (S) YLEE (1990) (L). ............................................................................................................................................... 53

TABLA XIV CONCENTRACIONES DE LOS PRODUCTOS DE PCR DE LA REGIÓN ITS1, 5.8S E ITS2 (PCR)DE CADA CEPA ENVIADO A SECUENCIAR A LA A LA UNIDAD DE ESTUDIOS GENÉTICOS YFORENSES DEL IVIC. ................................................................................................................................... 54

TABLA XV IDENTIDAD DE LOS PRODUCTOS DE PCR DE LA REGIÓN ITS1, 5.8S E ITS2 DE CADA CEPAENVIADA A SECUENCIAR A LA UNIDAD DE ESTUDIOS GENÉTICOS Y FORENSES DEL IVIC. ........... 55

TABLA XVI PATRONES DE BANDAS RFLP ESPERADOS PARA LAS ESPECIES DEL GÉNEROPLEUROTUS TRAS LA DIGESTIÓN TEÓRICA CON LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN QUE CORTANEN 3 SITIOS. NEGRO (LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN QUE COMPARTEN TODOS), ROJO QUECOMPARTEN LAS CEPAS P132, POST Y P3215. ...................................................................................... 57

TABLA XVII MATRIZ DE DISTANCIAS GENÉTICAS PAREADAS K2P PARA LA REGIÓN ITS1. ..................... 59 TABLA XVIII MATRIZ DE DISTANCIAS GENÉTICAS PAREADAS K2P PARA LA REGIÓN ITS2. .................... 60 TABLA XIX MOTIVOS CONSERVADOS 5.8S Y 28S EN LA REGIÓN ITS2 DEL GÉNERO PLEUROTUS ........ 62 TABLA XX COINCIDENCIAS ENCONTRADAS POR COMPARACIÓN DE ESTRUCTURA SECUNDARIA ITS2

DE LA CEPA P3215 (PLEUROTUS OSTREATUS VAR. FLORIDA). ........................................................... 64

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA I FILOGENIA Y CLASIFICACIÓN DEL REINO FUNGÍ. SUB REINO DIKARYA Y HONGOS BASALES.TOMADO DE HIBBETT ET AL., 2007. ............................................................................................................ 4

FIGURA II ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DE LOS GENES DEL ARN RIBOSOMAL. REGIONES NOCODIFICANTES; IGS (ESPACIADORES INTERGÉNICOS), ITS (ESPACIADORES DE TRANSCRIPCIÓNINTERNOS); REGIONES CODIFICANTES; 5.8S Y 5S [SSU (SUBUNIDAD PEQUEÑA)], Y LSU(SUBUNIDAD GRANDE). TOMADO DE WHITE ET AL., 1990. ...................................................................... 5

FIGURA III REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LAS REGIONES ITS. TOMADO DE CIARDO ET AL.,2010. ................................................................................................................................................................. 5

FIGURA IV ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DEL GEN DE LA Β-TUBULINA DE SCHIZOPHYLLUMCOMMUNE. REGIONES CODIFICANTES; (EXONES) SE INDICAN CON NÚMEROS. REGIONES NOCODIFICANTES; (INTRONES) SON EN BARRAS NEGRAS. TOMADO DE RUSSO ET AL., 1992. ............ 6

FIGURA V ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DEL GEN DEL FACTOR 1 DE ELONGACIÓN DE LATRADUCCIÓN (TEF1) DE SCHIZOPHYLLUM COMUNA. LOS INTRONES SE INDICAN EN LAS BARRASNEGRAS. LOS EXONES ESTÁN INDICADOS CON LOS NÚMEROS. TOMADO DE WENDLAND YKOTHE, 1997. .................................................................................................................................................. 6

FIGURA VI ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DEL GEN RPB2. A) LOS INTRONES SE INDICAN EN LÍNEASGRUESAS NEGRAS Y EXONES ESTÁN CONTADOS. TOMADO DE MATHENY ET AL., 2006. B)REPRESENTACIÓN DE LOS DOMINIOS CONSERVADOS DE LA PROTEÍNA RPB2. LOS SEGMENTOSNEGROS REPRESENTAN 12 MOTIVOS CONSERVADOS DE AMINOÁCIDOS (DOMINIOSCONSERVADOS) ENTRE LOS EUCARIOTAS. TOMADO DE LIU ET AL., 1999. ......................................... 7

FIGURA VII FILOGENIA Y CLASIFICACIÓN DEL FILUM BASIDIOMYCOTA. ...................................................... 7 FIGURA VIII CICLO DE VIDA DE LOS BASIDIOMYCOTA. TOMADO Y MODIFICADO DE JACKSON, 2010. .... 8 FIGURA IX LA SETA OSTRA P. OSTREATUS (JACQUIN: FRIES). TOMADO DE KUMMER, 1871. ................... 9



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FIGURA X CICLO DE VIDA DEL GÉNERO PLEUROTUS TOMADO DE: VALENCIA-DEL TORO, 2002............. 9 FIGURA XI CARACTERÍSTICAS ANATÓMICAS DEL GÉNERO PLEUROTUS. TOMADO DE LÓPEZ Y

GARCÍA, 2004. ............................................................................................................................................... 13 FIGURA XII CRECIMIENTO DEL P. OSTREATUS ECS-0110 EN MEDIO LÍQUIDO. SE OBSERVAN LAS

DIFERENTES FASES DE DESARROLLO: L: LATENCIA; E: EXPONENCIAL; D: DECLINACIÓN; S:ESTACIONARIA. CONDICIONES DE CULTIVO: CALDO DE GLUCOSA-EXTRACTO DE LEVADURA,

AGITACIÓN 200 RPM, AIREACIÓN 1 VVM Y TEMPERATURA 26°C. TASA DE CRECIMIENTO 0,036 H-1.TOMADO DE MARQUEZ-ROCHA ET AL., 1999. ......................................................................................... 18

FIGURA XIII CULTIVO POR FERMENTACIÓN EN ESTADO SOLIDO (FES) DE HONGOS COMESTIBLES.TOMADO DE STAMETS, 2000. ..................................................................................................................... 33 FIGURA XIV CARACTERIZACIÓN MACROSCÓPICA DE LA COLONIAL MICELIAL DE LOS HONGOS.

TOMADO DE PICCOLI ET AL., 2010). .......................................................................................................... 34 FIGURA XIV CRECIMIENTO MICELIAL DE LAS CEPAS POST Y P3215 AL 6TO DÍA CULTIVADAS EN

MEDIOS NO CONVENCIONALES COMO SEMILLA DE SORGO (SORGHUM SP.), TUZA DE MAÍZ (ZEAMAYS), ARROZ (ORYZA SATIVA) Y SEMILLA DE PARCHITA (PASSIFLORA EDULIS) INCUBADAS A25°C. ............................................................................................................................................................... 50

FIGURA XV ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 0,8% DE 1ΜG DEL ADN GENÓMICO EXTRAÍDODE LAS CEPAS DEL GÉNERO PLEUROTUS P3215, P132, POST, PCIT Y PRAL UTILIZANDO ELMÉTODO DE LEE (1990) (A) Y EL MÉTODO DE SAGHAI-MAROOF, ET. AL.(1984) (B). .......................... 53

FIGURA XVI ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE LOS PRODUCTOS DE PCR DE LA REGIÓN ITS1, 5.8S YITS2 AMPLIFICADOS CON LOS PRIMER’S ITS1 Y ITS4 A PARTIR DEL ADN GENÓMICOS DE LASCEPAS DEL GÉNERO PLEUROTUS COMO P3215, P132, POST, PRAL Y PCIT EXTRAÍDOS POR ELMÉTODO DE LEE ( 1990) DILUIDA A UN FD DE 1000 (A) Y EL MÉTODO DE SAGHAI-MAROOF, ET. AL.(1984) A UN FD DE 100(B). (EPM) ESCALERA DE PESO MOLECULAR 1 KB PLUS DNA LADDER (+)CONTROL POSITIVO Y (-) AL CONTROL NEGATIVO. ............................................................................... 54

FIGURA XVII PATRONES RFLP DE LOS FRAGMENTO ITS1-5.8S-ITS2 ADNR DE LAS SECUENCIASEF514248 PLEUROTUS OSTREATUS, EF514244 P. CYSTIDIOS, AB115043 P. CITRINOPILIATUS,EF514250 P. TUBERREGIUM, EF514243 P. PULMONARIUS, P132, P3215A, P3215B Y POSTA,DIGERIDOS CON LA ENZIMA HAEIII A TRAVÉS DE LA HERRAMIENTA NEBCUTTER V2.0 (VINCZE ET

AL., 2003). MARCADOR DE PESO MOLECULAR 100PB. .......................................................................... 56 FIGURA XVIII CLADOS DE LOS ARBOLES FILOGENÉTICOS DE LAS REGIONES ITS1 Y 5.8S (A) E ITS2 (B)

CONSTRUIDOS POR EL MÉTODO NJ-K2P- 1000 BOOTSTRAP. .............................................................. 61 FIGURA XIX MOTIVOS CONSERVADOS 5.8S Y 28S EN LA REGIÓN ITS2 DEL GÉNERO PLEUROTUS ...... 63 FIGURA XXI ESTRUCTURA SECUNDARIA DE LA SECUENCIA ITS2 DE LA CEPA P3215 (PLEUROTUS

OSTREATUS VAR. FLORIDA). ..................................................................................................................... 64

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO 1 KEY TO IDENTIFY MUSHROOMS TO GENUS USING ONLY MACROSCOPIC FEATURES(LARGENT, 1986). ......................................................................................................................................... 75

ANEXO 2 KEYS OF GÉNERO PLEUROTUS (PETERSEN ET AL., 2012). ......................................................... 76 ANEXO 3 ANALISIS ESTADÍSTICO DEL EFECTO DEL MEDIO DE CULTIVO Y LA TEMPERATURA EN LA

TASA DE CRECIMIENTO MICELIAL Y PRODUCCIÓN DE BIOMASA DE LAS CEPAS DEL GÉNEROPLEUROTUS .................................................................................................................................................. 77

ANEXO 4 BLAST RESULTADO DE LA BÚSQUEDA PARA LAS CEPAS P3215, P132 Y POST ....................... 78



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RESUMEN

Algunas especies del género Pleurotus han sido una alternativa alimentaría en muchos países, porsus propiedades nutricionales y medicinales. En Venezuela, el cultivo de este tipo de setas esmínimo, así como la investigación y las fuentes de información para llevar a cabo este tipo de cultivos.

En la presente investigación se realizó la caracterización morfológicas e identificación molecularutilizando la región ITS1 e ITS2, de las cepas Post, P132, P3215, PRAL y Pcit que se sospechabapertenecían al género Pleurotus, también se evaluaron algunas características fisiológicas siguiendosu crecimiento en medios de cultivo a diferentes temperaturas. Se determinó que las cepas P132 yPost pertenecen a la especie P. ostreatus y la cepa P3215 a especie P. ostreatus var. florida, y queexisten diferencias significativas entre el comportamiento fisiológico de estas cepas.

Palabras clave: cultivo de hongos comestibles, ―Hongo Orellana‖, Pleurotus, seguridad alimentaría,setas.

ABSTRACT

Some species genus Pleurotus have been a food alternative in many countries, for its nutritional andmedicinal properties. In Venezuela, the cultivation of this kind of mushroom is minimal, as well asresearch and information sources to carry out this type of crop. In the present investigation wasperformed the morphological characterization and molecular identification using the ITS1 and ITS2,strains Post, P132, P3215, PRAL and PciT suspected of belonging to the genus Pleurotus, somephysiological characteristics were also evaluated according to their growth in culture media at differenttemperatures. it was determined that the P132 and Post strains belong to the species P. ostreatus andstrain P3215 to P. ostreatus var. florida, and that there are significant differences between the

physiological behavior of these strains.

Keywords: cultivation of edible mushrooms, mushroom "Orellana", Pleurotus, food security,mushrooms.



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INTRODUCCIÓN

Los hongos son microorganismos descomponedores que forman parte fundamental en laconservación y preservación de los ecosistemas forestales, ayudando con la formación del suelo;siendo a su vez una parte importante de la cultura agroalimentaria humana desde hace miles de

años, como un rubro de alto valor nutricional y medicinal aprovechado por las civilizaciones másimportantes de la historia. Dentro de este grupo tenemos especies comestibles como Agaricusbisporus comúnmente llamado ―champiñón‖ u ―hongo de botón‖ difundido en países del occidente;Lentinula sp. denominado ―el hongo negro de los bosques‖, ―hiang-gu‖ para los chinos y ―shiitake‖para los japoneses, producido en el oriente de Asia; Pleurotus ostreatus nombrado ―hongo oreja depalo‖, ―hongo Orellana" u ―hongo ostra‖; Amanita sp. y Auricularia sp. Oreja de judas; caracterizadospor ser cultivables. En muchos países estos hongos representan una alternativa de seguridadalimentaria y agroecológica basada en la fermentación de estado sólido (FES) para elaprovechamiento de los desechos agroindustriales para la producción de alimentos de un alto valornutricional y potencial medicinal. Dentro de estas setas comestibles se encuentra los hongos delgénero Pleurotus, grupo comprendido por al menos 20 especies, distribuidas en todo el mundo (Kong,2005). Estos hongos han sido de gran interés en las últimas décadas en producción y estudio como

setas comestibles y medicinales por sus características organolépticos, facilidades de cultivo ycapacidad de degradar una gran diversidad de substratos lignocelulósicas en un amplio rango detemperaturas (Ardon, 2007), y su resistencia contra plagas (Rajarathnam et al., 1987), además ellosse obtiene un alimento de alto valor nutricional por su alto contenido de proteína cruda y bajos nivelesde carbohidratos y presencia de sustancias biológicas activas con propiedades medicinales.

En Venezuela, el cultivo del género Pleurotus de forma industrial tiene registro desde el año1976 hasta 1998 con una producción estimada en peso fresco de 18 ton/ año (Sánchez y Royse,2001); cosecha destinada a niveles socioeconómicos altos como un alimento gourmet, que debido asu baja oferta, sus precios elevados, pocas personas con las herramientas y la formación básica parasu cultivo y el hecho de implementar aislados de cepas comerciales importadas de regiones

templadas, se ha dejando de producir; lo que hace necesario aumentar los esfuerzos científicos ytecnológicos por recuperar aislados o cepas silvestres de estos hongos comestibles con potencial decultivo y desarrollar su comercialización.

En el presente trabajo se realizó la caracterización morfo-anatómica, fisiológica e identificaciónmolecular a través de la amplificación y análisis de la región de los espaciadores transcritos internos(ITS1 e IT2) intercalados por la unidad 5.8 S del ARN ribosomal, como técnicas taxonómicas para laidentificación de las cepas del género Pleurotus presentes en el Laboratorio de Biotecnología deMicroorganismos SIXTO DAVID ROJO, y el desarrollo del cultivo por FES de estas setas para laimplementación de metodologías fáciles de desarrollar y reproducibles por productores venezolanosque puedan cultivar su propio micelio a partir de su propia producción y así, producir la semillafúngica para el inicio de este tipo de cultivos. Llevando a un gran impulso en la producción de estosmicroorganismos, lo que permitiría generar un desarrollo artesanal con potencial como alternativa deseguridad alimentaria.



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CAPITULO I

MARCO TEORICO

I Hongos.

La denominación proviene del latín 'fungus': seta; griego: 'sphongos': esponja. Definido en elsentido Botánico como cualquier vegetal heterótrofo que carecen de flagelos y clorofila, que parasitano viven sobre materia orgánica en descomposición y producen esporas (Alexopoulos et al., 1996).Los hongos son el segundo grupo eucarionte más numerosos después de los insectos, conformanuna parte intrínseca y transcendental para la existencia y restauración de los ecosistemas forestales;están presentes en la naturaleza con una gran diversidad de especies descomponedores quemantienen los ciclados tróficos del carbono, nitrógeno y azufre, y el transporte de los nutrientesindispensables para la existencia de los biosistemas (Palm y Chapela, 1997). Son microorganismoque están presentes en los ecosistemas como saprófitos, parásitos facultativos y obligados, y en

asociación simbióticas conformando a los líquenes o las micorrizas (Guzmán, 1998). Se caracterizanprincipalmente por la producción de esporas, crecen formando filamentos septados ramificadosllamados hifas que conforman el micelio, poseen crecimiento apical en redes filamentosas de masasalgodonosas y radiales; que le permite mejor aprovechamiento de nutrimentos del medio ambiente(Kato y Ferreira, 2003); tienen capacidad de almacenamiento de polisacáridos (trehalosa yglucógeno), con nutrición heterotrófica por absorción debido a su pared celular (quitina) que no lepermite fagocitar, teniendo que absorber nutrientes simples y solubles mediante la degradación víaextracelular de materia orgánica compleja principalmente celulosa, hemicelulosa y lignina, esto por laacción de un complejo sistema de enzimas hidrolíticas que liberan al ambiente (Moore-Landecker,1996), tienen reproducción sexual y/o asexual (Malloch et al., 1980; Guzmán et al., 1993).

I.1. Taxonomía de los hongos.

Estos microorganismos anteriormente incluidos dentro del reino vegetal, considerados comoplantas sin clorofila, constituyen un grupo muy variable y polimórfico clasificado con base en suscaracterísticas macroscópicas (Alexopoulos et al., 1996), luego según estudios basados en lacaracterísticas morfológica macro y microscópicas según Herrera, Ulloa, y Oronoz en (1998) fueronubicados dentro de un reino diferente al de las plantas, animales o protistas, denominado Reino Fungí o Myceteae, clasificado en dos divisiones naturales la división Myxomycota o hongos gelatinosos ydivisión Eumycota hongos verdaderos o superiores; comprendido por los grupos Phycomycota,

Ascomycota, Basidiomycota y Deuteromycota y una división artificial los líquenes, que incluye

organismos mixtos constituidos por algas y hongos asociados simbióticamente (Maldonado, 2007).

Durante mucho tiempo la taxonomía de los hongos estuvo basada en: estudios morfológicosde los rasgos macroscópicos, características ecológicas, organolépticas (olor, sabor, consistencia yaspecto) (Murakami y Takemaru. 1990). Rasgos microscópicos (las esporas, los elementos estérilesde las esporas, la conformación del tejido por las hifas en el carpóforo y de la estructura de la hifa),propiedades bioquímicos y estructurales para así lograr la identificación de las especies de este clado(Buchanan, 1993). Pero ante la plasticidad fenotípica asociada a las condiciones ambientales decrecimiento, se agregaron otros caracteres que permitieron identificar y clasificar de acuerdo a suintercompatibilidad (Boidin, 1986), la técnica consiste en el cruce de micelios monocariotico (haploide,



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n) derivados a partir de una espora de una especie conocida, con micelios provenientes de unaespora de otra línea pudiéndose obtener micelios dicariótico (n+n) en el caso de existir compatibilidad(Petersen, 1992), permitiendo agrupar las distintas especies en grupos de incompatibilidad. Lastécnicas antes mencionadas tienen desventajas con respecto al análisis morfológico influenciado porel medio ambiente y condiciones experimentales in vitro; que afecta la interpretación de los resultadosy no permite separar las homologías de las analogías.Sin embargo, no aclara la visión del ReinoFungí como un clado polifiletico; Este problema se resolvió con estudios masivos de biologíamolecular basados en el análisis del genoma de todas las especies reportadas como miembros deeste grupo; que debido a su composición genética y su estructura se establecieron los diferentesniveles taxonómicos según su filogenias (Kauserud y Schumacher, 2003).

I.1.1 Aplicación de la biología molecular a la Taxonomía de los hongos.

Los primeros estudios masivos de la biología molecular en la micología fue la aplicación de laReacción en Cadena de Poimerasa (PCR), descrito por White et al. (1990) interesado en laamplificación y secuenciación del ADN ribosomal (ADNr) para establecer la taxonomía y las

relaciones filogenética de los hongos, ya que estas moléculas se encuentran en todas las célulasfúngicas vivas, por lo tanto, su evolución podría reflejar la evolución de todo el genoma. Estassecuencias también contienen regiones variables y conservadas, lo que permite la comparación y ladiscriminación de los microorganismos en diferentes niveles taxonómicos. En otras investigacionespara establecer la filogenia, se ha realizado el aislamiento y el secuenciamiento de los genesfundamentales en eucariotas: Los genes del ARN ribosómico (ADNr); genes que codifican proteínascomo β-tubulina, factor 1 de elongación de la transcripción (TEF1) y la ARN polimerasa Subunidad II(RPB2), además del estudio de las topologías de ciertas regiones del ADN ribosomal [ Espaciadoresde Transcripción Internos (ITS), Subunidad Larga (LSU), Subunidad Pequeña(SSU), EspaciadoresIntergénicos(IGS)]. Los resultados han permitiendo el análisis filogenéticos multilocus, con lo cual selogró unificar el reino de los hongos como un clado monofiletico estructurado en un sub-reino Dikarya que contempla a los antes llamados macromicetes la clases Basidiomycetes y Ascomycetes, hoy

conocidos como los fila Basidiomycota y Ascomycota; y 9 filum’ s que contemplan a los denominadosmicromycetes. Dicha clasificación se resume en la Figura I (Hibbett et al., 2007).

Figura I Filogenia y clasificación del Reino Fungí. Sub Reino Dikarya y Hongos basales. Tomado de Hibbett etal., 2007.



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A continuación se describen los aspectos más resaltantes de estas técnicas.

A. Genes del ARN ribosomal.

Los Genes del ARN ribosomal son los que codifican para el ADNr son los marcadores de la

historia filogenética de los eucariotas; presentes en varias copias de una familia multigénica de geneshomólogos, dispuestos en tándem y separados por espaciadores no transcritos llamados IGS. Elloscontienen la información de codificación para los tres tipos de ARNr [18S (subunidad pequeña ARN-SSU), 5.8S y 28S (subunidad grande ARN-LSU)]; y de dos regiones variables de ITS1 y ITS 2 queson no codificantes (Deacon, 2013). La figura II representa la estructura de los genes del ARN r delos hongos.

Figura II Esquema de la estructura de los genes del ARN ribosomal. Regiones no codificantes; IGS(espaciadores intergénicos), ITS (espaciadores de transcripción internos); Regiones codificantes; 5.8S y 5S[SSU (subunidad pequeña)], y LSU (subunidad grande). Tomado de White et al., 1990.

A.1 Las Región ITS1 e ITS2.

El ADNr es la región más conservada del genoma de los hongos con capacidad dedivergencia filogenética, albergando regiones con baja variabilidad intraespecifica, siendo estos

genes separados por dos secuencias espaciadoras internas que se transcriben junto a los genes del ARNr, denominadas ITS1 e ITS2 (internal transcribed spacer). Las regiones ITS’s son regioneshipervariables, con una variabilidad intragénica especie-específica, que permite alta discriminación eidentificación de especies; la extracción y el análisis individual de las regiones ITS1 e ITS2 ha sidouna técnica utilizada en: la diferenciación de especies de hongos, construcción de análisisfilogenéticos y trazar relaciones entre organismos a través del modelado de sus estructurassegundarias (Borrero, 2011). Estas regiones intergénicas pueden ser amplificadas por separadoutilizando los primer’ s universales ITS1 - ITS2. Para la amplificación específica de la secuencia ITS1,se utilizan los primer’ s IST3 - ITS4 para la amplificación de la secuencia ITS2 y de igual formaamplificar las dos regiones ITS1 e ITS2 conjuntamente con la secuencia del gen 5.8S rRNA utilizandola pareja de los primer’ s ITS1-ITS4 como muestra la Figura III (White et al., 1990; Ciardo et al., 2010).

Figura III Representación esquemática de las regiones ITS. Tomado de Ciardo et al., 2010.



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B. Gen de la β – tubulina.

Es el gen que está presente en todos los organismos y codifica la β-tubulina. En el caso de loshongos el polimorfismo de este gen sirve para identificar y diferenciar especies cripticas (sindiferencias morfológicas y fisiológicas y diferencias de incompatibilidad reproductiva) (Russo et al.,1992; Kim et al., 1997; Matsuo et al., 1999; Kim et al., 2001). La figura IV muestra la estructura del

gen de la β-tubulina.

Figura IV Esquema de la estructura del gen de la β-tubulina de Schizophyllum commune. RegionesCodificantes; (exones) se indican con números. Regiones no codificantes; (Intrones) son en barras negras.Tomado de Russo et al., 1992.

C. Gen del factor 1 de elongación de traducción (tef1).

El gen tef1 codifica la proteínaTEF1α, enzima fundamental para la síntesis de proteínasribosomales en eucariotas; presente en algunas especies en más de una copia. Para la filogenia delreino fungí se utiliza el análisis de secuencia parcial de este gen, en la diferenciación entresubespecies (Marongiu et al., 2005).La Figura V muestra la estructura del gen tef1.

Figura V Esquema de la estructura del gen del factor 1 de elongación de la traducción (TEF1) de Schizophyllumcomuna. Los intrones se indican en las barras negras. Los exones están indicados con los números. Tomadode Wendland y Kothe, 1997.

D. Gen de la ARN polimerasa II (RPB2).

El gen rpb2 codifica la segunda subunidad mayor de la RNA polimerasa II, enzima quetranscribe en eucariotas el ARN inmaduro, para que luego pase por el splaysing y splaysingalternativo (Liu et al., 1999; Matheny, 2005). En el reino Fungí el polimorfismo del gen rpb2 y lacomparación de las secuencias de aminoácidos de los dominios altamente conservados en lasregiones variables entre 6 y 7 de la enzima RPB2, permiten sugerir taxonómicamente que especiesestán más estrechamente relacionadas (Lutzoni et al., others, 2004). La Figura VI representa deestructura del gen rpb2 y la disposición de los dominios conservados de la proteína RPB2.



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Figura VI Esquema de la estructura del gen RPB2. a) Los intrones se indican en líneas gruesas negras yexones están contados. Tomado de Matheny et al., 2006. b) Representación de los dominios conservados de la

proteína RPB2. Los segmentos negros representan 12 motivos conservados de aminoácidos (dominiosconservados) entre los eucariotas. Tomado de Liu et al., 1999.

I.2 El Filum Basid iomycota .

En el sub reino Dikarya, el filum Basidiomycota incluye alrededor de 30000 especies, en su

mayoría hongos filamentosos caracterizados por producir meiosporas (basidiosporas) en el exteriordel esporangio en forma de bastón (basidio esporangio); El filum incluye tres sub fila como semuestra en la figura VII; Pucciniomycotina en su mayoría patógenos de las plantas;Ustilaginomycotina que incluye de hongos filamentos y levaduras, de los cuales la mayoría patógenosde las angiospermas; y Agaricomycotina conforman los hongos superiores o setas y algunas formasde levadura (Kirk et al., 2008; Lutzoni et al., 2004; Bauer et al., 2006).

Figura VII Filogenia y clasificación del Filum Basidiomycota.



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Los hongos del filum Basidiomycota se reproducen de forma sexual y asexual como semuestra en la figura VIII, el ciclo de vida inicia con la germinación de 2 esporas conformando laslíneas de hifas monocarioticas (n) (micelio primario), que permite la sobrevivencia y mayor invasiónde estos hongos hasta que estas 2 líneas celulares converjan y se produzca la fase de reproducciónsexual. Esta fase sexual ocurre en 3 procesos: El primero es la plasmogamia, en el que después delcontacto las 2 hifas monocarioticas compatibles se fusionan originando hifas dicariótica (n+n) (miceliosecundario), Este micelio crece e invade el sustrato hasta que condiciones apropiadas, disparan losprocesos de formación del cuerpo fructífero en el cual ocurre la cariogamia , fenómeno en el que sefusiona los núcleos haploides formando el zigoto, y por último la meiosis proceso en que se da laformación de las esporas que luego se dispersaran y germinaran desarrollando nuevamente elmicelio primario. (Miles y Chang, 2004). Dentro de este clado destacan los géneros Agaricus(Champiñón), Lentinula (Shiitake), Pleurotus (Hongo ostra), Amanita, entre otros que conforman lamayor parte de los hongos comestibles.

Figura VIII Ciclo de vida de los Basidiomycota. Tomado y modificado de Jackson, 2010.

I.2.1 Género Pleurotus

El género Pleurotus fue descrito inicialmente por Kummer en 1871, comprende la familiaPleurotaceae del orden Agaricales, definiéndolo como setas con un carpóforo de estípite excéntrico,lateral o ausente; sin tejidos gelatinosos, lamelas decurrentes y conjuntas, que presentan esporas noamiloideas de color blanco o lila pálido, con una forma elíptico-cilíndrica, de un tamaño de 4μm delongitud o más; son hongos saprófitos en madera sésiles (Kummer, 1871). La Figura IX muestra larepresentación de estas setas establecidas en el año 1871.



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Figura IX La Seta ostra P. ostreatus (Jacquin: Fries). Tomado de Kummer, 1871.

El ciclo de vida del género Pleurotus se muestra en la figura X está basado en un sistema deincompatibilidad de especies heterotálicas bifactoriales; en que la cariogamia no es inmediata a laplasmogamia y genera una fase dicariótica o dicariofase (célula dicariótico, binucleada) con diferentesfactores de incompatibilidad conocidos como dicarión, el cual sigue creciendo de forma vegetativa

(Herrera et al., 1998). Después ocurre la reproducción sexual, el micelio en estado vegetativo formacélulas especializadas, los basidios en los que se llevar a cabo la cariogamia comenzando la fasediploide, que inmediatamente inicia el proceso de meiosis (Valencia del Toro, 2002).

Figura X Ciclo de vida del género Pleurotus Tomado de: Valencia-del Toro, 2002.



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Dentro del género Pleurotus se incluye las setas con una gran diversidad de especiesdistribuidas por todo el mundo; entre ellas: P. pulmonarius y P. cystidiosus localizadas en regionestropicales y subtropicales, P. eryngii en Europa, África y parte de Asía, P. djamor, P. smithi, P. levis, P.sajor-cajou, P. citrinopileatus y P. ostreatus en Latinoamérica (Kong, 2005).

I.2.1.1 Importancia del género Pleurotus

El género Pleurotus es uno de los grupos más importantes de las setas comestibles ymedicinales del mundo después de la especies Agaricus bisporus (Champiñón), Lentinula edodes (Shiitake) y Auricularia sp. (Oreja de Judas), comprendiendo el 14% del mercado mundial deconsumo de hongos comestibles (Tabla I); debido a su facilidad de cultivo, alto rendimiento yproducción de alimento de alto valor nutricional por su contenido de minerales, vitaminas y contenidode proteínas (Tabla II), por lo cual se le conoce también como "bistec vegetal" (Fennema, 2000).

El género Pleurotus resulta de suma importancia por sus aplicaciones en múltiples áreas: En

la agricultura por su capacidad de degradar una gran diversidad de substratos en un amplio rango detemperaturas (0°C a 30°C; Ardon,2007); permitiendo el aprovechamiento de diversos desechosagroindustriales (Morillo et al., 2012), como un depósito de nutrientes vitales (vitaminas y minerales)para potenciar las cosechas agrícolas, estos nutrientes quedan como subproducto de los cultivos deestos hongos en lo que se conoce como compost agotado; para ser utilizado como fertilizantes(Chang et al., 1981; Fasidi et al., 2008). En la biorremediación: por la habilidad de estos hongos deacumular metales pesados, degradación de petróleo debido a su alta actividad enzimática y variedadde catalasas (Pernía et al., 2012). En la medicina, la especie P. ostreatus son un agentequimioterapéutico por la acumulación de pequeñas concentraciones de cesio (agente activo en lasquimioterapias), presencia de sustancias antitumorales en el carpóforo (Ajith y Janardhanan, 2007);alto contenido de sustancias biológicamente activas de alto valor nutricional y propiedades curativas,de las que destacan antioxidantes (ácido ascórbico, compuestos de á-tocoferol, â-caroteno y fenoles),

que actúan de forma similar a la vitamina E (Murcia et al., 2002); sustancias reductoras (cisteína,metionina y lovastatina) que tienen el efecto de disminuir los niveles de colesterol en sangre y lapresión arterial. Son muy utilizados como alimento humano debido a su bajo contenido de grasa ysodio, alto contenido de potasio y de proteína; los hacen un alimento que controla padecimientoscardiovasculares y estados de hipertensión y combate la obesidad (Kumari y Achal, 2008).Así mismotienen potencial como alimento para animales en época de apareamiento como estimulante sexual ypara prevenir enfermedades que se presentan en esta etapa de reproducción (Potter y Hotchkiss,1995).



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Tabla I Producción mundial de hongos comestibles cultiva dos en 1986 hasta el 2010 Peso fresco. Tomado de Miles y Chang, 200modificado.Rodriguez, 2007.

Nombre1970 1974 1984 1981 1986 1990 1994 1997 2002 2010

ton % ton % ton % ton % ton % ton % ton % ton % ton % ton %

Agar icus bisporus 185 62 260 55 410 57 900 72 1220 56 1400 40,2 1850 37,6 2000 36,7 2240 35,4 2940 36

Lent inu la edodes 94 31 148 31 191 27 180 14 320 15 400 11,3 830 16,8 1600 28,8 1160 18,2 1430 17,

Pleurotus - - 8 2 22 3 40 2,8 170 7,8 900 25,4 800 16,2 900 16,1 930 14,6 1190 14,

Auricular ia sp. - - - - - - 10 0,8 120 5,5 400 11,3 420 8,6 500 8,9 600 9,47 840 10,

Volvar iel la volvacea - - - - - - 200 4,3 180 8,2 210 5,8 300 6,1 200 3,3 350 5,59 450 5,5

Flammulina velut ipes 11 4 42 9 63 9 100 4,8 100 4,6 140 4 230 4,7 300 5,2 290 4,53 360 4,4

Tremella fuc iform is - - - - 0 - - 40 1,8 40 1,1 160 3,2 - - 230 3,69 290 3,5

Hypsizygus

marmoreus - - - - 7 1 - - - - - - 60 1,1 - - 110 1,78 130 1,6

Pholiota nameko 8 3 12 3 20 3 20 1,35 30 1,1 20 0,6 30 0,6 60 1 60 1,01 80 0,9

Tr icholomamatsutake 2 1 - - - - 513 120 272 - - - - -

Grifola frond oSa - - - - 1 0 - - - - - - 10 0,3 - - 40 0,58 40 0,5

Otros - - - - 0 - - 10 0,5 10 0,3 24 4,9 - - 330 5,13 410 4,9

Total 300 100 470 100 714 100 1450 100 2190 100 4033 100 4834 100 5832 100 6340 100 8160 100

Incremento (%) - 36 34 51 73 62,9 38,5 10,8 16,5 28,



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Tabla II Composición proximal de proteínas, vitaminas y minerales de algunas especies de hongos comestibles, Los valores se expresan como mg/100de peso seco. Tomado de Chang y Miles, 2004; Miles y Chang, 1997.

Composición

Especie

Agar icus bisporus Flammu l ina velut ipes Lent inula edodes P. ost reatus V. volvace

Humedad (%) 78,3 - 90,5 89,2 90,0 - 91,8 73,7 - 90,8 89,1

Proteína cruda (N x 4.38) 23,9 - 34,8 17,6 13,4 - 17,5 10,5 - 30,4 25,9

Grasa cruda 1,7 - 8,0 1,9 4,9-8,0 1,6-2,2 2,4

Carbohidratos

Totales 51,3 - 62,5 73,1 67,5-78,0 57,6 - 81,1 -

Sin N 44,0 - 53,5 69,4 59,5-70,7 48,9 - 74,3 45,3

Fibra cruda 8,0 - 10,4 3,7 7,3-8,0 7,5 - 8,7 9,3

Ceniza 7,7 - 12,0 7,4 3,7-7,0 6,1 - 9,8 8,8

Valor energético 328 - 368 378 387-392 345 - 367 276

Vitaminas

Tiamina 1,1 - 8,9 6,1 7,8 4,8 0,3 - 1,2

Rivoflavina 3,7 - 5,0 5,2 4,9 4,7 1,6 - 3,3

Niacina 42,5 - 51,0 106,5 54,9 108,7 47,6 - 91,9

Ácido ascórbico 26,5 - 81,9 46,3 - - 20,2

Minerales

Ca 23 - 71 19 98 33 35 - 347

P 790 - 1425 278 476 1348 978 - 1337

K 2849 - 4762 2981 Nd 3793 2005 - 6144

Fe 0,2 - 19,0 11,1 8,5 15,2 6,0

Na 106 - 156 278 8,5 837 151 - 347



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I.2.1.2 Características del género Pleurotus

Las especies del género Pleurotus se caracterizan por presentar carpóforos blandos con unolor y sabor característico. Su tamaño depende del medio donde crecen, siendo más pequeño enmadera, que en substratos de desecho agroindustrial como de algodón y paja. Pueden ser de varios

colores, incluyendo el azul, blanco, crema a café, amarillo y rosa, negro violáceo, pardo, gris, segúnlas especies; la intensidad del color se puede alterar de acuerdo a cambios en los factoresambientales, como son la luz y la temperatura. En general, el color será más obscuro en condicionesde luz intensa y clima frío, o más claro en luz débil y clima caliente. El estípite en este género sedispone de forma excéntrica, lateral o se encuentra ausente, inclusive algunas veces estos soncentrales, engrosados gradualmente hacia el lado del píleo, generalmente miden 2 cm de largo, 1 - 2cm de grosor, y de coloración blanquecina y contraste blanco, no presentan velo ni anillo, excepto enalgunas especies (Phillips, 1991). Como se observa en la figura XI el género Pleurotus presenta píleoliso y convexo, raramente redondo, casi siempre en forma de ostra o concha, y en las etapas másviejas llegan a ser tipo embudo, pueden presentar escamas hacia el centro o en la base y de untamaño de 5 - 30 cm de diámetro. El himenóforo presenta laminillas con disposición decurrente,anastomosadas en la base, anchas, blancas, blanquecinas y a veces amarillas o grises, con un trama

himenoforal completamente irregular, conformada por hifas de pared delgada o gruesa, sus esporasde color lila o crema en masa, en forma elipsoides de un tamaño promedio de 9,5 x 3,5 µm; losbasidios normales tetrapolares y cistidios como los queilocistidios usualmente presentes, unsubhimenio bien desarrollado y bien diferenciado y una trama del píleo inamiloide, con numerosasfibulas (Singer, 1986; Largent y Stuntz, 1977; Largent et al., 1977).

Figura XI Características anatómicas del género Pleurotus. Tomado de López y García, 2004.



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A. Caracterización morfológica del género Pleurotus

Los caracteres morfológicas en los hongos del género Pleurotus son herramientas o una guíapara las descripción e identificación científicas de las especies (Kohn, 1992).Para lo cual se hangenerado una gran cantidad de términos morfo-descriptivos que tratan de explicar de manera másprecisa cada uno de los caracteres observados como forma del carpóforo (píleo, himenio y estípite)

(Delgado-Fuentes et al., 2005). Los principales elementos utilizados para la caracterización deespecies del género Pleurotus son: setas con una forma plana a convexa, con colores grises, beige,café claros. El tamaño en los carpóforos va de 4.0 a 16.0 cm, con un margen ligeramente enrollado,láminas delgadas, que se engrosa y densifica de colores crema a marfil, con inserción al píleo deforma decurrente. El tamaño del estípite varia de 0.4 a 4.0 cm, localizado de forma lateral aexcéntrico, cilíndrica y estriado sólido, con colores crema a marfil, algunas veces flexible, frágil,elástico. Las basidiosporas son subcilíndricas a cilíndricas de 6.5 – 13.5 X 3.0 – 5.0 μm (Eger et al.,1979), las colonias dicarióticas tienen micelio denso y algodonoso, de crecimiento radial, algunasveces marginal y colores que van del blanco al marfil.

La caracterización morfológica también ha abordado el estudio del micelio en medio de cultivoconvencionales para su aislamiento y conservación, los cuales son pasos iniciales para el cultivo deestas setas de forma artesanal o industrial, de los que se ha reportado que en el medio Agar PapaDextrosa (PDA) a 25°C especies como P. ostreatus tiene textura algodonosa, de color blanca,crecimiento de la colonia de forma regular y crecimiento hifal abundante, con rangos de crecimientode 0.1 mm/h y 2.09 g/L/día de biomasa fresca; en otros medios como el medio Sabouraud presentatextura polvorienta, de color beige, hifas abundantes y crecimiento de la colonia fúngica de formaregular, con rangos de crecimiento de 0.08 mm/h y 2.68 g/l/día de biomasa fresca (Sobal et al., 1989).

B. Caracterización fisiológica del género Pleurotus

En el género Pleurotus los carpóforos representan una estructura transitoria dentro de su ciclo devida. Así el conocimiento ecológico, taxonómico y fisiológico de las especies dentro de dicho génerodebe ser complementado con el estudio de las fases tróficas de éste, analizando principalmente elmicelio vegetativo; punto donde se encuentra la mayoría de la funciones de estos hongos en losecosistemas debido a las capacidades bioquímicas y fisiológicas de estas estructuras. El estudio delas capacidades bioquímicas del micelio de especies del género Pleurotus no sólo provee de unaherramienta experimental para la descripción de los aspectos ecológicos y fisiológicos de dichosorganismos; proporcionando también elementos para el desarrollo de procesos o productosbiotecnológicos (capacidad del micelio vegetativo de degradar polifenoles aromáticos y sustanciascarcinogénicas y absorber metales tóxicos del ambiente) (Pointing, 2001; Baldrian y Gabriel, 2003).

Adicionalmente, diversos estudios han demostrado la capacidad de las especies del género Pleurotuspara producir lacasas extracelulares (Hammel, 1997), enzimas que participan en la degradación de lalignina que compone la madera y los sustratos en los cuales estas especies son fructificadas confines comerciales. Todo este potencial metabólico permite que las especies del género Pleurotussean empleadas en la bioconversión de desechos de materia orgánica para la producción decomposta y fertilizante de suelo (Croan, 2000). Hasta la fecha se han realizado diversos reportes yestudios bioquímicos y fisiológicos de distintas especies del género Pleurotus para caracterizar elcomportamiento in vitro del micelio vegetativo. No obstante, los estudios detallados en ese sentidodesarrollado en un número reducido de especies del total existente dentro del género. Siendo escasoel estudio bioquímico, genético y fisiológico de cepas silvestres (Sánchez y Royse, 2001).



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a. Factores que afectan el crecimiento y la fructificación de especies delgénero Pleurotus

Los hongos del género Pleurotus; como otros microorganismos, se ven afectados por factoresabióticos y bióticos, cada uno de estos factores, en un rango delimitado por un punto mínimo y unpunto máximo, bajo y sobre los cuales no ocurrirá crecimiento; según Sánchez y Royse (2001) por:

Temperatura: La variación de la temperatura, afecta el metabolismo de las células, incluyendo laactividad enzimática, y la fluidez de los lípidos de la membrana celular; variando entre especies yademás en las diferentes etapas de su ciclo de vida. Teniendo una temperatura óptima degerminación de las esporas distinta a la temperatura óptima de crecimiento micelial o de la defructificación. Algunas especies de este género pueden crecer en el rango de temperaturas desde los0 ºC a 35 ºC, con temperaturas óptimas de 30°C para la germinación, 28 ºC para el crecimientomicelial y 25°C para la fructificación.

pH: En el género Pleurotus el rango de pH para el crecimiento micelial oscila entre 4 y 7 con un

óptimo entre 5,5 y 6.

Sustrato: Estos hongos son saprófitos descomponedores de sustratos ricos en lignocelulosa,reportándose su desarrollo sobre desechos agroindustriales, obteniendo un óptimo crecimiento yfructificación en bagazo de trigo, cebada, centeno, avena, maíz, y arroz; tuza de maíz, tallo de sorgo;y sustratos con alto contenido de polímeros, azucares y lípidos.

Carbono: Las fuentes de carbono de estos microorganismos por lo general son polímeros denaturaleza lignocelulósica ( la lignina, la celulosa y la hemicelulosa); además azúcares (la glucosa, lamanosa, la galactosa y la fructosa); y lípidos que se han reportado que la adición de aceites vegetales

con un aumento del crecimiento micelial, los productos de la hidrólisis de estos (glicerol, ácidosgrasos y saponinas) deprimen el crecimiento, pero la adición de triglicéridos y metil ésteres de ácidosgrasos generalmente promueven su crecimiento.

Nitrógeno: Aunque a los hongos del género Pleurotus son capaces de degradar substratos con unbajo contenido de nitrógeno, son capaces de emplear fuentes de nitrógeno inorgánico como Nitratode potasio o la urea; como también fuentes orgánicas.

Relación C/N: En general estos hongos crecen en relaciones de C/N del 0,4 a 1,5; que en relacionesde Carbono y Nitrógeno de 1-1,3 se da el crecimiento micelial óptimo, mientras que una relación C/Nmenos 0,6 se favorece la fructificación de los carpóforos.

Minerales y Vitaminas: No son capaces de crecer en ausencia de calcio, fósforo, potasio ymagnesio; y presentan una auxotrofia de tiamina, en una concentración óptima de 100 mg/l.

La humedad en el substrato: La humedad en el sustrato influye directamente sobre el desarrollo delhongo ya que afecta la disponibilidad de nutrientes; por lo cual este hongo a contenidos de humedadinferiores al 50% y mayores al 80% tendrá un efecto negativo en el crecimiento de P. ostreatus. El



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contenido óptimo de humedad depende no solo de la especie de hongo que se cultiva, sino tambiéndel tipo de substrato utilizado.

La humedad del aire: Factor fundamental para una óptima fructificación, dado que el miceliosecundario está formado por un alto contenido de agua y su estructura no les permite retener lahumedad en condiciones adversas, un balance adecuado entre la humedad ambiental y el contenidode humedad del hongo es necesario, por lo que para una correcto desarrollo la humedad debe estarentre 85-90 %.

Tamaño del sustrato: El tamaño del sustrato afecta el crecimiento y la fructificación, porque serelaciona con la accesibilidad a los nutrientes, al agua y al aire por parte del micelio del hongo; enrelación a esto el tamaños del sustrato para un óptimo de desarrollo es de 2-3 cm.

La aireación: El oxígeno es un elemento de gran importancia para el crecimiento de losbasidiomicetos porque son organismos aerobios, que tienen requerimientos de oxígeno diferentessegún el estado fisiológico en que se encuentren, de lo cual concentraciones altas de CO 2 estimula lagerminación de las esporas y el crecimiento micelial pero inhibe la fructificación; obteniendo unóptimo de crecimiento micelial a 28% de CO2 presente en el aire. Por otra parte en ausencia de CO2 se ha encontrado pérdida de materia orgánica y la deslignificación del substrato a una mayor tasa.

b. Cinética del crecimiento micelial

El crecimiento del micelio en los hongos filamentosos como los del género Pleurotus seefectúa por la elongación y ramificación de las hifas que puede iniciarse a partir de una espora o deuna fracción viable de tejido, dicho crecimiento se da en forma apical, por la elongación y división dela célula terminal produciendo un crecimiento típico en forma de micelio (Cano et al., 1997; Parladé

Izquierdo et al., 2011). Según el medio en el que se establecen los hongos filamentosos (líquido osólido), procede la extensión y ramificación de sus hifas (Matsuura, 2000), establecidas por eldesarrollo espacial determinístico y el ángulo que se forma al surgir sus nuevas hifas; considerándosela presencia de dos diferentes tipos de hifas (madre y ramificada) caracterizadas por diferentesvelocidades de desarrollo y la disposición de nutrientes en el medio de cultivo (Camacho, 2009).

i. Crecimiento micelial en medio sólido

En la naturaleza los hongos del género Pleurotus suelen crecer en sustratos orgánicossólidos, principalmente aquellos de naturaleza lignocelulosica que se encuentran húmedos y

aireados, lo cual los hace ideales para propagación de inóculos a ser utilizados en procesos de cultivoen medios en estado sólido, en los que se busca que el micelio invada lo más extensamente posibleel sustrato, utilizando esta estrategia se han creado procesos para: producción de biomasa destinadaa la alimentación humana o animal (C. W. Hesseltine, 1972), composteo de desechos orgánicos parala obtención de abonos (A. Pandey, 1992), y de sustratos para el cultivo de otros hongos comestibles(Derikx et al., 1990). Sin embargo, ha sido el estudio del crecimiento micelial de estos hongosfilamentos abordado a través del cultivo en placas de agar para el estudio de los mecanismos decrecimiento en éste sistema de cultivo; permitiendo la observación de las condiciones de limitación defuentes de carbono, la formación de hifas y micelio de baja densidad o menor frecuencia deramificación (Trinci, 1969, 1971, 1974); obteniendo como resultado que en medios solidos lascolonias fúngicas se forman a partir de hifas que crecen apicalmente, ramificándose, las cuales se



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superponen una con otra para el llenado de áreas disponibles en el medio, formando complejas redesradiales con bordes irregulares que le permiten al hongo desarrollarse y encontrar sus nutrientes(Soddell et al., 1994; López y Jensen, 2002; Matsuura, 2002), a una tasa que varía según el estadiodel micelio y la disposición de los nutrientes (Yang et al., 1992); condiciones en que el crecimiento delas puntas y ramificaciones del micelial joven siguen una distribución normal y las hifas madrefúngicas se extienden a una velocidad lineal constante cuando los nutrimentos del medio sonilimitados y algunos otros factores ambientales permanecen estables.

El cultivo en medio sólido (CMS) de micelio del hongo del género Pleurotus, es el métodocomún de propagación del micelio para su posterior utilización en la producción de inóculos ―semilla‖y consiste en el crecimiento de micelio en granos de cereales (trigo, sorgo, arroz, etc.), una vezobtenido el inóculo-grano se mantiene en condiciones óptimas para su conservación, hasta suutilización para inocular el sustrato que se empleará para la producción de cuerpos fructíferos(Guillén-Navarro et al., 1998). Una alternativa para la obtención de ―semilla‖ es la utilización demicelio crecido en medio líquido ya que permitirá producir mayor cantidad de biomasa de mejorcalidad en menor tiempo, favorecerá la adaptación y dispersión del hongo en el trigo y facilitará sumanipulación durante la siembra. La caracterización de la morfología de crecimiento micelial esimportante en los estudios fisiológicos y de ingeniería de los hongos filamentosos, como en el diseñoy operación de fermentaciones fúngicas. Los sistemas de CMS que se utilizan en el cultivo de loshongos como Pleurotus, son mecanismos geométricamente complejos con distribución espacialheterogénea de los componentes del sistema. Por lo que el crecimiento está determinado por losgradientes de concentración que son difíciles de medir, por lo que se hace énfasis en la producciónde carpofóros para hacer evidencia del efecto del sustrato en el desarrollo del hongo (Mitchell et al.,1991).

ii. Crecimiento micelial en medio líquido

Dependiendo de la composición del medio y de las condiciones de cultivo, en los medios

líquidos el desarrollo del micelio de los hongos filamentosos como los del género Pleurotus varía, así,en condiciones de reposo provoca que el micelio de estos hongos crezca sólo sobre la superficie dellíquido, o en condiciones de agitación, en las que el micelio crece en todo el volumen pudiendo o noformar pellets (pequeñas esferas de micelio). En estos medios los hongos suelen presentar undesarrollo típico, similar al de otros organismos y que consta de las siguientes fases: de adaptación oLag, estacionaria, declinación y muerte. Este desarrollo se puede representar de manera gráficamediante una curva del peso celular seco o biomasa en gramos por litro (mg/ml) versus tiempo deincubación (T). Cuando el crecimiento de un hongo se da en un medio sólido en lugar de faseexponencial se presenta una fase de crecimiento más o menos lineal (Lilly y Barnett, 1951). En lafigura XII se muestra el comportamiento típico del crecimiento de un hongo en medio líquido.

Fase de adaptación o Lag: Es una etapa en la que no se observa un crecimiento vigoroso, más bienlos organismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia denutrimentos generalmente) para poder iniciar el crecimiento exponencial.

Fase exponencial o logarítmica (log): Una vez que el hongo crece en el medio nutritivo, ocurre unafase de crecimiento equilibrado, donde se duplica la población de células a intervalos regulares, enesta etapa se aprovechan al máximo los nutrimentos y son consumidos continuamente.



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Fase estacionaria: En esta fase el crecimiento cesa, está equilibrado por la muerte celular, esta fasese alcanza si disminuye algún nutrimento esencial u otro cambio en el medio físico. Esta fase tienegran importancia porque probablemente represente el estado metabólico real de los microorganismosen muchos ambientes naturales. El hongo puede reiniciar su crecimiento si es resembrado en nuevomedio propicio. En esta fase se producen diversos tipos de enzimas autolíticas que conducen a lamuerte del hongo (Sánchez y Royse, 2001).

Fase de declinación y muerte micelial: Al acumularse desechos metabólicos del hongo, puedenalcanzar niveles que limiten su crecimiento, o si algún nutrimento se termina. Pueden aparecermutaciones celulares, esto explica por qué la resiembra continua de un organismo en un medio decultivo, sobre todo sintético, puede conducir rápidamente al agotamiento de la cepa o a la pérdida dela misma (Sánchez y Royse, 2001).

Figura XII Crecimiento del P. ostreatus ECS-0110 en medio líquido. Se observan las diferentes fases dedesarrollo: L: latencia; E: exponencial; D: declinación; S: estacionaria. Condiciones de cultivo: caldo de glucosa-extracto de levadura, agitación 200 rpm, aireación 1 vvm y temperatura 26°C. Tasa de crecimiento 0,036 h -1.Tomado de Marquez-Rocha et al., 1999.

C. Caracterización molecular de especies del género Pleurotus

La taxonomía del género Pleurotus basada en diferencias morfológicas por mucho tiempo fuecorrecta, pero muchas veces ante la plasticidad de los caracteres morfológicos debido a lascondiciones climáticas en las que se desenvuelven, hicieron que fuera difícil la distinción entrealgunas especies, aislados y/o cepas de Pleurotus ampliamente conocidos. Por lo que otrasherramientas como la genética molecular permitieron avanzar en la taxonomía de este género,técnicas fundamentadas en identificar y diferenciar las especies del género Pleurotus a través de ladeterminación de las similitudes en las secuencias de genes y proteínas muy conservados dentro delgrupo.

Las herramientas moleculares aplicadas a la taxonomía, han permitido determinar lasecuencia de nucleótidos del ADN, y realizar la caracterización estructural de los genes, lo quepermitió analizar cualquier fragmento de ADN y detectar regiones regulatorias, genes estructurales eintrones, la secuencia de aminoácidos que codifican estos genes. A su vez la secuenciación denucleótidos y proteínas estímulo al desarrollo de software para almacenamiento de datos ycomparación de secuencias de ADN para la creación de bancos de información de ADN de diferentesseres vivos, donde pueden consultarse y compararse todas las secuencias de los genes y de losgenomas y proteomas que han sido publicadas (Bolívar, 2004).



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I.2.1.3 Cultivo del género Pleurotus

El cultivo de Pleurotus de forma industrial, a pesar de ser relativamente reciente; ha tenido unagran atención como proceso biotecnológico que permite la desgregación de la variedad de substratoslignocelulósicos en un amplio rango de temperaturas permitiendo así aprovechar diferentes desechosagronómicos, fundamentado actualmente en el CMS y la FES, utilizada tanto en la transformación de

residuos en alimentos para animales, como en la producción de alimento de alto potencial nutricionaly biofertilizante. Así mismo, en la fermentación líquida sumergida para la producción de biomasa,complejos biológicos activos y enzimas (Smith et al., 2002).

A. Fermentación en estado sólido con Pleurotus

La FES es un proceso de transformación de material biológico en el cual el sustrato sólido carecede agua libre permitiendo el desarrollo de microorganismos que crecen sobre la superficie o en elinterior de una matriz porosa, El término FES fue empleado por Hesseltine (1977) como un procesode fermentaciones en las que el sustrato empleado no es líquido, posteriormente se platea que esta

definición debe ser usada para el crecimiento y desarrollo de microorganismos en materiales sólidosno sumergidos en una fase líquida. La FES es utilizada tanto en la producción de ensilados, como enel cultivo de hongos comestibles y en procesos biotecnológicos industriales con la obtención demetabólitos primarios y secundarios como enzimas, químicos, alcohol y su aplicación como cultivosiniciadores (Roussos et al., 1997). El cultivo de hongos comestibles por fermentación solida es vistocomo la forma más eficiente de conversión de residuos vegetales en alimento de alto valor nutricionalcuya importancia ecológica de esta actividad económica radica en la utilización y reciclaje de más de280.000 toneladas anuales de subproductos agrícolas y agroindustriales que pueden ser puros omezclados (Bermúdez et al., 2003). El Cultivo de Pleurotus por FES ha implicado la utilización desustrato sólido en matrices, medios agarizados, y desecho de naturaleza lignocelulósicos; para ladegradación de la lignina, la producción de alimento animal o la producción de enzimas (Gregori etal.,2007).

a. FES para la producción de biomasa micelial y hongos.

La FES biomasa micelial se ha utilizado en el cultivo de Pleurotus a través de mediosagarizados, medios como extracto de malta agar (MEA) y Agar Papa Dextrosa (PDA) que hanpermitido la caracterización de estos microorganismo, determinando las tasas de crecimiento micelial,las condiciones óptimas de crecimiento micelial del hongo, y evaluar los efectos fisiológicos de latemperatura, diferentes fuentes de carbono, nitrógeno y suplementos de sales inorgánicas sobre elmicelio (Guo et al., 2006); además por medio del cultivo de estos hongos en sustratos noconvencionales como los desechos agroindustriales para la producción de micelio y la producción de

hongos; método en que se ha podido estudiar los diferentes sustratos y las proporciones de estospara el crecimiento optimo del micelio, la propagación del micelio dentro del sustrato, la inducción dela fructificación y el rendimiento de producción (Yildiz et al., 2006).

b. Uso de los desechos del cultivo de Pleurotus por FES.

La FES de desechos agroindustriales para el cultivo de Pleurotus, ha sido una técnica quepermite la transformación de desechos agroindustriales para la producción de un alimento de alto



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valor nutricional, dando origen a diferentes subproductos tras la colecta de la cosecha del cultivo,denominados como compost agotado; producto con propiedades de interés en la agricultura por elpotencial de estos residuos y subproductos agrícolas, ya sea para la transformación en alimentospara animales o como sustratos primarios para la producción de enzimas por otros microorganismoso a partir de estos desechos.

B. Fermentación líquida sumergida con Pleurotus

La técnicas de la fermentación liquida sumergida (FLS) se han desarrollado para una variedad dehongos y la propagación de micelio para la producción de semilla líquida que luego es inoculo para lafructificación por FES; la producción de biomasa para alimento animal, aplicaciones farmacéuticas yde suplementos dietéticos, además de la conversión de biomasa de residuos y la producción deenzimas; siendo así un método que permite la posibilidad de alta producción de biomasa en unespacio compacto, menos tiempo y con menos posibilidades de contaminación (Yang y Liau, 1998;Friel y McLoughlin, 2000).



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CAPITULO II

ANTECEDENTES

II.1 Los hongos

Se estima que existen 1,5 millones de especies de hongos y 140 mil corresponden a hongosmacroscópicos, de los que se conoce sólo el 10%. Un amplio número de estas setas han mostradouna gran cantidad de propiedades farmacológicas y potencial con alimento de alto valor nutricional;estimándose recientemente entre 270 a 700 las especies de hongos comestibles y medicinales(Smith et al., 2002; Wasser, 2002).

La capacidad de los hongos de tener efectos benéficos en la salud y en el tratamiento dealgunas enfermedades (Selegean et al., 2009), es debida seguramente a la biosíntesis de metabolitos

secundarios biológicamente activos. Hoy en día, estructuras de alrededor de 140 mil metabolitossecundarios aislados de basidiomicetos se ha elucidado (Zaidman et al., 2005). Las aplicaciones delos hongos, sus extractos y compuestos se incluyen en complementos medicinales o suplementosdietéticos, como agentes anticancerígenos, antivirales, inmunopotenciadores, hipocolesterómicos yhepatoprotectores, formando una nueva clase de compuestos llamados nutracéuticos (Chang, 2008).Dentro de los hongos comestibles con propiedades medicinales está el género Pleurotus (Croan,2000) que es ampliamente conocido como hongo medicinal en diferentes partes del mundo (Ajith yJanardhanan, 2007).

II.1.1 Los Hongos comestibles

Los hongos comestibles en la actualidad comprenden cerca de 14000 géneros de hongossuperiores de los fila Basidiomycota y Ascomycota, como son Agaricus sp. comúnmente llamado―hongo blanco‖, ‖champiñón‖ u ―hongo de botón‖ difundido en países del occidente; Lentinula sp.denominado ―el hongo negro de los bosques‖, ―hiang-gu‖ para los chinos y ―shiitake‖ para los

japoneses, siendo uno de los hongos comestibles más producido en el oriente de Asia ; Pleurotus,nombradas también ―oreja‖, ―hongo orellana" u ―hongo ostra‖; Amanita sp. Y Auricularia sp. (Oreja de

judas), son importantes fuentes de proteína que tienen un alto potencial para enriquecer la dietahumana; caracterizados por poseer cuerpos fructíferos que pueden ser cosechados fácilmente bajocondiciones específicas de cultivo dependiendo de la especie que se desee cultivar; además tienengran importancia etnomicológica, ya que son muy estimados por diversos grupos étnicos, a nivel

mundial su producción representa la mayor industria basada en FES (Miles y Chang, 2004;Hernández y López, 2006). Estos microorganismos han sido parte de la dieta humana desde hacevarios siglos por la capacidad de producir variedad de metabolitos segundarios con potencialnutricional y moléculas biológicas activas que favorecen la calidad de vida del hombre, como son losantibióticos, agentes antitumorales, antiinflamatorios, anticolesterolémicos y antioxidantes (López-Rodríguez et al., 2008).



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II.1.2 Historia del cultivo de los hongos comestibles

El cultivo de hongos comestibles es una actividad productiva basada en tecnologías limpiaspara el ecosistema fácil de realizar, que se puede desarrollar en forma personal, grupal, familiar ypor comunidades; esta actividad se ha realizado desde la época de la antigua Grecia (1200 A.C.)

que se llevaban de forma abierta, basada en recolectar numerosas especies de hongos que crecíana la intemperie sobre los árboles, más tarde en el año 60 A.C. es cultivado por primera vez en Chinael género Auricularia spp., desde entonces se han desarrollando diversos métodos para su cultivo,(S. Chang y Miles, 1989) luego los romanos y los celtas implementaron el cultivo ya no solo comoalimento sino por sus propiedades medicinales y tóxicas, sino también por las propiedadesalucinógenas de algunas especies, siendo utilizados para rituales; después en la Edad Media eranun alimento de consumo sólo a la realeza. En el siglo XVII se inicia en Francia el cultivo bajocondiciones cerradas, en España se logra industrializar explotando el cultivo de especies como

Agaricus sp. (Champiñón) y Lentinula sp. (Shiitake). En el siglo XXVIII comienza el cultivo dePleurotus de forma industrial con la FES abierta; abordando esta actividad una gran parte de Europa,posteriormente en Francia, Hungría, Italia y Checoslovaquia se desarrolla su cultivo por FES cerrada.Simultáneamente en América el cultivo de hongos comestibles se derrollaba por las etnias desde

varios siglos atrás con el cultivo de hongos alucinógenos (Hernández y López, 2006).

Desde los años 70 se desarrollo en varios países de Latinoamerica (México, Ecuador, Chile yPerú) el cultivo de hongos comestibles de forma industrial, basados en el cultivo de especies delgénero Pleurotus por las facilidades de cultivo y propiedades, como sus pocas necesidadesnutricionales, fácilidad de adaptación a los ambientes de cultivo, requiriendo de técnicas simples yeconómicas; siendo los desechos agroindustriales una de las mejores fuentes de carbono, nitrógeno,azufre y fósforo necesarias para el desarrollo adecuado de la biomasa fúngica de estos hongos(Cabrera et al., 1998; Madigan et al., 2008).

En Venezuela el cultivo de hongos comestibles ha sido una actividad que se ha venidodesarrollando desde 1968 con el cultivo del champiñón ( Agaricus bisporus), extendiéndose a laproducción del hongo ―Orellana‖ (Pleurotus ostreatus) como un alimento gourmet; partiendo deaislados importados de países como Argentina, México, EEUU y España (Torres y Hurtado, 2003);actualmente desarrollada en los estados Trujillo y Táchira, comercializándose de forma fresca oenlatados. Sin embargo, por sus propiedades los hongos comestibles como los pertenecientes algénero Pleurotus ha sido de interés de estudio por los últimos 60 años en país, como una alternativade producción de extractos enzimáticos útiles como fuentes de enzimas fibrolíticas exógenas para elalimento de rumiantes (Márquez-Araque et al., 2007), para la degradación de desechosagroindustriales (Miro, 2004) y descripción de la micodiversidad presentes en el país (Dennis, 1970;Iturriaga y Minter, 2006).

II.1.3. Taxonomía del género Pleurotus

La taxonomía y caracterización de las especies del género Pleurotus han resultado difíciles alrealizarse por los micólogos para identificar y diferenciar unos de otro debido al parentesco morfo-anatómico del carpóforo entre en cada especie y cepa como respuesta a las condiciones ambientalesen que se encuentre (Zervakis et al., 2001). Sin embargo, ante este sesgo se ha encontrado entreestos organismos debido a las barreras de reproducción no absolutas que implican incompatibilidadparcial y un proceso de especiación, siendo necesario otra herramienta para el taxónomo en la



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descripción y distinción de especies como la intercompatibilidad (Cailleux et al., 1981). La especiacióndentro del Reino Fungí se ha visto influenciada por el control genético de dos importantes eventos ensus ciclos de vida; como son el apareamiento y la fructificación, puntos que conllevan a la variación,selección y el aislamiento de estos microorganismo; mecanismo que se ha podido observar en elgénero Pleurotus, como es en los aislados de P. ostreatus que se originan en diversas partes delmundo y que al cruzarlos crecen en diferentes substratos reflejan hasta un 100% de compatibilidad,resultando híbridos viables y que desarrollan carpóforos fértiles. Sin embargo, la compatibilidad sereduce, cuando al intentar la hibridación entre las especies con morfovariantes alopátricas comoaislados de P. abalonus y P. cystidiosus, o con diferentes ecotipos de P. eryngii ; se presentanbarreras totales de reproducción entre las especies de Pleurotus que a veces son morfológicamenteindistinguibles (Bermúdez et al., 2003). Se ha encontrado que la especiación en este génerocontempla un sistema de incompatibilidad heterotálico bifactorial, el cual consta de dos factoresubicados en dos loci independientes entre sí (A y B), denominados loci de incompatibilidad o genesde apareamiento; conformados a su vez por uno o más subloci fuertemente unidos y funcionalmenteequivalentes por la compatibiliad de un locus del tipo de apareamiento heterocigótico de uno de losdos subloci; regiones genéticas que constan de más de 100 alelos del tipo de apareamiento por locusde incompatibilidad (Raper, 1966). La diversidad de alelos es atribuida a todas las combinacionesalélicas posibles de dichos subloci a través del proceso de recombinación para originar una progeniefértil (Larraya et al., 2001; James et al., 2004; Ramírez et al., 2010).

A pesar de todos los esfuerzos por aclarar el clado, la taxonomía de las especies dePleurotus, sigue siendo confusa; a pesar de que el estudio morfológico y de intercompatibilidadparcial de especies fueron herramientas que por largo tiempo soportaron la taxonómia para distinguiry clasificar a estos microrganismos (Sánchez y Roysee, 2001). Estas herramientas aún tienenalgunas delimitación entre la resolución de los clados de especies a menudo difíciles de resolver, queviene a consecuencia de la definición de especie biologica definida como grupo de organismosiguales capaces de entrecruzarse y de producir descendencia fértil; pero para el caso de estoshongos y otros, se maneja el concepto "complejo de especies" que se aplica ampliamente para definirespecies estrechamente relacionadas que son completamente o parcialmente intercompatibles(cruces fértiles) y pertenecientes a un grupo interestéril dado. Para el género Pleurotus se hanpropuesto varios complejos de especies (Bao et al., 2004; Zervakis et al., 2001). Dada su ampliadiversidad y su complejidad estructural, fisiológica y morfológica, ha sido necesario clasificarlos segúnsus características más intrínsecas como la interesterilidad o sistema de incompatibilidad sexual, conla cual se permitió diferenciar y categorizar las diferentes especies, sinónimos y/o taxas de nivel desubespecies en 11 grupos de complejos de especies (Tabla III), indicando además la posibilidad decompatibilidad entre ella, la posibilidad de crear nuevas especies dentro de este género; llevando alas necesidad del uso de otras herramientas como la biología molecular que ha conducido la mejorcomprensión de la identidad, variación genética y filogenia del género Pleurotus y otrosBasidiomycota; a través del uso de marcadores moleculares de RFLP y secuenciación de ADN dediferentes regiones del genoma nuclear y extracromosómico (Vilgalys y Sun, 1994; Zervakis et al.,1994; Gonzalez y Labarère, 2000; Zervakis el a., 2004).



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Tabla III Especies biológicas establecidas dentro del género Pleurotus, sus sinónimos correspondientes y/o taxa de nivel de subespecies, y gruporespectivos de íntercompatibilidad; y su distribución mundial. Tomado: Vilgalys et al., 1996) y Kong,. 2005.

EspecieSinónimos y/o taxa de nivel de sub

especiesGrupos

Norte América

Europa Asia Américadel Sur

África Australi

Pleurotus otreatusP. combilunus; P. florida; P. Salignus;

P. spodoleucus I * * *

P. pulmonarius P. sajor-caju; P. sapidus II * * * *

P. populinus III *

P. cornopopiae P. citrinopeliatus IV * *

P. djamorP. flabellatus; P. otreatoroseus;

P. salmoneostramineus; P. euosmus V * * * * * *

P. eryngiiP. ferulae; P. nebrodensis; P.

hadamardii VI * *

P. cystidiosus P. abolanus VII * * * * *

P. caliptratus VIII *

P. levis VIII *

P. dryinus IX * *

P. purpureo-olivaceus X *

P.turber-regiun XI * * * *

P. agaves XI *

P. abieticola XI *

P. brazil XI *

P. australis XI *



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II.1.3.1 El control genético y morfológico del proceso de fructificación

La morfogénesis de los carpóforos del género Pleurotus como de otros basidiomicetos, es uncampo ampliamente investigado en la actualidad, tanto a nivel fisiológico como genético; revelando laexistencia de una serie de genes expresados exclusivamente en alguna fase del desarrollo de estos

cuerpos fructíferos (Lacourt et al., 2002; Lee et al., 2002; Sunagawa y Magae, 2005),entre los que seencuentran los genes hidrofobínicos presentes en tanda, siendo genes marcadores de compatibilidadque determinan el establecimiento del tipo de micelio fértil de estos hongos, como también diferenciarentre micelio monocariótico y dicariótico (Koltin et al., 1972).Por otro lado, se ha comprobado que enla morfogénesis de los carpóforos de las especies de Pleurotus, no solo influyen aspectos genéticos,sino también factores ambientales como la intensidad luminosa y temperatura (Eger, et al., 1974;Marino et al., 2003). Estudios han determinado que la respuesta morfogenética en Pleurotus,depende principalmente del intervalo de longitud de onda de la luz situado entre 200 - 400 nm,correspondiente del ultravioleta al azul respectivamente (Tan, 1977). También se observó que aldisminuir la intensidad de luz, el estípite se alarga y adelgaza, el píleo se reduce parcialmente, elincremento en la duración e intensidad luminosa disminuye el número de primordios; por otro lado, seha reportado que la luz verde retarda el crecimiento micelial, produce la formación de primordios y su

elongación aunque el desarrollo de carpóforos solo se induce con luz blanca (Zadrazil, 1978; Danai etal., 1998).

A. Métodos utilizados para la obtención de ADN genómico en hongos.

Para la identificación del género Pleurotus, se pueden emplear algunas técnicas molecularesque faciliten descripción y la selección de rasgos cuantitativos tales como la tasa de crecimiento,rendimiento agronómico, acumulación de metabolitos de interés, así como también de característicasde resistencia a patógenos y formación de esporas (Ramírez et al., 2010). Sin embargo, el análisisgenético de muchas especies del género Pleurotus como de otros hongos utilizando técnicas de

biología molecular, resultan ser procesos lentos debido, inicialmente, a los métodos de extracción de ADN utilizados (Graham et al., 1994), siendo a través del tiempo modificados las diferentesmetodologías para el proceso de obtención de ADN genómico en plantas y hongos, arrojando quedependiendo de la especie que se pretenda utilizar, se pueden aplicar procesos de rompimientomecánico de membranas para liberar núcleos, lisis celular y extracción con amortiguadores(compuestas de Sales, bromuro de hexadeciltrimetil amonio o Triton), seguidas de extracciones conFenol-Cloroformo, sucesivas centrifugaciones y precipitación con alcoholes, principalmente etanol eisopropanol y, con la finalidad de obtener ADN más limpio y puro, se puede acoplar en la metodologíael uso de enzimas tales como la ARNasa y proteinasa K, así como lavados con fenol equilibrado.

Actualmente existen reportes de diferentes metodologías para la extracción de ADN genómico deorganismos vegetales como los protocolos de Murria y Thompson (1980), Dellaporta et al. (1983) ySaghai-Maroof et al. (1984) y debido a la similitud estructural entre plantas y hongos (Zolan y Pukkila,

1986) y diferentes especies de género Pleurotus (Gonzalez y Labarère, 2000).

B. Aplicaciones de técnicas de la biología molecular del género Pleurotus

El RFLP en los años 90, fue una de las primeras herramientas de biología molecular para ladiscriminación de especies y la intercompatibilidad entre estas en el género Pleurotus, haciendodiscriminación con base en a las diferencias hereditarias, en las longitudes de fragmentos de ADNque se generan por la digestión con una endonucleasa de restricción, reflejando relaciones estrechasen los patrones de digestión entre especies como P. citrinopileatus y P. cornucopiae que por estudios



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de intercompatibilidad se le asoció a P. citrinopileatus como una variedad de P. cornucopiae (Ohira,1990), y tras este método se reveló también la estrecha relación entre P. citrinopileatus y P.cornucopiae como 2 especies que comparten el mismo grupo de intercompatibilidad.

La técnicas RAPD, seguido de la RFLP; ha sido una metodología que ha permitido el estudiode la estructura de poblaciones del género Pleurotus que son difícil de caracterizar con otrosmarcadores o para aclarar la sistemática basado en criterios tradicionales (Assigbetse et al., 1994;Holmes et al., 1994), como fue determinar la sistemática y valorar la diversidad de taxones dePleurotus asociado con umbelíferas, y determinar el proceso de especiación en el complejo deespecies asociado a P. eryngii (Zervakis et al., 2001b). La técnica SCAR en el género Pleurotus se hautilizado con el fin de estimar la diversidad de los tipos de apareamiento en especies como P. eryngii de diferentes regiones, evaluando el emparejamientos entre monocariones derivadas de inter e intragrupos, identificación 16 alelos en los loci A y B, que son responsables de la fertilidad en el ciclo devida; reflejando secuencias consenso como la caja TATA y caja GC; influyendo en la eficienciabiológica de esta especie.

El RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción), RAPDs (Amplificaciónaleatoria de ADN polimórfico), SCARs (caracterización de la secuencia de la región amplificada), ySSRs (microSatélites) han sido tecnicas que determinaron el cariotipo del género Pleurotus , el cualposee 11 pares de cromosomas, con un tamaño cromosómico de 35 mega pares de bases (Larrayaet al., 1999), que cuenta con un gran número de marcadores genéticos funcionales y anónimos. Paraello se utiliza ADN mitocondrial y ADN ribosomal para cuantificar las relaciones entre poblaciones deuna misma especies distribuidas por todo el mundo y diferentes especies de este género,demostrando que existen diferentes fenotipos, relacionados con la ubicación geográfica y divergengenéticamente. Según (Bunyard et al. , 1996) demuestran que los análisis filogenéticos son útilespara entender los patrones de la evolución y especiación de estas setas en un contextobiogeográfico.

II.1.3.2 Algunas especies del género Pleurotus en Latinoamérica.

A. P. ostreatus (Jacquim ex Fries) Kummer.

Esta especie se caracteriza por tener un píleo liso, a veces algo escamoso hacia el centro obase; de 5 a 10 cm de ancho, grisáceo con tonos metálicos, láminas decurrentes de color blanco oamarillento al secarse, poco o nada unidas entre sí en la base; más o menos delgadas y con bordeslisos, sésiles con estípite excéntrico muy corto y mal definido, contorno color blanco, consistenciacarnosa-correosa con color y sabor agradables. Crecen sobre troncos podridos o árboles en zonas

tropicales, subtropicales o bosque de pino y encino (Griffin, 1972; Argueta, 1983; Sánchez, 1994). ElMicelio presenta una coloración blanca, su crecimiento es radial, tornándose algodonoso; y alenvejecer secreta a menudo gotas amarillentas o anaranjadas (Rolf Singer, 1986). Las esporas deesta especie son subcilíndricas de forma de riñon, en promedio de 8-9 x 3-4 µm; su esporada esblanca o ligeramente lila o gris (Kummer, 1871).



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B. P. levis (Berk y M.A Curtis).

Setas que presentan un carpóforo de color rosa pálido, rosa Salmón al madurar, secos sonamarillentos, correosos a duros; el píleo presenta hifas erectas de 2 mm dándole un aspectoaterciopelado, con una forma convexa-plana a deprimida, con un diámetro en promedio de 15-21 cm.Estípite subcilíndrico, excéntrico de más de l0 cm de longitud y superficie pubescente, de color rosa

pálido a blanco. Las láminas son decurrentes, gruesas, separadas entre sí, de borde entero adentado-lacerado, de un color blanco a rosa pálido y sobre el estípite forman un retículo rudimentario.Su micelio es formado por hifas de pared relativamente gruesa y de pared delgada. Estos hongoscrecen en troncos podridos en bosques subtropicales (Singer, 1986; Arora, 1986; Guzmán, 1990;Phillips, 1991; Chacón et al., 1995; Laso, 1996; A. López y García, 2009). Las esporas de estaespecie son entre cilíndricas a subcilíndricas lisas, de pared delgada, hialinas, de 9-15 x 4-5 µm(Singer, 1951).

C. P. dryinus (Persoon) Kummer.

Especie con un píleo de un diámetro de 5 – 15 cm de diámetro, de color blanco o crema yforma convexa, su cutícula tiene una textura agrietada, separable, de color blanco, cubierto confibrillas grisáceas sobre un fondo blanco y un margen involuto. Las láminas son decurrentes, distantesa subdistantes, algunas a veces con hendiduras que bajan hasta el estípite. El estípite es excéntrico acentral, sólido, blanquecino, y de 4 - 10 cm de longitud y 2 - 3 cm de ancho, el cual se estrecha haciala base; con un anillo de color blanco o crema de corta duración. En esta especie su esporada escolor blanco (Phillips, 1991). Sea encontrado asociado sobre árboles planifolios, madera de robles,álamos u olmos. Las esporas son lisas y elípticas, de 9 -14 x 3,5 - 4 µm, hialinas y inamiloides;además de un color amarillento a café (Kummer, 1871).

D. P. djamo r (Fries) Boedijn.

Especie del género Pleurotus que presenta un color salmón rosa; el cual varía según su edady la iluminación que recibe. Este microorganismo crece sobre maderas duras, incluso sobre palmas,el árbol de la goma e incluso en bambú; el carpóforo tiene una cutícula escamosa, en forma derepisas redondas, su píleo es de 3 a 8 cm de ancho, lobuladas de color blanquecino a café-amarillento claro; superficie lisa, láminas bien definidas decurrentes. El Estípite es corto sin presenciade velo. Contextura blanquecina, con Sabor y olor semejante a harina fermentada (Sánchez, 1994;Chacón et al., 1995). Los primordios son rosa, formando a menudo colonias en racimo a lo largo de laperiferia en el interior de la caja de Petri y/o alrededor de la inoculación. P. dejamor presenta esporasde color rosa, las cuales cambian a beige al llegar la madurez (Stamets, 2000).

E. P . cornucopiae (Fr.) Gillet.

Hongo comestible con un Píleo blanco de consistencia subcarnosa a correosa, de un anchode 8 - 20 cm; liso a escamoso o aterciopelado, láminas unidas entre sí en la base o sobre el pie,formando un retículo, en la madurez, esta estructura sufre una depresión y toma una forma deembudo. Las laminillas son decurrentes y de color blanco o crema, a veces con un tinte rosado.Estípite lateral corto de hasta 5 cm de largo y 1 – 2,5 cm, aterciopelado o cubierto de pequeños pelos,no presenta anillo. Su esporada es blanca o crema. Se han encontrado sobre diversas variedades de



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troncos menos pinos y abetos (Arora, 1986; Guzmán, 1998). P. cornucopiae presentan cheilocistidiosy esporas cilíndricas y lisas de 8 – 11 x 3,5 - 5 μm (Moore-Landecker, 1996).

F. P. citr ino pel iatus Singer.

Los carpóforos de P. citrinopileatus crecen en racimos, el píleo es de color amarillo brillante,de 2 – 6,5 cm de diámetro, con una cutícula de marrón a dorada, con una textura aterciopelada ytextura agrietada; Sus características organolépticas su una contextura suave, un Sabor suave y sinolor fuerte. El estípite es cilíndricos, de 2 - 5 cm de largo y 0,2 – 0,8 cm de diámetro, de color blanco,y a menudo curvo. Las láminas son blancas, decurrentes y poco espaciadas. La esporada es amarilla(Ohira, 1990). Las esporas de estas seta son cilíndrica o elíptica, y de 6 - 9 x 2 – 3,5 µm (Parmasto,1987).

G. P. pulm onar ius (Fries) Quelet.

P. pulmonarius presenta un píleo convexo expandido, ondulado en forma de ostra,eventualmente plano y muchas veces ondulado al envejecer, de 5-20 cm de diámetro, grisáceo,blanca a beige. El estípite es excéntrico, con laminillas decurrentes, con velo ausente. Conocidocomúnmente como hongo blanco, al igual que P. ostreatus, se diferencia de este por ser blanquecino.Reportado en Norteamérica y Europa, se encuentran desde los 1200 hasta los 3000 msnm., soncomunes en primavera y verano. La esporada es blanquecina a amarillentas. Esporas cilíndrica y alargadas de 7,5-11×3-4 µm (Gastón Guzmán et al., 1993).



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CAPITULO III

JUSTIFICACIÓN.

En las últimas décadas el cultivo de los hongos del género Pleurotus ha tomado gran interéscomo proceso biotecnológico por su alta capacidad de degradar por FES una gran diversidad de

sustratos lignocelulósicos en un amplio rango de temperaturas, aprovechando así los desechosagroindustriales para la producción de un alimento con un alto valor nutricional y medicinal, debido asu acumulación de agentes quimioterapéuticos y presencia de sustancias biológicamente activas queactúan como antioxidantes, agentes reductores y antitumorales que disminuyen los niveles decolesterol en sangre y la presión arterial lo que lo hace atractivo para la dieta humana; además degenerar un sub producto con potencial como fuente de nutrientes vitales directos para las plantas;propiedades que hacen del cultivo de los hongos del género Pleurotus una alternativa en lasestrategias de seguridad alimentaria de muchos países de Latinoamérica. Este Procesobiotecnológico puede ser implementado en Venezuela, partiendo de la caracterización e identificacióntaxonómica de las especies de este género, para la formación y equipamiento de los agroproductorescon los conocimientos básicos para su producción y mercado del cultivo de estos hongos en pro ainstalarlo como una alternativa alimentaria.

HIPOTESIS.

En el Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos SIXTO DAVID ROJO de la ULAExisten varias cepas del género Pleurotus Luego de su caracterización taxonómica y fisiológica seespera la identificación de las especies y establecer diferencias fisiológicas entre ellas.

OBJETIVO GENERAL

Caracterizar las cepas género Pleurotus existentes en el Laboratorio de Biotecnología deMicroorganismos.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Determinar las características morfo-anatómicas de las cepas del género Pleurotus presentesen el Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos.

Identificación taxonómica de las cepas del género Pleurotus basada en las característicasmorfo-anatómicas.

Caracterización de las cepas del género Pleurotus crecidas en medios convencionales y noconvencionales.

Identificar las cepas del género Pleurotus utilizando técnicas moleculares.



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CAPITULO IV

MATERIALES Y METODOS

La presente investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología de los

Microorganismos ―SIXTO DAVID ROJAS‖ de la Facultad de Ciencias de la Universidad de los Andes Estado Mérida.

MATERIALES

Microorganismos.

Las cepas de hongos comestibles P3215, P132, Post, PRAL y Pcit pertenecientes al cepariode macrohongos ―SIXTO DAVIS ROJO‖ del Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos ―SIXTODAVID ROJAS‖ (BIOMI) del Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias de la Universidadde los Andes, material biológico donado por el ingeniero Osmar Morillo de la Fundacioón Centro deInvestigaciones del Estado para la Producción Experimental Agroindustrial (CIEPE). Se mantuvieronen cuñas de agar papa dextrosa (PDA) con repiques cada 15 días.

Medios de cultivo.

Se utilizaron dos medios de cultivo: PDA composición: Papa 200,0 g, Agar-Agar 15,0 g,Dextrosa 20,0 g, Levadura 2,0 g. Preparación: pelar y poner a hervir 200 g de papa en 500 ml deagua destilada durante 10 - 15 min, luego se filtra el extracto y se adiciona agua hasta ajustar a 1000ml para reponer lo que se evaporó, se agregaron los otros ingredientes y se calentó con agitación por1 - 2 min hasta quedar homogénea la preparación de acuardo a lo indicado por (Gaitán, Salmones,Merlo, y Mata, 2002).

El medio agar Sabaraud Dextrosa (ASD) (Odds, 1991)composición: digerido enzimático decaseína 5,0 g, Digerido de tejido animal 5,0 g, Dextrosa 40,0 g, Agar 15,0. Preparación: Se toman 500ml de agua destilada y se agregan todos los ingredientes, se calientan bajo agitación hasta disolvertodos los ingredientes, se ajusta el pH a 5,6 y se lleva hasta 1000 ml.

Las semillas de sorgo (Sorghum bicolor ) fueron adquiridas en el mercado local y mantenidasen embaces herméticos hasta su uso, Los fardos de heno de pasto Bermuda ( Cynodon dactylon)fueron adquiridos en el mercado local y se procesaron en molino de martillo hasta un tamaño departicula de 1 cm.

Reactivos: A menos que se indique lo contrario los reactivos químicos utilizados fueron degrado analítico.



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METODOLOGÍAS

Las experiencias que se detallan a continuación se realizaron por triplicado a menos que seindique lo contrario.

IV. Diagrama general de investigación.

IV.1 Determinación de las características morfo-anatómicas de las cepas P3215, P132,Post, Pcit y PRAL presentes en el Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos.

La metodología se centra en el análisis de las características morfo-anatómicas del pleurocarpo consideradas de importancia en la clasificación de las especies dentro del géneroPleurotus Las características morfológicas proveen la mayoría de los caracteres usados para laconstrucción de los sistemas taxonómicos. En el caso de las cepas del género Pleurotus, incluye ladescripción macroscópica y microscópica del píleo, láminas y estípite.



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IV.1.1 Cultivo de las cepas P3215, P132 y Post por fermentación de estado sólidos(FES)

a. Preparación de semilla fúngica o inóculo madre.

Se cultivaron las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL en medio PDA a 28 ºC en oscuridadhasta que el micelio de cada cepa invadiera completamente las placas de pettri, a partir de estasplacas se cortaron trozos de un 1 cm2 del micelio, procediéndose a inocular frascos de vidrioconteniendo 300g de semilla de sorgo previamente hidratados y esterilizados, los cultivos fueronincubádos a 28 ºC en oscuridad durante 25 días, periodo en que el micelio invade por completo losfrascos, obteniendo así la semilla fúngica o inóculo mayor.

b. Preparación de los sustratos para la producción de Pleurotus

i. Preparación de los sustratos para la producción de semilla fúngica o inoculomadre.

Las semillas de sorgo (Sorghum bicolor ) se lavaron con abundante agua y fueron sumergidasen agua 12 h para su hidratación, luego se cocinaron durante 15 min, se decantaron las semillas y seempacaron en frascos de vidrio con tapa de rosca conteniendo 300g de semilla, y se esterilizarondurante 40 min a 120 ºC, dejando enfriar durante 24 h para su posterior uso.

ii. Preparación del sustrato para el cultivo y fructificación de Pleurotus

El heno de pasto Bermuda (Cynodon dactylon) fue cortado hasta tamaño de partícula de 1 a 2cm., se sumergió en agua durante 12 h, se decanto y empaco en bolsas plásticas transparentes arazón de 1 kg del material húmedo/ bolsa. Las bolsas conteniendo el material fueron esterilizadasdurante 6h a 120 ºC, dejándose enfriar durante 24 h para luego utilizarse en los cultivos de las cepasen estudio.

c. Cultivo y fructificación de Pleurotus en sustrato sólido.

Para cada una de las cepas, se tomaron 10 bolsas conteniendo sustrato estéril preparadas

como se indicó anteriormente, y se inocularon con 100g del inoculo madre. A las bolsas inoculadas ycerradas se les practicaron agujeros con una aguja estéril y se incubaron a 25 ºC en oscuridad,durante 20 a 30 días tiempo en el que el micelio invadió totalmente el sustrato.. Para la inducción dela fructificación a cada bolsa se le realizaron 6 cortes de 2 cm. de largo y transfirieron a la cámara decultivos e incubadas a 28 ºC con iluminación diurna de 10 h, humedad relativa del 70 a 85 % duranteun periodo de 30 a 45 días tiempo suficiente para la obtención de los carpóforos. Luego decosechados (figura XIII), los carpóforos se utilizaron en la caracterización morfo-anatómica.



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Figura XIII Cultivo por Fermentación en Estado Solido (FES) de hongos comestibles. Tomado de Stamets,2000.

IV.1.2 Caracterización macroscópicas y microscópicas de los pleurocarpos de las

cepas P3215, P132 y Post.

Para determinar las características macroscópicas, los pleurocarpos fueron examinados conuna lupa tomando en cuenta parámetros como: color, apariencia, consistencia y forma de loscarpóforos. Las esporas se obtuvieron, partiendo de carpóforos frescos maduros. A los que se lescorto estípite a nivel del ápice, se colocaron sobre papel blanco y se cubrieron con un frasco de vidrio,luego de 30 a 60 minutos se obtuvo la impronta de las esporas de cada cepa. Las esporas serecolectaron en tubos de ensayo estériles y se guardaron en frio.



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En la observación de las características microscópicas se realizaron cortes al carpóforo,obteniéndose pequeñas porciones del píleo, estípite y lamela, se observó al microscopio la morfologíade las hifas, el himenio, las esporas, los basidios y los cistidios de cada una de las cepas, por mediode la técnica de tinción con safranina y verde malaquita.

IV.2 Identificación taxonómica de las cepas P3215, P132 y Post basada en lascaracterísticas morfo-anatómicas.

Una vez descritas cada una de las cepas P3215, P132 y Post, se compararó y evaluó todaslas características taxonómicas, frente a claves taxonómicas permitiendo la identificación a nivel degénero (Largent y Stuntz, 1977; Largent et al., 1977) (Anexo 1), y especie (Petersen et al., 2006)(Anexo 2).

IV.3 Características de las cepas P3215, P132, Post, Pcit, PRAL y Post crecidas en

medios convencionales y no convencionales.

IV.3.1 Características de las colonias fúngicas en medios convencionales.

A partir de las cuñas de las cepas P3215, P132, Post, Pcit, PRAL y Post se inocularon decajas de pettri con medio PDA y ASD, se incubaron en oscuridad durante 6 días a 22 °C, partiendo deestos cultivos se tomo un fragmento de 7 mm de diámetro y se colocaron en el centro de cajas depettri con el mismo medio, se incubaron a 22 °C por 15 dias realizándose las observaciones diariasde la forma, la elevación, la textura, el aspecto, la superficie de la colonia micelial, el color, el margeno borde y la pigmentación de las colonias fúngicas de cada cepa siguiendo las indicacionesmostradas en la Figura XIV para el análisis de las características macromorfológicas.

Figura XIV Caracterización macroscópica de la colonial micelial de los hongos. Tomado de Piccoli et al., 2010).



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IV.3.2 Determinación del efecto de los medios de cultivo convencionales y latemperatura en el crecimiento y producción de biomasa de las cepas del géneroPleurotus

IV.3.2.1 Efecto de la temperatura sobre el crecimiento y producción de biomasa de lascepas P132, P3215, Post y PRAL cultivadas en placas de PDA y ASD.

Se procedió de acuerdo a (Mier et al., 2002)Las cajas con el medio (PDA, ASD) fueroninoculadas en el centro con discos de micelio de 7mm diámetro obtenidos de cultivos en placas de losmismos medios y que no superaban los 6 días de incubación. La incubación se realizó a 20 ºC, 25 ºC,30 ºC y 35 ºC. Diariamente, las placas se colocaron en un escáner y las imágenes obtenidas seprocesaron con el software ImageJ (Abràmoff et al., 2004) y se calculó la tasa radial de crecimientode los hongos (mm/día), al graficar la media del radio en mm contra el tiempo en días, la distancia oradio de crecimiento se caculó a través de la ecuación del área de un circulo figura geométrica que seasemeja al área que cubren los hongos filamentosos tras su crecimiento. La cinética de crecimiento

radial de la colonia se ajustó mediante el Software IBM SPS 20 (Field, 2013) a una serie de Fourierde suma de senos y cosenos trigonométricos; con los datos se estimó la tasa de crecimiento (kr) endichos medios y en las formulaciones elaboradas en caja Petri, la cual se calculó con la función decrecimiento lineal:

F(x) = k r (x) + c

Donde F(x) es la distancia y x es el tiempo, Kr expresada en milímetros por día (mm/día)(Zervakis et al., 2001a).

La biomasa se cuantifico por determinación del peso seco de los micelios presentes al final dela incubación en caja de Petri, el contenido de cada placa, se trasvaso a un vaso de precipitadoconteniendo 300 ml de H2O destilada hirviendo, una vez fundido el agar, la biomasa fúngica serecuperó por filtración en papel de filtros luego de varios lavados con agua caliente. La biomasaobtenida se secó a 85 ºC hasta peso constante y se determinó el peso seco gravimétricamente.Realizando el análisis estadístico de los datos mediante un ANOVA de dos vías y las diferenciassignificativas proporcionado por la prueba de rangos múltiples de TUKEY a través del IBM SPS 20(Field, 2013).

IV.3.2.2 Caracterización de las cepas Post y P3215 sobre medios no convencionales.

La evaluación se realizó comparando las tasas de crecimiento obtenidas en los sustratossemilla de sorgo, parchita, arroz y tuza de maíz procesados como se indica a continuación:



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Las semillas de sorgo se lavaron y dejaron hidratando por 24 h, posteriormente se retiró elexceso de agua, se trituraron hasta un tamaño de partícula de 2 mm, se almacenaron en frascos devidrio con rosca y esterilizaron por 40 min a 120 ºC. Las semillas de parchita se sumergieron en aguay se dejaron fermentar durante 4 a 8 días para eliminar los restos de pulpa, después de lavadossucesivos con abundante agua se eliminó el exceso de agua por secado en estufa a 40 °C por 48 h,luego de triturarlas hasta un tamaño de 2 mm, se almacenaron en frascos de vidrio con rosca yesterilizaron a 120 °C por 90 min. La tuza de maíz, se lavó por inmersión en agua durante 2 horas, sedrenó el agua y se secó en estufa durante dos días a 40 °C se trituró a un tamaño de 2 mm, seempaco en frascos de vidrios con rosca y se esterilizaron por 2 h a 120 °C. El arroz comercial tipo Amarca Mary se hidrató por inmersión en agua durante 24h, se le retiró el exceso de agua y triturohasta tamaño de partícula de 2 mm, luego de empacarlo en frascos de vidrio con tapa de rosca seesterilizó por 40 min a 120 ºC.

Los cultivos se realizaron en cajas de Petri previamente esterilizadas a las que se les agregouna capa de 20 g del medio no convencional, compactados a un espesor de 8 mm, se esterilizarondurante 1 h a 120 °C, se dejaron en reposo 24h y se inocularon, colocando en el centro de la placa undisco de 7 mm de diámetro obtenido de un cultivo de las cepas en PDA previamente incubadodurante 6 días (Hernández et al., 2002). Las variables a medir fuero tasa de crecimiento micelial enlos diferentes medios no convencionales a través del registro fotográfico diario y el procesamiento delas imágenes obtenidas con el software ImageJ (Abràmoff et al ., 2004), calculando la tasa igual comofue para los medios convencionales (Sihuanca, 2011); y forma del micelio presente por cepa.

IV.4 Identificación molecular de las cepas P3215, P132 y Post.

IV.4.1 Evaluación de los métodos de extracción de los ácidos nucleicos de las cepasP3215, P132 y Post.

La extracción de los ADNs genómicos de las cepas P3215, P132 y Post se realizó mediantelos métodos de Saghai-Maroof et al. (1984) y el método de Lee (1990). Para determinar qué protocolotiene mayor eficiencia, se evaluó la integridad, grado de pureza y concentración de los ADNsgenómicos de las muestras fúngicas obtenidos con cada uno de ellos y se comprobó si a partir dedichos ADNs era posible la amplificación por PCR de la región ITS1, 5.8S y ITS2.

Siguiendo el método de Saghai-Maroof, et al. (1984), se partió del cultivo de las cepas enmedio liquido Sabaraud bajo agitación a 28 ºC por 6 días. 300mg de micelio obtenido por filtración se

transfirieron a un mortero estéril y se les agrego nitrógeno líquido y se maceraron hasta pulverizar;con ayuda de una espátula se transfirió el macerado a tubos eppendorf de 1,5 ml conteniendo 600 µlde tampón de lisis (100 mM tris- HCl, pH 8,25; 0,2% B-mercaptoetanol; 20 mM EDTA; NaCl 1,4 M;2% CTAB) y se incubo a 75 ºC durante 15 min bajo inversiones cada 3 min. Después se dejó reposara temperatura ambiente durante 10 min y se le agregaron 1 volumen de una mezcla cloroformo – alcohol isoamilico (24:1), agitando los tubos hasta formar una emulsión, se centrifugó por 15 min a3000 g, punto en que se formaron las fases acuosas, interface y orgánica, de las cuales se colecto lafase acuosa en tubos Eppendorf nuevos obteniendo así los ácidos nucleicos.



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El método de extracción de los ácidos nucleicos de Lee (1990), se realizó partiendo de 100 mgde micelio de cada una de las cepas obtenidas del raspado con un palillo del cultivo en cajas de pettrien medio PDA incuvadas a 28 °C; se colocó cada muestra en un tubo ependroff de 1,5 ml con 300 µlde tampón de lisis (tris- HCl 120 mM, pH 8,25; EDTA 25 mM; NaCl 25 mM; SDS 2 %). El tejido fuemacerado con un micro macerador de plástico, después las muestras al estar homogenizadas sehirvieron a 95 ºC por 10 min para luego pasarlas por 5 min a 4 ºC, se centrifugan a 3000 g durante 5min, se colectan los sobrenadantes en nuevos tubos eppendorf. Los ácidos nucleicos se extrajeronañadiendo 250 µl de acetato de potasio 3 M e incubándose a 4 ºC por 1 h, seguido se centrifugan a10000 g durante 12 min a 4 ºC; de las fases que se forman, se colectan las fases acuosas en tuboseppendorf. El ADN se precipitó a -20 ºC en presencia de 2 volúmenes de la solución etanol absoluto y250 µl de acetato de potasio 3 M por toda la noche. Posteriormente, las mezclas se centrifugaron a3000 g durante 10 min y los precipitados se lavaron con etanol al 70 %. Después de dejarse secar atemperatura ambiente las muestras, el ADN se re suspendió en 50 µl de H2O destilada, desionizada ylibre de Dnasas y Rnasas (MQ).

Al obtener los ácidos nucleicos de cada una de las cepas a través de los diferentes métodosde extracción se procedió con la purificación del ADN genómico, cada uno de los ADN extraídos seincubo con 0,6 volúmenes de iso-propanol absoluto durante toda la noche a 4 ºC y se centrifugaron a

12000 g durante 30 min, los precipitados se lavaron varias veces con etanol al 70%, después secolocaron cerca de un mechero hasta evaporar totalmente el etanol, los ácidos nucleicos seresuspendió en 100 µl de H2O MQ. Una vez purificados los ácidos nucleicos, se procedió conobtención del ADN genómico, paso en que se tomaron 50 µl de los ácidos nucleicos en tubosEppendorf de 1,5 ml y se le agregó 450 ul de H2O MQ y 5 µl de RNAasa, incubándose por 1 h a 37ºC, se añadió 1 volumen de la mezcla fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1) pH 8, agitando lostubos hasta formar una emulsión, las mezclas se centrifugaron durante 15 min a 12000 g, se colectola fase acuosa en tubos eppendorf nuevos obteniendo así los ácidos nucleicos, luego se agregó unvolumen de cloroformo-alcohol isoamilico (24:1), se centrifugaron durante 15 min a 12000 g y secolecto la fase acuosa en tubos eppendorf nuevos obteniendo así los ácidos nucleicos. Después lasfases acuosas recolectadas se incubaron con 0,6 volúmenes de iso-propanol absoluto durante toda lanoche a 4 ºC, se centrifugaron a 12000 g por 30 min y se descartaron los sobrenadantes con ayudade una pipeta, los precipitados se lavaron con etanol al 70%.

Después cada muestra se colocó cerca de un mechero hasta evaporar totalmente el etanol,los ácidos nucleicos se resuspendieron en 100 µl de H2O MQ. Una vez purificados los ADNgenómicos se evaluó la integridad de estos mediante electroforesis en gel de agarosa D-1(Pronadisa) 0,8 %, en 1 % de buffer TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) al que se incorporó 0,5μg/mL de bromuro de etidio, a 70 voltios durante 45 min, cargando 5 ul de cada muestra. La purezadel ADN se determino por espectrofotometría, realizando lecturas de absorbancia de las muestras a230 nm, a 260 nm y 280 nm, relacionando la contaminación con sales al valor de coeficiente A230nm/A 260nm, comprendido entre 0,3 y 0,7 para un estándar del contenido en sales en la muestra,y la contaminación con proteínas y fenol al valor del coeficiente A 260nm/A 280nm, comprendidoentre 1,8 - 2,0 a bajas concentraciones de proteínas y fenol (Maniatis et al., 1982). La concentracióndel ADN genómico de las muestra se valoró realizando lecturas de absorbancia de una dilución de lamuestra a 260 nm. Teniendo en cuenta que una unidad de absorbancia a 260 nm corresponde a 50μg/mL de ADN bicentenario (Sambrook et al., 1989).



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IV.4.1.1 Amplificación a través de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de laregón ITS 1 a ITS 2.

Se amplificó la región ITS 1 a TS 2 a través de la PCR utilizando los primer’s universales parahongos; ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') y ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3')

(White et al,. 1990), siguiendo la metodología modificada propuesta por (A. Rodriguez, 2008),22 µlmezcla mixta PCR (Taq ADN polimerasa (1 unidad/ml), dNTPs 200 µM, MgCl2 1,5 mM), primer’s 2 µl(10 µM c/u), 5 µl tampón de la TaqADN polimerasa, 11,3 µl agua y 3,0 µl ADN (40 ng/l) en unvolumen de 25 µl de reacción. Realizando el ciclo de PCR en un PTC-100™ de control térmicoprogramable (MJ Research); 95 ºC/1 min, 35 ciclos de 94 ºC/30 s, 55ºC/90 s, 72 ºC/90 s y 72 º C/5min. Visualizando los productos de PCR a través de electroforesis en geles de agarosa al 2 % teñidoscon bromuro de etidio (0,16 µl/ ml); cargando 5 µl de cada producto de PCR a 100 V durante 30 min.

IV.4.1.2 Precipitación de productos de PCR empleando sales.

Los amplificados de la región ITS 1 a ITS 2 tras la PCR, fueron diluidos a un volumen final de100 µl con agua MQ, se agregó un volumen de acetato de amonio 10 M y 2,5 vol de etanol 100% conrespecto a 200 µl; se homogeneizo la mezcla e incubó a –20 °C durante 12 horas, se centrifugo a14000 g durante 30 min. Se decantó el sobrenadante y lavaron los productos de PCR con un volumende etanol 70%, de nuevo se centrifugo la solución a 14000 g por 30 min. Se descartó el sobrenadantey agrego 1 volumen de etanol 70 %, la preparación se centrifugó a 14000 g por 15 min. Se decantó elsobrenadante y dejo evaporar el etanol a temperatura ambiente por 1 h. Se resuspendió el ADN en11 µl de agua MQ y se procedió a verificar el ADN amplificado a través de la electroforesis en gel deagarosa al 2 %. Los volúmenes restantes de producto de PCR se utilizaron en las reacciones desecuenciamiento.

IV.4.1.3 Cuantificación semi-cuantitativa de los productos de PCR.

La cuantificación de la concentración de los productos de PCR de la región ITS1, 5.8S e ITS2,se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 %. Esto se consiguió comparando laintensidad de las bandas correspondientes a cada producto de PCR con las bandas patrón dediferentes concentraciones conocida de ADN del fago λ, obteniendo así resultados aproximados de laconcentración de los productos de PCR (Maniatis et al., 1982).

IV.4.2 Secuenciación del ADN.

Una vez obtenidos los 75 ng/µl de la región ITS1 a ITS2 de cada muestra fúngica para lasecuenciación, se procedió con la preparación de la mezcla reacción de secuencia en un tubo de0,2uL como se muestra en la tabla IV; para luego llevarse a un termociclador a 40 ciclos de 96 ºC/10seg, 58 ºC/ 5 seg y 60 ºC/ 4 min. El producto de la reacción se precipitó con isopropanol y lavado conetanol, la secienciación se realizó en el secuenciador ABI 3130, proceso basado en 3 pasos. 1) La



39

preparación de las muestras (desnaturalización del ADN y montaje en la placa de corrida), 2) lapreparación del archivo con las condiciones de corrida y 3) el montaje de las muestras en el equipo.

Tabla IV Mezcla de reacción para el secuencia miento de los productos de PCR.IVIC, 2014.

Reactivo

Concentración

inicial

Concentración

en la reacción

Cantidad para una

reacción (µL)Terminator ready reaction mix

(Big Dye) - 0,5

Buffer del kit 5X 1X 2

Primer F o R 10uM 0,2

Producto de PCR 5 - 20 ng/µL

Agua Completar

IV.4.3 Análisis de secuencia de la región ITS1, 5.8S ADNr e ITS2

El análisis de secuencia se comenzó con la visualización y exportación de las secuencias através del software de bioinformática Chromas LITE v2.01, para luego comparar las secuencias de lascepas P3215, Post y P132 frente a las secuencias reportadas en las bases de datos internacionalesde secuencias de nucleótidos (INSD: GenBank, EMBL, DDBJ), por medio de la herramienta BLAST(Johnson et al., 2008) y el servidor Expasy (Gasteiger et al., 2003); esto junto con los datos desecuencia de la región ITS1, 5.8S ADNr y ITS2 de las especies P. eryngii , P. tuberregium, P.citrinopileatus, P. cystidiosus, P. ostreatus, P. pulmonarius y P. djamor presentes en el GenBanck(números de acceso EU233990, EF514250, AB115043, EF514244, EF514248, EF514243,

AY265821, respectivamente), obteniendo las 20 secuencias con mayor identidad; esto mismo

proceso se repitió para el análisis bioinformatico por separado de las regiones ITS1 y ITS2 de lassecuencias problemas a través de las herramientas bioinformáticas ITS2 Database (Schultz et al.,2006), ITS1 Database (Nilsson et al., 2010) y DNAclub.

IV.4.3.1 Análisis Filogenético

La reconstrucción del árbol filogenético del género Pleurotus se realizó por separado con lassecuencias problema de las regiones ITS1 a 5.8S e ITS2, comparando con las secuenciasrecopiladas de mayor coincidencia encontradas tras el análisis de secuencias y bioinformáticosanteriormente mencionado. Una vez obtenidas las secuencias se realizaron los diferentesalineamientos a través del algoritmo del software MUSCLE del EMBI (Edgar, 2004), utilizando elprograma MEGA 6.1 (Kumar et al., 2008) se realizó la reconstrucción de los arboles filogenéticos porel método de vecinos más cercanos (neighbor-joining), adicionalmente se utilizó el modelo desustitución Kimura 2 parámetros (K2P con un valor de réplicas de 1000 bootstrap). Los arboles fueronobservados y editados en el mismo programa MEGA 6.1 (Kumar et al., 2008).



40

IV.4.3.2 RFLP por digestiones virtual

En el análisis del Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de lassecuencias de la región ITS de las cepas P3215, P132 y Post, se emplearon las herramientas debioinformática NEBcutter V2.0 (Vincze et al., 2003) y Webcutter 2.0 (Maarek et al., 1997). Se realizó

la digestión virtual de estas secuencias, junto con varias secuencias del GenBank correspondientes adiferentes cepas de las especies P. eryngii , P. tuberregium, P. citrinopileatus, P. cystidiosus, P.ostreatus, P. pulmonarius y P. djamor ; las digestiones se ajustaron para visualizar los productos engeles de agarosa al 2%; implementando aquellas enzimas de restricción que corten las secuencias en2 a 5 sitios.

IV.4.3.3 Análisis de estructuras secundarias del ADNr

Para la ejecución de este proceso se utilizaron las herramientas bioinformáticas disponibles en

el servidor web ITS2 Data base desarrollado por Schultz et al. (2006) accedida a travéshttp://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg (Selig et al., 2008; Koetschan et al., 2010).Inicialmentese realizó la extracción de la secuencia ITS2 de las secuencias de las muestras utilizando HMMs(Hidden Markov Models) seguida por la predicción de la estructura secundaria bajo el métodocomparativo de secuencias y estructuras homólogas, evaluando el grado de transferencia de hélicesy la homología de la molécula frente a las reportadas y anotadas en la base de datos ITS2.

Adicionalmente se corrió un análisis de cambios de bases compensatorias (Compensatory base perchanges – CBC) para la diferenciación de especies. Esto fue realizado con el programa 4SALE(Koetschan et al, 2010; Selig et al, 2008; Schultz et al, 2006; Schultz et al, 2009).



41

CAPITULO V

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

V.1.1 Características morfo-anatómicas de las cepas P3215, P132 y Postpertenecientes al Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos.

A continuación se presentan las características macroscópicas observadas en el estudio delos carpóforos de las cepas P3215, P132 y Post; en base a los caracteres macroscópicos obteniendoun catálogo (Tabla V – VII).

a. Cepa P132

Descripción: la cepa P132 se cultivó en heno de pasto bermuda (Cynodon dactylon) por FEScerrada, observándose que solo se desarrollaron los carpóforos de esta cepa y de forma individual.Los carpóforos de P132, presentaron forma Pleurocarpica con disposición de las lamelas con formade hoja en posición decurrente, sin volva presente, estípite excéntrico. El píleo de estos carpóforos sedesarrollo hasta los 6 cm de diámetro, en el plano anterior el píleo mostro una forma plana – convexay en el plano lateral con una vista apical petaloide y cóncavo, con un disco ligeramente deprimido,margen arqueada y bordes desgarrados, con un grado de humedad seca; estas presentarontonalidades de blanco - mate, con una textura glabra, consistencia carnosa porosa. En cuanto alestípite es de color blanco de 1,4 cm de largo y 9 mm de diámetro, con unión lateral al píleo y deforma cilíndrica ventricosa, una consistencia carnosa porosa y sólida. El himenio es de color blanco aclaro, con patrones de ramificación dicotómica, generalmente las láminas son atenuadas aredondeadas, estrechas y poco separadas (Tabla V).

b. Cepa P3215.

Descripción: la cepa 3215 se cultivó en heno de pasto bermuda (Cynodon dactylon ) por FEScerrada, encontrando un desarrollo en conjunto de 8 a 12 primordios para dar origen a los carpóforos,estos caracterizados por presentar un píleo sésil de un color entre café variando a mate de 7,5 cm dediámetro, con una forma Pleurocárpica de lamelas decurrentes, en una vista lateral el píleo con unaforma plana convexa y en vista apical un forma lenguada, petaloide y cóncavo, con un margenarqueado; bordes de tipo crenulado, ondulados, enteros y desgarrados, con humedad seca, contextura glabra y consistencia carnosa quebradiza y fibrosa; su esporada color blanco, sin presenciade volva. En cuanto al estípite poseé unión al píleo de forma lateral excéntrica, con forma cilíndrica ycompacta sinuosa, así como ventricosa, consistencia correosa, de cuerpo sólido y colores desde elblanco a crema, midiendo 1,5 cm de largo y 1,1 cm de diámetro. El himenio es de color blanco acrema claro, no poseen patrones de ramificación, las láminas son atenuadas o redondeadas,generalmente están muy juntas, son anchas como se ve en la tabla VI.



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Tabla V Caracteristicas de la cepa P132.

Carpóforo (Anterior) Carpóforo (Posterior)

PÍLEO

Forma

Vista lateral: Plano convexoVista Apical: Petaloide y cóncavo.Disco: Obtuso.

Margen: Arqueado.Borde: Ondulado.Viscosidad: Seca.Higroscopicidad: -

Color: Crema claro.Brillo: Mate.

Textura: Lisa.Consistencia: Carnoso-fibroso.

Diámetro: 7,5 cm.Grosor: 1,5 cm.

ESTIPITE HIMENIO Unión: Lateral.

Forma: Comprimidosinuosa.

Consistencia: Correosa.Contextura: Dura.

Color: Crema claro.Diámetro: 8,5 cm.

Largo: 3,5 cm.

Frecuencia: SeparadosUnión: Decurrentes.

Ancho: Anchas.

Lamelas: Atenuadas.Ramificación: Si.Color: Blanco.

Grosor: 0,3 cm.

c. Cepa Post.

Descripción: La cepa Post se cultivó en heno de pasto bermuda (Cynodon dactylon) por FEScerrada, reflejando un desarrollo en conjunto de 6 a 10 primordios para dar origen a los carpóforos.

Las setas obtenidas presentaron un píleo con una forma Pleurocarpica habitual a los hongos delgénero Pleurotus sp, en su vista lateral son planos - convexos y en la vista apical tienen forma desdeel lenguado, petaloide y concado; con un disco desde el de tipo deprimido, umbilicado hasta elobtuso; margen arqueada; bordes de tipo crenulado, ondulados, enteros, con un grado de humedadseco y colores mate, pasando por los cremas claros y obscuros, con una textura glabra y consistenciacarnosa quebradiza y fibrosa. En cuanto al estípite poseen uniones al píleo de forma lateral yexcéntrica, con formas cilíndricas y comprimidas sinuosas, así como ventricosas, contexto sólido ycolores desde el blanco a crema. El himenio es de color blanco a crema claro, no poseen patrones deramificación, las láminas son atenuadas o redondeadas, muy juntas, anchas y de forma decurrente(Tabla VII).



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Tabla VI Caracteristicas de la cepa P3215.


PÍLEOForma

Vista Laterial: Plano convexoVista Apical: Petaloide.

Disco: Obtuso.Margen: Arqueado.Borde: Degradado.Viscosidad: Seca.Higroscopicidad: -

Color: Crema claro.Brillo: Mate.

Textura: Lisa.Consistencia: Carnoso-fibroso.

Diámetro: 7,5 cm.Grosor: 1,5 cm.

ESTIPITE HIMENIO

Unión: Lateral.Forma: Comprimido sinuosa.



Largo: 3,5 cm.

Frecuencia: SeparadosUnión: Decurrentes.

Ancho: Anchas.Lamelas: Atenuadas.

Ramificación: Si.Color: Blanco.

Grosor: 0,3 cm.



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Tabla VII Caracteristicas de la cepa de Post.


PÍLEOForma

Vista Laterial: Plano convexoVista Apical: Petaloide.

Disco: Obtuso.Margen: Arqueado.

Borde: Liso.Viscosidad: Seca.Higroscopicidad: -

Color: Crema.Brillo: Mate.

Textura: Glabro.Consistencia: Carnosa-quebradiza.

Diámetro: 11,5 cm.Grosor: 4 cm.

ESTIPITE HIMENIO

Unión: Lateral:Forma: Compacta.



Largo: 4,2 cm.

Frecuencia: Juntas.Unión: Decurrentes.

Ancho: Anchas.Lamelas: Redondeadas.

Ramificación: No.Color: Crema.

Grosor: 0,56 cm.

V.1.2 Características microscópicas de las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL.

En cuanto a las características microscópicas de las cepas del género Pleurotus evaluados sepudo observar que las cepas P3215 y Post presentaron hifas de paredes delgadas y entrelazadas

junto a la presencia de perillas con pedúnculos, las cepas P132, Post, Pcit y PRAL presentaron hifas



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de paredes gruesas con fíbulas PRAL presentaron hifas de perillas con pedúnculo como se observaen la tabla VIII.

Tabla VIII Características microscópicas de las cepas del género Pleurotus

Cepa Presencia fíbulas Características de las hifas

P3215 + Hifas de paredes delgadas y entrelazadas, presencia de perillas con pedúnculo

P132 + Hifas de paredes gruesas

Pcit + Hifas de paredes gruesas

Post + Hifas de paredes delgadas y entrelazadas, presencia de perillas con pedúnculo

PRAL + Hifas de paredes gruesas

V.2 Identificación taxonómica de las cepas las cepas P3215, P132 y Post basada en las

características morfoanatomicas.

Las cepas evaluadas se identificaron contrastando nuestros resultados con los caracteresmacroscópicos propuestos por Delgado et al., 2005 y Largent, 1977, que definen a un hongo delgénero Pleurotus Encontrando que las cepas P132, P3215 y Post pertenecen al género Pleurotus porpresentar:

A. Donde se desarrollaron los carpóforos de cada cepa no crecían otros hongos.

B. El píleo es de color blanquecino, con un himenio formando láminas llamadas lamelas.

C. Las lamelas se disponen en posición decurrente, con un borde liso.

D. El carpóforo sin presencia de volva.

E. El estípite se dispone en el píleo de forma excéntrica o lateral, mide entre 2 a 4 cm, son decontexto sólido y de un color crema.

F. El píleo es sésil, con una forma de embudo o de espátula (hábito pleurotoide), consistencia dela pulpa suave, flexible y de cuero, y las lamelas no son duras, ni correosas.

G. La esporada es de un color entre blanquecino a amarillo pálido.

H. Las lamelas no se dividen a lo largo de sus bordes, estas son estrechas; el espesor del píleovaría, siendo las lamelas suficientemente delgadas para ser membranosas, suaves ycarnosas.

A través de los caracteres macroscópicos propuestos por Petersen et al., 2006, también sepudieron identificar las diferentes cepas a nivel de especie, encontrando que las cepas P132, P3215 yPost presentan las características fundamentales al género Pleurotus con píleo de color blanco deforma Pleurocarpica y la disposición de las lamelas en posición decurrente y borde liso, sin presenciade volva, y un estípite excéntrico de 2 a 4 cm, de contexto sólido y color crema.



46

V.3 Características de las cepas las cepas P3215, P132, Post y PRAL crecidas enmedios convencionales y no convencionales.

V.3.1 Características de las colonias fúngicas en medios convencionales.

Como puede observarse en la tabla IX los caracteres estudiados varían de acuerdo a cadacepa y al medio de cultivo empleado; encontrando que la cepa Pcit difiere a las demás por presentartextura polvorienta, no presentar micelio aéreo, su forma es filamentosa en PDA y circular en SA,elevación convexa umbilicada, de margen liso y superficie sectorizada, mientras que las demás cepasmostraron tener textura algodonosa, micelio aéreo, formas filamentosas, convexa umbilicada, demargen desflecado y superficie cerebriforme. En todos los casos la densidad fue mayor en el medioPDA.

Tabla IX Características macroscópicas de las colonias de las cepas las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL presentes en el Laboratorio BIOMI, evaluadas en medios de cultivo PDA y SA a 22°C.

CepaMedios de

Cultivo

Características

Color Textura DensidadMicelioaéreo

Forma Elevación Margen Superficie

P3215PDA

Blanco Algodonosa Alta

Si FilamentosoElevada ylimitada

Desflecado SectorizadaSA Media

P132PDA



DesflecadoSectorizada

SA Media Cerebriforme

PcitPDA

Blanco Polvorienta Alta

NoFilamentoso Convexa

umbilicadaLiso Sectorizada

SA Media Circular

PostPDA


SiFilamentoso Elevada y

limitadaDesflecado

Cerebriforme

SA Media Circular Sectorizada

PRALPDA



Desflecado CerebriformeSA Media

V.3.2 Efecto de la temperatura y el medio de cultivo en el crecimiento y la producciónde biomasa de las cepas P132, P3215 y P.ost.

Los resultados mostrados en la tabla X y la figua XV indican que existen diferenciassignificativas (p < 0,05) entre los medios de cultivo y la temperatura de incubación sobre la tasa decrecimiento micelial y la producción de biomasa. La cepa P132 mostro mejor desempeño tanto en latasa de crecimiento como en la producción de biomasa (5,22 mm/d y 558,97 mg respectivamente)cuando fue crecida en el medio PDA a 20°C, los valores más bajos en la tasa de crecimiento micelialen el medio PDA, se obtuvieron cuando la cepa se incubo a 35 °C (4,23 mm/d) en el caso de laproducción de biomasa el valor más bajo fue (158,7 mg) a 25 °C. Los cultivos de esta cepa en elmedio SA arrojaron en todos los caso valores menores, que los encontrados en el medio PDA a lamisma temperatura. Estos resultados son similares a los reportados por Zervakis et al., (2001a) conlas cepas de P. ostreatus, P. pulmonarius y L. edodes utilizando un medio suplementado con celulosa



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a 30º C, quienes obtuvieron la mayor tasa de crecimiento de 4.7 mm/d en P. pulmonarius que enmedio ASD o MEA.

Si se compara la tasa de crecimiento micelial con la producción de biomasa se puedeobservar que en el caso de la tasa de crecimiento, el mayor valor 5,22mm/d a 20°C es 1,23 vecesmayor que el menor valor 4,23 mm/d a 35°C, siendo esta diferencia menor a la observada en el casode la biomasa cuyo valor máximo 558,97mg a 20 °C es 3,53 veces mayor que el obtenido a 25 °C.Estos resultados indican que en el caso de esta cepa, el efecto de la temperatura es mayor sobre laproducción de biomasa corroborada por las observaciones en las placas en las que se observamicelio menos denso a temperatura superior a 25°C.

Para la cepa 3215, la tasa de crecimiento micelial máxima se obtuvo a 25 °C en el medio PDA5,45 mm/d y 3,72 mm/d en el medio SA a 30°C. Sin embargo, los valores más altos de producción debiomasa se obtuvieron a 30°C en el medio PDA y SA (742,33 y 233,97 mg respectivamente). La cepaPost presento mayor tasa de crecimiento micelial a 30°C tanto en el medio PDA 5,75 mm/d como enel medio SA 3,68 mm/d, en ambos casos el peor desempeño se registró a 35°C. En cuanto a laproducción de biomasa el valor máximo 146,33 mg se obtuvo a 20°C en el medio PDA y en el medioSA 106,65mg a 25 °C, esta cepa no presento crecimiento a 35C en ambos medios. La cepa PRALpresento el máximo de crecimiento micelial en el medio PDA a 25°C (5,59 mm/d) y en el medio SA a20°C (3,41 mm/d) los valores más bajos se obtuvieron a 35°C (3,23mm/d) en el medio PDA y en elmedio SA a 30°C (2,87mm/d). Los valores máximos de producción de biomasa se lograron a 25°C(136 mg) en el medio PDA y a 30 °C en el medio SA.

En general se puede indicar que la temperatura de incubación en el rango de 20 a 35 °C tienepoco efecto sobre la tasa de crecimiento de las cepas P132, P3215 y PRAL. No obstante, afecta deforma significativa la producción de biomasa dependiendo del medio de cultivo y de las característicasde cada cepa. La cepa Post es afectada negativamente por temperaturas superiores a 30°C.Presentando su mejor desempeño a 20°C. Las diferencias observadas entre las cepas crecidas en elmismo medio y en similares condiciones de incubación, indican que existen diferencias fisiológicasentre las mismas, atribuibles a diferencias genéticas. En cuanto al crecimiento en los dos mediosestudiados, es conocido, que estos hongos crecen naturalmente en sustratos vegetales ricos enlignocelulosa y almidón, pero con bajos contenidos de proteína, es de esperar que su capacidadamilolitica sea mayor que la proteolítica, esto explicaría el mayor crecimiento en el medio PDA.



48

Tabla X Tasa de crecimiento micelial (mm/día) tras la incubación por 9 día de las cepas P132, P3215, Post y PRAL enPDA (Agar Papa Dextrosa) y ASD (Agar Sabouraud Dextrosa).

CepaTasa de crecimiento micelial (mm/d) Producción de biomasa (mg) Temperatura

(ºC) i PDA a ASD b PDA c ASD d

P132e

5,22 2,42 558,97 * 230,40 20,00

5,07 3,25 158,17 269,67 * 25,00

4,51 3,24 166,80** 248,90 30,00

4,23** 3,17** 187,40 72,17** 35,00

P3215f

5,33 2,60** 193,00 192,63 20,00

5,45* 3,37 106,67** 224,43 25,00

3,52 3,72* 742,33* 233,97* 30,00

3,45** 2,76 145,67 149,70** 35,00

Postg

3,36 2,13 146,33 59,23 20,00

3,99 2,31 107,00 106,65 25,00

5,75 * 3,68 * 117,67 99,33 30,00

0,30 ** 0,30 ** 0,00 ** 0,30 ** 35,00

PRALh

4,78 3,41* 110,33 46,53 20,00

5,59* 3,01 136,00* 26,55 25,00

4,93 2,87** 58,33 63,60* 30,00

3,23** 3,01 34,33** 32,00** 35,00

Nota: a, b, c, d, e, f, g, h y i diferencia significativa en la tasa de crecimiento micelial, la producción de biomasascon respecto a la temperatura y los medios de cultivo con P < 0,05.

* Valores máximos ** Valores minimos



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Nota: a, b, c, d, e, f, g, h,i y j,

diferencia significativa en la tasa de crecimiento micelial con respecto a latemperatura y los medios de cultivo con P < 0,05.

Figura XV Efecto de la temperatura sobre el crecimiento micelial (mm) de las cepas P132, P3215,Post y PRAL crecidas en PDA (Agar Papa Dextrosa) y ASD (Agar Sabouraud Dextrosa).

V.3.3 Tasa de crecimiento de las cepas Post y P3215 en medios no convencionales

En los resultados mostrados en la fig. XVI a los 6 días de incubación se aprecia que la cepa3215 se desarrolla más rápido en el medio arroz seguida por tuza de maíz y sorgo, observándosepoco desarrollo sobre las semillas de parchita. Comportamiento similar se observó en el caso de lacepa Post, solo que en este caso el crecimiento en tuza fue ligeramente mayor al observado ensorgo. Sin embargo, a los 15 días de la incubación (tabla XI) se obtuvo que la cepa 3215 logró lamayor tasa de crecimiento 4,9 y 4,6 mm/d en los medios, tuza de maíz y arroz respectivamente, conescaso desarrollo en la semilla de parchita. La cepa Post mostro un comportamiento similar con tasasde crecimiento en tuza de maíz y en arroz de 4,1 y 3,9 mm/d respectivamente. Estos resultadosindican que la tuza de maíz podría ser un buen sustrato para la producción de inóculos (semilla) ypara el proceso de producción de carpóforos. Estos resultados nos permiten concluir que las cepasestudiadas presentan diferencias significativas entre ellas, ya que tienen comportamientos diferentes



50

frente a la composición del medio y la temperatura de incubación, desde el punto de vistabiotecnológico, esto resulta de gran importancia ya que se cuenta con cepas que pueden crecer adiferentes temperaturas y sustratos. En el caso de las cepas P132 P3215 y PRAL podrían cultivarseen zonas con temperaturas cercanas a los 25°C. Mientras la cepa Post se adapto mejor atemperaturas cercanas a los 30°C.

Tabla XI Tasa de crecimiento micelial (mm/día) a los 15 días de incubación de las cepas Post y P3215 ensustratos lignocelulósicos como tuza de maíz, semilla de sorgo, arroz y semilla de parchita.

SustratosTasa de crecimiento (mm/d)

Post P3215

Tuza a 4,1 ± 0 0,1 4,9 ± 0,3

Sorgo 2,1 ± 0,1 3,2 ± 0,1

Arroz b 3,9 ± 0,2 4,6 ± 0,2

Parchita c 1,49 ± 0,09 1,6 ± 0,1

Nota: a, b y c diferencia significativa en la tasa de crecimiento micelial con P< 0,05.

Figura XVI Crecimiento micelial de las cepas Post y P3215 al 6to día cultivadas en medios no convencionalescomo semilla de sorgo (Sorghum sp.), Tuza de maíz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa) y semilla de parchita(Passiflora edulis) incubadas a 25°C.

Estos resultados fueron parecidos a los obtenidos por (Grodzínskaya et al., 2002), donde lacolonización total sepresentó a los 14 días en las mezclas de medio no convencional; caña de azúcary tusa de maíz, y aserrín y caña de azúcar con cepas de P. ostreatus, aunque no presentan tasa decrecimiento micelial. Este crecimiento rápido, puede deberse al material lignocelulosico presente enestos sustratos y a la actividad del paquete enzimático presente en estas cepas, variando entre lascepas, siendo así reflejo de diferencias genéticas entre ellas.



51

V. 3.3. Características morfológicas de las cepas P3215 y Post en medios noconvencionales.

Las características miceliales de las cepas Post y P3215 crecidas en los medios no

convencionales como semilla de sorgo (Sorghum sp.), Tuza de maíz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa)y semilla de parchita (Passiflora edulis), se presentan en la Tabla XII. En la cepa P3215 se pudoobservar una densidad micelial de forma regular (tuza de maíz (Zea mays) y semilla de sorgo (Sorghum sp.)), abundante (arroz (Oryza sativa)) y escaso (semilla de parchita (Passiflora edulis)), elmicelio en cada medio se desarrollo de un color blanco y de forma aéria, no presentó aglomeracionesen los medios de cultivo. En los medios de cultivo semilla de sorgo (Sorghum sp.) y parchita(Passiflora edulis) tuvo menor invasión manteniendo la coloración de estos en donde no invadió elmicelio, mientras que en los medios como Tuza de maíz (Zea mays) y Arroz (Oryza sativa), lasregiones sin invasión sufrieron decoloración tornándose mas claros y mostrando estar secos.

En la cepa Post se pudo observar una densidad micelial de forma abundante (arroz (Oryza

sativa)), regular (tuza de maíz (Zea mays) y semilla de sorgo (Sorghum sp.)) y escaso (semilla deparchita (Passiflora edulis)). El micelio se desarrollo de color blanco en cada uno de los medios, nohay presencia de micelio aério en los medios Tuza de maíz (Zea mays) y Arroz (Oryza sativa), nopresentó aglomeraciones en los medios de cultivo. En los medios de cultivo semilla de sorgo(Sorghum sp.) y parchita (Passiflora edulis) tuvo menor invasión manteniendo la coloración estos endonde no invadió el micelio, mientras que en los medios como Tuza de maíz y Arroz , las regiones sininvasión sufrieron decoloración tornándose más claros.

Tabla XII Características morfológicas de las cepas estudiadas en en medios no convencionales como semillade sorgo (Sorghum sp.), Tuza de maíz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa) y semilla de parchita (Passiflora edulis)incubadas por 15 días a 25°C

CepaMedios de

Cultivo

Micelio Sustrato

DensidadMicelioaerio

ColorColor

Sin micelio Con micelio

P3215

Tuza de maíz Regular Si Blanco Marron claro Marron claro

S. Sorgo Regular Si Blanco Marron oscuro Marron claro

Arroz Abundante Si Blanco Beige Beige claro

S. Parchita Escaso Si Blanco Marron oscuro o negro Marron oscuro

Post

Tuza de maíz Regular Si Blanco Marron Marron claro

S. Sorgo Regular No Blanco Marron oscuro Marron claro

Arroz Abundante No Blanco Beige Beige claro

S. Parchita Escaso Si Blanco Marron oscuro o negro Marron oscuro



52

V.4 Identificación por técnicas moleculares de las cepas P3215, P132, Post.

Para llevar a cabo la identificación genética de las cepas del género Pleurotus, sedesarrollaron las siguientes actividades: 1) Puesta a punto de un método de extracción de ADN apartir del micelial de cada cepa. 2) Amplificación por PCR de las regiones ITS 1 e ITS2. A

continuación se describen los resultados obtenidos con relación a los objetivos planteados en estetrabajo.

V.4.1 Extracción del ADN

La integridad de los ADN obtenidos en cada uno de estos métodos de extracción se evaluó através de una electroforesis en gel de agarosa al 0,8%; mostraron que la metodología de Saghai-Maroof, et al . (1984) conservo la integridad del ADN y se obtuvo mayor concentración de ADN. El

ADN obtenido por el método de Lee, 1990 resulto parcialmente degradado y en menor concentracióncomo se muestra en la figura XV. La concentración de los ADNs genómicos obtenidas por el métodode Saghai-Maroof, et. al.1984 variaron entre los 1.000 - 4.000 ng/μL, permitiendo la amplificación dela región ITS1, 5.8S y ITS2 por PCR a un factos de dilución (FD) de 100 logrando amplificar todos lasmuestras. El ADN extraído por el método de Lee (1990) mostro degradación y concentración entre450 - 680 ng/μL, solo se pudo amplificar la región ITS1, 5.8S e ITS2 por PCR tras un FD de 1000. Enel caso de la cepa Pcit, no se produjo amplificación figura XVII.

V.4.1.1 La PCR de la región ITS 1 a ITS 2

La amplificación de la región ITS1-5.8S-ITS2 del ADNr con los primer’s ITS1 - ITS4. Arrojofragmentos con tamaño de alrededor de 500-670 pb para las cepas P3215, PRAL, POST, Pcit y P132,visualizando en geles de agarosa al 2% como muestra la figura XVIII.

La evaluación de los métodos Saghai-Maroof et al. (1984) y Lee (1990) para la extracción del ADN genómico de las cepas de estudio, permitió determinar que el protocolo con mayor eficiencia fueel de Saghai-Maroof et al. (1984); ya que permitió conservar la integridad, el grado de pureza, altasconcentraciones de los ADNs genómicos y amplificar por PCR la región ITS1, 5.8S e ITS2. Estodebido a que este método de extracción una vez pulverizado el material fúngico con nitrógenolíquido, el CTAB como surfactante catiónico es más eficiente en la eliminación de compuestossecundarios que atrapan el ADN en una matriz gelatinosa (Guillemaut & Maréchal-Drouard, 1992) yde proteínas y polifenoles que coprecipitan con el ADN genómico (Do & Adams, 1991; Demeke &

Adams, 1992) los cuales inhiben la reacción de amplificación de ADN (Pandey et al., 1996), mientrasque el método de Lee (1990); parte de la ruptura celular por acción mecánica, causando que laactividad lítica se dispare y se termine por degradar el ADN, también la purificación del ADNgenómico con un surfactante como el SDS es menos eficientes en la eliminación de compuestossegundarios que atrapan el ADN.



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Tabla XIII Comparación de las características del ADN obtenido a partir de las cepas del género Pleurotus a partir de los métodos de Saghai-Maroof, et al. (1984) (S) y Lee (1990) (L).

Muestra

Minerales Pureza Concentración (ng/ul) Integridad PCR (Dilución)

S L S L S L S L S L

P3215 1,8 1,03 1,3 1,62 18,73 1,25 Integro Degradado 100 1000

POST 0,72 3,39 1,7 1,75 6,92 0,28 Integro Degradado 100 1000

PCIT 4,33 2,59 1,01 1,42 0,21 0,43 Degradado Degradado 100 1000

PRAL 1,42 0,91 1,23 1,42 5,57 1,52 Integro Degradado 100 1000

P132 0,73 3,05 1,7 1,08 11,03 0,17 Integro Degradado 100 1000

Figura XVII Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de 1 μ g del ADN genómico extraído de las cepas delgénero Pleurotus P3215, P132, Post, Pcit y PRAL utilizando el método de Lee (1990) (a) y el método de

Saghai-Maroof, et. al.(1984) (b).



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Figura XVIII Análisis electroforético de los productos de PCR de la región ITS1, 5.8S y ITS2 amplificados conl os primer’s ITS1 y ITS4 a partir del ADN genómicos de las cepas del género Pleurotus como P3215, P132,Post, PRAL y PCIT extraídos por el método de Lee (1990) diluida a un FD de 1000 (a) y el método de Saghai-Maroof, et. al. (1984) a un FD de 100(b). (EPM) Escalera de peso molecular 1 Kb plus DNA ladder (+) Control

positivo y (-) al control negativo.

V.4.2 Análisis de la secuencia de la región ITS 1, gen 5.8 S ANDr y la región ITS2 dentrode las cepas del género Pleurotus

Una vez obtenidos los productos de PCR de la región ITS1, 5.8S e ITS2, se determinaron lasconcentraciones de AND a través de la cuantificación semicualitativa comparando con ADN delambda; obteniendo así entre 25 a 200 ng/µl y se enviaron a secuenciar a la Unidad de EstudiosGenéticos y Forenses (UEGF) del IVIC según como se muestra en la tabla XIV.

Tabla XIV Concentraciones de los productos de PCR de la región ITS1, 5.8S e ITS2 (PCR) de cada cepaenviado a secuenciar a la a la Unidad de Estudios Genéticos y Forenses del IVIC.

Muestras

Tipo de

ADNtemplado

Método de

Purificación

Tamaño del

ADNtemplado Primer

Temperatura

de Annealing(°C)

Concentración

de ADN (ng/µl)

P3215 PCR Método Alcalino 560 ITS1 (FW) 55°C 100Post PCR Método Alcalino 710 ITS1 (FW) 55°C 100Pcit PCR Método Alcalino 690 ITS1 (FW) 55°C 50

PRAL PCR Método Alcalino 720 ITS1 (FW) 55°C 25P132 PCR Método Alcalino 730 ITS1 (FW) 55°C 200



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De las 5 muestras enviadas a secuenciamiento, se obtuvieron 3 secuencias, de las cuales alcomenzar el análisis bioinformático se encontraron según la herramienta Blast del NCBI (Johnson etal., 2008) que las muestras P132, Post y P3215 comparten una identidad del 98% con cepasidentificadas en el NCBI a la especie Pleurotus ostreatus como lo muestra la tabla XV.

Tabla XV Identidad de los productos de PCR de la región ITS1, 5.8S e ITS2 de cada cepa enviada a secuenciar

a la Unidad de Estudios Genéticos y Forenses del IVIC.

Cepa Identidad ADNcódigo de

accesoEspecie

P132490/49(98.2%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 KJ020935 Pleurotus ostreatus 490/49(98.2%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 KF681359 P. ostreatus 490/49(98.2%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 KF309193 P. ostreatus

Post 492/49(98.8%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 JX429940 P. sapidus 492/49(98.8%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 KC686866 P. ostreatus 492/49(98.8%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 KC686865 P. ostreatus

P3215

626/64(97.81%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 KF309193 P. ostreatus

626/64(97.81%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 EU424300 P. ostreatus 625/64(97.66%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 KF681359 P. ostreatus

V.4.2.1 Análisis bioinformático de las secuencia de la región ITS 1, 5.8S e ITS2 de lascepas del género Pleurotus

Una vez identificadas las secuencias de la región ITS 1, gen 5.8 S ANDr a ITS2 de lascepas del género Pleurotus a través de la herramienta bioinformática Blast del NCBI como Pleurotus,

se procedió con el análisis del RFLP de las secuencias de P132, Post y P3215, junto a las con variassecuencias del GenBank correspondientes a diferentes cepas de las especies P. eryngii , P.tuberregium, P. citrinopileatus, P. cystidiosus, P. ostreatus, P. pulmonarius y P. djamor ; empleandolas herramientas de bioinformática NEBcutter V2.0 (Vincze et al., 2003) y Webcutter 2.0 (Maarek etal., 1997); encontrando que comparten los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción

ApoI, AciI, HaeIII, HinfI, Hpy166II, HpyCH4V, CviAII y MnLI, y cortan el ADN en 4 fragmento como semuestra en la tabla XVI, en relación a esto y con el análisis de Martin et al. (2004 ) se hizo el análisisde RFLP virtual con base en la enzima Haelll, a cada una de las secuencia encontrando variacionesen el patrón de digestión de la región ITS1 a ITS2 entre las especies evaluadas (Figura XVII, carrilesEF514248, AB115043, AY265821, EF514243, EF514244 y EF514250), y cierta similitud del patrón dedigestión entre las cepas y la especie P. ostreatus (Figura XIX, carriles P3215a, Posta, P132, Postb,P3215b y EF514248).

Los resultados por la técnica RFLP permitieron diferenciar e identificar correctamente lasespecies del género Pleurotus utilizadas en este estudio, obteniendo los patrones teóricos de bandasesperados. Adicionalmente, el patrón teórico de bandas de la cepa P3215, P132 y Post permitióubicarla en la especie P. ostreatus, obteniendo una identificación consistente con respecto a losresultados obtenidos por métodos convencionales. Aun así, esta metodología presenta una bajaespecificidad para la diferenciación de especies estrechamente relacionadas como las subespeciesde especies en este clado. El análisis electroforético, análisis de secuencias de dominios de la región28S y recientes comparaciones de las regiones ITS1-5.8s-ITS2 del ADNr han permitido distinguirnuevas especies reubicadas como P. cystidius y P. abalonus (Zervakis et al., 2004).La similitud de



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secuencias explica la alta probabilidad de obtener un perfil electroforético RFLP similar que nopermite distinguir entre especies estrechamente relacionadas.

Figura XIX Patrones RFLP de los fragmento ITS1-5.8S-ITS2 ADNr de las secuencias EF514248 Pleurotusostreatus, EF514244 P. cystidios, AB115043 P. citrinopiliatus, EF514250 P. tuberregium, EF514243 P.

pulmonarius, P132, P3215a, P3215b y Posta, digeridos con la enzima HaeIII a través de la herramientaNEBcutter v2.0 (Vincze et al., 2003). Marcador de peso molecular 100pb.



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Tabla XVI Patrones de bandas RFLP esperados para las especies del género Pleurotus tras la digestión teórica con las enzimas de restricción que cortan en sitios. Negro (Las enzimas de restricción que comparten todos), Rojo que comparten las cepas P132, Post y P3215.

Nombre de la Secuencia Enzimas de Restricción que cortan en 3 sitios del ADN

EF514248 P.ostreatus AciI (C^CG_C) APoI (RÂATT_Y) HaeIII (GG|CC) Hindi (GÂNT_C) HPy166II (GTN|NAC) HPyCH4V (TG|CA)

Cortes*7/9, *591/593,

*637/63924/28, 331/335,

411/41548/48, 230/230,

472/472340/343, *348/351, 571/574

*64/64, 94/94,*210/210

64/64, 328/328, 499/49

EF514244 P. cystidios APoI (RÂATT_Y) - - - - -

Cortes8/12, 327/331,

407/411- - - - -

AB115043 P. citrinopiliatus AciI (C^CG_C) HPy166II (GTN|NAC) APoI (RÂATT_Y) - - -

Cortes *473/475, *593/595,*614/616

*50/50, 83/83,*171/171

9/13, 294/298,374/378

- - -

EF514250 P. tuberregium APoI (RÂATT_Y) - - -

Cortes10/14, 323/327,

403/407- - -

EF514243 P. pulmonarius APoI (RÂATT_Y) HinfI (GÂNT_C) HPy166II (GTN|NAC) HP.yCH4V (TG|CA) - -

Cortes8/12, 315/319,

395/399324/327, *332/335,

546/549*48/48, 78/78,

*194/19448/48, 312/312, 474/474 - -

AY265821 P. djamor CviAII (CÂT_G) - - - - -

Cortes225/227, 383/385,

551/553- - - - -

EU233990 P.eryngii - - - - - -

Cortes - - - - - -

P.132 AP.oI (RÂATT_Y) HaeIII (GG|CC) HP.y166II (GTN|NAC) MnlI (CCTCNNNNNN_N^) - -

Cortes6/10, 312/316,

392/39629/29, 211/211,

455/455*45/45, 75/75,

*191/191 40/39, 358/357, 482/481 - -

P.3215a APoI (RÂATT_Y) CviAII (CÂT_G) FatI (^CATG_) MnlI (CCTCNNNNNN_N^) NlaIII (_CATG^) -

Cortes 18/22, 211/215,291/295

60/62, 94/96, 234/236 59/63, 93/97, 233/237 95/94, 127/126, 250/249 63/59, 97/93,237/233

-

P.3215b AciI (C^CG_C) HaeIII (GG|CC) HinfI (GÂNT_C) HPy166II (GTN|NAC) HPyCH4V (TG|CA) -

Cortes*572/574, *619/621,

*643/64526/26, 207/207,

451/451317/320, 552/555,

612/615*42/42, 71/71, 187/187

42/42, 305/305,479/479

-

P.osta AgsI (TT_SÂA) HaeIII (GG|CC) HPy166II (GTN|NAC) MnlI (CCTCNNNNNN_N^) - -

Cortes64/63, 240/239,

335/33429/29, 209/209,

454/454*45/45, 75/75,

*189/18940/39, 356/355, 481/480 - -

P.ostb AgsI (TT_SÂA) CviAII (CÂT_G) FatI (^CATG_) HPy166II (GTN|NAC) MluCI (ÂATT_) NlaIII (_CATG^)

Cortes65/64, 241/240,

336/33541/43, 369/371,

541/54340/44, 368/372,

540/544*46/46, 76/76, *190/190

303/307, 311/315,390/394

44/40, 372/368, 544/54



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V.4.2.2 Análisis Filogenético de las cepas del género Pleurotus

El análisis filogenético de las regiones ITS1 e ITS2 arrojaron resultados con topologíadiferentes entre las regiones evaluadas, encontrando en la región ITS1 valores bootstrap altos (60 -99) para la resolución de los clados correspondientes a las especies Pleurotus ostreatus, P. djamor,

P. citropileatus y P. eryngii, indicando una construcción filogenética solida (Figura XX a), y en ITS2 seobservó ser una región más variable en el género Pleurotus con valores de bootstrap altos (50 - 99)para la resolución de los clados correspondientes a las especies P. cystidios, P. citronopeliaus, P.

pulmonaris y P. ostreatus indicando una construcción filogenética solida exceptuando para lasespecies P. ostreatus y P. eryngii (Figura XX b).

En un intento de aproximar a la identificación de las cepas P3215, P132 y Post se analizaronlos valores observados en la matriz de distancia genética pareada de K2P. La matriz K2Pcorrespondiente a la región ITS2 presentó valores iguales de número de sustituciones de bases porsitio (0.00) entre las especies estrechamente relacionadas del clado P. ostreatus, P. sapidus y P.erryngii lo cual no permitió establecer diferencias entre las especies. Por otro lado, la matriz K2P de la

región ITS1 permitió excluir las especies P. djamor , P. citrinopileatus, P. cystidios, P. eriingy y P.drynius, reduciendo la identificación de estas cepas estudio a las especies P. ostreatus, P. floridanus,P. florida y P. sapidus (Tabla XVII y Tabla XVIII).

El análisis filogenético fue realizado únicamente con las cepas P3215, P132 y Post, lainferencia del árbol filogenético de las región ITS1 y ITS2 no obtuvo una sólida construcción dentro delos clados de especies estrechamente relacionadas como son P. ostreatus, P. sapidus y P. florida alobtener valores bajos de bootstrap (61 y 35).

Al evaluar las diferencias de los resultados del agrupamiento de los árboles filogenéticos y el

número de sustituciones de bases por sitio de las regiones ITS1 e ITS2, se obtiene que estasregiones no presentan igual conservación evolutiva. Al comparar el valor total (overall) de número desustituciones de bases por sitio (K2P) se obtiene una mayor divergencia nucleotídica para la regiónITS2 con respecto a la región ITS1. Aun así, estos estudios revelan que esta divergencia y ladiversidad de estas secuencias difieren dependiendo del grupo taxonómico. Para este estudio laregión ITS2 no permitió reducir la identificación dentro del género Pleurotus, mientras que la regiónITS1 permitió excluir las especies las especies Pleurotus eriingy y Pleurotus cornucopiea, reduciendola identificación de las cepa P3215, P132 y Post de estudio a las especies P. ostreatus y P.floridanus. Aun así, el análisis pudo verse sesgado por la falta de un número representativo desecuencias de cepas de referencia pertenecientes a dichas especies; siendo así las regiones ITS

ADNr insuficientes para la identificación certera de las cepas evaluadas.



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Tabla XVII Matriz de distancias genéticas pareadas K2P para la región ITS1.

Distancia 1,00000 2,00000 3,00000 4,00000 5,00000 6,00000 7,00000 8,00000 9,00000 10,00000 11,00000 12,00000 13,00000 14,00000 15,00000 16,00000 17,00000 18,00000 19,00000 20,00000 21,00000 22,00000 23,00000 24,00000 25,00000 26,00000 27,00000 28,00000 29,00000 30,00000 31,00000 32,00000 33,00000 34,00000 35,00000 36,00000 37,00000 38,00000 39,00000 40,00000 41,00000 42,00000 43,00000 44,00000 45,00000

1,00000 AB115036ITS1P_cystidiosus 0,06875 0,07796 0,09906 0,08383 0,10478 0,07987 0,09016 0,09906 0,07796 0,07796 0,07796 0,07782 0,07782 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,02251 0,07796 0,08758 0,10478 0,06259 0,06259 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,07796 0,08572 0,07796 0,07796

2,00000 AB115037ITS1P_cornucopiae 0,17159 0,07091 0,09054 0,08684 0,09687 0,07105 0,08147 0,09054 0,07091 0,07091 0,07091 0,02260 0,02260 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,06333 0,07091 0,07986 0,09687 0,06866 0,06866 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07091 0,07924 0,07091 0,07091

3,00000 AB115038ITS1P_pulmonarius 0,20101 0,17388 0,04063 0,07485 0,10201 0,03387 0,04786 0,04063 0,00000 0,00000 0,00000 0,06197 0,06197 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000

4,00000 AB115042ITS1P_eryngii 0,28929 0,25861 0,06866 0,10153 0,11044 0,04786 0,02260 0,00000 0,04063 0,04063 0,04063 0,08147 0,08147 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,09228 0,04063 0,09256 0,11044 0,10441 0,10441 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04611 0,04063 0,04063

5,00000 AB115049ITS1P_javanicus 0,22735 0,25702 0,19813 0,29018 0,09081 0,07853 0,09723 0,10153 0,07485 0,07485 0,07485 0,09459 0,09459 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07743 0,07485 0,07562 0,09081 0,08283 0,08283 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,07485 0,08204 0,07485 0,07485

6,00000 AB115053ITS1P_djamor 0,32144 0,28831 0,32058 0,35478 0,25800 0,10454 0,10456 0,11044 0,10201 0,10201 0,10201 0,10426 0,10426 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,09727 0,10201 0,04030 0,00000 0,09965 0,09965 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201

7,00000 AB272091ITS1P_nebrodensis 0,20101 0,17388 0,04549 0,09248 0,19813 0,32058 0,04063 0,04786 0,03387 0,03387 0,03387 0,08060 0,08060 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,07324 0,03387 0,08851 0,10454 0,08144 0,08144 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,03387 0,04230 0,03387 0,03387

8,00000 AB286152ITS1P_eryngii 0,25702 0,22735 0,09248 0,02223 0,26076 0,32144 0,06866 0,02260 0,04786 0,04786 0,04786 0,09054 0,09054 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,08333 0,04786 0,08705 0,10456 0,09634 0,09634 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,04786 0,05369 0,04786 0,04786

9,00000 AB286153ITS1P_eryngii 0,28929 0,25861 0,06866 0,00000 0,29018 0,35478 0,09248 0,02223 0,04063 0,04063 0,04063 0,08147 0,08147 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,09228 0,04063 0,09256 0,11044 0,10441 0,10441 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04063 0,04611 0,04063 0,04063

10,00000 AB733142ITS1P_ostreatus 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,06197 0,06197 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,0000011,00000 AB733143ITS1P_ostreatus 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,06197 0,06197 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000

12,00000 AY450345ITS1P_ostreatus 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,06197 0,06197 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000

13,00000 AY540318ITS1P_citrinopileatus 0,20101 0,02223 0,14530 0,22735 0,28929 0,32058 0,20420 0,25861 0,22735 0,14530 0,14530 0,14530 0,00000 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,07283 0,06197 0,08707 0,10426 0,07789 0,07789 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06963 0,06197 0,06197

14,00000 AY540319ITS1P_citrinopileatus 0,20101 0,02223 0,14530 0,22735 0,28929 0,32058 0,20420 0,25861 0,22735 0,14530 0,14530 0,14530 0,00000 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,07283 0,06197 0,08707 0,10426 0,07789 0,07789 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06197 0,06963 0,06197 0,06197

15,00000 AY540326ITS1P_sapidus 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000

16,00000 AY540327ITS1P_sapidus 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000

17,00000 AY540332ITS1P_ostreatus 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000

18,00000 EF514243ITS1P_pulmonarius 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,07128 0,00000 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000

19,00000 EF514244ITS1P_cystidiosus 0,02210 0,14530 0,17388 0,25861 0,19890 0,28831 0,17388 0,22735 0,25861 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388 0,17388 0,07128 0,08146 0,09727 0,05392 0,05392 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07128 0,07920 0,07128 0,07128

20,00000 EF514248ITS1P_ostreatus 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,08568 0,10201 0,07990 0,07990 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000

21,00000 EU424287ITS1P_djamor 0,25679 0,22671 0,25702 0,28805 0,19813 0,06823 0,25702 0,25679 0,28805 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,25702 0,22671 0,25702 0,04030 0,08991 0,08991 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,08568 0,09405 0,08568 0,08568

22,00000 EU424288ITS1P_djamor 0,32144 0,28831 0,32058 0,35478 0,25800 0,00000 0,32058 0,32144 0,35478 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,32058 0,28831 0,32058 0,06823 0,09965 0,09965 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201 0,10201

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24,00000 EU424294ITS1P_dryinus 0,14545 0,17159 0,22735 0,32058 0,22737 0,29018 0,22735 0,28831 0,32058 0,22735 0,22735 0,22735 0,20101 0,20101 0,22735 0,22735 0,22735 0,22735 0,11882 0,22735 0,25679 0,29018 0,00000 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,07990 0,08713 0,07990 0,07990

25,00000 EU424300IST1P_ostreatus 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000

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42,00000 P3215a 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02135 0,00000 0,00000

43,00000 P3215b 0,23227 0,20420 0,02223 0,09248 0,22671 0,32058 0,06988 0,11748 0,09248 0,02223 0,02223 0,02223 0,17388 0,17388 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,20420 0,02223 0,28929 0,32058 0,25861 0,25861 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02223 0,02135 0,02135

44,00000 Posta 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02223 0,00000

45,00000 Postb 0,20101 0,17388 0,00000 0,06866 0,19813 0,32058 0,04549 0,09248 0,06866 0,00000 0,00000 0,00000 0,14530 0,14530 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,17388 0,00000 0,25702 0,32058 0,22735 0,22735 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,02223 0,00000



60

Tabla XVIII Matriz de distancias genéticas pareadas K2P para la región ITS2.

Distancia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

1 AB115043ITS2P_citrinopileatus 0,05687 0,05522 0,05378 0,04476 0,00000 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,04499 0,04415 0,04415 0,04761 0,04600 0,05378 0,06481 0,05378 0,03272 0,03272 0,04386 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,06128 0,05378 0,05598 0,06145 0,06497

2 AB286152ITS2P_eryngii_var_ferula 0,20353 0,01528 0,01095 0,06812 0,05687 0,01095 0,01095 0,01095 0,01095 0,05443 0,05275 0,05275 0,02850 0,06789 0,01095 0,06260 0,01095 0,04747 0,04747 0,05686 0,01095 0,01095 0,01476 0,01476 0,01095 0,01476 0,01095 0,01095 0,01476 0,01095 0,01476 0,01476 0,02992 0,01095 0,01657 0,03023 0,03809

3 AB286153ITS2P_eryngii_var_ferula 0,20159 0,02183 0,01027 0,06476 0,05522 0,01027 0,01027 0,01027 0,01027 0,05200 0,04766 0,04766 0,02777 0,06202 0,01027 0,05701 0,01027 0,04636 0,04636 0,05350 0,01027 0,01027 0,01460 0,01460 0,01027 0,01460 0,01027 0,01027 0,01460 0,01027 0,01460 0,01460 0,02919 0,01027 0,01550 0,02980 0,03679

4 AY265832ITS2P_flor idanus 0,18815 0,01087 0,01084 0,06382 0,05378 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529

5 AY265851ITS2P_smithii 0,14595 0,25275 0,25002 0,23580 0,04476 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,03824 0,03550 0,03550 0,05460 0,04053 0,06382 0,06061 0,06382 0,04718 0,04718 0,04342 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,06382 0,07207 0,06382 0,06708 0,07647 0,07427

6 AY265852ITS2P_citrinopileatus 0,00000 0,20353 0,20159 0,18815 0,14595 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,04499 0,04415 0,04415 0,04761 0,04600 0,05378 0,06481 0,05378 0,03272 0,03272 0,04386 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,05378 0,06128 0,05378 0,05598 0,06145 0,06497

7 AY368665ITS2P_ostreatus 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529

8 AY450345ITS2P_ostreatus 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529

9 AY540327ITS2P_sapidus 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,0352910 AY540332ITS2P_ostreatus 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,05054 0,04865 0,04865 0,02599 0,06325 0,00000 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529

11 DQ882570ITS2P_abalonus 0,14595 0,17691 0,17494 0,16198 0,10539 0,14595 0,16198 0,16198 0,16198 0,16198 0,02248 0,02248 0,04945 0,04463 0,05054 0,04957 0,05054 0,05053 0,05053 0,04389 0,05054 0,05054 0,05426 0,05426 0,05054 0,05426 0,05054 0,05054 0,05426 0,05054 0,05426 0,05426 0,06160 0,05054 0,05322 0,06225 0,05889

12 DQ882571ITS2P_abalonus 0,14595 0,17691 0,16024 0,16198 0,10539 0,14595 0,16198 0,16198 0,16198 0,16198 0,04497 0,00000 0,05200 0,04184 0,04865 0,05789 0,04865 0,04407 0,04407 0,04045 0,04865 0,04865 0,05192 0,05192 0,04865 0,05192 0,04865 0,04865 0,05192 0,04865 0,05192 0,05192 0,05377 0,04865 0,05171 0,06059 0,05808

13 DQ978222ITS2P_cystidiosus 0,14595 0,17691 0,16024 0,16198 0,10539 0,14595 0,16198 0,16198 0,16198 0,16198 0,04497 0,00000 0,05200 0,04184 0,04865 0,05789 0,04865 0,04407 0,04407 0,04045 0,04865 0,04865 0,05192 0,05192 0,04865 0,05192 0,04865 0,04865 0,05192 0,04865 0,05192 0,05192 0,05377 0,04865 0,05171 0,06059 0,05808

14 EF514243ITS2P_pulmonarius 0,15872 0,06787 0,06756 0,05596 0,18815 0,15872 0,05596 0,05596 0,05596 0,05596 0,15872 0,17322 0,17322 0,05839 0,02599 0,05755 0,02599 0,03872 0,03872 0,05458 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,02599 0,03975 0,02599 0,02815 0,04126 0,04616

15 EF514244ITS2P_cystidiosus 0,15745 0,25906 0,22753 0,24151 0,13004 0,15745 0,24151 0,24151 0,24151 0,24151 0,14595 0,13206 0,13206 0,21941 0,06325 0,05532 0,06325 0,04180 0,04180 0,04677 0,06325 0,06325 0,06750 0,06750 0,06325 0,06750 0,06325 0,06325 0,06750 0,06325 0,06750 0,06750 0,07272 0,06325 0,06713 0,07716 0,07637

16 EF514248ITS2P_ostreatus 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,05889 0,00000 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529

17 EF514250ITS2P_tuberregium 0,24757 0,24540 0,21530 0,22927 0,25992 0,24757 0,22927 0,22927 0,22927 0,22927 0,18499 0,23117 0,23117 0,22630 0,21530 0,22927 0,05889 0,06382 0,06382 0,04771 0,05889 0,05889 0,06220 0,06220 0,05889 0,06220 0,05889 0,05889 0,06220 0,05889 0,06220 0,06220 0,07171 0,05889 0,06317 0,06484 0,06728

18 EU424286ITS2P_ostreatus 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,04487 0,04487 0,05247 0,00000 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529

19 EU424287ITS2P_djamor 0,09257 0,15872 0,15745 0,14464 0,16024 0,09257 0,14464 0,14464 0,14464 0,14464 0,17494 0,14595 0,14595 0,11761 0,14356 0,14464 0,25992 0,14464 0,00000 0,04501 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,05372 0,04487 0,04692 0,05366 0,06618

20 EU424289ITS2P_djamor 0,09257 0,15872 0,15745 0,14464 0,16024 0,09257 0,14464 0,14464 0,14464 0,14464 0,17494 0,14595 0,14595 0,11761 0,14356 0,14464 0,25992 0,14464 0,00000 0,04501 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,04487 0,05372 0,04487 0,04692 0,05366 0,06618

21 EU424291ITS2P_dryinus 0,14356 0,19229 0,19010 0,17691 0,15745 0,14356 0,17691 0,17691 0,17691 0,17691 0,14595 0,13206 0,13206 0,18815 0,16024 0,17691 0,18284 0,17691 0,15745 0,15745 0,05247 0,05247 0,05576 0,05576 0,05247 0,05576 0,05247 0,05247 0,05576 0,05247 0,05576 0,05576 0,05987 0,05247 0,05578 0,05392 0,05787


23 EU424316ITS2P_sapidus 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529



26 FJ379271ITS2P_cornucopiae 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,01031 0,00000 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529

27 FJ608594ITS2P_Florida 0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,01031 0,01031 0,00000 0,01031 0,00000 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755

28 FJ810181ITS2P_sapidus 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529

29 FN391585ITS2P_ostreatus 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000 0,01031 0,00000 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529

30 GU721058ITS2P_floridanus 0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087 0,01031 0,00000 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755

31 GU7222811ITS2P_ostreatus 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,01031 0,01031 0,02686 0,00000 0,01140 0,02734 0,03529

32 HM561980ITS2P_sapidus 0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755

33 HM590444ITS2P_ostreatus 0,18815 0,02198 0,02183 0,01087 0,23580 0,18815 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,05596 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,14464 0,14464 0,19229 0,01087 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000 0,02897 0,01031 0,01508 0,02970 0,03755

34 P132 0,24352 0,07937 0,07933 0,06746 0,29441 0,24352 0,06746 0,06746 0,06746 0,06746 0,23117 0,19991 0,19991 0,12893 0,30025 0,06746 0,32317 0,06746 0,19733 0,19733 0,23117 0,06746 0,06746 0,07937 0,07937 0,06746 0,07937 0,06746 0,06746 0,07937 0,06746 0,07937 0,07937 0,02686 0,02933 0,03309 0,04756

35 P3215a 0,18815 0,01087 0,01084 0,00000 0,23580 0,18815 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,16198 0,16198 0,16198 0,05596 0,24151 0,00000 0,22927 0,00000 0,14464 0,14464 0,17691 0,00000 0,00000 0,01087 0,01087 0,00000 0,01087 0,00000 0,00000 0,01087 0,00000 0,01087 0,01087 0,06746 0,01140 0,02734 0,03529

36 P3215b 0,20353 0,02198 0,02183 0,01087 0,25275 0,20353 0,01087 0,01087 0,01087 0,01087 0,17691 0,17691 0,17691 0,06787 0,25906 0,01087 0,24540 0,01087 0,15872 0,15872 0,19229 0,01087 0,01087 0,02198 0,02198 0,01087 0,02198 0,01087 0,01087 0,02198 0,01087 0,02198 0,02198 0,07937 0,01087 0,03051 0,03809

37 Posta 0,24352 0,07937 0,07933 0,06746 0,31260 0,24352 0,06746 0,06746 0,06746 0,06746 0,23117 0,23117 0,23117 0,12893 0,31912 0,06746 0,27140 0,06746 0,19733 0,19733 0,19991 0,06746 0,06746 0,07937 0,07937 0,06746 0,07937 0,06746 0,06746 0,07937 0,06746 0,07937 0,07937 0,09156 0,06746 0,07937 0,04343

38 Postb 0,25992 0,11688 0,11639 0,10406 0,31260 0,25992 0,10406 0,10406 0,10406 0,10406 0,23117 0,23117 0,23117 0,16950 0,31912 0,10406 0,29197 0,10406 0,27687 0,27687 0,21530 0,10406 0,10406 0,11688 0,11688 0,10406 0,11688 0,10406 0,10406 0,11688 0,10406 0,11688 0,11688 0,18216 0,10406 0,11688 0,15475



61

(a) (b)

Figura XX Clados de los arboles filogenéticos de las regiones ITS1 y 5.8S (a) e ITS2 (b) construidos por el método NJ-K2P- 1000 Bootstrap.



62

V.4.2.3 Análisis de la estructura segundaria de la región ITS2

Al realizar el análisis de estructuras secundarias bajo el método comparativo de secuencias yestructuras homologas de la región ITS2 de las secuencias de las cepas P3215, P132 y Post, juntocon varias secuencias del GenBank correspondientes a diferentes cepas de las especies P. eryngii ,

P. tuberregium, P. citrinopileatus, P. cystidiosus, P. ostreatus, P. pulmonarius y P. djamor ( EF514248, AB115043, AY265821, EF514243, EF514244, EF514250 y EF514248), se encontró que estascomparten el mismo motivo 5.8S que para el género Pleurotus representa la secuencia5’GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA3’; variando según la especie en el motivo 28S, como se veen la Figuras XXI y tabla XIX.

Una vez realizado el análisis global de las estructuras secundarias para todas las secuencias,se procedió bajo este método comparativo de secuencias y estructuras homologas a inferir laestructura segundaria completa de la región ITS2 de la cepa P3215 obteniendo una estructura decuatro proyecciones o brazos (doble hélices auto complementarias), como muestra la figura XXII.

El análisis de la cepa P3215 arrojó coincidencias con un valor de e-value de 2,64 e-99 de lascuales una perteneciente a la especie P. nebrodensis presentando una identidad de un 88,24 % y85,71 % de las primeras 2 hélices, y 75,57% y 77,78% para la tercera y cuarta hélice respectivamente(88,235 / 85,714 / 75,571 / 77,778). Las diez coincidencias restantes correspondieron a 5 P. ostreatus con un e-value de 5,716 e-96, con porcentajes de 100 / 100 / 100 / 100 identidad como muestra latabla XX, corroborando la identidad de la cepa con respecto al análisis filogenético de la región ITS1.

Tabla XIX Motivos conservados 5.8S y 28S en la región ITS2 del género Pleurotus

Especie ID Motivo 5.8S Motivo 28S

P. ostreatus

P3215 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCGGGTAGGACTCCC

Post GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA -

P132 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA -

EF514248 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCAGGTAGGACTACC

P. djamor AY265821 GAAGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCAGGTAGGACTACC

P. pulmonarius EF514243 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCAGGTAGGACTA

P. cystidiosus EF514244 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCAGGTAGGA

P. citrinopileatus AB115043 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCGCAAATCAGGTAGGACTACC

P. tuberregium EF514250 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCAGGTAGGACTAC

P. eryngii EU233990 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA -

El análisis de estructuras secundarias del ITS2 ADNr se vio afectado debido a el posibleencuentro de secuencias mal anotadas, lo cual queda reflejado en la presencia de especies como P.spodoleucus que pertenece actualmente al género Agaricus sp., pero la coincidencia con P. ostreatus corroboró el estudio al patrón RFLP teórico en que se le encontró relación a esta cepa de estudio conla especie P. ostreatus.



63

Figura XXI Motivos conservados 5.8S y 28S en la región ITS2 del género Pleurotus



64

Tabla XX Coincidencias encontradas por comparación de estructura secundaria ITS2 de la cepa P3215(Pleurotus ostreatus var. florida).

ID Especie E-value Modelo

EF470252 P. nebrodensis 1,203x 10-112 88,235 / 85,714 / 75,571 / 77,778

AY368663 P. floridanus 2,640x10-99 100 / 100 / 100 / 100

GU722281 P. ostreatus 3,416x10-98 100 / 100 / 100 / 100

AY265848 P. spodoleucus 1,228x10-97 100 / 100 / 100 / 100

EU424310 P. ostreatus 1,228x10-97 100 / 100 / 100 / 100

EU622256 P. ostreatus 5,716x10-96 100 / 100 / 100 / 100

FN391585 P. ostreatus 5,716x10-96 100 / 100 / 100 / 100

DQ077881. Pleurotus 5,716x10-96 100 / 100 / 100 / 100

HM561980 P. sapidus 5,716x10-96 100 / 100 / 100 / 100

AY854077 P. ostreatus 2,056x10-95 100 / 100 / 100 / 100

Figura XXII Estructura secundaria de la secuencia ITS2 de la cepa P3215 (Pleurotus ostreatus var. florida).



65

CAPITULO VI

CONCLUSIÓNES

Las características morfo-anatomicas permitieron clasificar a las cepas Post, P3215 y P132 enel género Pleurotus.

En los medios PDA y ASD la temperatura de incubación en el rango de 20 – 35 °C, tiene pocoefecto sobre las tasas de crecimiento micelial de las cepas P3215, P132, Post y PRAL; no obstante,afecto la producción de biomasa dependiendo del medio de cultivo y de cada cepa.

El compartamiento de las cepas inoculadas a diferentes temperaturas en mediosconvencionales, indican que las cepas P132, P3215 y PRAL podrían cultivarse en temperaturascercanas a los 25 °C, mientras que la cepa Post se cultiva mejor a temperaturas cercanas a los 30°C.

Las diferencias en cuanto a las tasa de crecimiento y producción de biomasa, cuando lascepas fueron cultivadas en las mismas condiciones, indican que existe diferencias fisiologicas ygenéticas entre ellas.

La tuza de maíz resulto el mejor sustrato no convencional para el cultivo de las cepas Post yP3215, siendo así una alternativa al sorgo para la producción de semilla fúngica o inoculo mayor.

Mediante las técnicas moleculares se determino por análisis filogenético de las regiones ITS1e ITS2 del ADNr que las cepas Post, P3215 y P132 pertenecen a la especie P. ostreatus.

La técnica de RFLP teóricos a través de la digestión virtual de las secuencias del región ITS1,5.8S a ITS2, corroboró el análisis filogenético; logrando diferenciar e identificar correctamente lasespecies del género Pleurotus utilizadas en este estudio, obteniendo los patrones de bandasesperados. Adicionalmente, el patrón de bandas de la cepa Post de estudio permitió ubicarla en laespecie P.ostreatus. Por otro lado, los análisis de la secuencia primaria y secundaria de la regiónITS1 e ITS2 ubicaron las cepa P3215, P132 y Post de estudio dentro del clado de especiesestrechamente relacionadas P . ostreatus y P. floridanuss.

El estudio molecular de las cepas corroboró su descripción morfológica.



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RECOMENDACIONES

Se requiere la constitución de un mico-cepario de hongos comestibles del géneo Pleurotus spp., queincluya cepas importadas y aislados autóctonos; dicho material debe ser caracterización desde e l punto de vistamorfologíco y anatomico del micelio vegetativo y los cuerpos reproductivo, fisiologíco evaluando su desarrolloen diferentes medios de cultivo, a temperaturas, pH, luz y humedad; y identificación molecular por medio de

diferentes marcadores moleculares a parte de la región ITS 1, 5.8S e ITS2; buscando así la aplicabilidadbiotecnologíca del cepario.

El análisis filogenético de la región ITS1 a ITS2 de las cepas del género Pleurotus presentesen el Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos SIXTO DAVID ROJO, revelo unaincertidumbre para identificación de especie, por lo cual se recomienda ampliar la recolección deestos recursos genéticos y repetir este tipo de análisis junto a otros marcadores moleculares como elgen del factor de elongación de la traducción 1 (EF1), los tres tipos de ARNr [18S (subunidadpequeña ARN-SSU), 5.8S y 28S (subunidad grande ARN-LSU)]; el de la ARN polimerasa II (RPB2)para lograr una identificación definitiva de las cepas de estudio, tal como lo sugieren varios autores(Lutzoni et al.,2004; Marongiu et al., 2005; White et al.,1990), además de evaluar el conocimientotradicional de estos en las comunidades y llevar a cabo pruebas de compatibilidad genética con elresto a los 15 grupos interestériles hasta ahora descritos para el género Pleurotus (Vilgalys et al.,1996), lo cual confirmará la identidad del material aislado y evaluará la posibilidad de especiesgenéticamente aisladas e interestériles con el resto de los miembros de esta taxa, a partir delconcepto biológico de especie.

El uso de las regiones ITS’s ADNr no fueron suficientes para una identificación definitiva entreespecies estrechamente relacionadas, por lo cual se concluye que es necesario la realización deestudios adicionales de métodos convencionales y diferentes marcadores moleculares para llegar auna identificación certera. Por último, se recomienda la revisión de las especies estrechamenterelacionadas para lograr una correcta anotación tanto de las secuencias como de las estructurassecundarias que permitan una diferenciación correcta entre estas especies, estableciendo límitesclaros entre ellas.



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BIBLIOGRAFÍA Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., & Ram, S. J. (2004). Image processing with ImageJ. Biophotonics

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75

ANEXOS

Anexo 1 Key to identify Mushrooms to genus using only macroscopic features (Largent, 1986).

In this key, only characteristics of mushrooms that can be seen with the unaided eye or with a handlens are used. Since this key is based only on macroscopic features, you many not be able to identifycorrectly all genera of mushrooms you study ( Langent, 1986).

1. Sporocarp not growing on other mushrooms………………………………………………………………6 6. Undersurface of pileus with normal, blade-like gills……………………………………………………...10

10. Pileus with definite stipe that may be central, eccentric, or (rarely) even lateral……………………21

10. Pileus sessile; laterally attached and sheving, or attached by a short lateral tubercle or"pseudostipe", or basally attached and funnel-shaped or spatulate (pleurotoid habit)…………………11 11. Spores not as above……………………………………………………………………………………….13

13. Spores white to pale yellowish or cream-colored, or (rarely) pale dingy lilac………………………15 15. Gills not split along their edges and rolled back laterally………………………………………………16 16. Gills narrow or broad, but not strongly crisped or sinuos; pileal thickness varies, but if thin enoufghto be membranous it is also soft and fleshy…………………………………………………………………17 17. Pileus varying in consistency from soft and pulpy to pliable and leathery, but not corky; gills nottough and leathery……………………………………………………………………………………………...19 19. Edges of gills entire………………………………………………………………………………………20 20. Pileus soft and pulpy or fleshy……………………………………………………………… Pleurotus

21. Gills not deliquescent………………………………………………………………………………………23 23. Stipe when broken or split lengthwise showing evidence of fibrous context………………………25 25. Volva not present…………………………………………………………………………………………..31

31.Annulus absent; however, a cortina may be present……………………………………………………51 51. Gills attached……………………………………………………………………………………………….58 58. Flesh of mature pilei soft and pulpy to soft-fibrous, or very fragile (not reviving when moidtenedafter having been dried); spores white, parle yellowish, or some other color……………………………61

61 stipe central, or nearly so…………………………………………………………………………………65 61. Stipe definitely and consistenly escentric, sometimes almost lateral………………………………62 62. Spores white to pale yeloowish or cream-colored, or pallid lilac…………………………Pleurotus

65. Gills variously attached, but neither adnate-subdecurrent not decurrent…………………………….77 77. Stipe stouter than the above, usually 5 mm or more thick, fleshyfibrous and soft, or pulpy, or with afirm cartilaginou " rind" and soft interior; pileal fleh ordinarily at least 3-5 mm thick at the center , rarelythin enough to be called membranous……………………………………………………………................91 91.Spores white to pale cream-colored (rarely cream-colored with a faint pinkish tinge) to pale pink, orsalomon-pink, dingy salmon, to brownish-salmon…………………………………………………………..92 92. Gills thin, usually close or crowded, rarely subdistant, and not waxy-appearing……………………96 96. Spore wite to cream-colored to pale pink, al times cream-colored with a faint pinkish tinge; maturegills not pink from the spores………………………………………………………………………………….97 97. Not as above………………………………………………………………………………………………..98 98. Carpophore growing out of cones or growing oud of decaying wood (i.e.lignicolous)…………...…99 99.Carpophore on cones or on decaying wood; gills not completely sterile (some especies ofPleurotus)



76

Anexo 2 Keys of género Pleurotus (Petersen et al., 2012).

Keys abound for limited groups (Vilgalys et al., 1993, for the P. ostreatus complex) or of limitedaccuracy (Pilát, 1935; Kühner and Romagnesi, 1953; Hilber, 1982, 1993, 1997).To devise a key to this group is fraught with problems, for basidiome colors, hosts, and stature oftenintergrade, and geographical distribution is often wide and therefore creates overlaps. Especiallyvexing is the separation of Pleurotus pulmonarius from its sister monomitic, pleurotoid species, P.ostreatus and P. populinus. With these problems in mind, the following key to biological species isoffered.

1. Anamorphic spores produced on basidiomata or associated vegetative mycelium…................…… 2 1. Anamorphic spores, if formed, not associated with basidiomata ………….…………..…………........ 42. Anamorphic state a lawn of simple conidiophores producing black arthrospores, dry initially but laterslimy; Australa, New Zeald…………………………….............................................................. P. australis

2. Anamorph coremioid, with black, slimy heads of arthrospores.………..…….…………………........… 3 3. Pileus pale tan to brown; distribution roughly pantropical..……………...……………….. P. cystidiosus

3. Pileus deep olive, olive-black, occasionally with purplish tints; New Zealand, Australia……………………………………………………………………………...….. P. purpureo-olivaceus

4. Stipe central to weakly eccentric …………………………………………...............…………….….…… 5 4. Stipe strongly eccentric or lateral …………….…………………....................…….…………………... 11 5. Pileus tan, brown, rufous brown, usually concave ……………………………………………...……..….6 5. Pileus pearl gray, white, or banana yellow …………………….………........................................…… 8 6. Basidiomata arising from a sclerotium ………….....……..........................................… P. tuber-regium

6. Basidiomata without sclerotium ……………………………………………....................................……. 7 7. Root parasite; pileus tan to brown; Europe ……………………………...………………….... P. eryngii

7. On rotting wood; pileus tan, brown, usually with ruddy tints....……………………........ P. cornucopiae

8. Pileus and stipe white to pearl gray …………………………………………………...….................…… 9 8. Pileus banana yellow; stipe white (citrinopileatus form) ……………….....................… P. cornucopiae

9. Stipe nearly lateral; on Agave, Opuntia; northern Africa, Mexico ……...........................… P. opuntiae

9. Stipe central; all basidiome parts white …………………………………………………………..…… 10 10. Pileus surface velutinous to plushy; warm climates; anamorph unknown ….......................... P. levis

10. Pileus surface strigose to wooly; cool, wet climates; anamorph of tan to Brown arthrospores inculture ……………………………………...............................................................................…. P. dryinus

11. Stipe tissue dimitic.…………………………………………...……………....…..............................…. 12 11. Stipe tissue monomitic…………………………….………...………………................................…… 14 12. Partial veil present over young lamellae.……………………………………......……… P. calyptratus 12. Partial veil absent …………………………………………..……..............................................…….. 13 13. Basidiomata usually everted; pileus surface ruddy tan to ruddy brown…………….. P. cornucopiae

13. Basidiomata pleurotoid; pileus surface white, yellow-olive, brown, olive-brown, pink or gray………………..…….………....................................................................................................… P. djamor

14. On coniferous wood; northern China, far eastern Russia ………......………………..... P. abieticola



77

14. On deciduous wood (chiefly) …………………………………………………….........................……. 15 15. Pileus and lamellae buffy tan to pastel tan; lamellae subdistant; spore print pallid buff; spores 9-12X 3-5 m m; North America; usually on Populus wood..............………………………….….... P. populinus

15. Pileus various shades of off-white, tan, brown, deep gray, bluish olive to olive-black; spore printavellaneous; spores 7-10 m m long; worldwide; usually on deciduous wood……...…………………... 1616. Fruiting predominately in winter; pileus tan, brown, gray-brown, olive-black; North Temperate Zone………………………..……………………………................................................................... .P. ostreatus

16. Fruiting predominately in late summer (Europe, Asia, eastern North America) or spring (westernNorth America); pileus white, tan, gray-brown; North Temperate Zone…………………. P. pulmonarius.

ANEXO 3 Analisis estadístico del efecto del medio de cultivo y la temperatura en la tasa decrecimiento micelial y producción de biomasa de las cepas del género Pleurotus

Factores inter-sujetos N

Cepa

1,00 6

2,00 83,00 124,00 10

Temperatura

20,00 1025,00 1030,00 935,00 7

Suma de

cuadrados

tipo III

gl Media

cuadrática F Sig.

Suma de

cuadrados

tipo III

gl Media

cuadrática F Sig.

PDA 83,239a 14,00 5,95 68,02 0,00 PDA 23,27 8,00 2,91 33,28 0,00

SA 32,753b 14,00 2,34 107,32 0,00 SA 11,98 8,00 1,50 68,69 0,00

mgPDA 1653599,307c 14,00 118114,24 29,69 0,00 mgPDA 877443,34 8,00 109680,42 27,57 0,00

mgSA 255295,762d 14,00 18235,41 6,93 0,00 mgSA 45162,50 8,00 5645,31 2,15 0,08

PDA 478,48 1,00 478,48 5474,21 0,00 PDA 1,84 21,00 0,09

SA 201,90 1,00 201,90 9261,40 0,00 SA 0,46 21,00 0,02

mgPDA 777234,89 1,00 777234,89 195,38 0,00 mgPDA 83540,01 21,00 3978,10

mgSA 388772,29 1,00 388772,29 147,76 0,00 mgSA 55254,59 21,00 2631,17

PDA 10,96 3,00 3,65 41,78 0,00 PDA 724,41 36,00

SA 7,09 3,00 2,36 108,37 0,00 SA 300,26 36,00

mgPDA 391315,54 3,00 130438,51 32,79 0,00 mgPDA 2591962,84 36,00

mgSA 114720,65 3,00 38240,22 14,53 0,00 mgSA 787973,77 36,00

PDA 27,09 3,00 9,03 103,29 0,00 PDA 85,08 35,00

SA 8,07 3,00 2,69 123,44 0,00 SA 33,21 35,00

mgPDA 334083,15 3,00 111361,05 27,99 0,00 mgPDA 1737139,32 35,00

mgSA 13831,52 3,00 4610,51 1,75 0,19 mgSA 310550,35 35,00

Cepa Total

Temperatura Total

corregida

Pruebas de los efectos inter-sujetos

Origen Origen

Modelo

corregido

Cepa *

Temperatura

Intersección Error

a. R cuadrado = ,978 (R cuadrado corregida = ,964)

b. R cuadrado = ,986 (R cuadrado corregida = ,977)



78

Anexo 4 Secuencias de la región ITS 1 a ITS2 de las cepas del género Pleurotus P3215, P132 y Post

Región ITS1 a 5.8S de las cepas P3215, P132 y Post del género Pleurotusp .

>P132ITS1

AAAAAGAATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCA ACCACCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGACAACACAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCTACGA

ATGTCATTTAATGGGCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAAAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

>P3215aITS1CATTATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCACCACCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTTTCAAGTCGTCAGACTTGGTTTGCTGGGATTT

AAACGTCTCGGTGTGACAACACAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCTACAAATGTC

ATTTAATGGGCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAAAATTCAGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

>P3215bITS1CTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGACAACACAGTCTATTTACTTAACACACCCCAAATGTATGTCT

ACGAATGTCATTTAATGGGCCTTGTGCCTATAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTC

A

>POstaITS1CATAATTATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTCAACCACCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTCTCAAGTCGTCAGACTTGGTTGCTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGACTACGCAGTCTATTTACTTACACACCCCAAATGTATGTCTACGAATGTCATTTAATGGGCCTTGTGCCTTTAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGA

ATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA

>PostbITS1GAATATTGATTCCTATGGAGTTGTTGCTGGCCTCTAGGGGCATGTGCACGCTTCACTAGTCTTTC

AACCACCTGTGAACTTTTGATAGATCTGTGAAGTCGTCTCTCAAGTCGTCAGACTTGGTTGCTGGGATTTAAACGTCTCGGTGTGACTACGCAGTCTATTTACTTACACACCCCAAATGTATGTCTACGAATGTTATTTAATGGGCCTTGTGCCTTTAAACCATAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCCCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA



lxxix

Region ITS2 de las cepas P3215, P132 y Post del género Pleurotusp.

>P132_ITS2TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTGGGGGGCTGCTGGCCTTGACAGGTGGGCTCCTCCTAAAAGCTTTAGCGGGACTTCTCATTG

>P3215a_ITS2TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGCTGCTGGCCTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCAGGACTTCTCATTGCCTCTGCGCATGATGTGATAATTATCACTCATCAATAGCACGCATGAATAGATGTCCAGCTCTCCAATCGTCCGCAAGTGACG

AATTTGACAATTGACCTCAAAT

>P3215b_ITS2TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTTTTTCCAATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGGGCTGCTGGCCTTGACAGGTCGGCTCCCTCTTAAATGCATTAGCAGGATTTCTCATTGCCTCTGCGCATGATGTGATAATTATCACTCATCAATAGCACGCATGAATAAGAGTCCAGCTCTCCAATCGTCCGCAGGGAC

AATTTGACAATTTGACCTCAAATCGGGTAGGACTCCCCCGCTGAACTTAAGCTTTCAATAAGCGG

AAAAAAA

>Postb_IT2TTAAATTCTCAACTCACTTTGGTTTCTTTCCATTGTGATGTTTGGATTGTTGGGGCTGCTGGCCTTGACAGGCCGGCTCCTCTTTAATGGATTAGGAGGACTTTCCATTGCCCTCTGCGCTGATGGGAAAA

ATATCACTCCTCAATAGCCCCGCATGAATAGAGTCCC

>Posta_ITS2TTAAATTCTCAAACTCACTTTGGTTTCTTTCCAAATTGTGATGTTTGGGATTGTGGGGGGCTGCTGGCCTTGACAGGTCGGCTCCTCTTAAATGCTTTAGCAGGGACTTCTCATTTGCCTCT



80

GLOSARIOC.Cariogamia: Paso final en el proceso de fusión de dos células eucariontes haploides, en el cual sefusionan los dos núcleos celulares dando origen al zigoto.

Carpóforo: Cuerpo fructífero.

Cepa: En microbiología, una variante fenotípica de una especie o incluso de un taxón inferior,propagada clonalmente, debido al interés en la conservación de sus cualidades definitorias.

Champiñón: hongo de botón: Agaricus bisporus

D.Dicariótica: La carga genética es n+n.

Diploide: La carga genética es 2n. H.Haploides: la carga genética es n.

Hiang-gu: Shiitake: Lentinula sp.

Hongo: fungus: seta.

Hongo Orellana: hongo ostra: hongo oreja de palo: Setas ostra: Pleurotus ostreatus.

L.Líquenes: Asociación simbióticas conformando por hongo y bacteria. o las micorrizas (hongo conplantas superiores)

M.Meiosis: División celular que permite la reproducción sexual, comprendido por 2 divisiones

sucesivas; una primera división meiótica, en la cual una célula diploide se obtienen dos células hijashaploides (n); y una segunda división meiótica (división mitótica), división en que las células hijastienen el mismo número de cromosomas que la célula madre. Así, dos células haploides de la primeradivisión meiótica se obtiene cuatro células haploides.

Micorrizas: Asociación simbióticas conformando por hongo y plantas superiores.

O.Oreja de judas: Auricularia sp.

P.Parásitos facultativos y obligados: Alimentarse lentamente de otros seres vivos.

Plasmogamia: Es la unión íntima entre los citoplasmas de los gametos o células que se funcionencomo tales en los procesos de reproducción sexual.

Pleurocarpo: Etimología; del latín científico pleurocarpus, acuñado como nombre del taxónPleurocarpi por Bridel en (1822) , a partir del neolatín pleuro-, del griego antiguo πλεσρο-, de πλεσρά(pleurá), "costado", o πλεσρόν (pleurón), "costilla"; y el neolatín -carpus, del griego antiguo -καρπος(karpos), forma combinatoria de καρπός (karpós), "fruto".

S.Saprófitos: alimentarse de material vegetal en descomposición.



81

SIGLAS Y ABREVIATURAS

#.ºC: Grados centrigrados.

5.8S: Unidad 5.8S del ARN ribosomal.A.A.C.: Antes de Cristo.

ADN: Ácido dexoribonucleico.

ADNr: ADN ribosomal.

ASD: Agar Sabarouad Dextrosa.

ARN: Ácido ribonucleico.

ARNr: ARN ribosomal.C.cm: Centímetro.

CMS: Cultivo en Medios Solido.

F.FES: Fermentación de estado sólido.

G.g: gramo

H.h: Horas

I.IGS: Espaciadores Intergénicos.

ITS: Espaciadores transcritos Internos.

L.LSU: Subunidad Larga.

M.mg: miligramos.

ml: mili litros.

mm: milímetros.

min: Minutos

P.PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.



PDA: Agar Papa Dextrosa.

R.RAPDs: Amplificación aleatoria de ADN polimórfico.

RFLP: Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción.

RPB2: Sub unidad II de la ARN polimerasa Subunidad.

S.SCARs: Caracterización de la secuencia de la región amplificada.

sp.: Se emplea para designar una especie concreta cuyo epíteto específico es desconocido.

SSRs: microSatélites.

SSU: Subunidad pequeña.

T.TEF1: Factor 1 de elongación de la transcripción.

Ton: Tonelada.

µ.µm: micrómetro.

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