TEKSTIILIVÄRIEN KROONISET, MONEN SUKUPOLVEN

HAITTAVAIKUTUKSET VESIKIRPUSSA (DAPHNIA MAGNA)

ENNI HUOTARI

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND

Department of Environmental and Biological Sciences

HUOTARI, ENNI: Chronic multigenerational effects of textile dyes on Daphnia magna

MSc. thesis, 33 p.

April 2019

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

(Key words: Textile dyes, chronic ecotoxicity, Daphnia magna)

Textile industry is one of the most polluting industries in the world. It uses variety of chemicals, textile

dyes being one of the most harmful ones. Still, part of the effluents from textile factories are released

to surrounding waterways without any or adequate treatment. This master thesis research studied

chronic, multigenerational effects on Daphnia magna of two textile dyes which are sold in

supermarkets, focusing on reproduction and growth effects. Studied textile dyes are reactive dyes,

which are designed to be non biodegradeble and stable in fabric, Reactive red 180 and Reactive blue

ver 2108. These dyes are commonly used for dying cotton. Both acute and chronic methods were used

to study ecotoxicity of the dyes. Acute toxicity test was performed to find suitable concentration for

chronic test, which means concentration that does not show acute toxicity. Two chronic tests were

performed. The first chronic test ended after F1 generation due to high mortality rate probably because

of too warm temperature in the test room. Thus, there were not enough new-born daphnids to continue

to next generation. During chronic tests, reproduction, size of mother daphnids, mortality, sex and

number of ephippias were observed and measured. Number of offspring was recorded daily and size of

mother daphnids was measured after each generation.

Neither of the dyes showed acute toxicity in any exposure concentration. One observation was that

the growth was reduced with the successive generations in this test setup in control and exposure

groups. The second chronic test exposure of reactive blue ver 2108 caused changes in reproduction

and growth. Daphnids that were exposed to dye were bigger and reproduced more than daphnids in

control group. This can be explained for example by hormesis, which means that in low concentrations

harmful substance causes the opposite effect than in high concentrations. Hormetic effect can seem to

be beneficial for the population e.g because of increased reproduction or bigger body size.

This research was not able to go further than F2-generation. Analysis of more generations is necessary

before it is possible to make conclusions about harmfulness of these textile dyes.

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO

Ympäristö- ja biotieteiden laitos

HUOTARI, ENNI: Tekstiilivärien krooniset, monen sukupolven haittavaikutukset vesikirpussa

(Daphnia magna)

Pro gradu - tutkielma, 33s.

Huhtikuu 2019

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

(Avainsanat: Tekstiilivärit, krooninen ekotoksisuus, Daphnia magna)

Tekstiiliteollisuus on yksi saastuttavimmista teollisuudenaloista. Sen käytössä on monenlaisia

erilaisia kemikaaleja, joista tekstiilivärit ovat haitallisimpien joukossa. Tekstiilitehtaista pääsee

käsittelemättömiä tai puutteellisesti käsiteltyjä vesiä ympäröiviin vesistöihin. Tässä

gradututkimuksessa tutkittiin kahden marketeissa saatavilla olevan tekstiilivärin kroonisia, monen

sukupolven haittavaikutuksia vesikirpun (Daphnia magna) lisääntymiseen ja kasvuun. Värit olivat

tyypillisesti puuvillan värjäykseen käytettyjä biohajoamattomiksi ja pysyviksi suunniteltuja

reaktiivivärejä, Reactive red 180 ja Reactive blue ver 2108. Tekstiilivärien haitallisuutta tutkittiin

akuutein ja kroonisin kokein. Akuutteilla toksisuuskokeilla etsittiin sopiva pitoisuus kroonisia

kokeita varten, eli pitoisuus joka ei aiheuttanut akuuttia toksisuutta. Kroonisia kokeita suoritettiin

tutkimuksen aikana kaksi. Ensimmäinen koe loppui F1-sukupolveen suuren kuolleisuuden vuoksi,

jonka syynä oli luultavasti koehuoneen liian korkea lämpötila. Seuraavaa sukupolvea varten ei

kuolleisuuden takia syntynyt tarpeeksi vesikirppuja. Kroonisten kokeiden aikana seurattiin

vesikirppujen lisääntymistä, emokirppujen kokoa sekä kuolleisuutta, sukupuolijakaumaa ja

lepomunien määrää. Syntyneiden poikasten määrä laskettiin päivittäin ja emojen pituus mitattiin

kunkin sukupolven päätteeksi.

Kummankaan värin kohdalla ei havaittu akuuttia toksisuutta missään altistuspitoisuudessa.

Kroonisissa kokeissa yhtenä huomiona oli vesikirppujen koon pieneneminen sukupolvien edetessä,

sekä kontrollissa että altistussarjoissa. Toisessa kroonisessa kokeessa, jossa tutkittiin ainoastaan

violettia väriä, huomattiin värin vaikuttavan vesikirppujen lisääntymiseen sekä kokoon.

Värialtistuksessa kasvaneet vesikirput tekivät enemmän poikasia ja olivat isokokoisempia kuin

kontrollisarjan vesikirput. Tämä voidaan selittää hormeesilla, eli haitallinen aine aiheuttaa pienissä

pitoisuuksissa vastakkaisen vaikutuksen kuin suurissa pitoisuuksissa. Pienissä pitoisuuksissa

aineen vaikutus voi näyttää eliötä hyödyttävältä vaikutukselta. Tämä tutkimus jatkui vain F2-

sukupolveen asti, koska koe oli aikataulullisten syiden vuoksi päätetty lopettaa tähän sukupolveen.

Useamman sukupolven analysointi on tarpeen ennen kuin näiden tekstiilivärien haitallisuudesta

voidaan vetää suurempia johtopäätöksiä.

Sisällysluettelo

1. JOHDANTO ............................................................................................................................. 4

1.1 Tutkimuksen tausta ............................................................................................................ 4

1.2 Tutkimuksen tavoitteet ...................................................................................................... 7

2 MATERIAALIT JA MENETELMÄT .......................................................................................... 7

2.1 Tutkittavat kemikaalit ............................................................................................................. 7

2.2 Malliorganismi Daphnia manga ........................................................................................... 10

2.3 Alustavat testit ja akuutit toksisuustestit .............................................................................. 11

2.4 Krooninen altistuskoe ja koeasetelma .................................................................................. 12

2.5 Analytiikka ja tilastolliset menetelmät ................................................................................. 16

3 TULOKSET ................................................................................................................................ 17

3.1 Akuutit toksisuustestit .......................................................................................................... 17

3.2 Ensimmäinen krooninen koe ................................................................................................ 18

3.2.1 Poikastuotanto ................................................................................................................ 18

3.2.2. Koko .............................................................................................................................. 20

3.2.3 Sukupuolijakauma ja lepomunat .................................................................................... 21

3.3 Toinen krooninen koe ........................................................................................................... 21

3.3.1 Poikastuotanto ................................................................................................................ 22

3.3.2 Koko ............................................................................................................................... 24

3.3.3 Sukupuolijakauma ja lepomunat .................................................................................... 24

4 TULOSTEN TARKASTELU ..................................................................................................... 25

4.1 Akuutit toksisuustestit .......................................................................................................... 25

4.2 Krooniset kokeet ................................................................................................................... 25

4.2.1 Poikastuotanto ................................................................................................................ 26

4.2.2 Koko ............................................................................................................................... 27

4.2.3. Sukupuolijakauma ja lepomunat ................................................................................... 28

5. JOHTOPÄÄTÖKSET ................................................................................................................ 29

5. KIITOKSET ............................................................................................................................... 30

6. LÄHDELUETTELO .................................................................................................................. 30

4

1. JOHDANTO

1.1 Tutkimuksen tausta

Tekstiiliteollisuus on yksi saastuttavimmista teollisuudenaloista (UNECE 2018). Vaate -ja

jalkineteollisuus tuottaa 5-10% vuosittaisista globaaleista hiilidioksidipäästöistä ja 20%

globaaleista jätevesistä (Quantis 2018 & UNECE 2018). Suurimmat vaikutukset näkyvät tekstiilejä

värjäävien tehtaiden ympäristössä. Vuonna 2017 suurimmat tekstiilivalmistajat ja -viejät olivat

Kiina, EU-maat ja Intia (WTO 2018). EU-maista suurimpia tuottajia ovat Ranska, Italia, Saksa,

Espanja ja Alankomaat. Tekstiiliteollisuus on kasvanut viime vuosien aikana ja samalla myös sen

aiheuttama paine ympäristölle. Nykyään esillä on termi ”pikamuoti”, jolla tarkoitetaan halpoja ja

heikkolaatuisia vaatteita, joilla on lyhyt elinkaari. Tekstiiliteollisuuden suuri ympäristökuorma

koostuu raaka-aineiden kuten puuvillan tuotannosta, sen kuluttamasta vedestä,

kemikaalikuormasta ja jäteveden tuotannosta sekä vaikeudesta kierrättää tekstiilijätettä. Pikamuoti

ja vaatteiden lyhyet elinkaaret kasvattavat tätä kuormitusta.

Vaatteiden valmistus keskittyy edelleen halpatuotantomaihin, joissa jätevedenpuhdistamoiden

menetelmät eivät välttämättä ole riittäviä poistamaan haitallisia aineita jätevedestä (Dey & Islam

2015). Tekstiilitehtaiden jätevesistä haasteellisinta on poistaa väriaineita, liuenneita kiintoaineita,

suoloja, ja mahdollisia raskasmetalleja sekä neutraloida kemiallista hapenkulutusta (COD) ja

happamuutta (pH) (Chen ym. 2005). Lisäksi puhdistamoiden toiminnan valvonta ei ole aina

riittävällä tasolla (Idris ym. 2007 & Haque 2017). Jätevedenpuhdistamoiden kapasiteetti tuleville

vesimäärille voi myös olla riittämätön (Vacchi ym. 2017). Teollisuuden jätevesille, mukaan lukien

tekstiiliteollisuuden jätevedet, asetetut raja-arvot vaihtelevat maittain suuresti (ZDHC 2015).

Jäteveden väriä mitataan monessa maassa, mutta hajonta raja-arvoissa on suurta ja eri maissa

käytetään erilaisia mittayksiköitä. Tämä vaikeuttaa jätevesien värillisyyden vertailua.

Värillisyyden raja-arvot ilmoitetaan tyypillisimmin platina-koboltti -skaalassa (Pt-Co). Menetelmä

sopii parhaiten, keltaisen väristen luonnollisten orgaanisten ainesten värjäämien vesien väriarvojen

määritykseen ja sen skaala on välillä 0-500 ppm (EPA Method 110.2). Intian

ympäristölainsäädännössä teollisuuden jätevesille on yleinen standardi, jonka mukaan vedestä

tulee poistaa väriä niin paljon kuin käytännössä on mahdollista (The Environment Protection rules

5

S.O.844(E) 1986. Schedule 6). Tekstiilitehtaille on asetettu raja-arvoksi 150 Pt-Co ja värejä

valmistaville tehtaille raja-arvo 400 Pt-Co (Standards for discharge of effluents from textile

industry 2016 & Environment Standards for Dyes and Dye Intermediate Industry 2014). Thaimaan

nykyisen lainsäädännön mukaan pintavesiin vapautettavan käsitellyn veden väriarvo saa olla 300

ADMI (B.E. 2560 2017). ADMI -väriarvo vastaa Pt-Co -skaalaa ja sen kantaliuos, jota käytetään

väriarvon määrityksessä, valmistetaan samalla tavalla (EPA method 110.1). Menetelmä sopii

teollisuuden jätevesille, joiden väri eroaa keltaisesta.

Jopa 20% tekstiilien värjäämiseen käytetyistä väreistä päätyy jäteveteen (Umbuzeiro ym.

2005). Tehtaat ovat vastuussa jätevesiensä käsittelystä. Ne voivat käsitellä ne itse tai johtaa vedet

jätevedenpuhdistamoihin. Tehtaiden, jotka käsittelevät itse jätevedet tulee noudattaa

päästörajoituksia, mutta käytössä olevilla menetelmillä näihin rajoituksiin ei aina päästä (Idris ym.

2007).

Tekstiilivärejä on eri tyyppejä ja suurimmat haitat tekstiilitehtaiden jätevesissä aiheuttavat

reaktiivivärit (Pang & Ahmad 2013). Tämä johtuu niiden heikosta kiinnittymisestä kuituun sekä

moniosaisesta värjäysprosessista, jossa kiinnittymätön väri toistuvasti huuhdellaan pois (Khatri

ym. 2015). Kiinnittymätön väri päätyy jätevesijärjestelmään. Tekstiilivärit on suunniteltu

biohajoamattomiksi, koska niiden tarkoitus on pysyä vaatteessa (Chequer ym. 2013). Tämän

vuoksi niiden poistaminen jätevedestä on vaikeaa ja värit voivat koitua ympäristössä ongelmaksi.

Jätevedenpuhdistamoissa on käytössä yleensä mekaaninen, kemiallinen tai biologinen puhdistus

tai näiden yhdistelmä (Vacchi ym. 2017). Nämä ovat taloudellisia vaihtoehtoja, mutta eivät riitä

poistamaan vedestä kaikkia kemikaalijäämiä. Uusia menetelmiä värien poistoon kehitellään, mutta

niiden ongelmana on kallis hinta ja tehtaiden erilaiset tarpeet puhdistukselle (Khatri ym. 2015).

Epätäydellinen jätevesien puhdistus johtaa puhdistamattomien tai vaillinaisesti puhdistettujen

jätevesien päätymiseen vastaanottaviin vesistöihin, joissa ne voivat aiheuttaa haittavaikutuksia

sekä ympäristölle että ihmisille (Dey & Islasm 2015 & Vacchi ym. 2017). Monet tekstiilejä

värjäävistä tehtaista sijaitsevat jokien läheisyydestä ja usein tehtaiden puhdistettu jätevesi lasketaan

jokiin (Dey 2015 & Haque 2017). Jokivettä käyttävät ihmiset voivat näin altistua haitallisille

kemikaaleille. Mutageenisiä ja karsinogeenisiä vaikutuksia on tutkittu esimerkiksi Brasilian

Piracicabajoesta ja tutkimusten perusteella havaittiin haittoja ihmisten terveydelle (Vacchi ym.

2017). Väriaineiden saastuttamat vedet voivat haitata vesikasvien fotosynteesiä, koska valoa ei

pääse väriaineiden vuoksi veteen tarpeeksi (Mostafa 2005).

6

Tekstiilien värjäämiseen käytetään happovärejä, reaktiivivärejä, dispersiovärejä, suoravärejä ja

rikkivärejä. Osaa käytetään luonnonkuiduille ja osaa synteettisten materiaalien värjäämiseen.

Selluloosapohjaisille kuiduille eniten käytetyt tekstiilivärit ovat reaktiivivärejä (OECD 2017).

Tässä tutkimuksessa käytetyt värit ovat marketeista saatavilla olevia reaktiivivärejä.

Markettiväriaineet ovat tarkoitettu kankaiden värjäykseen joko pesukoneessa tai liottamalla

vaatetta vedessä. Värjäyksen jälkeen nämä tekstiilivärit päätyvät kunnalliseen

jätevesijärjestelmään. Reaktiivivärit ovat vesiliukoisia värejä, joilla voidaan tuottaa laaja skaala

erilaisia värisävyjä (Lewis 2014). Kaikkien värien kohdalla värjäämisprosessiin tarvitaan suuri

määrä vettä (Hessel ym. 2007). Puuvillan värjääminen reaktiiviväreillä kuluttaa kaikista

värjäysprosesseista eniten vettä (Khatri ym. 2015). Mikään tekstiilien värjäämiseen käytetty väri

ei kiinnity täydellisesti materiaaliin, vaan osa väriaineesta pysyy aina liuenneena valmistusprosessi

käytettyyn veteen. Reaktiiviväreillä on kaikista alhaisin kiinnittymisprosentti (50-90%), mikä

tarkoittaa, että jopa puolet väristä päätyy jäteveteen (Khatri ym. 2015). Reaktiivivärit muodostavat

kovalenttisen sidoksen reagoidessaan kuidun funktionaalisen ryhmän kanssa. Kovalenttinen sidos

on vahva kemiallinen sidos, jonka vuoksi reaktiivivärit pysyvät hyvin tekstiilissä.

Tekstiilivärien perusrakenne koostuu kromoforeista ja auksokromeista (Pang & Ahmad 2013).

Kromofori on molekyylin osa, joka saa aikaan molekyylin värin. Auksokromi on molekyylin

funktionaalinen ryhmä, joka vaikuttaa kromoforiin muuttaen absorboituvan valon aallonpituutta ja

intensiteettiä (Chequer ym. 2013). Väriaineen rakenne ja funktionaaliset ryhmät vaikuttavat

väriaineen kiinnittymiseen ja värin vahvuuteen (Siddiqua ym. 2017). Tekstiilien valmistuksessa

niihin lisätään värin lisäksi paljon muita kemikaaleja, joiden tarkoitus on parantaa tekstiilin

ulkonäköä ja kestävyyttä, estää ryppyyntymistä ja likaantumista sekä suojata tekstiiliä kosteudelta

ja homeelta (KEMI 2014). Tekstiiliä ostettaessa on kuitenkin mahdotonta tietää sen todellinen

kemikaalisisältö.

Useat tekstiilivärit luokitellaan atsoväreihin niiden sisältämän atso-ryhmän (-N=N-) vuoksi.

Atsovärit voivat hajotessaan muuntua karsinogeenisiksi ja mutageenisiksi aromaattisiksi

amiineiksi. Tämän vuoksi aromaattisiksi amiineiksi muuntuvien atsovärien käyttöä rajoitettiin

EU:n alueella vuonna 2002 (REACH EC 1907/2006). Aromaattisiksi amiineiksi hajoavia

atsovärejä saa olla tekstiileissä korkeintaan 30ppm, jos tekstiili on käytössä suorassa ja pitkässä

ihokontaktissa. Intiassa syöpää aiheuttavia atsovärejä on kielletty jo 1990-luvun lopulla (OECD

2002). Intia seuraa samoja rajoituksia aromaattisten yhdisteiden osalta kuin EU-maatkin. Myös

7

Vietnam asetti vuoden 2018 alusta lähtien raja-arvoja atsoväreille, jotka voivat muuntua

karsinogeenisiksi aromaattisiksi amiineiksi (QCVN 21: 2017 / BCT & SGS NO. 186/17).

Tekstiileissä saa Vietnamin ja Intian asetusten myötä olla korkeintaan 30mg/kg näitä aromaattisia

amiineja, eli vastaava määrä kuin REACH-asetuksen mukaan.

Myös käytössä olevista vaatteista irtoaa vielä pesun aikana kemikaaleja, ja etenkin väriä vielä

useammankin pesukerran jälkeen (Luongo 2015). Pesun kautta ympäristöön kulkeutuvia

tekstiilikemikaaleja on tutkittu toistaiseksi suhteellisen vähän eikä tarkasti

tiedetä, minkälaisia vaikutuksia niillä on. Tässä tutkimuksessa käytettävät värit ovat

kotitalouskäyttöön tarkoitettuja pesukonevärejä. Värjäysprosessi on erilainen, kuin teollisuudessa

mutta pesukonevärjäyksessäkään kaikki väri ei tartu värjättävään tekstiiliin vaan osa siitä päätyy

kunnalliseen jätevedenpuhdistukseen.

1.2 Tutkimuksen tavoitteet

Tämä tutkimus keskittyi tutkimaan kahden vaatteiden värjäämiseen käytetyn

markettiväriaineen haittavaikutuksia. Tutkimuksessa haluttiin:

1)selvittää tekstiilivärien akuutti haitallisuus vesikirpulle (Daphnia magna)

2) tutkia värien kroonista haitallisuutta monen sukupolven testeillä, sekä

3) saada lisää tietoa sukupolvia ylittävästä tutkimuksesta vesikirpuilla.

Sukupolvia ylittävät kokeet vesikirpuilla ovat uusia ekotoksikologisessa tutkimuksessa, mutta

antavat tarpeellista tietoa kemikaalien haittavaikutuksista. Vuoden aikana yhdessä järvessä voi olla

jopa 30 sukupolvea ja kemikaalien vaikutukset voivat olla erilaisia sukupolvien edetessä (Piscia

ym. 2015).

2 MATERIAALIT JA MENETELMÄT

2.1 Tutkittavat kemikaalit

Tutkimuksessa käytettiin tekstiilien värjäykseen tarkoitettuja jauhevärejä, jotka ovat saatavilla

marketeista. Tähän kokeeseen värit ostettiin Prismasta. Värit ovat Nitor-merkin valmistamia All in

8

one-tekstiilivärejä (valmistusmaa Ranska) ja valikoituivat mukaan siksi että molemmat sisältävät

pakkausselosteen mukaan vain yhtä nimettyä väriainetta.

Tutkimukseen valitut värit olivat violetti (reactive blue ver 2108) ja fuksia (reactive red 180)

CAS-numero 85586-40-9. Reactive blue ver 2108:lla ei ole CAS numeroa.

Molemmat värit ovat reaktiivivärejä, joita käytetään pääasiassa selluloosapohjaisten kankaiden ja

kuitujen värjäämiseen. Niiden kiinnittyminen kankaaseen perustuu vahvaan kovalenttiseen

sidokseen, jonka väriaine muodostaa kuidun kanssa. Kovalenttinen sidos on vahva kemiallinen

sidos, minkä vuoksi reaktiviivärien pysyvyys vaatteessa on hyvä (Ghaly ym. 2014). Kovalenttinen

sidos edistää myös pesun-ja valonkestävyyttä (Clark 2011). Reaktiivivärien etuna on myös suuri

kirjo erilaisia värejä, minkä vuoksi niistä on tullut suosittuja.

Reaktiivivärit koostuvat neljästä erilaisesta kemiallisesta ryhmästä: kromoforista, muita

molekyylejä sitovasta ryhmästä (bridging group), kuituihin reagoivasta ryhmästä (fibre-reactive

group) ja veteen liukenevasta ryhmästä (water solubilising group) (Christie 2001). Monet

reaktiivivärit kuuluvat atsoväreihin, erityisesti punaiset, keltaiset ja oranssit sävyt. Atsoväreihin

kuuluvissa väreissä on vähintään yksi atsoryhmä (-N=N-). Atsoryhmä toimii reaktiivivärin

kromoforina. Kromoforina voi olla myös karbonyyliryhmä tai ftalosyaniini.

Reaktiiviväreissä on yksi tai kaksi reaktiivista ryhmää (fibre-reactive group), useimmissa

reaktiiviväreissä on kaksi reaktiivisuuden parantamiseksi. Väriainetta, jossa molemmat

reaktiiviryhmät ovat samanlaisia, kutsutaan homobifunktionaaliseksi ja väriainetta, jossa

reaktiiviset ryhmät ovat erilaisia, kutsutaan heterobifunktionaaliseksi (Khatri ym. 2015).

Tyypillisimmät reaktiiviset ryhmät ovat klooritriatsiini -ja vinyylisulfoni vinylryhmät (Ghaly ym.

2014 & Khatri ym. 2015). Bridging group on yleisimmin aminoryhmä (-NH-) (Christie 2001).

Water solubilising -ryhmä parantaa värin vesiliukoisuutta, tämä ryhmä on yleisimmin jokin

sulfonaatti. Lisäksi lähes kaikki tekstiilivärit sisältävät raskasmetalleja (Ghaly ym. 2014 & Verma

2008). Reaktiiviväreissä yleisimmät metallit ovat kupari, kromi ja lyijy (Verma 2008).

All-in-one Nitor-tekstiilivärit sisältävät väriaineen lisäksi kiinnitysaineen ja suolan. Suola

edistää värin kiinnittymistä kuituun (Talukder ym. 2017). Violetissa väriaineessa suolana on

dinatriummetasilikaatti ja punaisessa natriummetasilikaatti.

Reactive blue ver 2108 kemiallinen nimi on:

6,13-dichloro-3,10-bis{[2-({[(2-chloroethyl)sulfonyl]alkanoyl}amino)ethyl]-amino}-

polycarboheterocyclo 4,11-disulfonic acid, mono and/or disodium salt and 6,13-dichloro-3-{[2-

9

({[(2-chloroethyl)sulfonyl]alkanoyl}amino) ethyl]amino}-10-[(2-{[4-

(ethenylsulfonyl)alkanoyl]amino}ethyl)amino] polycarboheterocyclo -4,11-disulfonic acid

Rakennekaavaa violetille väriaineelle ei löytynyt. ECHA:n tietokannassa väri löytyy nimellä blue

ver 2108 (ECHA 2014a).

Reaktiivipunainen 180 kemiallinen nimi (ECHA 2014b):

5-(benzoylamino)-4-hydroxy-3-[[1-sulpho-6-[[2-(sulphooxy)ethyl]sulphonyl]-2-

naphthyl]azo]naphthalene-2,7-disulphonic acid, sodium salt.

KUVA 1. Rakennekaava Reactive red 180

Reaktiivipunainen 180 sisältää yhden atsoryhmän (-N=N-), jolloin se luokitellaan atsoväreihin

(kuva 1).

Molempien väripakkausten kyljessä on varoitusmerkit syövyttävä sekä huutomerkki

(vaarallinen/ haitallinen otsonikerrokselle). Molemmissa väripaketeissa on mainittu lisäksi

varoituksia ”ärsyttää ihoa” sekä ”vaurioittaa vakavasti silmiä”. Punaisen värin paketissa on myös

mainintana allergisen ihoreaktion mahdollisuus ja violetin värin paketissa mainintana ”saattaa

aiheuttaa hengitysteiden ärsytystä”.

10

2.2 Malliorganismi Daphnia manga

Tässä tutkimuksessa käytettiin malliorganismina vesikirppua (Daphnia magna), jota käytetään

laajasti ekotoksisuuden mittaamisessa. Ne sopivat ekotoksisiin testeihin, koska eläinplankton,

kuten Daphnia:t, ovat tärkeitä ravintoketjujen kannalta, niitä on monissa vesiympäristöissä, ne ovat

herkkiä kemikaaleille ja niiden kasvattaminen ja ylläpitäminen laboratorioissa on helppoa

(Siciliano & Gesuele 2013).

Daphnia- suvun vesikirput ovat makean veden äyriäisiä, joita on yli 100 erilaista lajia.

Vesikirput lisääntyvät suvuttomasti ja hyvissä olosuhteissa populaatiossa ei ilmene koiraita

ollenkaan (Ebert 2005). Alkiot kehittyvät poikasiksi sikiökammiossa, jossa ne ovat noin kolme

päivää. Tämän jälkeen ne vapautuvat emosta ulos aikuisen kaltaisina.

Epäotollisissa olosuhteissa vesikirput tuottavat lepomunia, ephippioita (Ebert 2005). Näissä

lepomunissa on kova musta kuori ja ne sisältävät 0-2 alkiota. Lepomunien tarkoitus luonnossa on

suojata alkioita ja kannan jatkumista talven yli. Yliopiston kasvatushuoneessa lepomunia ilmenee

myös talven aikana, vaikka olosuhteet (valo ja lämpötila) ovat koko ajan samanlaiset. Lepomunat

kertovat siis siitä, että ympäröivissä olosuhteissa on jotain vialla. Vesikirppujen lisääntyminen on

normaalisti partenogeneettistä eli suvutonta lisääntymistä. Hyvissä olosuhteissa naaraat tuottavat

diploideja munia, joista kehittyy lähes aikuisen näköisiä naaraspoikasia poikaspussissa.

Ensimmäisten munien syntymiseen menee yleensä 8-13 päivää (Ebert 2005). Aika voi olla

pidempi, jos ravinto on heikkoa tai sitä on liian vähän. Ensimmäisen poikueen jälkeen naaras voi

synnyttää uuden poikueen 3-4 päivän välein. Optimaalinen happamuus vesikirppujen kasvulle ja

lisääntymiselle on pH 7.2-8.5. pH 6.5-9.5 on vielä hyväksyttävän pH:n väli, jossa vesikirput

pystyvät elämään.

Tutkimuksessa käytetyt vesikirput olivat Itä-Suomen yliopiston ekotoksikologian

kasvatushuoneesta. Vesikirppuja pidetään siellä jatkuvassa kasvatuksessa ja niiden määrää

säädellään tutkimustarpeen mukaan. Kirppujen kasvatusvesi vaihdetaan kerran viikossa ja lisäksi

kirppupoikaset seulotaan uuteen kasvatusaltaaseen ja aikuiset kirput omaansa viikoittain.

Vesikirppuja ruokitaan kolme kertaa viikossa levällä, jossa päälaji on Scenedesmus.

Ruokintamäärä on 1ml/50ml. Myös levä kasvatetaan Itä-Suomen yliopiston ekotoksikologian

kasvatushuoneessa.

11

Vesikirppukokeita varten on useita standardeja, joiden mukaan tehdään kasvu- ja

lisääntymiskokeita. Vesikirppujen lisääntymisstrategian vuoksi kokeissa on tärkeää määrittää

koiraiden ja naaraiden määrä. Sukupuolet erotettiin toisistaan pään suuosan rakenteen perusteella.

Koirailla on pari pidentyneitä antenneja, naarailla nämä ovat lyhyet (kuva 2).

Kuva 2. Daphnia magna -naaras vasemmalla ja Daphnia magna -koiras oikealla.

Kokeita varten valittiin alle 24 tunnin aikana syntyneitä poikasia. Kokeen aloitusta edeltävänä

päivänä valittiin emoja, joilla näkyi munia ja nämä siirrettiin erilliseen kasvatusastiaa. Alle 24

tunnin päästä laskettiin poikasten lukumäärä silmämääräisesti ja koe aloitettiin, jos poikasia oli

tarpeeksi.

2.3 Alustavat testit ja akuutit toksisuustestit

Tutkimuksen aluksi tehtiin väriliuokset, joista seurattiin pH:n muutoksia sekä värijauheen

sakkautumista veteen. pH:n muutoksia mitattiin noin 24 ja 48 tunnin jälkeen liuoksen tekemisestä.

Mahdollista sakkautumista seurattiin silmämääräisesti. Kantaliuokset tehtiin mittaamalla 2g

värijauhetta yhteen litraan milliporevettä ja sekoittamalla magneettisekoittimella.

12

Ennen varsinaisten kasvu -ja lisääntymiskokeiden alkua testattiin tutkittavien kemikaalien

vaikutusta testiveden pH:n. Tarkoituksena oli seurata testiolosuhteiden säilymistä optimaalisina.

0,1mg/l, 1mg/l, 10mg/l ja 100mg/l laimennokset tehtiin kantaliuoksista (2g/l) milliporeveteen.

Laimennosten ja kantaliuoksen pH tasapainotettiin natriumhydroksidilla (NaOH) ja vetykloridilla

(HCl) optimaaliseksi (pH 7,2).

Samat laimennokset tehtiin Elendt M7 -kasvatusveteen OECD:n standardin 211 mukaisesti (OECD

2012). M7-vesi puskuroi pH:n nousua ja veden pH pysyi tasaisena alustavassa kokeessa. M7-vesi

soveltui näin myös koeasetelmaan, jossa pH:n tuli pysyä tasaisena viikon ajan.

Tutkimuksen aluksi tehtiin akuutit toksisuustestit (OECD 202) akuutin toksisuuden

mittaamiseksi sekä sopivien pitoisuuksien löytämiseksi krooniseen kokeeseen, eli pitoisuudet,

jotka eivät aiheuta akuuttia toksisuutta. Akuuteissa toksisuustesteissä käytettiin sekä punaisesta

että violetista väriaineesta tehtyjä neljää eri pitoisuutta (0,1mg/l, 1mg/l, 10mg/l ja 100mg/l). Näiden

lisäksi käytettiin yhtä kontrollisarjaa M7-kasvatusvedestä. Jokaisessa sarjassa oli neljä rinnakkaista

koeastiaa ja jokaisessa koeastiassa oli viisi vesikirppua. Vesikirput olivat alle 24h tunnin ikäisiä.

Liikkumattomat vesikirput laskettiin 24h ja 48h kohdalla.

Akuuteissa toksisuuskokeissa koeastioihin mitattiin ensin 20 ml väriliuosta eri pitoisuuksin, ja

jokaisesta pitoisuudesta tehtiin neljä replikaattia. Tämän jälkeen jokaiseen koeastiaan laitettiin viisi

alle 24 tunnin aikana syntynyttä poikasta. Kontrollisarjassa oli 20 ml M7-kasvatusvettä. Koe

toteutettiin akuutin toksisuuskokeen standardin mukaan (OECD 202). Koe suoritettiin Itä-Suomen

yliopiston ekotoksikologian tutkimushuoneessa, jossa valojakso oli 8:16h.

Vesikirppujen liikkumattomuutta tarkastettiin ensimmäisen kerran 24 h kohdalla ja toisen kerran

48 h kohdalla.

2.4 Krooninen altistuskoe ja koeasetelma

Akuuttien toksisuuskokeiden jälkeen aloitettiin krooninen, usean sukupolven tutkimus.

Kroonisella kokeella tarkoitetaan tässä yhteydessä 21-35 vuorokauden mittaista koetta, jossa

vesikirput elävät jatkuvassa altistuksessa ja kokeen aikana syntyy useampi sukupolvi.

Kemikaalipitoisuus pysyi jatkuvassa altistuskokeessa samana läpi kokeen. Tutkimus tehtiin

jatkuvan altistuksen lisääntymiskokeen standardia (OECD 211) mukaillen. Usean sukupolven

13

Daphnia-kokeista ei ole vielä olemassa erillistä standardia. Kroonisessa kokeessa

altistuspitoisuutena oli 1mg/l, koska se ei ollut akuutisti toksinen ja väriä ei pystynyt silmin

havaitsemaan vedestä.

Kroonisia kokeita tehtiin yhteensä kaksi. Ensimmäisessä kokeessa tutkittiin sekä punaista että

violettia väriä ja toisessa vain violettia. Molemmissa kokeissa käytetiin alle 24 tunnin aikana

syntyneitä vesikirpun poikasia. Ensimmäisen kokeen suuri kuolleisuus esti sukupolvien jatkumisen

F1-sukupolven jälkeen, minkä takia suoritettiin toinen koe. Jälkimmäisessä kokeessa tutkittiin vain

yhtä väriä, koska kahta altistussarjaa varten ei syntynyt tarpeeksi vesikirppuja. Laitoksella

kasvatettava pysyvä vesikirppupopulaatio oli heikkokuntoinen ja uusia poikasia syntyi vähän työn

ajankohdasta johtuen. Kahteen altistussarjaan ja kontrollisarjaan olisi tarvittu 60 poikasta, eikä näin

montaa poikasta syntynyt saman vuorokauden aikana. Aikataulullisten syiden vuoksi koe täytyi

aloittaa pian, joten ei voitu odottaa vesikirppupopulaation parempaa kuntoa. Poikasia syntyi

riittävästi kontrollisarjaa ja yhtä altistussarjaa varten ja koe päätettiin aloittaa.

Jokaista sarjaa, yhtä kontrollia ja kummastakin väristä yhtä altistussarjaa varten oli kymmenen

vesikirpun poikasta, jotka laitettiin aluksi kasvamaan koeastiaan 250 ml tilavuuteen M7-

kasvatusvettä (kuva 3). Kun vesikirpuilla havaittiin munia, munalliset vesikirput siirrettiin

kasvamaan yksittäin 50 ml tilavuuteen, missä ne elivät koko loppukokeen ajan. Vesikirppuja

ruokittiin levällä joka toinen päivä. Vitamiinilisän ja ruokinnan tarkoitus oli luoda kokeen ajaksi

hyvät olosuhteet vesikirpuille, jotta partenogeneettinen lisääntyminen olisi mahdollista.

Kuva 3. Kokeen eteneminen. Jokaista sarjaa varten oli 10 alle 24h aikana syntynyttä vesikirpun

poikasta. Altistussarjoissa värin pitoisuus oli 1 mg/l.

14

Uusi sukupolvi muodostettiin, kun edellisessä sukupolvessa oli vähintään 10 saman vuorokauden

aikana syntynyttä poikasta. Ensimmäisiä poikasia ei tyypillisesti käytetä testeissä eikä niitä

tässäkään kokeessa otettu mukaan, koska ne ovat usein herkempiä kuin seuraavat poikueet (OECD

211 & Campos ym. 2016). Lisäksi ensimmäiset poikueet voivat olla hyvin pieniä, vain muutaman

poikasen kokoisia (Campos ym. 2016). Uusi sukupolvi pyrittiin aloittamaan kaikissa sarjoissa

samana päivänä. Uudet poikaset siirrettiin kasvamaan 250ml tilavuuteen M7-kasvatusvettä ja niitä

ruokittiin ja ylläpidettiin samoin, kun edellisiä sukupolvia (kuva 4).

Ensimmäisessä kokeessa tehtiin molemmista väriaineista yksi altistussarja, jossa väriaineen

pitoisuus oli 1mg/l. Lisäksi tehtiin kontrollisarja M7-kasvatusvedestä. Kaikissa käsittelyissä oli

lisäksi b-vitamiinia (100 µl/litra) kuten kasvatushuoneen normaalissa ylläpidossakin.

Kuva 4. Ensimmäisen kokeen koeasetelma. Jokaista sarjaa varten oli 10 vesikirppua, jotka

kasvoivat aluksi yhdessä 250ml tilavuudessa M7-kasvatusvettä ja ensimmäisten munien

havaitsemisen jälkeen emot siirrettiin kasvamaan itsekseen 50ml tilavuuteen. Altistussarjoissa

väriaineen pitoisuus oli 1 mg/l.

Kolmannen sukupolven aikana koehuoneessa oli ongelmia lämpötilan kanssa. Joinain päivinä

lämpötila oli noin 17°C ja toisina päivinä saattoi nousta yli 25°C. Suurin mitattu lämpötila oli

26,9°C. Valojakso oli 16:8 h.

Koe 2 suoritettiin kasvatuskaapissa, jolloin saatiin lämpötila pidettyä halutussa 20°C. (+/-1°C)

(kuva 5). Muilta osin koeasetelma oli kokeen 1 kaltainen. Valoaika (16:8h) oli myös

15

kasvatuskaapissa sama kuin koehuoneessa. Ruokintamäärää vähennettiin F0-sukupolven jälkeen,

koska levä kasvoi kasvatuskaapissa voimakkaammin. F1-ja F2-sukupolvissa ruokintamäärä oli

2ml/100ml.

Kuva 5. Toisen kokeen koeasetelma.

Tutkimuksen aikana kerran viikossa vaihdettiin noin puolet koeastioissa olevasta vesimäärästä,

jotta kemikaalipitoisuus pysyisi kaikissa eri pitoisuuksissa tasaisenakoko kokeen ajan.

Koeastioissa ei ollut päällä suojaa, jolloin niistä pääsi haihtumaan hieman vettä, joka korvattiin

vesien vaihdon yhteydessä. Vesien vaihtoa varten joka viikko tehtiin uudet altistusvedet

kantaliuoksesta. Altistusvesistä mitattiin pH (SCHOTT GERÄTE pH-METER CG822), ja

tarvittaessa säädettiin pH 7,2:een. Vesien vaihdon yhteydessä mitattiin pH (WTW MultiLine P4)

sekä ennen että jälkeen vaihdon. Näin voitiin seurata pH-tasoa kokeen aikana ja poissulkea

poikkeavan pH:n vaikutus kokeen tuloksiin.

Syntyneiden poikasten määrä laskettiin päivittäin ja niiden sukupuoli määritettiin. Jokaisesta

koeastiasta poimittiin syntyneet poikaset pipetillä erilliseen astiaan. Tämän jälkeen poikaset

siirrettiin pipetillä aluslasille pienessä vesimäärässä. Kaikkien poikasten sukupuoli tarkastettiin

mikroskoopilla (Dialux 20) ja laskettiin tarkka poikasmäärä. Tämän jälkeen poikaset lopetettiin.

Vesikirppujen sukupuoli määritettiin suuosan antenneista, jotka ovat naarailla lyhyet ja koirailla

16

selkeästi pidentyneet (kuva 2). Päivittäin tarkistettiin myös mahdollisten kuolleiden emojen määrä

ja silmämääräisesti huomioitiin emojen liikkumista ja liikkumattomuutta.

Yhtä sukupolvea kasvatettiin ensimmäisessä kokeessa viisi viikkoa (35 vuorokautta) ja toisessa

kokeessa kolme viikkoa (21 vuorokautta). Jatkuvan altistuksen kokeissa tyypillinen kasvatusaika

on 21-28 vuorokautta, mutta ensimmäisessä kokeessa tutkimusaika venyi yhdellä viikolla. Toisessa

kokeessa oli tiukka aikataulu ja 21 vuorokautta valittiin kasvatusajaksi, jotta oli mahdollista saada

useampi sukupolvi. Sukupolvien jälkeen kaikkien elossa olleiden vesikirppujen koko mitattiin

käyttäen Nikon SM2800-mikroskooppia. Koko mitattiin päästä vartalon perään asti. Häntää ei

otettu huomioon.

2.5 Analytiikka ja tilastolliset menetelmät

Altistuspitoisuus (1 mg/l) oli tarkoitus varmistaa kokeen aikana spektrofotometrillä. Erilaisia

laimennoksia mitattiin ennen kokeen aloitusta mutta krooniseen kokeeseen valittu pitoisuus

osoittautui niin pieneksi, ettei sitä voitu tarkastaa spektrofotometrilla. Laimennoksia yritettiin myös

konsentroida, mutta tästäkään huolimatta mittaukset eivät onnistuneet.

Tilastomenetelmänä käytettiin Mann-Whitneyn U-testiä. Testit tehtiin SPSS-ohjelmalla.

Tuloksista analysoitiin poikasten määrä emoa kohden sekä emojen koko sukupolven päätteeksi.

Eroja analysoitiin sekä käsittelyjen että sukupolvien välillä. Kuvat tehtiin käyttäen Microsoft Excel

-ohjelmaa.

Poikasten määrässä emoa kohden on otettu huomioon ainoastaan naaraspuoliset vesikirput,

jotka olivat elossa poikastuotannon alkaessa. Koon tilastollisessa analyysissä on otettu huomioon

ainoastaan naarapuoliset vesikirput, koska koiraat ovat tyypillisesti naaraita pienempiä (Ebert

2005).

17

3 TULOKSET

3.1 Akuutit toksisuustestit

Sekä violetti että punainen väri olivat selkeästi havaittavissa pitoisuuksissa 10 mg/l ja 100 mg

/l. Tästä alemmissa pitoisuuksissa väriä ei voinut silmin havaita. Kummankaan värin kohdalla ei

havaittu akuuttia toksisuutta 24 tunnin eikä 48 tunnin kohdalla missään pitoisuudessa (Taulukko 1

& 2).

Taulukko 1. Reactive blue ver 2018 akuutti toksisuus. Liikkumattomien vesikirppujen määrä on

merkattu taulukkoon. Suluissa on koeastioissa olleiden vesikirppujen määrä, jos se poikkeaa

viidestä.

Taulukko 2. Reactive red 180 akuutti toksisuus. Liikkumattomien vesikirppujen määrä on merkitty

taulukkoon. Suluissa on koeastioissa olleiden vesikirppujen määrä, jos se poikkeaa viidestä.

24 h liikumattomat 48h liikkumattomat

Konsentraatio (mg/l) A B C D A B C D

Kontrolli 0 0 0 0 0 0 0 0

0,1 0 1(6) 0 0 0 1(6) 0 0

1 0 0 0 0 0 0 0 0

10 0 0 0 0 0 0 0 0

100 0 0 0 0 1 0 1 0

24 h liikkumattomat 48h liikkumattomat

Konsentraatio (mg/l) A B C D A B C D

Kontrolli 1 0 0(4) 0 1 0 0(4) 0

0,1 0 0 0(4) 0 0 0 1(4) 1

1 0 0 0 0 0 0 0 0

10 0 0 0 0 0 0 0 1

100 0 0 0 0 0 0 0 0

18

3.2 Ensimmäinen krooninen koe

Ensimmäisessä kroonisessa sukupolvia ylittävässä kokeessa ei löytynyt merkitseviä eroja

käsittelyjen välillä poikastuotannossa eikä koossa. Sukupolvien välillä oli merkitsevä ero

vesikirppujen koossa sekä kontrollissa, että punaisessa altistuksessa, p <0,05.

Ensimmäisessä kokeessa F1-sukupolven kohdalla koeastioissa havaittiin munia emojen

ulkopuolella molemmissa altistuksissa sekä kontrollissa. Kontrollissa munia näkyi emojen

ulkopuolella 12 kpl, violetissa altistuksessa 20 kpl ja punaisessa altistuksessa 3kpl. Kaikki

abortoidut munat havaittiin samana päivänä.

3.2.1 Poikastuotanto

F0-sukupolvessa kontrollisarjan vesikirput alkoivat tuottaa poikasia 10. päivänä (kuva 6).

Violetissa altistuksessa poikastuotanto alkoi myös 10. päivänä kokeen alusta, punaisessa

altistuksessa poikastuotanto alkoi vasta 12. päivänä (kuva 6).

Kuva 6. Kumulatiivinen poikastuotanto F0-sukupolvessa.

0102030405060708090

100

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Syn

tyn

eet

po

ikas

et %

Päivä kokeen aloituksesta

Koe 1 Kumulatiivinen poikastuotanto F0-sukupolvi

Kont F0 Pun F0 Viol F0

19

Kuva 7. Kumulatiivinen poikastuotanto F1-sukupolvessa.

F1-sukupolvessa poikastuotanto alkoi violetissa altistuksessa 16. päivänä, punaisen värin

altistuksessa 18. päivänä ja kontrollisarjassa 17. päivänä (kuva 7). F2-sukupolvea varten ei

syntynyt tarpeeksi vesikirppuja. F1-sukupolvessa violetissa altistuksessa eläneistä vesikirpuista jäi

eloon yksi vesikirppu. Kontrollisarjan vesikirpuista oli F1-sukupolven päätyessä elossa kolme

yksilöä ja punaisessa altistuksessa eläneistä elossa oli kuusi vesikirppua.

Kuva 8. Poikasten määrä emoa kohden (F0 kontrolli 22,7±4,2; violetti 17,8±8,2; punainen

22,8±3,4. F1 kontrolli 4,1±5,4; violetti 3,5±7,1; punainen 9,3±4,8) F0 -ja F1-sukupolvissa. F0

kontrolli n=10, violetti n=10, punainen n=10. F1 kontrolli n= 10, violetti n=10, punainen n=7.

0102030405060708090

100

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

syn

tyn

eet

po

ikas

et %

Päivä kokeena aloituksesta

Koe 1 Kumulatiivinen poikastuotanto F1-sukupolvi

Kontrolli F1 Punainen F1 Violetti F1

0

5

10

15

20

25

30

F0 F1

Po

ikas

ten

mää

rä (

kpl)

Sukupolvi

Koe 1 Poikasten määrä emoa kohden

Kontrolli

Violetti

Punainen

20

Poikasten määrän laskemisessa emoa kohden käytettiin elossa olleiden naaraiden määrää, kun

poikastuotanto alkoi. Laskemisessa on käytetty emojen määränä 10 emoa kontrollin ja violetin

värin osalta molemmissa sukupolvissa. F1-sukupolvessa punaisen värin kohdalla emojen määränä

on käytetty seitsemää emoa, koska kolme emoista kuoli ennen poikastuotannon aloittamista.

Tilastollista merkitsevyyttä ei ollut, vaikka laskennassa olisi käytetty 10 emoa. Poikasten määrässä

emoa kohden ei ollut tilastollisia eroja kontrollien ja alistusten välillä (kuva 8). Sukupolvien välillä

on tilastollisesti merkitsevä ero kaikkien sarjojen osalta. Kontrollissa p=0,001, violetissa p=0,002,

punaisessa p=0,001.

3.2.2. Koko

Vesikirppuemojen koossa ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa (F0 p = 0,3 ja F1 0,5) kontrollin

ja violetin altistuksen välillä eikä kontrollin ja punaisen altistuksen välillä (F0 p = 0,1 ja F1 p= 0,7)

(kuva 9).

Kuva 9. Emojen koko F0 -ja F1 -sukupolvissa (F0 kontrolli 4±0,09; violetti 3,9±0,05; punainen

3,9±0,05. F1 kontrolli 3±0,06; violetti 3,7±0; punainen 3,5±0,05). F0 kontrolli n= 9, violetti n=8,

punainen n=8. F1 kontrolli n=3, violetti n=1, punainen n=6.

3,1

3,2

3,3

3,4

3,5

3,6

3,7

3,8

3,9

4

F0 F1

Pit

uu

s (m

m)

Sukupolvi

Koe 1 emojen koko

Kontrolli

Violetti

Punainen

21

Kuva 10. Vesikirppuemojen koko (mm) molemmissa kokeissa (Koe 1. F0 kontrolli 4±0,09;

violetti 3,9±0,05; punainen 3,9±0,05. F1 kontrolli 3±0,06; violetti 3,7±0; punainen 3,5±0,05.

Koe 2. F0 kontrolli 3,7±0,08; violetti 3,7±0,1. F1 kontrolli 3,5±0,1; violetti 3,6±0,09. F2

kontrolli 2,8±0,07; violetti 2,9±0,05). Ensimmäinen koe F0 kontrolli n=9, violetti n=8, punainen

n=8. F1 kontrolli n=3, violetti n=1, punainen n=6. Toinen koe F0 kontrolli n=4, violetti n= 5.

F1 kontrolli & violetti n=10, F2 F1 kontrolli & violetti n=10.

Sukupolvien välillä on tilastollisesti merkitsevä ero kontrollisarjassa (p=0,01) sekä punaisessa

altistuksessa (p=0,002) (kuva 10).

3.2.3 Sukupuolijakauma ja lepomunat

Kokeen aikana ei havaittu yhtään lepomunaa. Kaikki kokeen aikana syntyneet vesikirput olivat

naaraita.

3.3 Toinen krooninen koe

Toisessa kroonisessa kokeessa tutkittiin ainoastaan violetin värin vaikutuksia. Yhden sukupolven

kesto oli 21 vuorokautta. Kokeen aikana huomattiin levän tarttuvan vesikirppujen uimaraajoihin ja

osa vesistä oli selkeästi vihertyneitä (Kuva 5). Näissä vesissä oli myös korkeampi pH, kahdessa

mittauksessa yli optimaalisen rajan (pH >8.5). Muissa mittauksissa pH oli 7,2-8,5.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

Kontrolli koe1 Violetti koe 1 Punainen koe1 Kontrolli koe2 Violetti koe2

Pit

uu

s (m

m)

Käsittely

Emojen koko

F0 F1 F2

{* * *{ { **

22

3.3.1 Poikastuotanto

F0-sukupolven poikastuotanto alkoi sekä altistuksessa että kontrollisarjassa 12. päivänä kokeen

alusta (kuva 11). F1-sukupolvessa violetissa altistuksessa kasvaneet vesikirput alkoivat tuottaa

poikasia 10. päivä ja kontrollissa kasvaneet vesikirput 13. päivä (kuva 12).

F2-sukupolvessa violetissa altistuksessa kasvaneilla vesikirpuilla havaittiin munia sukupolven

viimeisenä päivänä, mutta yhtään poikasta ei syntynyt. Tästä johtuen F3-sukupolvea ei voitu

aloittaa.

Kuva 11. Kumulatiivinen poikastuotanto F0.

Kuva 12. Kumulatiivinen poikastuotanto F1-sukupolvessa.

0

20

40

60

80

100

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Syn

tyn

eet

po

ikas

et (

%)

Päivä (laskettuna kokeen alusta)

Kumulatiivinen poikastuotanto F0

Kontrolli

Violetti

0

20

40

60

80

100

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Syn

tyn

eet

po

ikas

et (

%)

Päivä (kokeen aloituksesta laskien)

Kumulatiivinen poikastuotanto F1

Kontrolli

Violetti

23

Kuva 13. Poikasten määrä emoa kohden F0 -ja F1-sukupolvissa. (F0 kontrolli 21,8 ±7,8; violetti

23,2±1,4. F1 kontrolli 10,6±2,9; violetti 17,4±5,4). F0 kontrolli & violetti n=10. F1 kontrolli &

violetti n=10.

Poikasten määrässä emoa kohden on tilastollisesti merkitsevä ero kontrollin ja altistuksen välillä

sekä F0- että F1-sukupolvissa, F0 p= 0,013 ja F1 p= 0,001 (kuva 13). F0-sukupolvessa syntyi

enemmän poikasia kontrollisarjan vesikirpuille ja F1-sukupolvessa violetissa altistuksessa.

Tilastollisesti merkitsevä ero havaittiin myös sukupolvien välillä kontrollisarjassa (p=0,008).

F0-sukupolvessa oli mukana koiraita, eli jo kokeeseen valituista kirpuista osa oli koiraita.

Kontrollisarjassa oli kuusi koirasta ja violetissa altistuksessa viisi. Koiraita ei ole otettu huomioon

laskettaessa keskiarvoa poikasten määrälle per emo. Kontrollissa emoja oli kymmenen sijasta neljä

ja violetissa altistuksessa kymmenen sijasta viisi.

0

5

10

15

20

25

30

35

F0 F1

Po

ikas

ten

mää

rä (

kpl)

Sukupolvi

Koe 2 poikasten määrä emoa kohden

Kontrolli

Violetti

* *

24

3.3.2 Koko

Kuva 14. Emojen koko F0-, F1- ja F2-sukupolvissa (F0 kontrolli 3,7±0,08; violetti 3,7±0,1. F1

kontrolli 3,5±0,1; violetti 3,6±0,09. F2 kontrolli 2,8±0,07; violetti 2,9±0,05). Tilastollisesti

merkitsevä ero emojen koossa kontrollin ja altistuksen välillä F1-ja F2-sukupolvissa. F0 kontrolli

n= 4, violetti n=5. F1 kontrolli & violetti n=10. F2 kontrolli & violetti n=10.

Koossa havaittiin tilastollisesti merkitsevä ero käsittelyjen välillä F1- ja F2-sukupolvissa. F1-

sukupolvessa p=0,023 ja F2-sukupolvessa p<0,0001 (kuva 14). F0-sukupolvessa ei ollut

tilastollisesti merkitsevää eroa kontrollin ja altistuksen välillä.

Koon pieneneminen sukupolvien edetessä oli tilastollisesti merkitsevä F0- ja F1-sukupolvien

välillä kontrollissa (p=0,014) ja tilastollisesti merkitsevä F1- ja F2-sukupolvien välillä sekä

kontrollissa että altistuksessa (p<0,0001) (kuva 10).

3.3.3 Sukupuolijakauma ja lepomunat

Koiraita havaittiin ainoastaan kokeen F0-sukupolvessa. Eli jo kokeeseen aluksi valituista poikasista

osa oli koiraita. Kontrollissa oli kuusi koirasta ja violetissa altistuksessa viisi. Muissa sukupolvissa

koiraita ei havaittu. Lepomunia ei havaittu kokeen aikana.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

F0 F1 F2

Pit

uu

s (m

m)

Sukupolvi

Koe 2 emojen koko

Kontrolli

Violetti

***

25

4 TULOSTEN TARKASTELU

4.1 Akuutit toksisuustestit

Valituilla väriaineilla ei havaittu akuuttia toksisuutta. Reactive red 180:llä ei ole aiemmissa

tutkimuksissa havaittu akuuttia toksisuutta altistuspitoisuuksilla 1mg/l – 100mg/l (ECHA 2014b).

Näillä pitoisuuksilla myöskään Reactive blue ver 2108:a ei ole havaittu akuutisti toksiseksi (ECHA

2014a).

Reaktiivipunainen 120:lla tehdyissä vesikirppututkimuksissa EC50-arvoksi määritettiin 24

tunnin kohdalla 50,10 mg/l ja 48 tunnin kohdalla 10,40 mg/l (Darsana ym. 2015). Johtopäätöksenä

oli, että alle 10 mg/l väripitoisuudet voivat olla haitallisia vesikirpuille. Reaktiivipunainen 120

sisältää klooria kuten violetti värikin. Klemola (2008) havaitsi reaktiivivärien toksisuutta

solututkimuksissa.

4.2 Krooniset kokeet

Tekstiiliväreillä ei ole tehty sukupolvia ylittäviä toksisuuskokeita, joten tuloksia on vaikea verrata

muuhun tutkimustietoon. Tuloksia voidaan verrata muihin monen sukupolven tutkimuksiin ja

akuutteihin ja kroonisiin tutkimuksiin tekstiiliväreistä.

Ensimmäisessä kokeessa huomattiin abortoituja munia koeastioiden pohjalla. Munia huomattiin

sekä kontrolleissa, että altistuksissa. Munien abortoinnin syistä ei ole olemassa yhteneväistä

tutkimustietoa (Conde-Porcuna ym. 2011). Abortoitumisen syynä voivat olla haitalliset metallit

esimerkiksi lyijy, liian vähäinen tai huonolaatuinen ravinto (Araujo ym. 2018 & Conde-Porcuna

ym. 2011). Kokeen ajan vesikirppuja ruokittiin joka toinen päivä viherlevällä kasvatushuoneen

tapaan. Leväpitoisuutta ei kuitenkaan kokeen aikana mitattu, eli ravinnon laadusta ja riittävyydestä

ei ole tuloksia.

Lisäksi lämpötilan ja parasiittien vaikutusta abortointiin on tutkittu (Boersma & Vijverberg

1995). Conde-Porcuna ym. (2011) tutkimuksessa sekä lämpötilan alenemista että valoajan

lyhentymistä verrattiin muuttumattomiin olosuhteisiin. Abortoituja munia ilmeni enemmän

26

muuttuvissa olosuhteissa, kuin pysyvissä olosuhteissa. Ensimmäisen kokeen aikana lämpötila

vaihteli, sekä laski että nousi normaalista lämpötilasta.

Toisessa kroonisessa kokeessa huomattiin veden vihertymistä eli levien kasvu oli suurempaa

kuin normaalisti kasvatushuoneessa. Levän kasvuun vaikuttaa lämpötila, valon intensiteetti sekä

säteilytysvoimakkuus (Singh & Singh 2015). Kasvatuskaapissa lämpötila ja valoaika olivat

samanlaiset kuin kasvatushuoneen normaaliolosuhteissa. Valon intensiteetistä tai lamppujen

tehosta ei ole tietoa. Kasvatuskaapissa lamput olivat lähempänä koeastioita kuin

kasvatushuoneessa tai koehuoneessa, mikä vaikuttaa valon voimakkuuteen.

4.2.1 Poikastuotanto

Värillä ei ollut ensimmäisen kroonisen kokeen perusteella vaikutusta vesikirppujen kykyyn tuottaa

poikasia (kuva 8). Ensimmäisessä kroonisessa kokeessa F1-sukupolvessa syntyi huomattavasti

vähemmän poikasia kuin F0-sukupolvessa. Tämä voi olla seurausta heikentyneistä olosuhteista

lämpötilan osalta, koska samassa sukupolvessa lähes kaikki kirput kuolivat ja kuolleisuutta oli sekä

kontrollissa että altistussarjoissa.

Kuolleisuutta tapahtui ensimmäisessä kokeessa sekä kontrolleissa, että altistuksissa. Suurinta

kuolleisuutta havaittiin ensimmäisen kokeen F1-sukupolvessa, erityisesti kontrollisarjassa. Tämä

johtui mahdollisesti lämpötilan noususta. Koehuoneessa korkein mitattu lämpötila oli yli 25℃.

Daphnia magna selviää elossa korkeissa, yli 30℃, lämpötiloissa (Kivivuori & Lahdes 1996).

Daphnia magna:n elinaika voi kuitenkin lyhentyä normaalia korkeammissa lämpötiloissa

(Hoefnagel ym. 2018). Korkealla lämpötilalla on havaittu olevan yhteys heikentyneeseen

lisääntymiseen (Threlkeld 1979).

Huomioitavaa on myös se, että vesikirput saattoivat vahingoittua, kun niitä siirrettiin uusiin

astioihin, vaikka siirrot tehtiin varovaisesti pipetillä. Molemmissa kokeissa vesikirput siirrettiin

uusiin astioihin samalla menetelmällä.

Kumulatiivisessa poikastuotannossa huomataan vesikirpuille tyypillistä porrasmaisuutta

lisääntymisessä (kuva 6 & 7). Vesikirput voivat tehdä ensimmäisen poikueen jälkeen uuden

poikueen 3-4 päivän välein (Ebert 2005). F0-sukupolvessa poikasten määrä pysyi samana kaikissa

käsittelyissä muutaman päivän ajan, minkä jälkeen uusi poikue taas syntyy. Sama nähdään F1-

sukupolvessa erityisesti violetin käsittelyn kohdalla.

27

Usean sukupolven ekotoksisissa tutkimuksissa poikastuotannon on havaittu alkavan

myöhemmin kemikaalialtistuksessa, ja kemikaalipitoisuuden noustessa myös lisääntymisen

alkamisessa kesti pidempään (Chen ym. 2013). Myös poikueiden määrän emoa kohden on

huomattu vähenevän.

Toisessa kroonisessa kokeessa erot poikasten määrässä käsittelyjen välillä olivat tilastollisesti

merkitseviä (kuva 13). F0-sukupolvessa poikasia syntyi enemmän kontrollisarjassa ja F1-

sukupolvessa poikasia syntyi enemmän violetissa altistuksessa. Vesikirpuilla on havaittu

kemikaalialtistuksissa hormeesia (Flaherty & Dodson 2005). Sama ilmiö on huomattu useilla eri

kemikaaleilla ja useilla eri lajeilla (Stanley ym. 2013). Hormeesissa vesikirput lisääntyvät stressin

takia pienissä pitoisuuksissa enemmän kuin kontrollissa mutta suurissa pitoisuuksissa vaikutus on

päinvastainen (Stanley ym. 2013). Reaktio voi aluksi näyttää siltä, että eliö hyötyy

kemikaalialtistuksesta. Hormeesissa eliön puolustusmekanismit käynnistyvät, vaikka haitallisia

vaikutuksia ei vielä voida havaita (Calabrese & Baldwin 2002).

Yksikään vesikirppu ei kuollut toisen kroonisen kokeen aikana, eli kaikki vesikirput pystyivät

lisääntymään kokeen päättämiseen asti. F2-sukupolvessa ei syntynyt yhtään poikasta 21

vuorokauden aikana. Normaalisti ensimmäisten munien muodostumiseen menee 5-10 päivää

20°Cja hyvissä ravinto-olosuhteissa (Ebert 2005). Munasta tulee alkio noin yhdessä päivässä ja

tämän jälkeen alkio kehittyy sikiökammiossa noin kolmen päivän ajan, minkä jälkeen se vapautuu

kammiosta. Laskennallisesti uuden sukupolven aloittamiseen tarvitaan siis vähintään 12

vuorokautta, olettaen että ensimmäinen poikue syntyy yhdeksännen vuorokauden kohdalla ja

seuraava poikue, josta uusi sukupolvi voidaan aloittaa, kolme vuorokautta tämän jälkeen.

4.2.2 Koko

Ensimmäisessä kroonisessa sukupolvia ylittävässä kokeessa ei havaittu tilastollisesti merkitsevää

eroa vesikirppujen koossa eri käsittelyjen välillä. Toisaalta F1-sukupolvessa vesikirppujen koko

on keskimääräisesti pienempi kuin F0-sukupolvessa.

Sukupolvien välillä ero on tilastollisesti merkitsevä kontrollissa ja punaisessa värissä (kuva 10).

Pienempikokoiset jälkeläiset tuottavat vähemmän munia ja munat ovat pienempiä (Campos ym.

2016). Pienempikokoisilla jälkeläisillä myös kestää aikuistumisessa ja lisääntymisessä kauemmin.

28

Tällä voitaisiin selittää koon pienemistä kokeen edetessä. Kroonisten kokeiden aikana ei tässä

tutkimuksessa mitattu syntyneiden poikasten pituutta, joten tuota yhteyttä ei voida tarkemmin

käsitellä. Emoja oli F1-sukupolven päätteeksi elossa vain muutamia yksilöitä, joiden varaan koon

laskeminen jäi. Lisäksi kokeen aikana oli lämpötilavaihtelua mikä voi vaikuttaa tuloksiin.

Toisessa kokeessa käsittelyjen välillä oli tilastollisesti merkitsevä ero F1- ja F2-sukupolvissa

(kuva 14). Violetissa altistuksessa kasvaneet olivat kooltaan suurempia. Ero oli suurempi F2-

sukupolvessa. F0-sukupolvessa ei ollut kokoeroja, mutta otoskoko oli myös pienempi, koska

sukupolvessa oli mukana koiraita. Koiraita ei otettu huomioon laskettaessa koon keskiarvoa.

Pienissä kemikaalipitoisuuksissa hormeesi voi aiheuttaa kasvaneen lisääntymisen lisäksi

yksilöiden isompaa kokoa (Stanley ym. 2013). Tällä voitaisiin selittää violetissa altistuksessa

kasvaneiden vesikirppujen suurempi koko kontrollissa kasvaneisiin kirppuihin nähden.

Koon havaittiin pienevän tutkimuksen edetessä kaikissa käsittelyissä myös tässä kokeessa

(kuva 10). Tulokset ovat siis samansuuntaisia kuin ensimmäisessä kokeessa. Koska koko pieneni

sekä altistuksissa että kontrolleissa, voidaan olettaa sen johtuvan kroonisesta koeasetelmasta ja

sen aiheuttamasta stressistä. Vesikirpuilla on tehty jatkuvan altistuksen kokeita muilla

kemikaaleilla, mutta näissä kokeissa ainoastaan kemikaalialtistuksen on huomattu aiheuttavan

pienenemistä sukupolvien edetessä (Chen ym. 2013).

Pieni koko voi johtua ravinnon huonosta laadusta (Steinberg ym. 2010). Levän määrää

vähennettiin F0-sukupolven jälkeen, koska edellisessä sukupolvessa levä oli tarttunut

vesikirppujen uimaraajoihin ja vesi oli huomattavan vihreää. Myös F2-sukupolvessa vedet olivat

selkeästi vihertyneitä. Kun emot poimittiin mittausta varten, myös niiden uimaraajoihin oli

tarttunut levää. Näin ollen ravinnon määrä voidaan olettaa olleen tarpeeksi suuri. Tietyt

tekstiilivärit voivat olla myös levälle toksisia (Croce ym. 2017)

4.2.3. Sukupuolijakauma ja lepomunat

Kummankaan kroonisen kokeen aikana ei syntynyt yhtään koirasta eikä lepomunia havaittu kokeen

aikana. Lepomunia ja koiraita ilmenee, kun olosuhteet eivät ole vesikirpulle sopivat (Ebert 2005).

Ekotoksisissa kokeissa koiraita on havaittu esimerkiksi lääkeaineilla tehdyissä tutkimuksissa

(Flaherty & Dodson 2005). Lepomunia havaitaan kevättalvella Itä-Suomen yliopiston

29

kasvatushuoneessa, vaikka olosuhteet huoneessa ovat läpi vuoden. Koska koiraita eikä lepomunia

havaittu kummassakaan kroonisessa kokeessa, voidaan olettaa, etteivät väriaineet aiheuttaneet

huomattavaa haittaa vesikirppujen elinympäristölle.

5. JOHTOPÄÄTÖKSET

Tutkimuksella oli useampi tavoite, joista yksi oli saada lisää tietoa kroonisista usean sukupolven

vesikirppukokeista. Standardeja usean sukupolven kokeille ei vielä ole ja/tai niitä tulisi kehittää.

Tällaiset kokeet ovat uusia ja on vielä vaikeaa sanoa, miten kyseinen koeasetelma vaikuttaa kokeen

tuloksiin. Koeasetelma voi olla jo itsessään stressaava, jolloin tulokset kemikaalin vaikutuksista

voivat vääristyä. Tämän kokeen aikana huomattiin esimerkiksi vesikirppujen koon pieneneminen

sukupolvien edetessä.

Kokeiden perusteella valitut väriaineet eivät ole akuutisti toksisia. Vaikka akuutin toksisuuden

puuttuminen ei kerro vielä kaikkea kemikaalin haitallisuudesta, se on usein perustana

jatkotutkimusten tarpeelle. Tekstiilivärien kohdalla nämä jatkotutkimukset ovat tarpeen, koska

vain harvoista väreistä oli tutkittu muuta kuin akuuttia toksisuutta. Kuten monen muunkin

kemikaalin osalta, myös tekstiilivärejä pääsee jatkuvasti vesistöihin sekä tekstiilitehtaiden

ympäristössä että kotitalouksien jätevesien kautta, kun vaatteita pestään.

Yhden värin tutkimuksen perusteella ei voida myöskään vetää suoria johtopäätöksiä muiden

saman ryhmän väriaineiden toksisuudesta. Tekstiilivärien kemiallinen sisältö voi vaihdella

suurestikin ryhmän sisällä. Osa väreistä voi esimerkiksi sisältää klooria tai erilaisia metalleja, ja

toiset väreistä eivät sisällä mitään näistä.

Jälkimmäisessä kokeessa altistuksessa kasvaneet vesikirput sekä lisääntyivät enemmän että

olivat kooltaan suurempia. Hormeesiteorian mukaan haitalliset kemikaalit voivat pieninä

pitoisuuksina aiheuttaa reaktioita, jotka vaikuttavat suotuisilta populaation kannalta. Olettaen, että

teoria pätee myös tähän tapaukseen, violetti väri on haitallinen vesikirpuille. Toisaalta voidaan

pohtia riittääkö kahden ja kolmen sukupolven kokeet luotettavaan tulkintaan väriaineen haitoista.

Koiraspuolisia kirppuja ei syntynyt kokeen aikana eikä lepomunia havaittu. Suvullista

lisääntymistä ei siis tarvittu tukemaan suvutonta lisääntymistä.

30

Kokeita tehdessä täytyy muistaa koeolosuhteiden vakioimisen tärkeys. Hyvien ja

vertailukelpoisten tulosten saamiseksi tutkimusolosuhteiden tulisi pysyä samanlaisina koko kokeen

ajan. Tämän kokeen aikana lämpötila vaihteli koehuoneessa, eikä tämän vaikutuksia tuloksiin

voida suoraan arvioida. Toinen koe siirrettiin kasvatuskaappiin, jossa lämpötilaa pystyttiin

kontrolloimaan, mutta levä kasvoi enemmän kuin koehuoneessa. Levän kasvun ja sen tarttumisen

uimaraajoihin vaikutuksia ei myöskään voida tarkasti määrittää.

5. KIITOKSET

Kiitokset työn ohjaamisesta Kukka Pakariselle ja Jarkko Akkaselle. Erityiskiitos Kukalle

laboratoriotyöskentelyn ohjauksesta ja koko Itä-Suomen yliopiston ekotoksikologian

tutkimusryhmälle auttamisesta kokeiden ongelmakohdissa.

Kiitokset tutkimusrahoituksesta Maa- ja vesitekniikan tuki ry.

6. LÄHDELUETTELO

Araujo, G. S., Pavlaki, M. D., Soares, A. M. V. M., Abessa, D. M. S., Loureiro, S. 2019.

Bioaccumulation and Morphological Traits in a Multi-Generation Test with Two Daphnia

Species Exposed to Lead. Chemosphere 219: 636-644.

Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. 2002. Defining Hormesis. Human and Experimental

Toxicology. 21 (2): 91-97.

Campos, B., Jordão, R., Rivetti, C., Lemos, M. F. L., Soares, A. M. V. M., Tauler, R., Barata, C.

2016. Two‐generational Effects of Contaminants in Daphnia Magna: Effects of Offspring

Quality. Environmental Toxicology and Chemistry 35 (6): 1470-1477.

Chen, X., Shen, Z., Zhu, X., Fan, Y., Wang, W. 2005. Advanced Treatment of Textile

Wastewater for Reuse using Electrochemical Oxidation and Membrane Filtration. Water

SA 31 (1).

Chen, Y., Huang, J. Liqun, X., Liu, H., Giesy, J. P., Yu, H., Zhang, X. 2013. Effects of

Multigenerational Exposures of D. Magna to Environmentally Relevant Concentrations of

Pentachlorophenol. Environmental Science and Pollution Research: 1-10.

Chequer, F. A. D., Oliveira, G. A. de R., Ferraz, E. R. A., Cardoso, J. C., Zanoni, M. V. B,

Oliveira, D. de P. 2013. Textile Dyes: Dyeing Process and Environmental Impact. Teoksessa

31

Gunay, M. (toim), Eco-Friendly Textile Dyeing and Finishing 11-21. Intech

DOI:10.5772/53659.

Christie, R. M. 2001. Reactive Dyes for Textile Fibres. Teoksessa: Christie, R. M. Colour

Chemistry, 135-147. The Royal Society of Chemistry, United Kingdom.

Clark, M., 2011. Chapter 1: Principles, processes and types of dyes. Teoksessa: Clark, M.

(Toim.), Handbook of Textile and Industrial Dyeing. Volume 1: Principles, Processes and

Types of Dyes, s. 3-27. Woodhead Publishing Limited, Philadelphia.

Conde-Porcuna, J., Valdes, F., Romo, S., Perez-Martinez, C. 2011. Ephippial and Subitaneous

Egg Abortion: Relevance for an Obligate Parthenogenetic Daphnia Population. Journal of

Limnology 70 (1): 69-75.

Croce, R., Cinà, F., Lombardo, A., Crispeyn, G., Cappelli, C. I. , Vian, M., Maiorana, S.,

Benfenati, E., Baderna, D. 2017. Aquatic Toxicity of several Textile Dye Formulations:

Acute and Chronic Assays with Daphnia Magna and Raphidocelis

Subcapitata. Ecotoxicology and Environmental Safety 144: 79-87.

Darsana, R., Chandrasehar, G., Deepa, V., Gowthami, Y., Chitrikha, T., Ayyappan, S., Goparaju,

A. 2015. Acute Toxicity Assessment of Reactive Red 120 to Certain Aquatic

Organisms. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 95 (5): 582-587.

de Aragão Umbuzeiro, G. 2005. The Contribution of Azo Dyes to the Mutagenic Activity of the

Cristais River." Chemosphere 60 (1): 55-64.

Dey, S., Islam, A. 2015. A Review on Textile Wastewater Characterization in Bangladesh.

Resources and Environment 5 (1): 15-44.

Ebert, D. 2005. Introduction to Daphnia Biology. Teoksessa: Ecology, Epidemiology, and

Evolution of Parasitism in Daphnia. s.11-21. National Center for Biotechnology Information.

US.

ECHA 2014a. Registration dossier blue ver 2108. https://echa.europa.eu/fi/registration-dossier/-

/registered-dossier/1290/1 (27.3.2019).

ECHA 2014b. Registration dossier rective red 180. https://echa.europa.eu/fi/registration-dossier/-

/registered-dossier/10676/1 (27.3.2019).

Environment Protection rules S.O.844(E) 1986. Schedule 6: General standards for discharge of

environmental pollutants part-A: effluents.

US EPA. EPA method 110.1. https://www.umass.edu/mwwp/pdf/epa110.1colorspec.pdf

(29.4.2019)

US EPA. EPA Method 110.2. https://www.umass.edu/mwwp/pdf/epa110_2colorplatcob.pdf

(29.4.2019)

Flaherty, C. M., Dodson, S. I. 2005. Effects of Pharmaceuticals on Daphnia Survival, Growth,

and Reproduction. Chemosphere 61 (2): 200-207.

Ghaly, A., Ananthashankar, R., Alhattab, M., Ramakrishnan, V. 2014. Production,

Characterization and Treatment of Textile Effluents: A Critical Review. Journal of Chemical

Engineering & Process Technology 5 (1): 1.

Government of India. Ministry of Environment, Forest and Climate Change 2014. Environment

Standards for Dyes and Dye Intermediate Industry.

Government of India. Ministry of Environment, Forest and Climate Change 2016. Standards for

discharge of effluents from textile industry.

Haque, R., ENRAC team. 2017. Research report. Use and Effectiveness of Effluent Treatment

Plants (ETPs) in the Garments Industry of Bangladesh: a Water Sector Integrity Perspective.

https://www.ti-bangladesh.org/beta3/images/2017/ENRAC/ETP_Use_Effectiveness_water-

Integrity.pdf

32

Hessel, C., Allegre, C., Maisseu, M., Charbit, F., Moulin, P. 2007. Guidelines and Legislation for

Dye House Effluents. Journal of Environmental Management 83 (2): 171-180.

Hoefnagel, K. N, de Vries, E. H. J. (Lisenka), Jongejans, E., Verberk, W. C. E. P. 2018. The

Temperature‐size Rule in Daphnia Magna Across Different Genetic Lines and Ontogenetic

Stages: Multiple Patterns and Mechanisms. Ecology and Evolution 8 (8): 3828-3841.

Idris, A.E., Hashim, R., Rahman, R.A., Ahmad, W., Ibrahim, Z., Razak, P.A., Zin, H.M., Bakar,

I. 2007. Application of bioremediation process for textile wastewater treatment using pilot

plant. International Journal of Engineering and Technology. 4 (2), 228-234

KEMI 2014. Chemicals in textiles – Risks to human health and the environment. Report 6/2014.

Swedish Chemicals Agency. Tukholma.

Khatri, A., Peerzada, M. H., Mohsin, M., White, M. 2015. "A Review on Developments in

Dyeing Cotton Fabrics with Reactive Dyes for Reducing Effluent Pollution." Journal of

Cleaner Production 87 (1): 50-57.

Kivivuori, L. A., Lahdes, E. O. 1996. How to Measure the Thermal Death of Daphnia? A

Comparison of Different Heat Tests and Effects of Heat Injury. Journal of Thermal

Biology 21 (5): 305-311.

Klemola, K. 2008. Cytotoxicity and Spermatozoa Motility Inhibition Resulting from Reactive

Dyes and Dyed Fabrics. Väitöskirja. Kuopion yliopisto. Doctoral dissertation in Biosciences.

43.s. Kuopio.

Lewis, D. M. 2014. Developments in the Chemistry of Reactive Dyes and their Application

Processes. Coloration Technology 130 (6): 382-412.

Luongo, G. 2015. Chemicals in Textiles: A Potential Source for Human Exposure and

Environmental Pollution. Väitöskirja. Tukholman yliopisto, Doctoral dissertation in

Analytical chemistry. 53 s. Tukholma.

Ministry of Industry, Thailand. 2017. Notification of Ministry of Industry Industrial Effluent

Standards (B.E. 2560).

Ministry of Industry and Trade of Vietnam. (QCVN: 01/2017/BCT). Restriction of Azo Dye and

Formaldehyde in Textile Products.

Mostafa. M. 2015. Waste water treatment in Textile Industries- the concept and current removal

Technologies. Journal of Biodiversity and Environmental Sciences 7, (1) 501-525

OECD Joint Working Party on Trade and Environment. 2002. The development dimension of

trade and environment: case studies on environmental requirements and market access.

COM/ENV/TD(2002)86/FINAL.

OECD Environment directorate joint meeting of the chemicals committee and the working party

on chemicals, pesticides and biotechnology. 2017. Emission scenario document (ESD) on

the use of textile dyes. ENV/JM/MONO(2015)50.

OECD. 2004. Test No. 202: Daphnia sp. Acute Immobilisation Test, OECD Guidelines for the

Testing of Chemicals, Section 2, OECD Publishing, Paris

https://doi.org/10.1787/9789264069947-en.

OECD. 2012. Test No. 211: Daphnia magna Reproduction Test, OECD Guidelines for the

Testing of Chemicals, Section 2, OECD Publishing,

Paris, https://doi.org/10.1787/9789264185203-en.

Pang,Y. L., Ahmad Z. A. 2013. Current Status of Textile Industry Wastewater Management and

Research Progress in Malaysia: A Review. Vol. 41.

Piscia, R., Colombini, M., Ponti, B., Bettinetti, R., Monticelli, D., Rossi, V., Manca, M. 2015.

Lifetime Response of Contemporary Versus Resurrected Daphnia Galeata Sars (Crustacea,

33

Cladocera) to Cu(II) Chronic Exposure. Bulletin of Environmental Contamination and

Toxicology 94 (1): 46-51.

Quantis 2018. Measuring fashion - Environmental Impact of the Global Apparel and Footwear

Industries Study. https://quantis-intl.com/wp-

content/uploads/2018/03/measuringfashion_globalimpactstudy_full-

report_quantis_cwf_2018a.pdf

REACH asetus 2006: Regulation (EC) no 1907/2006 of the European Parliament and of the

Council

SGS NO. 186/17 Vietnam issues new regulations on formaldehyde and azo dyes requirements in

textile products. https://www.sgs.com/en/news/2017/12/safeguards-18617-vietnam-issues-

new-regulations-on-formaldehyde-and-azo-dyes (27.3.2019)

Siciliano, A., Gesuele, R. 2013. How Daphnia (Cladocera) Assays may be used as Bioindicators

of Health Effects? Journal of Biodiversity & Endangered Species 01 (s1).

Siddiqua, U. H., Ali, S., Iqbal, M., Hussain, T. 2017. Relationship between Structure and Dyeing

Properties of Reactive Dyes for Cotton Dyeing. Journal of Molecular Liquids 241: 839-844.

Singh, S. P., Singh, P 2015. Effect of Temperature and Light on the Growth of Algae Species: A

Review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 50: 431-444.

Stanley, J. K., Perkins, E. J., Habib, T., Sims, J. G., Chappell, P., Escalon, B. L., Wilbanks, M.,

Garcia-Reyero, N. 2013. The Good, the Bad, and the Toxic: Approaching Hormesis in

Daphnia Magna Exposed to an Energetic Compound. Environmental Science &

Technology 47 (16): 9424.

Steinberg, C., Ouerghemmi, N., Herrmann, S., Bouchnak, R., Timofeyev, M., Menzel, R. 2010.

Stress by Poor Food Quality and Exposure to Humic Substances: Daphnia Magna Responds

with Oxidative Stress, Lifespan Extension, but Reduced Offspring

Numbers. Hydrobiologia 652 (1): 223-236.

Talukder, M. E., Kamruzzaman, M., Majumder, M., Rony, M. S. H., Hossain, M., Das, S. 2017.

Effects of Salt Concentration on the Dyeing of various Cotton Fabrics with Reactive

Dyes. International Journal of Textile Science 6 (1): 7-14.

Threlkeld, S. T. 1979. The Midsummer Dynamics of Two Daphnia Species in Wintergreen Lake,

Michigan. Ecology 60 (1): 165-179.

UNECE 2018. Fashion is an environmental and social emergency, but can also drive progress

towards the Sustainable Development Goals.

https://www.unece.org/info/media/news/forestry-and-timber/2018/fashion-is-an-

environmental-and-social-emergency-but-can-also-drive-progress-towards-the-sustainable-

development-goals/doc.html (27.3.2019).

Vacchi, F. I., Vendemiatti, J. A., Da Silva, B. F., Zanoni, M. V. B., Umbuzeiro, G. A. 2017.

Quantifying the Contribution of Dyes to the Mutagenicity of Waters Under the Influence of

Textile Activities. Science of the Total Environment 601-602: 230-236.

Verma, Y. 2008. "Acute Toxicity Assessment of Textile Dyes and Textile and Dye Industrial

Effluents using Daphnia Magna Bioassay." Toxicology and Industrial Health 24 (7): 491-

500.

WTO 2018. World Trade Statistical Review.

https://www.wto.org/english/res_e/statis_e/wts2018_e/wts2018_e.pdf

The Zero Discharge of Hazardous Chemicals (ZDHC) Programme 2015. Textile Industry

Wastewater Discharge Quality Standards: Literature Review